ОСУЩЕСТВЛЯЕМЫЙ IN VITRO СПОСОБ МОНИТОРИНГА ПАТОГЕННОЙ НАГРУЗКИ В ПОПУЛЯЦИИ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2022 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/70 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к осуществляемому in vitro способу мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных. Более конкретно, настоящее изобретение относится к неинвазивному способу мониторинга изменений показателя нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных с течением времени.

Уровень техники

Предупреждение инфекций, вызываемых патогенами, или контаминации патогенами является крайне важным для здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных. Заболевания, вызываемые патогенными видами бактерий или вирусов или патогенными одноклеточными эукариотами, приводят к высоким экономическим потерям вследствие сниженного прироста массы тела, низкой эффективности конверсии корма, повышения показателей смертности и более высоких затрат на лечение.

Для обеспечения возможности раннего выявления и эффективного воздействия на ранние признаки или даже проявления заболеваний существует потребность в быстром и надежном способе прижизненного мониторинга патогенной нагрузки в популяциях животных.

Краткое описание настоящего изобретения

В настоящем изобретении представлен осуществляемый in vitro способ мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных, при этом способ включает следующие стадии:

(a) отбор и объединение материала образцов экскрементов, полученных от популяции животных;

(b) гомогенизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (a);

(c) разбавление и необязательно стабилизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (b), с использованием водного буферного раствора;

(d) лизирование клеточного материала, содержащегося в разбавленном материале образца, полученном на стадии (c);

(e) выделение материала, представляющего собой нуклеиновые кислоты, из лизированного материала образца, полученного на стадии (d);

(f) выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена или его функционального фрагмента, содержащегося в изоляте нуклеиновых кислот, полученном на стадии (e);

(g) повторение стадий (a)-(f) через последовательные промежутки времени и

(h) отслеживание изменений количества по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предусмотрено применение способов в соответствии с настоящим изобретением для определения необходимости в проведении кормовых вмешательств или медицинских вмешательств или в качестве альтернативы для контроля эффективности кормовых вмешательств или медицинских вмешательств.

Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ получения объединенного образца экскрементов, представляющего общую патогенную нагрузку в популяции животных, при этом способ включает:

(a1) разделение помещения для животных или пространства, в котором популяция животных содержится, на области, образующие сетку из однородных ячеек;

(a2) определение по меньшей мере одного произвольного участка отбора образцов в пределах первой ячейки и сбор одного первого образца из указанного по меньшей мере одного участка отбора образцов; и

(a3) проведение последовательного отбора отдельных образцов экскрементов из оставшихся ячеек с использованием таких же относительных участков отбора образцов в пределах каждой ячейки;

и необязательно

(a4) повторение стадий (a2) и (a3) для получения по меньшей мере одной повторной выборки.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяциях животных. Более конкретно, настоящее изобретение относится к осуществляемому in vitro способу мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных, при этом способ включает следующие стадии:

(a) отбор и объединение материала образцов экскрементов, полученных от популяции животных;

(b) гомогенизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (a);

(c) разбавление и необязательно стабилизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (b), с использованием водного буферного раствора;

(d) лизирование клеточного материала, содержащегося в разбавленном материале образца, полученном на стадии (c);

(e) выделение материала, представляющего собой нуклеиновые кислоты, из лизированного материала образца, полученного на стадии (d);

(f) выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена или его функционального фрагмента, содержащегося в изоляте нуклеиновых кислот, полученном на стадии (e);

(g) повторение стадий (a)-(f) через последовательные промежутки времени и

(h) отслеживание изменений количества по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени.

Термин «патогенспецифический целевой ген» относится к гену, который является специфическим по отношению к патогенному виду или подвиду.

В соответствии со стадией (g) стадии (a)-(f) подлежат повторению через последовательные промежутки времени. В качестве примера, после исходного определения количества по меньшей мере одного патогенспецифического маркерного гена в объединенном образце экскрементов отслеживают количество указанного по меньшей мере одного патогенспецифического маркерного гена в тестируемых образцах, собираемых и анализируемых еженедельно, ежедневно или ежечасно. В одном варианте осуществления объединенные образцы экскрементов собирают в последовательные дни. Объединенные тестируемые образцы экскрементов можно отбирать и анализировать ежедневно в период с момента рождения до убоя.

