ГОМОДЕТНЫЕ ЦИКЛИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ, ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННО ВОЗДЕЙСТВУЮЩИЕ НА ИНТЕГРИН α4β7 Российский патент 2022 года по МПК C07K7/64 C07K7/54 A61K38/12 A61P29/00 A61P37/06 

РОДСТВЕННЫЕ 3АЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/504309, поданной 10 мая 2017 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ И3ОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к антагонистам интегрина α4β7 и, в частности, к циклическим пептидным антагонистам.

УРОВНЕНЬ ТЕХНИКИ

Интегрины представляют собой трансмембранные рецепторы, которые являются мостиками для взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс (ЕСМ). Целеноправленное воздействие на интегрины приводит к возникновению химических путей внутрь (трансдукция сигнала), например, химического состава и механического состояния ЕСМ.

Интегрины представляют собой облигатные гетеродимеры, имеющие две разные цепи: α (альфа) и β (бета) субъединицы.

Интегрин α4β7 экспрессируется на лимфоцитах и отвечает за хоминг Т-клеток в лимфоидные ткани, связанные с кишечником, посредством его связывания с молекулой клеточной адгезии типа «аддрессин» в слизистых оболочках (MAdCAM), которая присутствует в венах с высоким содержанием эндотелия слизистых лимфоидных органов.

Было показано, что ингибиторы специфических взаимодействий интегрин-лиганд эффективны в качестве противовоспалительных агентов для лечения различных аутоиммунных заболеваний. Например, мо но тональные антитела, проявляющие высокую аффинность связывания с α4β7, продемонстрировали терапевтические преимущества при желудочно-кишечных ауто-воспалительных/аутоиммунных заболеваниях, таких как болезнь Крона и язвенный колит.

Существует необходимость в разработке улучшенных антагонистов α4β7 для предотвращения или лечения воспалительных состояний и/или аутоиммунных заболеваний.

Некоторые способы получения циклических пептидов (нацеллинов) описаны в публикации РСТ, составленной заявителем, № WO 2010/105363. Нацеллиновые антагонисты интегрина α4β7 описаны в заявке на патент РСТ, составленной заявителем, № РСТ/СА 2016/000274. Мультимерные нацеллиновые антагонисты интегрина α4β7 описаны в предварительной заявке на патент США, составленной заявителем, №62/421117.

СУЩНОСТЬ И3ОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте предложено соединение формулы (I):

где

R¹ представляет собой Н; низший алкил; арил; гетероарил; алкенил; или гетероцикл; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей;

R² и R³ каждый независимо представляет собой аминокислотную цепь протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, при условии, что R² и R³ могут быть ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца или могут быть ковалентно связаны с R¹ с образованием циклического вторичного амина,

R⁴ представляет собой Н, низший алкил, бензил, алкенил, низший алкилокси; арил; гетероарил; гетероцикл; -C(O)R****, где R**** независимо выбран из алкила, арила, гетероарила, амино, аминоалкила, аминоарила, аминогетероарила, алкокси, арилокси, гетероарилокси; -CH2C(O)R; или -C(O)Rc; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей,

или вместе с R⁵ или R⁶, циклическую боковую цепь протеи но генной или непротеиногенной аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, при этом протеиногенная или непротеиногенная аминокислота может быть замещена подходящим заместителем;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из аминокислотных боковых цепей протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, или могут образовывать циклическую боковую цепь с R⁴;

стереоцентры 1* и 2*, каждый, независимо выбраны из R и S; и

где Z представляет собой аминоконец аминокислоты; -С=O- смежный с L, представляет собой карбокси-конец аминокислоты; и L вместе с Z и -С=O- представляет собой пептид, имеющий следующую формулу:

X^y-X^z-X¹-Х²-Х³

где Х^у представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X^z отсутствует или представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X¹ представляет собой лейцин или трет-бутил-Ala;

X² представляет собой Asp; и

X³ представляет собой Thr, Ile, MeThr, alloThr, Abu, Thr(OBn), Val или аллоил.

В одном аспекте, предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение или мультимер, описанные в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном аспекте, предложен способ лечения воспаления или аутоиммунного заболевания у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента состояния, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента заболевания или состояния, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом указанное заболевание или состояние представляет собой локальное или системное заражение вирусом или ретровирусом.

В одном аспекте, предложен способ лечения у пациента заболевания или состояния, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом заболевание или состояние представляет собой гепатит А, В или С, печеночную энцефалопатию, неалкогольный стеатогепатит, цирроз печени, варикозное кровотечение, гемохроматоз, болезнь Вильсона, тирозинемию, дефицит альфа-1-антитрипсина, гепатоклеточную карциному, рак печени, первичный билиарный холангит, первичный склероз желчных путей, болезнь желчных протоков или аутоиммунный гепатит.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложены описанные в данном документе соединения или мультимеры для использования при лечении или профилактике заболеваний и состояний, указанных выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Эти и другие признаки предпочтительных вариантов осуществления изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, в котором делается ссылка на прилагаемые графические материалы и таблицы, где:

На Фиг. 1 проиллюстрированы типичные соединения 1-6 по данной заявке.

На Фиг. 2 проиллюстрированы типичные соединения 7-12 по данной заявке.

На Фиг. 3 проиллюстрированы типичные соединения 13-15 по данной заявке.

На Фиг. 4 проиллюстрированы типичные мультимерные соединения 16-17 по данной заявке.

На Фиг. 5 проиллюстрированы типичные мультимерные соединения 18-19 по данной заявке.

На Фиг. 6 проиллюстрирована способность соединений ингибировать адгезию клеточных линий человека, экспрессирующих интегрин α4β7, на планшетах, покрытых MAdCAM-1. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования адгезии клеток RPMI8866, экспрессирующих интегрин α4β7, с MAdCAM-1, нанесенным на планшеты. Столбики ошибок указывают стандартные отклонения.

На Фиг. 7 проиллюстрирована способность соединений ингибировать адгезию клеточных линий человека, экспрессирующих интегрин α4β7 на планшетах, покрытых VCAM-1. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования адгезии клеток RAMOS, экспрессирующих интегрин α4β7, с VCAM-1, нанесенным на планшеты. Столбики ошибок указывают стандартные отклонения.

На Фиг. 8 проиллюстрирована занятость рецепторов (RO) соединения, измеренная с использованием анализа смещения лиганда цельной крови. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования связывания MAdCAM с α4β7 Th клетками памяти в репрезентативном эксперименте. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение для дублирующих экспериментальных точек для соединения №16.

На Фиг. 9 проиллюстрирована занятость рецепторов (RO) соединения, измеренная с использованием анализа смещения лиганда цельной крови. Кривые зависимости реакции от дозы для ингибирования связывания MAdCAM с α4β7-негативными Th клетками памяти в репрезентативном эксперименте.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В нижеследующем описании изложены многочисленные конкретные подробности, чтобы обеспечить полное понимание данного изобретения. Однако понятно, что данное изобретение может быть осуществлено на практике без этих конкретных подробностей.

