Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР и его применение Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и, в частности, относится к уникальному набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению, в частности, предназначен для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ). Настоящее изобретение также относится к применению набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ. Настоящее изобретение может быть использовано специалистами учреждений практического здравоохранения и в научно-исследовательских лабораториях.

Перечень последовательностей

К настоящему документу прилагается перечень последовательностей, поданный в формате XML.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире, от которой каждый год умирает 17,9 млн человек. Сердечно-сосудистые заболевания представляют собой группу болезней сердца и кровеносных сосудов, в которую входят ишемическая болезнь сердца, заболевания сосудов головного мозга, ревматическая болезнь сердца и другие патологии. Более четырех из пяти смертей от ССЗ происходит в результате инфаркта миокарда и инсульта, причем треть из этих случаев смерти носит преждевременный характер и происходит среди людей в возрасте до 70 лет.

Условием профилактики преждевременной смертности является выявление всех лиц, подверженных наиболее высокому риску ССЗ, и обеспечение предоставления им надлежащего лечения. Важнейшим условием предоставления необходимого лечения и консультирования всем, кому это необходимо, является обеспечение наличия в учреждениях первичного звена соответствующих лекарственных препаратов и базовых медицинских технологий, необходимых для диагностики и лечения неинфекционных заболеваний.

Таким образом, существует потребность в создании эффективных диагностических средств для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития.

В статье Медведева Е. А. и др. Молекулярные биомаркеры в диагностике, стратификации риска и прогнозировании хронической сердечной недостаточности. Российский кардиологический журнал 2016, 8 (136): 86–91 http://dx.doi.org/10.15829/1560-4071-2016-8-86-91, указано, что последнее десятилетие широкое развитие получила концепция молекулярных биомаркеров, используемых в том числе и для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.

Поиск надежных молекулярных биомаркеров и разработка эффективных средств их обнаружения является текущей задачей последнего десятилетия.

В международной патентной публикации WO2011084460 A1 описан способ лечения или профилактики ишемии миокарда у нуждающегося в этом субъекта, включающий модуляцию экспрессии или активности одной или более микроРНК, выбранных из члена семейства miR-15, miR-21, miR-26a, let-7b, miR-199a, miR-214, miR-10a, miR-10b, miR-574, miR-320, miR-92a, miR-499, miR-101a, miR-101b, miR-125b, miR-126, члена семейства miR-30, miR-143, miR-145, miR-185, miR-34a, miR-1, miR-133, miR-210 и miR-29a, в клетках сердца субъекта. Таким образом, раскрыты семейства микроРНК, которые могут быть использованы в качестве молекулярных биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний.

В международной патентной публикации WO2010135570 описан способ лечения или профилактики инфаркта миокарда, ремоделирования сердца и сердечной недостаточности у нуждающегося в этом субъекта, включающий модуляцию экспрессии или активности одной или более миРНК, выбранных из члена семейства let-7, miR-15b, miR-21, miR-199a, miR-199b, miR-214, miR-10a, miR-10b, miR-16, miR-146a, miR-146b, miR-221, miR-222, miR-497, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-101, miR-126, члена семейства miR-30, miR-143, miR-145, miR-150 и miR-29а, в клетках сердца субъекта.

Таким образом, определенные семейства микроРНК могут быть рассмотрены в качестве молекулярного биомаркера для диагностики сердечно-сосудистого заболевания и выявления риска его развития. Однако успех надежного и точного диагностирования состоит в выборе наиболее показательного молекулярного биомаркера, при этом проведение диагностики на основе конкретного выбранного наиболее показательного биомаркера существенно упрощает проведение диагностики.

Одним из современных методов диагностики заболеваний является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали ПЦР незаменимой для решения различных задач клинической диагностики, таких как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, а также молекулярное типирование.

В патенте RU2662975 C1 описано определение микроРНК в плазме для обнаружения ранних стадий колоректального рака с использованием реакции ПЦР. В заявке RU2020108781 A раскрыт способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микроРНК с использованием реакции ПЦР. Однако согласно этим публикациям проводят измерение относительного количества транскриптов микроРНК 143 путем анализа экспрессии гена искомой микроРНК.

В последние годы в мировой и отечественной практике стали широко использоваться методы молекулярно-биологического анализа, в частности, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ).