В одном конкретном варианте осуществления для домашней птицы первый объединенный тестируемый образец отбирают и анализируют в ходе фазы начального роста (стартерная фаза, с 5 дня по 10 день), второй объединенный тестируемый образец отбирают и анализируют в ходе фазы усиленного роста (с 11 дня по 18 день) и необязательно третий объединенный тестируемый образец отбирают и анализируют на более поздней стадии.

В альтернативном варианте осуществления первый объединенный тестируемый образец отбирают и анализируют в фазе начального роста, а дополнительные объединенные тестируемые образцы отбирают и анализируют, например, ежедневно в ходе фазы усиленного роста, необязательно до убоя.

Под «изменением» подразумевается повышение или снижение количества указанного по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена. Изменение может составлять всего лишь 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30% или 40%, 50%, 60% или даже достигать 75%, 80%, 90% или 100%.

Количество по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена в объединенном образце экскрементов коррелирует с общей нагрузкой соответствующего патогена в популяции животных. Повышение количества указанного по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени указывает на распространение или прогрессирование патогенной нагрузки. И наоборот, снижение количества по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени указывает на регрессию патогенной нагрузки (восстановление/излечение).

Вышеуказанный способ является особенно пригодным для выполнения прижизненной диагностики в полевых условиях.

В контексте настоящего изобретения по меньшей мере один патоген представляет собой патоген, связанный с инфекцией, обычно приобретаемой во время производства животноводческой продукции. По меньшей мере один патоген может представлять собой патогенный вид бактерий, патогенный вид вирусов и/или патогенный одноклеточный эукариотический организм.

Патогенные виды бактерий могут представлять собой, например, такие виды, как Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Salmonella, патогенный для птиц вид E. coli, Mycoplasma spp., Mycobacterium avium и/или Pasteurella multocida.

Патогенные виды вирусов могут представлять собой, например, вирус африканской чумы свиней, вирус Акабане, лиссавирус австралийских летучих мышей, вирус птичьего гриппа, птичий парамиксовирус, вирусы птичьей оспы, вирус блютанга, вирус пограничной болезни, вирус эфемерной лихорадки крупного рогатого скота, вирус парагриппа крупного рогатого скота, парвовирус крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, вирус артрита и энцефалита коз и овец, вирус анемии цыплят, вирус классической чумы свиней, вирус герпеса лошадей, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус гриппа лошадей, вирус вирусного артериита лошадей, вирус ящура, вирус Хендра, вирус герпеса, вирус инфекционного бурсита, вирус болезни Марека, вирус болезни Ньюкасла, вирус Нипах, пестивирус, вирус бешенства, вирус лихорадки долины Рифт, вирус чумы, вирус анемии лосося, вирус чумы свиней, вирус свиного гриппа, вирус везикулярной болезни свиней, вирус везикулярной экзантемы, вирус везикулярного стоматита и/или вирус болезни белых пятен.

Патогенные одноклеточные эукариоты представляют собой, например, Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mitis, E. praecox, E. necatrix, E. brunetti или жгутиконосцы, например, Histomonas meleagridis, Chochlosoma spp.

В соответствии с настоящим изобретением мониторинг показателей нагрузки вышеуказанными патогенами можно осуществлять отдельно для каждого патогена или одновременно, т.е. с помощью мультиплексного тестирования.

Используемый в данном документе термин «популяция животных» относится к группе отдельных животных одного вида. Популяция животных может, например, представлять собой группу домашних питомцев или домашних животных, вовлеченных в разведение животных, группу выращиваемых на ферме животных, вовлеченных в производство животноводческой продукции или разведение скота, или группу дикоживущих животных или животных зоопарка.

В одном варианте осуществления популяция животных представляет собой поголовье животных, вовлеченных в процессы производства животноводческой продукции. Например, популяция животных или поголовье животных может представлять собой поголовье птиц; поголовье овец, коз или крупного рогатого скота, поголовье лошадей или поголовье свиней.

В одном конкретном варианте осуществления популяция животных представляет собой популяцию птиц.

Популяция животных может представлять собой поголовье птиц. Поголовье птиц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой домашнюю птицу. Предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашняя птица может иметь характеристики, оптимальные для получения поголовья молодняка. Данный тип домашней птицы также называется родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными, соответственно, являются (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.

Домашняя птица в соответствии с настоящим изобретением также может быть выбрана из декоративной птицы и пернатой дичи. Предпочтительной декоративной птицей или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.