В одном аспекте предложено соединение формулы (I):

где

R¹ представляет собой Н; низший алкил; арил; гетероарил; алкенил; или гетероцикл; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей;

R² и R³ каждый независимо представляет собой аминокислотную цепь протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты,

при условии, что R² и R³ могут быть ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца или могут быть ковалентно связаны с R¹ с образованием циклического вторичного амина,

R⁴ представляет собой Н, низший алкил, бензил, алкенил, низший алкилокси; арил; гетероарил; гетероцикл; -C(O)R****, где R**** независимо выбран из алкила, арила, гетероарила, амино, аминоалкила, аминоарила, аминогетероарила, алкокси, арилокси, гетероарилокси; -CH₂C(O)R; или -C(O)Rc; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей, или вместе с R⁵ или R⁶, циклическую боковую цепь протеиногенной или непротеиногенной аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, при этом протеиногенная или непротеиногенная аминокислота может быть замещена подходящим заместителем;

R⁵ и R⁶ независимо выбраны из аминокислотных боковых цепей протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты, имеющей N-конец, представляющий собой N-R⁴, или могут образовывать циклическую боковую цепь с R⁴;

стереоцентры 1* и 2*, каждый, независимо выбраны из R и S; и

где Z представляет собой аминоконец аминокислоты; -С=O- смежный с L, представляет собой карбокси-конец аминокислоты; и L вместе с Z и -С=O- представляет собой пептид, имеющий следующую формулу:

X^y-X^z-X¹-Х²-Х³

где Х^у представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X^z отсутствует или представляет собой протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту;

X¹ представляет собой лейцин или трет-бутил-Ala;

X² представляет собой Asp; и

X³ представляет собой Thr, Ile, MeThr, alloThr, Abu, Thr(OBn), Val или аллоил.

Используемый в данном документе термин «аминокислота» относится к молекулам, содержащим аминогруппу, группу карбоновой кислоты и боковую цепь, которая варьируется. Предполагается, что аминокислота включает в себя не только двадцать аминокислот, обычно встречающихся в белках, но также нестандартные аминокислоты и производные неприродных аминокислот, известные специалистам в данной области техники, и поэтому включает в себя, но не ограничивается ими, альфа, бета и гамма-аминокислоты. Пептиды представляют собой полимеры по меньшей мере из двух аминокислот и могут включать в себя стандартные, нестандартные и неприродные аминокислоты. Пептид представляет собой полимер из двух или большего количества аминокислот. В данном документе используются следующие сокращения:

Подразумевается, что термин «подходящий заместитель», используемый в контексте данного изобретения, включает в себя независимо друг от друга Н; гидроксил; циано; алкил, например, низший алкил, например, метил, этил, пропил, н-бутил, трет-бутил, гексил и аналогичные заместители; алкокси, например, низший алкокси, например, метокси, этокси и аналогичные заместители; арилокси, например, фенокси и аналогичные заместители; винил; алкенил, например, гексенил и аналогичные заместители; алкинил; формил; галоалкил, например, низший галоалкил, который включает в себя CF₃, CCl₃ и аналогичные заместители; галид; арил, например, фенил и нафтил; гетероарил, например, тиенил и фуранил, и аналогичные заместители; амид, например, C(O)NR_aR_b, где R_a и R_b независимо выбраны из низшего алкила, арила или бензила, и аналогичные заместители; ацил, например, С(O)-С₆Н₅ и аналогичные заместители; сложный эфир, например, -С(O)ОСН₃ и аналогичные заместители; простые эфиры и тиоэфиры, например, О-Bn и аналогичные заместители; тиоалкокси; фосфин; и -NR_aR_b, где R_a и R_b независимо выбраны из низшего алкила, арила или бензила, и аналогичные заместители. Следует понимать, что подходящий заместитель, используемый в контексте данного изобретения, предназначен для обозначения заместителя, который не препятствует образованию желаемого продукта способами по данному изобретению.

Используемый в контексте данного изобретения термин «низший алкил», используемый в данном документе отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает ациклический, прямой или разветвленный алкильный заместитель, содержащий от одного до шести атомов углерода, и включает в себя, например, метил, этил, 1-метилэтил, 1-метилпропил, 2-метилпропил и аналогичный заместитель. В отношении числа атомов углерода следует понимать аналогичное использование термина для «низшего алкокси», «низшего тиоалкила», «низшего алкенила» и аналогичного заместителя. Например, «низший алкокси», используемый в данном документе, включает в себя метокси, этокси, трет-бутокси.

Термин «алкил» охватывает низший алкил, а также включает в себя алкильные группы, имеющие более шести атомов углерода, например, ациклические, линейные или разветвленные алкильные заместители, имеющие от семи до десяти атомов углерода.

Используемый в данном документе термин «арил», отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает ароматическую моноциклическую систему или ароматическую полициклическую систему. Например, термин «арил» включает в себя фенильное или нафтильное кольцо и может также включать в себя более крупные ароматические полициклические системы, например, флуоресцентные (например, антраценовые) или радиоактивные метки и их производные.

Используемый в данном документе термин «гетероарил», отдельно либо в комбинации с другим заместителем, означает 5, 6 или 7-членный ненасыщенный гетероцикл, содержащий от одного до 4 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, и которые образуют ароматическую систему. Термин «гетероарил» также включает в себя полициклическую ароматическую систему, содержащую 5, 6 или 7-членный ненасыщенный гетероцикл, содержащий от одного до 4 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы.

Используемый в данном документе термин «циклоалкил», отдельно или в комбинации с другим заместителем, означает циклоалкильный заместитель, который включает в себя, но не ограничивается ими: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Используемый в данном документе термин «циклоалкил-алкил-» означает алкильный радикал, с которым непосредственно связан циклоалкильный радикал; и включает в себя, но не ограничивается ими: циклопропилметил, циклобутилметил, циклопентилметил, 1-циклопентилэтил, 2-циклопентилэтил, циклогексилметил, 1-циклогексилэтил и 2-циклогексилэтил. Аналогичное использование в данном документе терминов «алкил» или «низший алкил» следует понимать для арилалкила-, арил-низшего алкила- (например, бензила), низшего алкил-алкенила (например, аллила), гетероарил-алкила- и аналогичных заместителей. Например, термин «арил-алкил-» означает алкильный радикал, с которым связан арил. Примеры арил-алкилов- включают в себя, но не ограничиваются ими: бензил (фенилметил), 1-фенилэтил, 2-фенилэтил и фенилпропил.

Используемый в данном документе термин «гетероцикл», отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает одновалентный радикал, полученный посредством удаления водорода из трех- или семичленного насыщенного или ненасыщенного (включая ароматическое) циклического соединения, содержащего от одного до четырёх гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Примеры таких гетероциклов включают в себя, но не ограничиваются ими: азиридин, эпоксид, азетидин, пирролидин, тетрагидрофуран, тиазолидин, пиррол, тиофен, гидантоин, диазепин, имидазол, изоксазол, тиазол, тетразол, пиперидин, пиперазин, гомопиперидин, гомопиперазин, 1,4-диоксан, 4-морфолин, 4-тиоморфолин, пиридин, пиридин-N-оксид или пиримидин и аналогичные гетероциклы.

Термин «алкенил», используемый в данном документе, отдельно либо в комбинации с другим радикалом, предназначен для обозначения ненасыщенного ациклического радикала с прямой цепью, содержащего два или большее количество атомов углерода, по меньшей мере два из которых связаны друг с другом двойной связью. Примеры таких радикалов включают в себя, но не ограничиваются ими: этенил (винил), 1-пропенил, 2-пропенил и 1-бутенил.

Используемый в данном документе термин «алкинил» предназначен для обозначения ненасыщенного ациклического радикала с прямой цепью, содержащего два или большее количество атомов углерода, по меньшей мере два из которых связаны друг с другом тройной связью. Примеры таких радикалов включают в себя, но не ограничиваются ими: этинил,1-пропинил, 2-пропинил и 1-бутинил.

Используемый в данном документе термин «алкокси», отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает радикал -O-(С_1-n)алкил, где алкил имеет значения, указанные выше, и содержит 1 или большее количество атомов углерода, и включает в себя, например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1-диметилэтокси. В случае если n равен 1-6, термин «низший алкокси» применяется как отмечено выше, при этом термин «алкокси» охватывает «низший алкокси», а также алкоксигруппы, где n больше 6 (например, n=7-10). Термин «арилокси», используемый в данном документе отдельно либо в комбинации с другим радикалом, означает -О-арил, где арил имеет значения, указанные выше.