В статье Xiangran Sun et al., miR-143-3p inhibits the proliferation, migration and invasion in osteosarcoma by targeting FOSL2, Scientific Reports | (2018) 8:606 | DOI:10.1038/s41598-017-18739-3, описано применение количественной ПЦР-РВ для сравнения уровня экспрессии miR-143-3p в нормальной и опухолевой ткани.

Однако еще в 2005 г. в источнике Caifu Chen et al., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20, был описан метод количественного определения микроРНК методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» (stem-loop primer). В данном методе для обратной транскрипции используется праймер типа «стебель-петля», представляющий собой последовательность, комплементарную целевой микроРНК длиной 6 нуклеотидов и петлевой домен длиной до 44 нуклеотидов, формирующий шпилечную структуру ДНК, что удлиняет целевую микроРНК и делает возможным последующее проведение количественной ПЦР. В данном источнике указано, что эффективность профилирования микроРНК, а также чувствительность и специфичность данного метода определения микроРНК в значительной степени зависят от применяемого набора праймеров. При этом в связи с небольшим размером микроРНК разработка набора праймера с высокой специфичностью и основанного на его применении метода количественной ПЦР с высокой чувствительностью является достаточно сложной задачей.

Таким образом, предложенный еще в 2005 г. метод определения микроРНК методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» является более эффективным, чем применение простой количественной ПЦР-РВ для сравнения уровня экспрессии miR-143-3p в здоровом образце и патологическом образце, однако метод ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» осложнен необходимостью разработки набора праймеров для его осуществления.

В источнике Martha F. Kramer et al., Stem-Loop RT-qPCR for miRNAs, Curr Protoc Mol Biol. 2011 July ; Chapter: Unit15.10. doi:10.1002/0471142727.mb1510s95, описано, что сложность осуществления метода, описанного Caifu Chen et al., состоит также в присутствии первичной микроРНК (pri-miRNA) и предшественника микроРНК (pre-miRNA), что в случае их большого молярного избытка относительно зрелой микроРНК приводит к низкому уровню обратной транскрипции и низкой эффективности последующей количественной ПЦР. Решение указанной проблемы описано, например, в источнике Д.Н. Федорин, В.О. Чуйкова, А.Т. Епринцев, Создание специфического зонда «стебель-петля» для идентификации микроРНК MIR165A в листьях кукурузы, Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2023, № 4, путем применения модифицированной методики фенол-хлороформной экстракции суммарной клеточной РНК с применением полиэтиленгликоля 1500 в качестве соосадителя РНК, что позволило осуществить выделение микроРНК, которая может использоваться при количественном исследовании ее содержания в клетках исследуемых организмов методом ПЦР в реальном времени.

Таким образом, требуется высокая специфичность и чувствительность метода количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» в отношении зрелой микроРНК.

В источнике Yang L-h, Wang S-l, Tang L-l, Liu B, Ye W-l, et al. (2014) Universal Stem-Loop Primer Method for Screening and Quantification of MicroRNA. PLoS ONE 9(12): e115293. doi:10. 1371/journal.pone.0115293, описан универсальный праймер типа «стебель-петля» для определения микроРНК, однако указанный праймер не может обеспечить требуемую специфичность в отношении конкретной микроРНК, выбранной в качестве молекулярного биомаркера.

Таким образом, в области диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и риска их развития сохраняется потребность в разработке надежных систем определения микроРНК, таких как набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе микроРНК в качестве биомолекулярного маркера методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Решение поставленной задачи является критически важным для эффективной и надежной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Для решения поставленной задачи авторы настоящего изобретения разработали уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля», предназначенный, в частности, для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p.

Согласно настоящему изобретению для определения hsa-miR-143-3p количественную ПЦР-РВ проводят в две стадии. Первая стадия состоит в проведении обратной транскрипции с матрицы микроРНК. Вторая стадия состоит в постановке и анализе количественной ПЦР-РВ. Экспрессионный анализ можно проводить в качестве метода для поиска биомаркера.

Разработанный авторами настоящего изобретения уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению, в частности, предназначен для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к применению набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно первому аспекту для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Согласно одному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения при проведении количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» применяют интактный краситель SybrGreen.