Материал образца экскрементов может быть выбран из группы, состоящей из образцов помета, образцов жидкого навоза или образцов выводимых из организма экскрементов и их растворов/суспензий. В целом термин «помет» относится к смеси экскрементов животного с материалом подстилки. Более конкретно и в контексте настоящего изобретения термин «помет» относится к смесям выведенных из организма экскрементов и материала подстилки, которые обнаруживаются в загоне, клетке или на настиле. Термин «образцы жидкого навоза» относится к смешанным образцам экскрементов, содержащим фекалии и мочу.

В одном варианте осуществления материал объединенного образца экскрементов представляет собой фекалии. Материал объединенного образца экскрементов может, например, представлять собой объединенный образец фекалий, в частности объединенный образец фекалий, полученный от популяции птиц/поголовья птиц, такой как объединенный образец фекалий бройлеров.

В одном варианте осуществления материал объединенного образца на стадии (а) представляет собой смешанный образец, состоящий из случайно отобранных отдельных образцов экскрементов; в частности, смешанный образец, состоящий из отдельных образцов фекалий, полученных от популяции птиц/поголовья птиц, такого как поголовье бройлеров.

Образцы экскрементов, которые должны быть отобраны от конкретной популяции, в идеале отбирают в определенном количестве участков в пределах помещении для животных с получением объединенного образца, который является репрезентативным для популяции животных в целом.

Размер выборки (т.е. количество отбираемых образцов экскрементов; при этом каждый образец отбирают в определенном участке внутри помещения для животных) должен определяться с учетом фактической скученности содержания, т.е. с учетом фактического количества животных, принадлежащих к тестируемой популяции птиц.

Размер выборки можно рассчитать с помощью следующей формулы:

,

где

n₀ представляет собой рекомендованный размер выборки,

Z равняется 1,96 при доверительном уровне, составляющем 95%,

p представляет собой расчетную долю популяции, характеризующуюся наличием рассматриваемого атрибута, q равняется 1-p, и

e представляет собой доверительный интервал, выраженный в виде дроби.

В целом как минимум от 80 до 100 отдельных образцов экскрементов является достаточным для большинства популяций сельскохозяйственных птиц. Бройлеры обычно содержатся в поголовьях, которые состоят из >20000 птиц в одном помещении.

В качестве примера, для поголовья бройлеров из 20000 животных требуется 96 отдельных образцов при доверительном уровне, составляющем 95%.

Вышеуказанная формула особенно пригодна для определения размера выборки, необходимого для крупной популяции.

Для меньших популяций (≤100) рекомендованный размер выборки n₀, получаемый с помощью вышеуказанной формулы, может дополнительно корректироваться в соответствии со следующей формулой:

где

N представляет собой размер популяции, и

n представляет собой откорректированный размер выборки.

Для получения материала объединенного образца экскрементов, требуемого на стадии (a), могут быть применены несколько способов отбора образцов.

В одном варианте осуществления объединенный образец экскрементов может быть получен с помощью систематического отбора образцов по сетке (систематического случайного отбора образцов). Для осуществления этого способа пространство, в котором содержится популяция животных, делится на области, образующие сетку из однородных ячеек или подобластей, исходя из необходимого количества отдельных образцов экскрементов (т.е. размера выборки). Затем в пределах первой ячейки сетки определяют произвольный участок отбора образцов, и в указанном участке отбирают первый образец. Наконец, дополнительные образцы получают последовательно из соседних ячеек, например, змеевидным, угловым или зигзагообразным образом, с использованием такого же относительного местоположения в пределах каждой ячейки. Произвольная исходная точка может быть получена с помощью игральных костей или генератора случайных чисел.

Вышеуказанная процедура может необязательно повторяться для получения повторных выборок. Т.е. устанавливается новое произвольное положение для одной точки отбора, которое повторяется во всех ячейках. Путем анализа повторных выборок можно определить вариабельность оценки среднего значения, полученной с помощью исходных выборок.

Соответственно, вышеупомянутые способы могут дополнительно предусматривать следующие подстадии:

(a1) разделение помещения для животных или пространства, в котором популяция животных содержится, на области, образующие сетку из однородных ячеек;

(a2) определение по меньшей мере одного произвольного участка отбора образцов в пределах первой ячейки и сбор одного первого образца из указанного по меньшей мере одного участка отбора образцов; и

(a3) проведение последовательного отбора отдельных образцов экскрементов из оставшихся ячеек с использованием таких же относительных участков отбора образцов в пределах каждой ячейки;

и необязательно

(a4) повторение стадий (a2) и (a3) для получения по меньшей мере одной повторной выборки.