3ащитная группа представляет собой заместитель, введенный в молекулу для получения хемоселективности в последующей химической реакции. Многие защитные группы известны в данной области техники, и специалист в данной области техники должен понимать виды защитных групп, которые могут быть включены и могут быть использованы вместе со способами, описанными в данном документе. В «синтезе пептидов на основе защитных групп», как правило, в твердофазном синтезе пептидов, желаемый пептид получают посредством поэтапного добавления аминокислотных фрагментов к строящейся пептидной цепи. Два наиболее широко используемых протокола в твердофазном синтезе применяют трет-бутилоксикарбонил (Boc) или 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) в качестве аминозащитных групп. Аминозащитные группы, в целом, защищают аминогруппу от нежелательных реакций в процессе методов синтеза и могут быть впоследствии удалены для обнаружения амина. Широко используемые аминозащитные группы описаны в Greene, Т. W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons (1999). Аминозащитные группы включают в себя ацильные группы, например, формил, ацетил, пропионил, пивалоил, трет-бутилацетил, 2-хлорацетил, 2-бромацетил, трифторацетил, трихлорацетил, о-нитрофеноксиацетил, альфа-хлорбутирил, бензоил, 4-хлорбензоил, 4-бромбензоил, 4-нитробензоил и аналогичные группы; сульфонильные группы, например, бензолсульфонил, п-толуолсульфонил и аналогичные группы; алкокси- или арилоксикарбонильные группы (которые образуют уретаны с защищенным амином), например, бензилоксикарбонил (Cbz), п-хлорбензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, 2,4-диметоксибензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, 2-нитро-4,5-диметоксибензилоксикарбонил, 3,4,5-триметоксибензилоксикарбонил, 1-(п-бифенилил)-1-метилэтоксикарбонил, альфа-, альфа-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил (Boc), диизопропилметоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этоксикарбонил, метоксикарбонил, аллилоксикарбонил (Alloc), 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, 2-триметилсилилэтилоксикарбонил (Теос), феноксикарбонил, 4-нитрофеноксикарбонил, флуоренил-9-метоксикарбонил (Fmoc), циклопентилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, фенилтиокарбонил и аналогичные группы; аралкильные группы, например, бензил, трифенилметил, бензилоксиметил и аналогичные группы; а также силильные группы, например, триметилсилил и аналогичные группы. Аминозащитные группы также включают в себя циклические аминозащитные группы, например, фталоил и дитиосукцинимидил, которые включают аминный азот в гетероцикл. Как правило, аминозащитные группы включают в себя формил, ацетил, бензоил, пивалоил, трет-бутилацетил, фенилсульфонил, Alloc, Теос, бензил, Fmoc, Boc и Cbz. Обычный специалист может выбрать и использовать подходящую аминозащитную группу для выполнения задачи синтеза.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R¹ представляет собой Н. В других вариантах осуществления изобретения R² или R³ ковалентно связаны с R¹ с образованием пролина, имеющего NR¹ в качестве N-конца.

В некоторых вариантах осуществления изобретения как R², так и R³ не представляют собой Н.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² и R³ каждый независимо выбран из группы, состоящей из аминокислотных цепей протеиногенных или непротеиногенных альфа-аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² и R³ представляют собой Н и СН₃, соответственно, или в обратном порядке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R² или R³ представляет собой -CH₂-S-R^s, где R^s выбран из низшего алкила; низшего аминоалкила; арила; гетероарила; алкенила; или гетероцикла; все из которых необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемых положений одним или большим количеством подходящих заместителей; предпочтительно R^s представляет собой фенил или фенил, замещенный низшим алкилом, галогеном; или низший аминоалкил.

В некоторых вариантах осуществления изобретения R⁴ представляет собой Н. В других вариантах осуществления изобретения R⁴ и либо R⁵ либо R⁶ образуют кольцо, в результате чего остаток пролина имеет N-R⁴ в качестве N-конца.

В некоторых вариантах осуществления изобретения n равен 1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Z вместе с L и -С=O является таким, как показано в любом из соединений 1-19.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X¹ представляет собой Leu.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X² представляет собой Asp.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Thr.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Val.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X³ представляет собой Ile.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у и X^z каждый независимо представляет собой протеиногенную или непротеиногенную альфа-аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z представляет собой протеиногенную или непротеиногенную бета-аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у и X^z, каждый, представляет собой первичную аминокислоту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Х^у представляет собой (1,2-цис-АСНС), (2,4-дихлор-MePhe), (2,4-дихлор-Phe), (2-аминометил-dPhe), (2-аминометил-Phe), (2-аза-Phe), (2-бром-Phe), (2-CF3-Phe), (2-хлор-Phe), (2-фтор-MePhe), (2-фтор-Phe), (2-йод-dPhe), (2-йод-Phe), (2-фенил-dPhe), (2-фенил-Phe), (3,3-дифенил-Ala), (3,4,5-трифтор-Phe), (3,4-диметокси-Phe), (3,5-дибром-Tyr), (3-аминометил-4-бромбензойную кислоту), (3-аминометил-4-морфолинилбензойную кислоту), (3-аминометил-4-пиперидинилбензойную кислоту), (3-аминометил-5-бромбензойную кислоту), (3-аминометил-6-бромбензойную кислоту), (3-аминометилбензойную кислоту), (3-аминометил-dPhe), (3-аминометил-Phe), (3-аза-dPhe), (3-аза-Phe), (3-бензотиенил-Ala), (3-бензотиенил-dAla), (3-йод-Phe), (3-фенил-dPhe), (3-фенил-Phe), (4-амино-dPhe), (4-аминометил-dPhe), (4-аминометил-Phe), (4-аминометил-Phe)-восстановленный, (4-амино-Phe), (4-аза-dPhe), (4-аза-Phe), (4-гуанидино-Phe), (4-йод-Phe), (N-бензил-3-аминометилбензойную кислоту), (N-бензил-Gly), (N-метил-3-аминометилбензойную кислоту), (пиперидин-4-амино-4-карбоновую кислоту), (винил-Br-Leu), [(2-пиперазинил-2-фенил)-Phe], [(2-пиперазинил-2-фенил)-Phe], [1-(S)-изоиндолинкарбоновую кислоту], [2-(2,5-диметилизоксазол)-dPhe], [2-(2,5-диметилизоксазол)-Phe], [2-(2,6-диметилфенил)-Phe], [2-(2-бром-3-пиридил)-Phe], [2-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [2-(2-метоксифенил)-Phe], [2-(2-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(2-трифторметоксифенил)-dPhe], [2-(3-бром-2-пиридил)-Phe], [2-(3-метоксифенил)-Phe], [2-(3-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(3-пиридил)-Phe], [2-(3-хинолинил)-Phe], [2-(4-метоксифенил)-Phe], [2-(4-пиридил)-4-тиазолил-Ala], [2-(4-пиридил)-Phe], [2-(4-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-MePhe], [2-(5-хинолинил)-Phe], [2-(5-хинолинил)-Phe]-восстановленный, [2-(аминобензил)-4-тиазолил-Ala], [2-(бензотиазол-5-ил)-Phe], [2-[2,5-бис(трифторметил) фенил]-Phe], [2-[3-(1-пиперазинил)фенил]-Phe]-бетагомоLys, [2-[4-(1-пиперазинил)фенил]-Phe], [2-йод-Phe], [3-(2,6-диметоксифенил)-dPhe], [3-(2,6-диметоксифенил)-Phe], [3-(2,6-диметилфенил)-Phe], [3-(2-аминобензил-4-тиазолил)-Ala], [3-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [3-(2-метоксифенил)-dPhe], [3-(2-метоксифенил)-Phe], [3-(2-тиенил)-dAla, [3-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [3-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [3-(3,4-дифторфенил)-Phe], [3-(3'-пиридил)-Ala], [3-(4-хинолинил)-dPhe], [3-(4-тиазолил)-Ala], [3-(4-тиазолил)-Ala]-восстановленный, [3-(4-тиазолил)-dAla], [3-(5-хинолинил)-dPhe], [3-(бензотиазол-5-ил)-Phe], [3-(хинолин-4-ил)-Phe], [3-аминометил-(4-метилпиразол-3-ил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметоксифенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметил-изоксазол)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2-аминометилфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2-фторпиридил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-аминометилфенил) бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-CF3-фенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-N,N-диметиланилин)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-N,N-диметилдиариловый эфир)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-хинолинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(3-тиофенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-аминометилфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-карбокси)-фенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-гидроксифенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-N,N-диметилкарбоксамидфенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-пиридил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(4-хинолинил)]-бензойную кислоту, [3-аминометил-4-(5-пиримидинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(5-хинолинил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(N,N-диметил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(пиперонил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[(2,3,4-триметокси)-фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[2-(1-пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[2-(3-(пиперидин-4-илметокси)) фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[3-(1-пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1 -пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1 -пиперазинил)-фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1-пиперазинил-4-AlexaFluor 647)фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[4-(1-пиперазинил-4-FITC) фенил]-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-[5-(2,4-диметил)тиазол]-бензойную кислоту], [3-аминометил-5-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [4-(2,6-диметилфенил)-Phe], [4-(2-хлор-6-метоксифенил)-Phe], [4-(2-метоксифенил)-Phe], [4-(2-трифторметоксифенил)-Phe], [N-метил-3-аминометил-4-(4-хинолинил)-бензойную кислоту], 1Nal, 2lgl, 2Nal, Aic, альфаМеPhe, Atc, бетагомоLys, бетаhomoMet, бетаНоmоPhe, Bip, Cha, Chg, циклоLeu, d2lgl, Dap(Cbz), dArg, dгомоPhe, dLys, dMet, dNle, dOrn, dOrn(диметил), dPip, dPro, dSer(OBn), dTic, dTiq, dTrp, dTyr, dTyr(ОАллил), dTyr(OBn), F, H, His(Bn), гомоPhe, Hyp, Hyp(OBn), Igl, K, M, MeMet, MePhe, метаY(Opr), MeTyr, Nva, Orn(ацетамид), Orn(бензамид), Orn(этилкарбамат), Orn(метансульфонамид), Orn(пентиламид), Р, Phe-восстановленный, Pip, R, Tic, Tyr(2-метоксидиариловый эфир), Tyr(2-толилдиариловый эфир), Tyr(3,4-дифтордиариловый эфир), Tyr(3,4-диметилдиариловый эфир), Tyr(3-CO2Me диариловый эфир), Tyr(3-фтордиариловый эфир), Tyr(3-метоксидиариловый эфир), Tyr(3-метилдиариловый эфир), Tyr(4-CF3 диариловый эфир), Tyr(4-CO2H диариловый эфир), Tyr(4-CO2Me диариловый эфир), Tyr(4-фтордиариловый эфир), Tyr(4-метоксидиариловый эфир), Tyr(ОАллил), Tyr(OPh), W или Y.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z представляет собой dThr, Р, dPro, Sar, циклоLeu, dLys, dArg, dSer, Pip, dTic, dPip, Hyp, dHyp, (цис-dHyp), dMeLys, dNle, dMeArg, G, A, dAla, dVal, dPro, Aze, бетагомоPro, 2Abz, бетагомоIlе, dбетагомоPro, бетагомоNle, MeбетагомоLys(Me)2, (3-аминометил-4-бромбензойную кислоту), [3-аминометил-4-(4-азафенил)-бензойную кислоту], [3-аминометил-4-(2,5-диметилизоксазол)-бензойную кислоту] или [3-аминометил-4-(3-аминометилфенил)-бензойную кислоту].