Технический результат настоящего изобретения состоит в следующем:

- предоставление нового эффективного и специфичного набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- предоставление уникального набора стабильных олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

-расширение арсенала средств для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и определения риска их развития,

- достижение высокоспецифичного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- повышение специфичности определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- достижение высокочувствительного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- повышение чувствительности определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- эффективное профилирование экспрессии hsa-miR-143-3p,

- достижение высокопроизводительного анализа экспрессии hsa-miR-143-3p,

- достижение высокой диагностической чувствительности,

- достижение высокой диагностической специфичности.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схема ПЦР-РВ с петельной структурой. 1: Обратная транскрипция микроРНК, опосредованная специфичным праймером типа «стебель-петля». 2: Первая цепь кДНК амплифицируется в ПЦР с использованием специфичного прямого праймера и обратного праймера, комплементарного праймеру типа «стебель-петля».

На фиг. 2 представлены результаты амплификации.

На фиг. 3A и фиг. 3B представлены результаты определения температуры плавления.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

В ходе анализа опубликованных научно-исследовательских работ авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что в качестве эффективного молекулярного биомаркера для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития можно применять микроРНК hsa-miR-143-3p.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наиболее эффективным методом диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития для микроРНК hsa-miR-143-3p в качестве молекулярного маркера является применение количественной ПЦР-РВ с праймером для обратной транскрипции типа «стебель-петля», что требует разработки эффективного и высокоспецифичного набора стабильных олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p в качестве молекулярного биомаркера.

В области диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и риска их развития сохраняется потребность в разработке надежных систем определения микроРНК hsa-miR-143-3p, таких как набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе микроРНК hsa-miR-143-3p в качестве биомолекулярного маркера методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Решение поставленной задачи является критически важным для эффективной и надежной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития.

Для решения поставленной задачи авторы настоящего изобретения разработали уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), предназначенный, в частности, для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ).

Согласно настоящему изобретению для определения hsa-miR-143-3p количественную ПЦР-РВ проводят в две стадии. Первая стадия состоит в проведении обратной транскрипции с матрицы микроРНК. Вторая стадия состоит в постановке и анализе количественной ПЦР-РВ. Экспрессионный анализ можно проводить в качестве метода для поиска биомаркера.

Разработанный авторами настоящего изобретения уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO:1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:3.

Разработанный авторами настоящего изобретения уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров является высокоспецифичным в отношении молекулярного биомаркера микроРНК hsa-miR-143-3p, обеспечивает высокочувствительное определение микроРНК hsa-miR-143-3p посредством количественной ПЦР-РВ, эффективное профилирование экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p, достижение высокопроизводительного анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p и высокоточное диагностирование сердечно-сосудистых заболеваний и выявление риска их развития.

Определения

В контексте настоящего изобретения термин «микроРНК» означает малые некодирующие молекулы РНК длиной приблизительно от 18 до 25 нуклеотидов (в среднем 22 нуклеотида), принимающие участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов путём РНК-интерференции.

В контексте настоящего изобретения термин «праймер для ПЦР» означает короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК- или РНК-мишени, который служит затравкой для синтеза комплементарной цепи.

В контексте настоящего изобретения термин «прямой праймер для ПЦР» означает фрагмент нуклеиновой кислоты, необходимый для начала реакции ПЦР и комплементарный последовательности ДНК-матрицы в направлении 5’-3’.

В контексте настоящего изобретения термин «обратный праймер для ПЦР» означает фрагмент нуклеиновой кислоты, необходимый для окончания реакции ПЦР и обратно комплементарный последовательности ДНК-матрицы.

В контексте настоящего изобретения термин «праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля»» означает праймер для проведения полимеразной цепной реакции обратной транскрипции, обеспечивающий формирование кДНК-матрицы для дальнейшей ПЦР. Конструкция олигонуклеотидов «стебель-петля» способна специфично обратно транскрибировать только выбранную зрелую микроРНК, которая впоследствии амплифицируется с помощью ПЦР. Типичный праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» включает нуклеотидную последовательность 3'-элемента, комплементарную 3'-концу зрелой микроРНК, последовательность стебля и петли, которая также содержит 3'-сайт праймирования для последующего ПЦР.