Размер выборки соответствует количеству ячеек в сетке в случае отбора одного образца на ячейку. В целом, в случае, если для каждой ячейки необходимо отбирать x образцов, размер выборки представляет собой количество ячеек, деленное на x.

Способ систематического отбора образцов по сетке можно легко реализовать в полевых условиях. Таким образом, можно избегать чрезмерной или недостаточной представленности подобластей. Паттерны систематического отбора образцов по сетке в соответствии с настоящим изобретением представлены в качестве примера на фиг. 1 и фиг. 2.

Другой способ отбора образцов представляет собой стратифицированный случайный отбор образцов (т.е. случайный отбор образцов в сетке). В данном случае образцы получают последовательно из соседних ячеек сетки, однако местоположение участка отбора образца в пределах каждой ячейки является случайным.

В качестве альтернативы образцы могут быть отобраны с помощью простого случайного отбора образцов, в случае чего образцы отбирают из случайных местоположений (без привязки к сетке) по всему пространству, в котором содержатся животные. Для этого способа необходимо использовать формальный подход для определения случайных местоположений отбора образцов, например на основе генератора случайных чисел.

Образцы можно отбирать вручную с помощью шпателя или аналогичного инструмента и сразу же переносить в сосуд или пробирку для сбора образцов.

В альтернативном варианте осуществления объединенный образец экскрементов может быть получен с использованием способа «галоши», осуществляемого путем обхода помещения с использованием маршрута, который обеспечит получение репрезентативных образцов для всех частей помещения или соответствующего сектора. Такой маршрут может, например, иметь равномерную форму змеевидных или извилистых линий, угловых линий или зигзагообразных линий. Бахилы для сбора образцов с пола, обладающие достаточными поглощающими свойствами для впитывания влаги, являются особенно подходящими. Однако трубчатые марлевые чулки также являются приемлемыми.

Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения массы образца составляют, например, от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.

Образец материала, полученный на стадии (a), может содержать гетерогенные компоненты, такие как использованный корм или материал помета, поэтому его необходимо гомогенизировать. Специалисту в данной области техники известны подходящие широко применяемые способы гомогенизации.

Водный буферный раствор, используемый на стадии (c) для разбавления и необязательно стабилизации материала объединенного образца, полученного на стадии (b), содержит буферный раствор, детергенты, денатурирующее средство и/или комплексообразующие средства. Предпочтительно указанный водный буферный раствор содержит хаотропные соли для химического разрушения клеток и для стабилизации и защиты нуклеиновых кислот от нуклеаз в растворе. Необязательно водный буферный раствор дополнительно содержит ингибиторы нуклеаз.

Стадия лизирования (d), предусматриваемая способом в соответствии с настоящим изобретением, может выполняться посредством химического лизирования или механического лизирования. Реагентами для химического лизирования являются, например, гуанидиниумтиоцианат. Механическое лизирование можно осуществить с помощью обработки образца гранулами, ультразвуком или Ultra turrax®.

Предпочтительно стадия (d) лизирования в соответствии с настоящим изобретением предусматривает как обработку с помощью механического лизирования, так и обработку с помощью химического лизирования.

В одном варианте осуществления стадия (d) лизирования предусматривает стадию (d1) нагревания, стадию (d2) измельчения и стадию (d3) центрифугирования. На стадии (d1) нагревания разбавленный материал образца нагревают до 60-80°C или 65-75°C в течение промежутка времени от 10 минут до 30 минут или от 15 минут до 25 минут. В качестве примера, разбавленный образец материала можно нагревать в течение 20 минут до 70°C. Стадия (d2) измельчения предусматривает обработку материала образца гранулами размером от 3 мм до 5 мм в зависимости от объема сосуда или пробирки для образца. Например, стадию измельчения можно проводить в пробирке объемом 50 мл с использованием от 4 до 7 гранул размером 4 мм. Стадия (d3) центрифугирования может, например, выполняться путем центрифугирования сосуда или пробирки для образца в течение 5 минут при 2000×g.

В одном варианте осуществления выделение нуклеиновой кислоты на стадии (е) выполняется путем экстракции с помощью магнитных гранул.