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z не является бетагомоLys.

В некоторых вариантах осуществления изобретения X^z не является бета-аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение включает в себя 21-членное кольцо.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение представляет собой любое из соединений 1-19.

В одном аспекте, предложен мультимер, содержащий множество соединений, описанных в данном документе, ковалентно связанных друг с другом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера все из множества соединений являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой димер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой тример.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой тетрамер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, мультимер представляет собой пентамер.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера, соединения связаны линкером.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мультимера, соединения связаны друг с другом при углероде, связанном с R⁴, R⁵/R⁶ или Х^у.

В одном аспекте, предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение или мультимер, описанные в данном документе, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Термин «фармацевтически приемлемая соль», используемый в данном документе, представляет собой соли или цвиттерионные формы соединений по данному изобретению, которые растворимы или диспергируемы в воде или масле и которые подходят для лечения заболеваний, не вызывая чрезмерную токсичность, раздражение и аллергический ответ; которые соразмерны с разумным соотношением выгод/рисков и эффективны для их предполагаемого использования. Соли могут быть получены в процессе окончательного выделения и очистки соединений или отдельно посредством обработки аминогруппы подходящей кислотой. Типичные кислотно-аддитивные соли включают в себя: ацетат, адипат, альгинат, цитрат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, диглюконат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, формиат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат (изетионат), лактат, малеат, мезитиленсульфонат, метансульфонат, нафтиленсульфонат, никотинат, 2-нафталенсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, трихлорацетат, трифторацетат, фосфатат, глутамат, бикарбонат, пара-толуолсульфонат и ундеканоат. Кроме того, аминогруппы в соединениях по данному изобретению могут быть кватернизованы метилом, этилом, пропилом и бутилхлоридами, бромидами и йодидами; диметилом, диэтилом, дибутилом и диамилсульфатами; децилом, лаурилом, миристилом и стерилхлоридами, бромидами и йодидами; а также бензилом и фенетилбромидами. Примеры кислот, которые могут быть использованы для образования терапевтически приемлемых солей присоединения, включают в себя неорганические кислоты, например, соляную, бромистоводородную, серную и фосфорную, и органические кислоты, например, щавелевую, малеиновую, янтарную и лимонную. В определенных вариантах осуществления изобретения любое из пептидных соединений, описанных в данном документе, представляет собой солевые формы, например, ацетатные соли.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и аналогичные агенты, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают в себя один или большее количество из: воды, солевого раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и аналогичных носителей, а также комбинации вышеуказанных. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, например, маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать в себя незначительные количества вспомогательных веществ, например, смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность фармакологического агента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция составлена для пероральной доставки, доставки при местном нанесении или парентеральной доставки.

В одном аспекте, предложен способ лечения воспаления или аутоиммунного заболевания у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, воспаление или аутоиммунное заболевание является желудочно-кишечным.

В одном аспекте, предложен способ лечения состояния у пациента, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное состояние или заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит, болезнь Крона, целиакию (нетропическую спру), энтеропатию, связанную с серо негативны ми артропатиями, микроскопический колит, коллагенозный колит, эозинофильный гастроэнтерит, колит, связанный с лучевой терапией или химиотерапией, паучит, возникающий после проктоколэктомии и илеоанального анастомоза, рак желудочно-кишечного тракта, панкреатит, инсулинозависимый сахарный диабет, мастит, холецистит, холангит, перихолангит, хронический бронхит, хронический синусит, астму, первичный склерозирующий холангит, заражение вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) в желудочно-кишечном тракте, эозинофильную астму, эозинофильный эзофагит, гастрит, колит, микроскопический колит, болезнь «трансплантат против хозяина», колит, связанный с радио- или химиотерапией, колит, связанный с нарушениями врожденного иммунитета, например, дефицитом адгезии лейкоцитов-1, хроническую гранулематозную болезнь, болезнь накопления гликогена типа 1b, синдром Херманского-Пудлака, синдром Чедиака-Хигаши, синдром Вискотта-Олдрича, различные формы рака желудочно-кишечного тракта, остеопороз, артрит, рассеянный склероз, хроническую боль, набор лишнего веса или депрессию.

Предпочтительно, указанное состояние представляет собой воспалительное заболевание кишечника, более предпочтительно, язвенный колит или болезнь Крона.