В контексте настоящего изобретения термин «количественная ПЦР-РВ» означает лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий.

В контексте настоящего изобретения термин «количественная ПЦР-РВ с применением праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»» означает лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, позволяющий определять не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество её копий, включающий стадию обратной транскрипции с применением праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

В контексте настоящего изобретения термин «набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров» означает уникальную комбинацию трех уникальных по последовательности и длине праймеров, которые в совокупности обеспечивают определение микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ).

В контексте настоящего изобретения термин «интактный краситель SybrGreen» означает интеркалирующий краситель, специфичный к двухцепочечной ДНК. Раствор оптимизирован для применения в ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Выбор молекулярного биомаркера для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития

МикроРНК (miRNA) являются ключевыми регуляторами посттранскрипционной экспрессии генов, участвующими в широком спектре физиологических и патологических процессов, включая воспаление, метаболизм и регуляцию работы сердечно-сосудистой системы. Среди них hsa-miR-143-3p привлекает особое внимание благодаря своей роли в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), являющихся одной из ведущих причин смертности в мире.

hsa-miR-143-3p представляет собой одну из двух зрелых форм микроРНК, происходящих из одного и того же гена miR-143. Она играет важную роль в регуляции экспрессии генов, участвующих в различных биологических процессах, таких как клеточный цикл, дифференцировка, апоптоз и метаболизм. Ниже приведено подробное описание hsa-miR-143-3p, включая его происхождение, механизмы действия, биологические функции и клиническое значение. hsa-miR-143-3p образуется в результате процессинга прекурсорной молекулы микроРНК (pre-miR-143), которая имеет шпилечную структуру. Прекурсорная молекула синтезируется в ядре из первичного транскрипта (pri-miR-143) с помощью фермента Drosha. Затем pre-miR-143 экспортируется в цитоплазму, где она разрезается ферментом Dicer, что приводит к образованию двух цепей: 3p (hsa-miR-143-3p) и 5p (hsa-miR-143-5p).

hsa-miR-143-3p функционирует как регулятор экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Он связывается с комплементарными участками в 3'-нетранслируемых областях (3'-UTR) мРНК-мишеней, что приводит к подавлению их экспрессии. Это подавление может происходить за счет деградации мРНК, а именно hsa-miR-143-3p способствует разрушению мРНК-мишеней. Согласно другому варианту связывание с мРНК hsa-miR-143-3p блокирует процесс трансляции, предотвращая синтез белка.

Исследования показывают, что hsa-miR-143-3p участвует в регуляции сосудистого тонуса, ремоделирования сосудов и воспалительных процессов, что делает ее перспективным биомаркером для ранней диагностики и прогнозирования риска ССЗ [Zhao W, Zhao SP, Zhao YH. MicroRNA-143/-145 in Cardiovascular Diseases. Biomed Res Int. 2015;2015:531740. doi:10.1155/2015/531740]. hsa-miR-143-3p играет важную роль в контроле дифференцировки сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК), а именно при фенотипическом переключении СГМК, влияя на их пролиферацию, миграцию и способность к образованию атеросклеротических бляшек. Дисрегуляция этой микроРНК может приводить к атеросклеротическим изменениям и повышенному риску развития ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда [Xin M, Small EM, Sutherland LB, Qi X, McAnally J, Plato CF, Richardson JA, Bassel-Duby R, Olson EN. MicroRNAs miR-143 and miR-145 modulate cytoskeletal dynamics and responsiveness of smooth muscle cells to injury. Genes Dev. 2009 Sep 15;23(18):2166-78. doi: 10.1101/gad.1842409. Epub 2009 Aug 31. PMID: 19720868; PMCID: PMC2751981.].