В одном варианте осуществления выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена на стадии (f) осуществляют с помощью qPCR. При количественном определении используются внешние откалиброванные стандарты для количественного определения. Результаты указываются в копиях/мкл (копий/г фекалий). qPCR проводится в разные моменты времени отбора образцов, получаемых от поголовья.

Способ выявления на основе qPCR в соответствии с настоящим изобретением может предусматривать мультиплексную амплификацию множества маркеров или целевых генов одновременно. В данной области техники хорошо известна процедура выбора праймеров для ПЦР, обеспечивающих получение продуктов ПЦР, которые не перекрываются по размеру и могут анализироваться одновременно. В качестве альтернативы можно амплифицировать различные маркеры или целевые гены с помощью праймеров, которые были подвергнуты дифференциальному мечению и, таким образом, могут быть подвергнуты дифференциальному обнаружению.

Вышеуказанные способы можно применять для определения необходимости в проведении кормовых вмешательств или медицинских вмешательств или в качестве альтернативы для контроля эффективности кормовых вмешательств или медицинских вмешательств. Увеличение нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных может указывать на необходимость проведения кормовых или медицинских вмешательств. После проведения вмешательств эффективность вмешательства может быть подтверждена вышеуказанными способами мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции животных. Если вмешательство окажется эффективным, следует ожидать снижения нагрузки по меньшей мере одним патогеном.

Кормовые вмешательства или медицинские вмешательства, предпринимаемые для борьбы с прогрессированием инфекций, приобретаемых во время производственного процесса, включают, среди прочего, скармливание или введение лечебно-профилактических веществ, таких как зоотехнические кормовые добавки или терапевтические средства.

Выражение «введение» или связанные с ним выражения включают пероральное введение. Пероральное введение может осуществляться с помощью питьевой воды, зонда для перорального введения, распыляемого аэрозоля или корма для животных. Термин «зоотехническая кормовая добавка» относится к любой добавке, используемой для положительного воздействия на продуктивность здоровых животных или используемой для положительного воздействия на окружающую среду. Примерами зоотехнических кормовых добавок являются усилители перевариваемости, т.е. вещества, которые при скармливании животным повышают перевариваемость рациона за счет воздействия на целевые кормовые материалы; стабилизаторы кишечной микрофлоры; микроорганизмы или другие вещества с химически установленным составом, которые при скармливании животным проявляют положительный эффект в отношении микрофлоры кишечника; или вещества, которые положительно воздействуют на окружающую среду. Предпочтительно лечебно-профилактические вещества выбраны из группы, состоящей из пробиотических средств, пребиотических средств, лекарственных средств на основе растительного сырья, органических/жирных кислот, цеолитов, бактериофагов и бактериолитических ферментов или любых их комбинаций.

Терапевтические средства представляют собой, например, антибиотики или противовоспалительные средства.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ получения объединенного образца экскрементов, являющегося репрезентативным для популяции животных в целом, т.е. представляющего общую патогенную нагрузку в популяции животных, при этом способ включает:

(a1) разделение помещения для животных или пространства, в котором популяция животных содержится, на области, образующие сетку из однородных ячеек;

(a2) определение по меньшей мере одного произвольного участка отбора образцов в пределах первой ячейки и сбор одного первого образца из указанного по меньшей мере одного участка отбора образцов; и

(a3) проведение последовательного отбора отдельных образцов экскрементов из оставшихся ячеек с использованием таких же относительных участков отбора образцов в пределах каждой ячейки;

и необязательно

(a4) повторение стадий (a2) и (a3) для получения по меньшей мере одной повторной выборки.

Необходимый размер выборки (т.е. общее количество отбираемых образцов) может быть определен с помощью следующей формулы:

,

где

n₀ представляет собой рекомендованный размер выборки,

Z равняется 1,96 при доверительном уровне, составляющем 95%,

p представляет собой расчетную долю популяции, характеризующуюся наличием рассматриваемого атрибута, q равняется 1-p, и

e представляет собой доверительный интервал, выраженный в виде дроби.

В целом как минимум от 80 до 100 отдельных образцов экскрементов является достаточным для большинства популяций сельскохозяйственных птиц. В качестве примера, для поголовья бройлеров из 20000 животных требуется 96 отдельных образцов при доверительном уровне, составляющем 95%.

Размер выборки соответствует количеству ячеек в сетке в случае отбора одного образца на ячейку. В целом, в случае, если для каждой ячейки необходимо отбирать x образцов, размер выборки представляет собой количество ячеек, деленное на x.