В одном аспекте, предложен способ лечения заболевания или состояния у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом указанное заболевание или состояние представляет собой локальное или системное заражение вирусом или ретровирусом.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирус или ретровирус представляет собой эховирус 1 и 8, эховирус 9/штамм Барти, вирусы папилломы человека, хантавирусы, ротавирусы, аденовирусы, вирус ящура, вирус Коксаки А9, пареховирус человека 1 или вирус иммунодефицита человека 1 типа.

В одном аспекте, предложен способ лечения заболевания или состояния у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения или мультимера, описанного в данном документе, при этом заболевание или состояние представляет собой гепатит А, В или С, печеночную энцефалопатию, неалкогольный стеатогепатит, цирроз печени, варикозное кровотечение, гемохроматоз, болезнь Вильсона, тирозинемию, дефицит альфа-1-антитрипсина, гепатоклеточную карциному, рак печени, первичный билиарный холангит, первичный склероз жёлчных путей, болезнь жёлчных протоков или аутоиммунный гепатит.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное соединение селективно ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пациентом является человек.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложено применение описанных в данном документе соединений или мультимеров для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и состояний, указанных выше.

В других аспектах предложены описанные в данном документе соединения или мультимеры для использования при лечении или профилактике заболеваний и состояний, указанных выше.

Используемые в данном документе термины «заболевание», «расстройство» и «состояние» могут быть использованы взаимозаменяемо.

Используемые в данном документе термины «ингибирование», «средство для лечения», «лечение» и «улучшение» используются взаимозаменяемо и относятся, например, к застою симптомов, увеличению продолжительности жизни, частичному или полному ослаблению симптомов и частичному или полному устранению состояния, заболевания или расстройства у субъекта, например, млекопитающего.

Используемый в данном документе термин «предотвращать» или «профилактика» включает в себя (i) профилактику или приостановку заболевания, поражения или состояния у субъекта, например млекопитающего, в частности, когда такой субъект предрасположен к состоянию, но еще не было диагностировано, что оно имеется у субъекта; или (ii) снижение вероятности возникновения заболевания, поражения или состояния у субъекта.

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение определенного периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество фармакологического агента может варьироваться в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способность фармакологического агента вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любое токсическое или вредное действие фармакологического агента перевешивается терапевтически полезным действием.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, соединение вводят в форме введения, выбранной из группы, состоящей из перорального, внутривенного, перитонеального, внутри кожного, подкожного, внутримышечного, интратекального, ингаляционного, вапоризационного, распылительного, сублингвального, буккального, парентерального, ректального, вагинального и наружного введения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение вводят в виде начальной дозы, за которой следуют одна или большее количество последующих доз, причем минимальный интервал между любыми двумя дозами представляет собой период, составляющий менее 1 дня, и при этом каждая из доз содержит эффективное количество соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, эффективное количество соединения представляет собой количество, достаточное для достижения по меньшей мере одного из следующего, выбранного из группы, состоящей из: а) насыщения сайтов связывания MAdCAM на молекулах интегрина α4β7 приблизительно на 50% или более; b) ингибирования экспрессии интегрина α4β7 на клеточной поверхности приблизительно на 50% или более; и с) насыщения сайтов связывания MAdCAM на молекулах α4β7 приблизительно на 50% или более и ингибирования экспрессии интегрина α4β7 на клеточной поверхности приблизительно на 50% или более, при этом i) насыщение сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день; ii) ингибирование сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день; или iii) насыщение и ингибирование, каждое, сохраняется в течение периода, соответствующего частоте введения дозы, составляющей не более двух раз в день.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, соединение вводят с интервалом, выбранным из группы, состоящей из: круглосуточного, ежечасного, каждые четыре часа, один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в день, через день, еженедельного, раз в две недели и ежемесячного введения.

Предполагается, что приведенное выше описание вариантов осуществления изобретения также включает в себя любые и все комбинации различных вариантов осуществления изобретения. Преимущества данного изобретения дополнительно иллюстрируются приведенными ниже примерами. Приведенные в данном документе примеры и их конкретные подробности представлены только для иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение формулы данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Способы и материалы

Общий синтез

Приведенные ниже примеры протоколов были использованы для синтеза каждого из соединений, описанных в данном документе. На схеме 1 изображен путь общего синтеза для получения соединения 8.

Синтез связанного со смолой линейного пептида А

К смеси, содержащей 2-хлортритильную смолу (0,1 ммоль, загрузка = 1,0 ммоль/г, 0,1 г) и Fmoc-Ala-OH (3 экв.), по каплям добавили DCM (10 мл), а затем DIEA (4,0 экв.). Смолу осторожно перемешивали в течение 1,5 часов. Добавили МеОН (0,1 мл), чтобы закрыть все оставшиеся реакционноспособные 2-хлортритильные группы, и смолу осторожно перемешивали в течение 30 минут, а затем слили. Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). Стандартное твердофазное пептидное химическое вещество Fmoc использовали для установки Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-ОН и Fmoc-Leu-OH с использованием аминокислоты Fmoc (3 экв.), HATU (2,85 экв.) и DIPEA. (3 экв.) в DMF (1 мл) в течение 1 часа. Реакции сочетания контролировали посредством цветной реакции с нингидрином. Смолу обрабатывали Fmoc-3-аминометил-4-бромбензойной кислотой (1,5 экв., приготовленной в соответствии с РСТ № РСТ/СА 2016/000274), HATU (1,5 экв.) И DIPEA (3 экв.) в DMF (300 мл) в течение 1 часа. Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). Для установки Fmoc-Pro-OH использовали стандартное твердофазное пептидное химическое вещество Fmoc с использованием аминокислоты Fmoc (3 экв.), HATU (2,85 экв.) и DIPEA (3 экв.) в DMF (1 мл) в течение 1 часа. После реакции сочетания смолу промыли DMF (5×100 мл). Fmoc-защищенную пептидную смолу обрабатывали 20% пиперидином в DMF в течение 30 минут. После удаления защитной группы Fmoc смолу слили и промыли DMF (5×5 мл). После последней стадии смолу промыли МеОН (3×100 мл) и высушили в вакууме.

Отщепление линейного пептида А от смолы

Пептидную смолу (10 г) обрабатывали коктейлем для расщепления (20% HFIP/80%DCM, 1 л) в течение 0,5 часа при осторожном перемешивании. Коктейль для расщепления собрали в колбу Эрленмейера объёмом 3 л. Смолу снова обрабатывали коктейлем для расщепления (20%HFIP/80%DCM, 1 л) в течение 0,5 часа при осторожном перемешивании. Коктейль для расщепления собрали в ту же колбу Эрленмейера объёмом 3 л. Объединенный раствор коктейля для расщепления концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить неочищенный линейный пептид А (4,5 г).

Циклизация

Сырой линейный пептид А (4,5 г) растворили в DCM (5 л) и обработали DIEA (4 экв.) И HATU (2 экв.). Смесь перемешивали в течение 0,5 часа при комнатной температуре. Конверсию линейного пептида контролировали методом ЖХМС. Летучие вещества концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить неочищенный циклический пептид, соединение А (5 г).