Также следует отметить противовоспалительное действие этой регуляторной молекулы. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что hsa-miR-143-3p модулирует сигнальные пути воспаления, такие как NF-κB и PI3K/AKT, подавляя экспрессию провоспалительных цитокинов (IL-6, TNF-α). Нарушение ее регуляции может способствовать развитию эндотелиальной дисфункции и хроническому воспалению сосудов, являющихся ключевыми механизмами прогрессии ССЗ [Wang Y, Zhang X, Wang J, et al. Inflammatory Periodontal Ligament Stem Cells Drive M1 Macrophage Polarization via Exosomal miR-143-3p-Mediated Regulation of PI3K/AKT/NF-κB Signaling. Stem Cells. 2023;41(2):184-199. doi:10.1093/stmcls/sxac087]. Отмечено влияние на метаболизм липидов. Было показано, что hsa-miR-143-3p регулирует гены, участвующие в метаболизме липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов, что делает ее важной мишенью для оценки риска дислипидемий и метаболического синдрома [Wang Y, Zhang X, Wang J, et al. Inflammatory Periodontal Ligament Stem Cells Drive M1 Macrophage Polarization via Exosomal miR-143-3p-Mediated Regulation of PI3K/AKT/NF-κB Signaling. Stem Cells. 2023;41(2):184-199. doi:10.1093/stmcls/sxac087].

Использование hsa-miR-143-3p в клинической практике имеет замечательные перспективы. Анализ уровней hsa-miR-143-3p в плазме крови может стать эффективным методом для раннего выявления лиц с высоким риском сердечно-сосудистых катастроф, таких как инфаркт миокарда, инсульт, разрыв аневризмы аорты.

hsa-miR-143-3p может быть использована как диагностический биомаркер. Повышенный или пониженный уровень hsa-miR-143-3p в биологических жидкостях может быть индикатором патологических изменений в сердечно-сосудистой системе задолго до появления клинических симптомов. hsa-miR-143-3p может быть использована также как прогностический маркер. Динамическое наблюдение за уровнем этой микроРНК позволяет оценивать эффективность терапии (например, статинов, антиагрегантов, противовоспалительных препаратов) и прогнозировать вероятность повторных сердечно-сосудистых событий.

В перспективе микроРНК могут быть использованы как терапевтическая мишень. Разработка молекулярных методов коррекции уровня hsa-miR-143-3p (например, антисмысловых олигонуклеотидов или малых молекул, регулирующих ее экспрессию) открывает перспективы персонализированной терапии атеросклероза и гипертонической болезни.

Учитывая всё сказанное выше, перед исследователями встаёт необходимость разработки точных методов анализа hsa-miR-143-3p.

Таким образом, для эффективного диагностирования сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития авторами настоящего изобретения в качестве молекулярного биомаркера выбрана микроРНК hsa-miR-143-3p.

Однако несмотря на высокий потенциал hsa-miR-143-3p как биомаркера ее точное определение в клинических образцах (кровь, плазма, сыворотка) затруднено отсутствием высокоспецифичных и высокочувствительных средств ее определения.

Выбор методики проведения диагностики сердечно-сосудистых заболеваний

В последние годы в мировой и отечественной практике стали широко использоваться методы молекулярно-биологического анализа, в частности, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), для количественного анализа содержания молекулярного биомаркера.

Более эффективным оказался описанный 2005 г. в источнике Caifu Chen et al., Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 20, метод количественного определения микроРНК методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» (stem-loop primer). В данном методе для обратной транскрипции используется праймер типа «стебель-петля», представляющий собой последовательность, комплементарную целевой микроРНК длиной 6 нуклеотидов и петлевой домен длиной до 44 нуклеотидов, формирующий шпилечную структуру ДНК, что удлиняет целевую микроРНК и делает возможным последующее проведение количественной ПЦР.

Таким образом, метод определения микроРНК методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» является единственно возможным методом, так как применение простой количественной ПЦР-РВ позволяет только оценить изменение относительного уровня экспрессии miR-143-3p в биологических образцах, что не является аналогией количественной оценке содержания микроРНК.

Однако эффективность профилирования микроРНК, а также чувствительность и специфичность данного метода определения микроРНК в значительной степени зависит от применяемого набора праймеров. При этом, в связи с небольшим размером микроРНК, разработка набора праймера с высокой специфичностью и основанного на его применении метода количественной ПЦР с высокой чувствительностью является достаточно сложной задачей.

Кроме того, сложность указанного метода также состоит в присутствии первичной микроРНК (pri-miRNA) и предшественника микроРНК (pre-miRNA), что случае их большого молярного избытка относительно зрелой микроРНК приводит к низкому уровню обратной транскрипции и низкой эффективности последующей количественной ПЦР. Таким образом, требуется разработка набора праймеров, обладающего высокой специфичностью в отношении зрелой микроРНК.