Вышеуказанные способы отбора образцов могут применяться в процедурах или способах определения наличия по меньшей мере одного конкретного патогена или мониторинга показателя его нагрузки в популяции животных.

Вариантами применения способов в соответствии с настоящим изобретением являются, например, (i) содействие диагностированию и/или прогнозированию течения инфекций, приобретаемых во время процесса производства; (ii) контроль прогрессирования или повторного возникновения этих инфекций или (iii) содействие в оценке эффективности лечения популяции животных, которую подвергают лечению или в отношении которой предполагается проведение лечения.

Варианты применения настоящего изобретения, в частности, помогают избежать снижения показателей продуктивности животных, как, например, прироста массы тела и конверсии корма.

Далее настоящее изобретение проиллюстрировано неограничивающими примерами и иллюстративными вариантами осуществления.

Примеры

C. perfringens использовали в качестве иллюстративного патогена, подлежащего выявлению в популяции птиц. netB и cpa выступают в качестве целевых генов и играют определяющую роль в развитии некротического энтерита птиц.

Приблизительно 20000 бройлеров случайным образом распределяли по бройлерным птичникам в рамках обычных проводимых компанией процедур по размещению кур в соответствии с сертифицированной программой Американской ассоциации гуманности, которая ограничивает плотность размещения до 6,2 фунта/квадратный фут при убое, включая выполнение основных требований к содержанию и контролю. Все поголовья содержали в соответствии со стандартными протоколами компании, которые соответствуют рекомендациям заводчиков по освещению, температуре и вентиляции. Корма состояли из основного рациона (кукуруза и соя), скорректированного с учетом потребностей птиц для стартерных, ростовых и финишных кормов. Ежедневно контролировали общие условия содержания поголовья: доступность корма и воды, температурный контроль и любые нестандартные условия. Мертвых птиц извлекали и вскрывали с определением причины смерти, а истощенных птиц умерщвляли, чтобы избавить их от дальнейших страданий.

Отбор образцов

Образцы фекалий и данные о продуктивности поголовья для нескольких стандартных производственных процессов бройлеров в живом виде собирали ежедневно с дня 13 по день 24 и с дня 15 по день 22 соответственно.

В каждый момент времени или событие отбора 24 отдельных образца отбирали из каждого квадранта помещения с помощью пластмассовых щипцов, проходя через каждый квадрант по зигзагообразному маршруту. Чтобы избежать перекрестной контаминации образцов, для каждого помещения использовали новые стерильные щипцы, а также соблюдали предписанные меры биобезопасности. Кроме того, мусор, такой как деревянная стружка, помет и т.д., удаляли из образцов до того, как все образцы из 4 квадрантов смешивали для получения одного объединенного образца (состоящего из 96 отдельных образцов фекалий) в стерильном пакете для сбора образцов. Образцы помещали на лед и переносили в лабораторию для хранения при -80°C.

Экстракция ДНК

Каждому пакету с объединенными 96 образцами давали медленно оттаять при комнатной температуре; затем фекалии переносили в стерильный контейнер и тщательно перемешивали стерильным шпателем для отдавливания языка. Пять (5) граммов гомогенизированного образца переносили в запатентованную пробирку для сбора образцов, содержащую 20 мл стабилизирующего буфера и стеклянные гранулы. Образцы фекалий в пробирках для отбора образцов сохраняют стабильность в течение периода до 7 дней при температуре от +15°C до +30°C.

Пробирку, содержащую образец фекалий, инкубировали при 70°C в течение 20 минут на водяной бане. Затем пробирку переносили в мельницу Poly Mix (взбиватель с гранулами) для гомогенизации при 20 Гц в течение 15 минут. По окончании гомогенизации образец центрифугировали при 2000 g в течение 5 минут и 500 мкл супернатанта использовали для экстракции ДНК. Экстракцию ДНК проводили с помощью системы King Fisher Flex (Thermo Fisher, США) в соответствии с протоколом запатентованного набора для экстракции фекалий, доступного от Evonik.

Инструмент King Fisher подготавливали путем загрузки предварительно заданной программы («Cper_Extraction_01»), определяющей различные стадии процедуры экстракции; наконечники для отбора образцов, планшет для элюирования ДНК, планшеты для промывки и планшет для образцов подготавливали, как описано ниже.