Реакция перекрестного сочетания Сузуки

Пять реакций были проведены параллельно. Смесь неочищенного соединения А (1 г 1,2 ммоль) и сложного эфира пинакола 4-(4-Вос-пиперазино)фенилбороновой кислоты (931 мг, 2,4 ммоль) объединили в сосуде микроволнового реактора и растворили в 1,2-диметоксиэтане (5,4 мл) и этаноле (1,2 мл) при комнатной температуре. К раствору добавили воду (1,2 мл), а затем Na₂CO₃ (254 мг, 2,4 ммоль). Реакционную колбу продували в течение 5-10 минут газообразным азотом и загрузили Pd(P(Ph)3)4 (277 мг, 0,24 ммоль). Пробирку закупорили и нагревали при 120°С в течение 10 мин в микроволновой печи. ЖХ-МС показала полное израсходование циклического пептида и один главный пик с желаемым m/z. Реакционную смесь отфильтровали через целитовую прокладку для удаления Pd(Р(Ph)₃)₄. Целитовую прокладку промыли THF, а растворители удалили в вакууме для получения сырого твердого вещества бледно-желтого цвета, соединения В

Гповальное снятие защиты

Неочищенное соединение В, полностью защищенное боковой цепью, обработали буфером для расщепления объемом 500 мл (TFA:DCM = 1:1) и перемешивали в течение 1 часа. Летучие вещества концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 8 (7 г) с полностью снятой защитой.

Очистка

Сырое соединение 8 подвергли препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в H₂O; В: ACN) с получением соли TFA очищенного циклического пептида. Второй обработкой препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 1 ммоль/л NH₄HCO₃ в Н₂О; В: ACN) удалили все следы остаточной TFA и после лиофилизации получили «бессолевую» форму соединения 8 (800 мг) в виде белого твердого вещества.

Димеризация соединения 8: синтез соединения 16

Раствор дифеновой кислоты (12,1 мг, 0,05 ммоль, 1,0 экв) в безводном THF (1 мл) обработали оксалилхлоридом (10 мкл), а затем DMF (5 мкл). Полученную суспензию перемешивали при 25°С и она стала желтым раствором в течение 1 часа. Летучие вещества удалили, промыв колбу аргоном. Полученное желтое твердое вещество растворили в безводном DCM (3 мл) и обработали соединением 8 (95 мг, 0,12 ммоль, 2,4 экв; бессолевая форма). К смеси по каплям добавили DIPEA (1,6 мл, 1,25 ммоль, 25,0 экв.). Реакцию контролировали методом ЖХ-МС. Через 30 минут летучие вещества удалили в вакууме, а неочищенный материал очистили методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н₂О, В: ACN). Соединение 16 выделили в виде белого твердого вещества (9,4 мг).

Димеризация соединения 8: синтез соединения 18

Суспензию соединения 8 (120 мг, 0,13 ммоль, 2,7 экв; бессолевая форма), 1,3-бис(бромметил)бензол (12,8 мг, 0,05 ммоль, 1 экв) и DIPEA (0,1 мл) в ACN (1 мл) перемешивали при 25°С в течение 1 часа. Летучие вещества удалили в вакууме, а неочищенный материал очистили методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ (А: 0,075% TFA в Н₂О, В: ACN). Соединение 18 выделили в виде белого твердого вещества (4,2 мг).

Анализ конкурентного связывания ELISA интегрина α4β7 с MAdCAM-1

Ha 96-луночный планшет Microlon (Greiner, 655001) нанесли 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл рекомбинантного интегрина α4β7 (R&D Systems, 5397-А3-050) в карбонатном буфере (50 мМ, рН 9,6). Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор удалили и в каждую лунку добавили 250 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 1% BSA, 0,05% Tween). 3атем планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды промыли промывочным буфером (50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,05% Tween). В каждую лунку добавили 50 мкл соединения, разведенного в аналитическом буфере, посредством переноса из планшета для серийного разведения соединения. В каждую лунку добавили 50 мкл рекомбинантного MAdCAM-Fc (R&D systems, 6056-МС-050) в концентрации 0,1 мкг/мл в аналитическом буфере (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,1% BSA, 0,05% Tween). Планшет инкубировали при комнатной температуре при встряхивании (300 об/мин) в течение 2 часов до достижения равновесия связывания. 3атем планшет трижды промыли в промывочном буфере и в каждую лунку добавили 100 мкл специфического к HRP человеческого антитела IgG Fc (Abcam, Ab97225), разведенного в аналитическом буфере в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. 3атем планшет трижды промыли и после этого в каждую лунку добавили 100 мкл 1,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, KPL 5120-0083). Реакцию остановили через 2 минуты инкубации посредством добавления 50 мкл 1М H₂SO₄ и считали оптическую спектральную поглощательную способность при 450 нМ.

Анализ конкурентного связывания ELISA интегрина α4β1 с VCAM-1

На 96-луночный планшет Microlon (Greiner, 655001) нанесли 100 мкл на лунку раствора 0,5 мкг/мл рекомбинантного интегрина α4β1 (R&D Systems, 5397-А3-050) в карбонатном буфере (50 мМ, рН 9,6). Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. Раствор удалили и в каждую лунку добавили 250 мкл блокирующего буфера (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 1% BSA, 0,05% Tween). 3атем планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет трижды промыли промывочным буфером (50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,05% Tween). В каждую лунку добавили 50 мкл соединения, разведенного в аналитическом буфере, посредством переноса из планшета для серийного разведения соединения. В каждую лунку добавили 50 мкл рекомбинантного VCAM-Fc (R&D systems, 862-VC-100) в концентрации 0,1 мкг/мл в аналитическом буфере (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ MnCl₂, 0,1% BSA, 0,05% Tween). Планшет инкубировали при комнатной температуре при встряхивании (300 об/мин) в течение 2 часов до достижения равновесия связывания. 3атем планшет трижды промыли в промывочном буфере и в каждую лунку добавили 100 мкл специфического к HRP человеческого антитела IgG Fc (Abcam, Ab97225), разведенного в аналитическом буфере в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании. 3атем планшет трижды промыли и после этого в каждую лунку добавили 100 мкл 1,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ, (ТМВ, KPL 5120-0083). Реакцию остановили через 2 минуты инкубации посредством добавления 50 мкл 1М H₂SO₄ и считали оптическую спектральную поглощательную способность при 450 нМ.

Исследование адгезии интегрина α4β7 с клетками человека MAdCAM

Клетки человека RPMI8866 (Sigma №95041316) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора человеческого рекомбинантного MAdCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 6056-MC-050) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1% обезжиренного сухого молока в PBS) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. RPMI8866 клетки ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Для наполнения пробирки добавили PBS, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% CO₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. 3атем в каждую лунку добавили 100 мкл PBS. Флуоресценцию считывали (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Исследование адгезии интегрина α4β1 с клетками человека VCAM

Клетки человека RAMOS (АТСС CRL-1596) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора человеческого рекомбинантного VCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 862-VC-100) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1% обезжиренного сухого молока в PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. На стадии блокировки клетки RAMOS ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Для наполнения пробирки добавили PBS, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% CO₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. После последней промывки в лунки добавили 100 мкл PBS и считывали флуоресценцию (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Исследование адгезии интегрина α4β7 с мышиными клетками MAdCAM

Клеточные линии лимфомы Т-клеток мыши ТК-1 (АТСС CRL2396) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.1), дополненной 10% FBS (Seradigm) и 1% пенициллин-стрептомицином. На 96-луночный планшет (Costar, 3603) нанесли 100 мкл/лунку раствора мышиного рекомбинантного MAdCAM-1 Fc Chimera (R&D Systems, 993-MC-050) при 0,25 мкг/мл в покрывающем буфере (50 мМ карбоната натрия, рН 9,6). Планшет инкубировали в течение ночи при 4°С и дважды промыли с использованием 150 мкл на лунку промывочного буфера (0,05% Tween 20 в PBS), блокировали с использованием 250 мкл на лунку блокирующего буфера (1 % обезжиренного сухого молока в PBS) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Клетки TK-1 ресуспендировали при 10 миллионах клеток/мл в PBS, содержащем 5 мМ кальцеина и инкубировали при 37°С в течение 30 мин в 50 мл пробирке. Добавили PBS для заполнения пробирки, клетки отцентрифугировали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 до 2 млн/мл. Соединения разбавили посредством серийного разведения в буфере для связывания (1,5 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MnCl₂, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5) до конечного объема, составляющего 50 мкл на лунку при 2х концентрации. Планшет промыли один раз 300 мкл PBS, 50 мкл соединения и 50 мкл клеток (100000 клеток) были перемещены в каждую лунку и планшет инкубировали в темноте при 37°С, 5% С0₂ в течение 45 минут, чтобы обеспечить адгезию клеток. Планшет опорожнили посредством переворачивания и промокания бумажными полотенцами и дважды промыли вручную с использованием PBS. 3атем в каждую лунку добавили 100 мкл PBS. Флуоресценцию считывали (Ex₄₉₅/Em₅₁₅) с использованием планшет-ридера (Tecan Infinite 1000). Чтобы рассчитать реакцию на дозу, значение флуоресценции контрольных лунок, не содержащих клеток, вычитали из каждой тестовой лунки.