Авторы настоящего изобретения в результате анализа имеющихся на сегодняшний день научно-исследовательских публикаций и результатов исследований пришли к необходимости определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» для эффективной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития, согласно которому количественную ПЦР-РВ проводят в две стадии. Первая стадия состоит в проведении обратной транскрипции с матрицы микроРНК. Вторая стадия состоит в постановке и анализе количественной ПЦР-РВ. Экспрессионный анализ можно проводить в качестве метода для поиска биомаркера.

Выявление авторами настоящего изобретения наиболее эффективного метода количественного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля» для эффективной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития, поставило перед авторами настоящего изобретения задачу разработки уникального набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для наиболее высокоспецифичного и высокочувствительного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом ПЦР-РВ с использованием праймеров типа «стебель-петля».

Разработанный авторами настоящего изобретения уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: , прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

Разработанный авторами настоящего изобретения уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров является высокоспецифичным в отношении молекулярного биомаркера микроРНК hsa-miR-143-3p, обеспечивает высокочувствительное определение микроРНК hsa-miR-143-3p посредством количественной ПЦР-РВ, эффективное профилирование экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p, достижение высокопроизводительного анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p и высокоточное диагностирование сердечно-сосудистых заболеваний и выявление риска их развития.

Разработка уникального набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»

Основная задача для получения эффективного метода количественного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» для эффективной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития состоит в разработке уникального набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, обладающего высокой специфичностью в отношении микроРНК hsa-miR-143-3p, обеспечивающего высокочувствительное определение микроРНК hsa-miR-143-3p посредством количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля», эффективное профилирование экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p, достижение высокопроизводительного анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p и высокоточное диагностирование сердечно-сосудистых заболеваний и выявление риска их развития.

Авторами настоящего изобретения создан уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

Указанный набор получали в результате анализа депонированной в базе данных MiRBase (https://mirbase.org) последовательности микроРНК hsa-miR-143-3p и многочисленных трудоемких экспериментов.

МикроРНК hsa-miR-143-3p имеет последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 4.

Согласно настоящему изобретению разработан уникальный праймер обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1. Так как возможность определения наличия/отсутствия продукта и уровня его экспрессии в образце методом ПЦР в реальном времени варьируется размером ампликона от 50 п.н. до 400 п.н. соответственно, определить структуру меньшей длины этим методом не представляется возможным. Для этого был разработан уникальный олигонуклеотидный праймер для обратной транскрипции, который, в свою очередь, увеличивает размер искомой специфичной РНК-матрицы до необходимого размера, которую можно качественно и количественно определять методом ПЦР в реальном времени, при необходимости с интактным красителем SybrGreen. В дополнении к этому олигонуклеотидный праймер по типу «стебель-петля» добавляет в матрицу уникальную последовательность для отжига обратного праймера, что кратно увеличивает специфичность реакции ПЦР, при необходимости в реальном времени, при необходимости с интактным красителем SybrGreen.

Согласно настоящему изобретению разработан уникальный прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2. Прямой олигонуклеотидный праймер был разработан таким образом, чтобы снизить вероятность образования праймер-димеров и неспецифичного отжига в альтернативном месте матрицы, данное решение дает возможность как качественно, так и количественно определять микроРНК в образцах с выделенной тотальной мРНК, а не только в образцах, где микроРНК была очищена от тотальной мРНК.

Согласно настоящему изобретению разработан уникальный обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3. Обратный олигонуклеотидный праймер, разработан чувствительным только к одному уникальному сайту отжига, который находится на олигонуклеотидной последовательности праймера 143-3p RTprimer для обратной транскрипции типа «стебель-петля». Таким образом снижается риск образования неспецифичных ампликонов в реакции ПЦР в реальном времени. Помимо этого, последовательность разработана с учетом сниженного риска образования праймер-димеров и шпилек, для увеличения показателя эффективности реакции.

Анализ полученных праймеров проводили с использованием программного обеспечения PrimerSelect (https://bio.tools/primerselect).

Температуры плавления анализировали с использованием программного обеспечения OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html).