Гребенку с 96 наконечниками вставляли в пустой планшет с глубокими лунками и помещали в устройство. После этого в планшет для элюирования вносили 100 мкл буфера для элюирования, и этот планшет также помещали в устройство. Кроме того, 500 мкл промывочных буферов 3, 2 и 1 помещали в каждую лунку 3 разных промывочных планшетов соответственно, и эти планшеты помещали в устройство в том же порядке. Наконец, в каждую лунку планшета для образцов добавляли 300 мкл буфера для лизиса, 25 мкл магнитных гранул, 20 мкл энхансера, 10 мкл внутреннего контроля и 500 мкл супернатанта из образца фекалий. После размещения планшета для образцов в устройстве экстракцию начинали нажатием кнопки запуска.

Количественное определение ДНК

Для количественного определения маркеров в ДНК 20 мкл мастер-микса, состоящего из 5 мкл компонента A мастер-микса, 15 мкл компонента B мастер-микса и 1 мкл IC (внутреннего контроля), получали в соответствии с инструкцией к запатентованному набору для ПЦР-анализа в реальном времени от Evonik Nutrition & Care GmbH для каждой реакции. Получали достаточное количество мастер-микса для того, чтобы обеспечить анализ всех образцов, контролей без матрицы (NTC) и 4 стандартов (от S1 до S4) в двух повторностях. 20 мкл мастер-микса вносили в отдельные лунки 96-луночного планшета. Затем в каждую лунку переносили 10 мкл образца экстрагированной ДНК. В каждую стандартную лунку переносили 10 мкл соответствующего стандарта и 1 мкл IC соответственно. Для получения NTC в каждую лунку для NTC переносили 10 мкл стерильной воды, не содержащей нуклеаз, и 1 мкл IC. Содержимое планшета тщательно перемешивали с помощью многоканальной пипетки, и планшет запечатывали фольгированной пленкой Clear Weld Seal Mark II. Планшет центрифугировали в течение 30 секунд при 1000g (~3000 об/мин). Наконец, планшет подвергали анализу в устройстве для ПЦР в реальном времени CFX96 (Bio Rad, Германия) со следующими условиями ПЦР: 45 циклов денатурации при 95°C в течение 15 секунд, отжиг при 58°C в течение 45 секунд и достройка при 72°C в течение 15 секунд. Данные получали во время фазы амплификации цикла QPCR. В конце цикла данные, полученные с помощью CFX96 от BioRad предварительно обрабатывали с помощью CFX Manager 3.1 от Bio-Rad и экспортировали в Excel 2013 для дальнейшего анализа. Количественное определение маркеров в образцах проводили с помощью стандартной кривой, построенной с использованием стандартных растворов (от S1 до S4), содержащих равные концентрации обеих мишеней. Концентрации netB в S1, S2, S3 и S4 составляли 10⁴ копий/мкл, 10³ копий/мкл, 10² копий/мкл и 10¹ копий/мкл соответственно. Логарифмические показатели для стандартов откладывали на оси x, тогда как Ct (значения порогового цикла) откладывали на оси y. Полученную линию линейной регрессии [y=mx+b или Ct=m (log количества)+b] использовали для определения концентраций мишеней в тестируемом образце.

Перечень праймеров и зондов, используемых в ходе qPCR для количественного определения уровней экспрессии netB

Мишень Праймеры и зонды (где применимо) Репортер для зонда

netB Прямой: 5'-TATACTTCTAGTGATACCGC-3'

(SEQ ID NO.: 1)

Обратный: 5'-ATCAGAATGAGGATCTTCAA-3'

(SEQ ID NO.: 2)

Зонд: 5'-TCACATAAAGGTTGGAAGGCAAC-3' FAM

(SEQ ID NO.: 3)

Наличие вспышки некротического энтерита устанавливали на основе диагноза ветеринарного врача (при вскрытии) на 16 день.

Перечень праймеров и зондов, используемых в ходе qPCR для количественного определения уровней экспрессии cpa

Мишень Праймеры и зонды (где применимо) Репортер для зонда

cpa Прямой: 5'-TACATATCAACTAGTGGTGA-3'

(SEQ ID NO.: 4)

Обратный: 5'-ATTCTTGAGTTTTTCCATCC-3'

(SEQ ID NO.: 5)

Зонд: 5'-TGGAACAGATGACTACATGTATTTTGG-3' Cy5

(SEQ ID NO.: 6)

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Эвоник Дегусса ГмбХ

<120> Осуществляемый in vitro способ мониторинга патогенной нагрузки в

популяции животных

<130> 201800008

<160> 6

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (прямой)