Анализ конкурентного связывания тестируемого аналита первичных CD4+ Т-клеток памяти человека с α₄+B₇-neqative интегрином

3анятость рецепторов (RO) в первичных клетках определили посредством измерения количества биотинилированного человеческого рекомбинантного MAdCAM-1-FC или человеческого рекомбинантного VCAM-1-Fc, связанного с выбранными популяциями клеток, с использованием проточной цитометрии. Человеческий рекомбинантный MAdCAM-1-FC или человеческий рекомбинантный VCAM-1-FC (R&D systems) биотинилировали с использованием коммерчески доступных реагентов и протокола (Pierce).

Цельную кровь собрали от доноров-людей в натриевые гепариновые пробирки. Кровь объемом 100 мкл инкубировали с соединением и 4 мМ MnCl₂ в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки дважды промыли 1 мл 1XDPBS свободного кальция-магния (CMF) (ThermoFisher Scientific) и ресуспендировали в 100 мкл DPBS CMF.

Биотинилированный человеческий рекомбинантный MAdCAM-1-Fc или VCAM-1-Fc добавили в насыщающей концентрации и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. 3атем добавили 2 мл 1XBD FACS Lyse (BD Biosciences) и смесь инкубировали в течение 8-12 минут при комнатной температуре в темноте для лизиса эритроцитов. Клетки промыли 1 мл окрашивающего буфера FBS (BD Biosciences) и ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера FBS (BD Biosciences), содержащего 4 мМ MnCl₂. Биотинилированный rhMAdCAM-1 нанесли в насыщающей концентрации, составляющей 1200 нг/мл, чтобы конкурировать со связыванием испытуемого препарата, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. 3атем клетки промыли 1 мл окрашивающего буфера FBS и ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера FBS. Клетки инкубировали в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре с 1 мкл стрептавидина АРС (BioLegend 0,2 мг/мл) и панелью антител для обнаружения Т-хелперов памяти a4b7-позитивных клеток подмножества. И каждое из следующих ниже антител были использованы в количестве 5,0 мкл; CD45 FITC (BioLegend 200 мкг/мл), CD29 АРС Су7 (BioLegend 100 мкг/мл), интегрин бета7 РЕ, (BioLegend в концентрации 50 мкг/мл), CD49d V421 (BioLegend 50 мкг/мл), CD3 V510 (BioLegend 30 мкг/мл), CD4 РЕСу7 (BioLegend 100 мкг/мл), CD45RO PerCP, BioLegend 200 мкг/мл). 3атем клетки промыли окрашивающим буфером FBS и ресуспендировали в 150 мкл окрашивающего буфера FBS для определения на проточном цитометре (проточный цитометр BD FACSCanto™ и программное обеспечение BDFACSDiva™). Данные FACS были получены методом электронного стробирования на основе прямого и бокового рассеяния. Цитометр был настроен на сбор 20000 событий в каждой пробирке. Клеточная популяция была определена с использованием следующих ниже маркеров, CD45+, CD3+, CD4+, CD45RO+, CD49d+, интегрина β7, биотинилированных лигандов.

Соединение RO определили как уменьшение числа клеток интегрина β₇+ или интегрина связывающих биотинилированные rhMAdCAM-1 или rhVCAM-1, соответственно.

3анятость рецепторов рассчитывали по следующему уравнению: 100-((% лиганд-позитивных клеток с соединением/% лиганд-позитивных клеток ДМСО)*100). Лиганды и соединения не конкурируют за антитела к интегрину и препятствуют обнаружению α4β7 положительных Т-клеток памяти.

Результаты и обсуждение результатов

Соединения, представленные на Фиг. 1-5, были синтезированы в соответствии с указанными выше способами. Выбор соединений был охарактеризован с использованием ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР (данные не показаны). В некоторых случаях соединения, выделенные из синтеза и очистки первого поколения (партия 1), давали множественные пики на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых из этих случаев был проведен синтез и очистка второго и/или третьего поколения, в результате чего были получены материалы партии 2 и/или партии 3, которые демонстрировали по существу одинарные пики на хроматограммах ВЭЖХ. Обозначения партии 1, партии 2 и партии 3 были отмечены в данных ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР (не показаны).

Анализы конкурентного связывания

Результаты по соединениям для двух анализов конкурентого связывания лигандов (MAdCAM-1/α4β7 и VCAM-1/α4β1) показаны в таблице 1.

Анализы конкурентного связывания клеточной адгезии

Результаты по соединениям в анализах конкурентного связывания клеточной адгезии RPMI8866, RAMOS и ТК-1 показаны в таблицах 1 и 2.

3анятость рецепторов

Результаты исследований соединений в анализах смещения лиганда цельной крови показаны в таблицах 1 и 3.

Связывающая аффинность и селективность соединений для интегрина α4β7 и α4β1

Мы измерили эффективность связывания мономерных и димерных соединений с интегрином α4β7 с использованием ряда биохимических, клеточных и ex vivo анализов. Мультимерные соединения были, в целом, более эффективны в биохимических и клеточных анализах по сравнению с составляющими их мономерами.

Мы измерили способность испытуемых препаратов предотвращать адгезию клеток RPMI8866, которые экспрессируют человеческий интегрин α4β7, с пластинками, покрытыми MAdCAM-1. Мультимерные соединения обладали, в целом, большей способностью ингибировать клеточную адгезию, чем составляющие их мономеры. Например, соединение №16 и соединение №8 имели значения IC₅₀, составляющие ~ 6 нМ и ~ 202 нМ, соответственно, в сопоставимых анализах на адгезию клеток RPMI8866 (Фиг. 6; таблицы 1 и 2). Мультимерные соединения, в целом, были также более селективными, чем составляющие их мономеры, в их способности ингибировать адгезию для клеток, экспрессирующих интегрин α4β7 (RPMI8866), по сравнению с клетками, экспрессирующими человеческий интегрин α4β1 (RAMOS; Фиг. 7; таблицы 1 и 2). Например, мультимерное соединение №16 ингибировало адгезию в клетках RPMI8866 со значением IC₅₀,

составляющим ~ 6 нМ и ингибировало адгезию в клетках RAMOS со значением IC₅₀, составляющим ~ 21 нМ (различие между анализами в 3,5 раза в пользу интегрина α4β7), при этом мономерное соединение №8 ингибировало адгезию в клетках RPMI8866 со значением IC₅₀, составляющим ~ 202 нМ и ингибировало адгезию в клетках RAMOS со значением IC₅₀, составляющим ~ 451 нМ (различие между анализами в 2,2 раза в пользу интегрина α4β7). Взятая в совокупности, мультимеризация мономера привела к усиленному ингибированию клеточной адгезии, а также к повышенной селективности в ингибировании клеточной адгезии в пользу интегрина α4β7 по сравнению с интегрином α4β1.

Интересно, что различия в сродстве связывания между мономерными и мультимерными соединениями не были такими выраженными в анализе связывания ELISA α4β7. Например, мономерное соединение №8 для ELISA α4β7 показало значение IC₅₀ ~ 24 нМ, при этом димерное соединение №16 для ELISA α4β7 показало значение IC₅₀ ~ 8 нМ (таблица 1). Возможно, что авидность увеличивает эффективность связывания мультимерных соединений в клетках.