МикроРНК представляют собой короткие некодирующие цепочки РНК, состоящие из последовательности, содержащей приблизительно 18-25 нуклеотидов, что делает задачу получения высокоспецифичных праймеров достаточно сложной и требует высокой точности метода их определения, так как ошибка даже в один нуклеотид будет крайне существенно снижать эффективность определения.

Кроме того, полученные праймеры должны обладать высокой стабильностью, чтобы выдержать температурные циклы, используемые при проведении количественной ПЦР РВ с использованием праймера обратной транскрипции типа «стебель-петля». Специалисту в данной области техники также известно, что температуры плавления праймеров, входящих в набор, должны находиться в сопоставимых диапазонах.

Авторы настоящего изобретения разработали уникальный набор праймеров, содержащий праймеры уникальной последовательности и длины, которые в комбинации обеспечивают достижение технического результата настоящего изобретения.

Специалисту в данной области техники очевидно, что сведения уровня техники и проведенные предварительные исследования не могут гарантировать получение эффективного, высокоспецифичного и стабильного набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p. Успешная разработка набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера обратной транскрипции типа «стебель-петля» с целью диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития может быть подтверждена исключительно в рамках экспериментов.

В ходе проведенных экспериментов авторы настоящего изобретения подтвердили, что им удалось разработать уникальный, эффективный, высокоспецифичный и стабильный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера обратной транскрипции типа «стебель-петля» с целью диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению, в частности, предназначен для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к применению набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно первому аспекту для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

Согласно одному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения при проведении количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» применяют интактный краситель SybrGreen.

Технический результат настоящего изобретения состоит в следующем:

- предоставление нового эффективного и специфичного набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- предоставление уникального набора стабильных олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

-расширение арсенала средств для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и определения риска их развития,

- достижение высокоспецифичного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- повышение специфичности определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- достижение высокочувствительного определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- повышение чувствительности определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ) с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля»,

- эффективное профилирование экспрессии hsa-miR-143-3p,

- достижение высокопроизводительного анализа экспрессии hsa-miR-143-3p,

- достижение высокой диагностической чувствительности,

- достижение высокой диагностической специфичности.

Технический результат настоящего изобретения достигается уникальным набором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, который содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO:1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:3.

Перечень последовательностей, представленных в настоящем документе

SEQ ID NO Наименование Нуклеотидная последовательность 1 Синтезированный праймер 143-3p RTprimer для обратной транскрипции типа «стебель-петля» GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGCTA 2 Синтезированный прямой праймер для ПЦР hsa-miR-143-3p_F AAGAGCGTTGAGATGAAGCAC 3 Синтезированный обратный праймер для ПЦР hsa-miR-143-3p_R GTCGTATCCAGTGCAGGGT 4 микроРНК hsa-miR-143-3p UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC 

Примеры

Материалы и методы

Метод количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» предназначен для обнаружения и количественного анализа малых некодирующих РНК, особенно для микроРНК. Сначала специфичный праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» гибридизуется с малой некодирующей РНК, а затем осуществляется обратная транскрипция. Далее продукт обратной транскрипции амплифицируется в режиме реального времени с использованием специфичного набора прямого праймера для ПЦР и обратного праймера для ПЦР (фиг. 1). Этот метод позволяет профилировать экспрессию малых некодирующих РНК, состоящих по меньшей мере из 10 нуклеотидов общей РНК, и подходит для высокопроизводительного анализа экспрессии малых некодирующих РНК.

Все используемые реагенты и оборудование являются коммерчески доступными.

Пример 1. Получение набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров согласно настоящему изобретению

Авторами настоящего изобретения создан уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO:1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO:3.

Указанный набор получали в результате анализа депонированной в базе данных MiRBase (https://mirbase.org) последовательности микроРНК hsa-miR-143-3p и многочисленных трудоемких экспериментов.

Анализ полученных праймеров проводили с использованием программного обеспечения PrimerSelect (https://bio.tools/primerselect).

Температуры плавления анализировали с использованием программного обеспечения OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html).

Пример 2. Обратная транскрипция и синтез кДНК

Обратную транскрипцию проводили с помощью M-MLV ревертазы (RNase H-), доступной для приобретения коммерческим путем, для полимеразной цепной реакции обратной транскрипции.