<400> 1

tatacttcta gtgataccgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (обратный)

<400> 2

atcagaatga ggatcttcaa 20

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 3

tcacataaag gttggaaggc aac 23

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 4

tacatatcaa ctagtggtga 20

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 5

attcttgagt ttttccatcc 20

<210> 6

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 6

tggaacagat gactacatgt attttgg 27

201800008 Ausland 9

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности способу мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции птиц, при этом способ включает следующие стадии: отбор и объединение материала образцов экскрементов, полученных от популяции птиц; гомогенизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (a); разбавление и необязательно стабилизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (b), с использованием водного буферного раствора; лизирование клеточного материала, содержащегося в разбавленном материале образца, полученном на стадии (c); выделение материала, представляющего собой нуклеиновые кислоты, из лизированного материала образца, полученного на стадии (d); выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена или его функционального фрагмента, содержащегося в изоляте нуклеиновых кислот, полученном на стадии (e); повторение стадий (a)–(f) через последовательные промежутки времени и отслеживание изменений количества по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени. 4 н. 11 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Осуществляемый in vitro способ мониторинга нагрузки по меньшей мере одним патогеном, выбранным из патогенных видов бактерий и/или патогенных одноклеточных эукариот, в популяции птиц, при этом способ включает следующие стадии:

(a) отбор и объединение материала образцов экскрементов, полученных от популяции птиц;

(b) гомогенизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (a);

(c) разбавление и необязательно стабилизацию материала объединенного образца, полученного на стадии (b), с использованием водного буферного раствора;

(d) лизирование клеточного материала, содержащегося в разбавленном материале образца, полученном на стадии (c);

(e) выделение материала, представляющего собой нуклеиновые кислоты, из лизированного материала образца, полученного на стадии (d);

(f) выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена или его функционального фрагмента, содержащегося в изоляте нуклеиновых кислот, полученном на стадии (e);

(g) повторение стадий (a)-(f) через последовательные промежутки времени; и

(h) отслеживание изменений количества по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена с течением времени.

2. Способ по п. 1, где популяция птиц представляет собой стадо домашней птицы.

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере один патоген представляет собой патогенный вид бактерий.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где изменения показателей нагрузки более чем одним патогеном отслеживают одновременно.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где материал образца экскрементов выбран из группы, состоящей из образцов помета, образцов жидкого навоза или образцов выводимых из организма экскрементов и их растворов/суспензий.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где материал образца представляет собой фекалии.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где материал объединенного образца, полученный на стадии (a), представляет собой смешанный образец, полученный из отдельных образцов экскрементов.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где размер выборки, необходимый для конкретной популяции, определяют с использованием следующей формулы:

,

при этом

n₀ представляет собой рекомендованный размер выборки,

Z равняется 1,96 при доверительном уровне, составляющем 95%,

p представляет собой расчетную долю популяции, характеризующуюся наличием рассматриваемого атрибута, q равняется 1-p, и

e представляет собой доверительный интервал, выраженный в виде дроби.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где материал объединенного образца из стадии (а) получают путем

(a1) разделения помещения для животных или пространства, в котором популяция животных содержится, на области, образующие сетку из однородных ячеек;

(a2) определения по меньшей мере одного произвольного участка отбора образцов в пределах первой ячейки и сбора одного первого образца из указанного по меньшей мере одного участка отбора образцов; и

(a3) проведения последовательного отбора отдельных образцов экскрементов из оставшихся ячеек с использованием таких же относительных участков отбора образцов в пределах каждой ячейки;

и необязательно

(a4) повторения стадий (a2) и (a3) для получения по меньшей мере одной повторной выборки.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где водный буферный раствор, используемый на стадии (c), содержит хаотропные соли.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия (d) лизирования предусматривает стадию (d1) нагревания, стадию (d2) измельчения и стадию (d3) центрифугирования.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выявление и количественное определение по меньшей мере одного патогенспецифического целевого гена на стадии (f) осуществляют с помощью qPCR.

13. Применение способа по любому из пп. 1-12 для мониторинга изменений показателя нагрузки по меньшей мере одним патогеном в популяции птиц с течением времени.

14. Применение способа по любому из пп. 1-12 для определения необходимости в проведении кормовых вмешательств или медицинских вмешательств.

15. Применение способа по любому из пп. 1-12 для контроля эффективности кормовых вмешательств или медицинских вмешательств.