Готовили смесь РНК/праймера в каждой пробирке, количество общей РНК составляло 0,5-1,0 мкг, RT праймер обратной транскрипции типа «стебель-петля» добавляли в количестве 2 мкл, DEPC H₂O добавляли до 3,5 мкл. Образцы инкубировали при 65 ℃ в течение 5 минут, затем на льду не менее 1 минуты.

Готовили мастер-микс для реакции: 5X RT буфер 4 мкл, дНТФ (10 мМ каждый) 4 мкл, ИнгиРНКаза (40 Ед/мкл) 0,8 мкл, RTase (200 Ед/мкл) 1,2 мкл, DEPC H₂O 6 мкл.

Полученные смеси перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 2 минуты. Затем пробирки инкубировали в ПЦР-амплификаторе, используя следующие условия: 16 ℃ в течение 15 минут, 37 ℃ в течение 20 минут, 42 ℃ в течение 80 минут, инактивация теплом при 95 ℃ в течение 5 минут.

Затем охлаждали на льду и хранили затем при -20 ℃ до проведения количественной ПЦР-РВ.

Пример 3. Проведение количественной ПЦР

Концентрации прямого и обратного праймеров для ПЦР нормализовывали, и концентрация каждого праймера (прямого или обратного) в смеси составляла 5 пмоль/мкл.

Реакцию ПЦР запускали в амплификаторе, способном анализировать сигнал по интактному красителю SybrGreen, следующим образом:

этап 1: 94 ℃, 5 минут, 1 цикл

этап 2: 95 ℃, 15 сек; 67 ℃, 60 сек, 40 циклов

этап 3: анализ диссоциации (кривая плавления)

Готовили реакционную смесь для ПЦР в реальном времени в количестве 25 мкл, содержащую 12,5 мкл смеси SYBR Green (2X), 0,2 мкл кДНК, 1 мкл смеси праймеров и 11,3 мкл H₂O.

После завершения ПЦР пробирки извлекали из амплификатора. Специфичность ПЦР проверяли с помощью 3,5% агарозного геля, используя 10 мкл реакционной смеси.

Анализировали результат ПЦР в реальном времени, убедившись в отсутствии двухфазной кривой плавления или ненормальных графиков амплификации.

Анализ экспрессии проводили стандартным методом.

Полученные результаты подтвердили, что авторами настоящего изобретения разработан уникальный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, который является высокоспецифичным в отношении молекулярного биомаркера микроРНК hsa-miR-143-3p, обеспечивает высокочувствительное определение микроРНК hsa-miR-143-3p посредством количественной ПЦР-РВ, эффективное профилирование экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p, достижение высокопроизводительного анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-143-3p и высокоточное диагностирование сердечно-сосудистых заболеваний и выявление риска их развития.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2025-03-04"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="набор

праймеров_HSA-MIR-143-3P.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>набор

праймеров_hsa-miR-143-3p</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение «Российский научный центр хирургии имени

академика Б.В. Петровского»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe nauchnoe

uchrezhdenie Rossiiskii nauchnyi tsentr khirurgii imeni akademika

B.V. Petrovskogo</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ

ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ВЫЯВЛЕНИЯ

РИСКА ИХ РАЗВИТИЯ НА ОСНОВЕ БИОМОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА МИКРОРНК

HSA-MIR-143-3P МЕТОДОМ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>50</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..50</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q15">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgagcta</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagagcgttgagatgaagcac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcgtatccagtgcagggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>modified_base</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mod_base</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>OTHER</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q13">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>uracil</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgagatgaagcactgtagctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Описан набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Также описано применение данного набора для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p. Технический результат заключается в расширении арсенала средств для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и определения риска их развития. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для определения микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (количественная ПЦР-РВ), где указанный набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров содержит праймер для обратной транскрипции типа «стебель-петля» с последовательностью согласно SEQ ID NO: 1, прямой праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 2 и обратный праймер для ПЦР с последовательностью согласно SEQ ID NO: 3.

2. Применение набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров по п. 1 для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и выявления риска их развития на основе биомолекулярного маркера микроРНК hsa-miR-143-3p методом количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля».

3. Применение по п. 2, где при проведении количественной ПЦР-РВ с использованием праймера для обратной транскрипции типа «стебель-петля» применяют интактный краситель SybrGreen.