Аналогичные результаты были получены в анализе конкурентного связывания лигандов с интегрином α4β7 в цельной крови человека (таблицы 1 и 3). 3анятость рецепторов соединениями определили посредством измерения доли α4β7+ Т-хелперных клеток памяти, способных связывать биотинилированный rhMAdCAM-1, с использованием проточной цитометрии. Мультимерные соединения были способны конкурировать с MAdCAM-1 на α4β7-позитивных первичных клетках с большей активностью, чем мономерные соединения. Было показано, что мультимеры, содержащие различные линкеры, конкурируют более эффективно, чем составляющий их мономер. Например, димерные соединения №№ 16, 18 и 19 показали значения IC₅₀ ~ 6, ~ 25 и ~ 260 нМ, при этом для соответствующего исходного мономерного соединения №8 была получена относительно слабая кривая концентрация-отклик (Фиг. 8; таблица 3). Это может быть результатом неспецифического связывания мономерного соединения с клеткой.

3анятость рецепторов, измеренная методом анализируемого «анализа конкурентного связывания» в первичных Т-клетках памяти CD4+ с интегрином человека, выявила мультимерные соединения, обладающие значительной активностью и способствующие селективности α4β7 по сравнению с α4β1, в цельной крови. Мономерное соединение №8 продемонстрировало относительно слабую RO на α4β7 (IC₅₀ > 4 мкМ) (Фиг. 8; таблицы 1 и 3) и отсутствие селективности по сравнению с α4β1. Аналогичные профили были зарегистрированы для мономерных соединений №№ 11 и 14. Напротив, мультимерное соединение №16, в частности, продемонстрировало сильную селективность α4β7 RO (IC₅₀ ~ 6 нМ) и сильную (~ 11-кратную разницу в IC₅₀ между анализами) селективность по сравнению с α4β1 (Фиг. 9; таблицы 1 и 3). Мультимерные соединения №№ 18 и 19 также продемонстрировали субмикромолярные α4β7 RO IC₅₀ значения, а также селективность по сравнению с α4β1.

Для оценки адгезии в клетках мыши, для сравнения с клетками человека, мы использовали мышиную клеточную линию ТК-1, которая экспрессирует мышиный интегрин α4β7 (таблица 1). Мономерное соединение № 8 продемонстрировало ~ 10-кратное различие в IC₅₀ между адгезией мышиных клеток, содержащих α4β7 (более слабая адгезия), и адгезией человеческих клеток, содержащих α4β7 (более сильная адгезия). Мультимерные соединения, в целом, демонстрируют более низкие расхождения между адгезией клеток мыши и человека по сравнению с мономерным соединением №8. Например, мультимерные соединения №№ 16, 17 и 18 продемонстрировали значения IC₅₀, составляющие ~ 28, ~ 97 и ~ 68 нМ для адгезии мышиных клеток, содержащих α4β7, но значения IC₅₀, составляющие ~ 6, ~ 19 и ~ 8 нМ для адгезии человеческих клеток, содержащих α4β7. Одним из исключений является мультимерное соединение № 19, которое продемонстрировало значение IC₅₀, составляющее 1,883 мкМ для адгезии мышиных клеток, содержащих α4β7, но значение IC₅₀, составляющее ~ 25 нМ для адгезии человеческих клеток, содержащих α4β7.

Хотя предпочтительные варианты осуществления изобретения были описаны в данном документе, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в них могут быть внесены изменения, не отступая от сущности изобретения или объема прилагаемой формулы изобретения. Все документы, описанные в данном документе, в том числе в следующем ниже перечне ссылок, включены посредством ссылки.

Таблица 1

В таблице 1 показаны гомодетные соединения, проявляющие аффинность, селективность и/или активность в отношении интегрина α4β7.

^a Все значения IC₅₀ для α4β7 ELISA определены в первом периоде, если не указано иное

^b Все значения IC₅₀ для α4β1 ELISA определены в первом периоде, если не указано иное

^с Все значения IC₅₀ адгезии α4β7 с человеческими клетками RPMI8866 определены в первом периоде, если не указано иное

^d 3начения IC₅₀ для α4β7 ELISA определены во втором периоде

^е 3начения IC₅₀ для α4β1 ELISA определены во втором периоде

^f 3начения IC₅₀ адгезии α4β7 с человеческими клетками RPMI8866 определены во втором периоде

Изобретение относится к антагонисту интегрина α4β7, который представляет собой димер, содержащий два соединения формулы (I), ковалентно связанных друг с другом, его фармацевтической композиции и способу лечения состояния, связанного с биологической функцией интегрина α4β7. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 1 пр.

1. Димер, содержащий два соединения формулы (I), ковалентно связанных друг с другом, где соединение формулы (I) имеет структуру:

где

R¹ представляет собой Н;

R² и R³ каждый независимо представляет собой аминокислотную боковую цепь протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты,

при условии, что R² и R³ могут быть ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца или могут быть ковалентно связаны с R¹ с образованием циклического вторичного амина,

R⁴ вместе с одним из R⁵ и R⁶ образует кольцо, в результате чего остаток пролина имеет N-R⁴ в качестве N-конца, а второй из R⁵ и R⁶ представляет собой Н;

стереоцентры 1* и 2*, каждый, независимо выбраны из R и S; и

где Z представляет собой аминоконец аминокислоты;

-C=O-, смежный с L, представляет собой карбокси-конец аминокислоты; и L вместе с Z и –C=O- представляет собой пептид, имеющий следующую формулу:

X^y – X^z – X¹ – X² – X³,

где X^y представляет собой -[3-аминометил-4-[4-(1-пиперазинил)фенил]-бензойную кислоту];

X^z отсутствует;

X¹ представляет собой лейцин или трет-бутил-Ala;

X² представляет собой Asp; и

X³ представляет собой Thr, Ile, MeThr, alloThr, Abu, Thr(OBn), Val или аллоил; и где указанные соединения связаны линкером, и эти соединения связаны вместе по атому углерода, связанному с X^y.

2. Димер по п. 1, отличающийся тем, что как R², так и R³ не представляют собой H.

3. Димер по п. 1, отличающийся тем, что каждый из R² и R³ независимо выбран из группы, состоящей из аминокислотныx боковых цепей протеиногенной или непротеиногенной альфа-аминокислоты.

4. Димер по п. 1, отличающийся тем, что R² и R³ представляют собой Н и CH₃, соответственно, или в обратном порядке.

5. Димер по п. 1, отличающийся тем, что R² или R³ представляет собой -CH₂-S-R^s, причём R^s выбран из низшего алкила; низшего аминоалкила; арила; гетероарила; алкенила; или гетероцикла; все из которыx необязательно замещены в одном или большем количестве замещаемыx положений одним или большим количеством подходящиx заместителей, выбранных из группы, состоящей из H; гидроксила; циано; алкила; алкокси; арилокси; винила; алкенила; алкинила; формила; галогеналкила; галогенида; арила; гетероарила; амида; ацила; сложного эфира; простых эфиров и тиоэфиров; тиоалкокси; фосфино;

и –NR_aR_b, где R_a и R_b независимо выбраны из низшего алкила, арила или бензила; предпочтительно R^s представляет собой фенил или фенил, замещенный низшим алкилом, галогеном; или низший аминоалкил.

6. Димер по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что X^y – X^z – X¹ – X² – X³ является

таким, как показано в любом из соединений 16-19.

7. Димер по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что X¹ представляет собой Leu.

8. Димер по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что X³ представляет собой Thr.

9. Димер по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что X³ представляет собой Val.

10. Димер по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что X³ представляет собой Ile.

11. Димер по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанное соединение формулы (I) включает в себя 21-членное кольцо.

12. Димер по п. 1, представляющий собой любое из соединений 16-19

,

,

,

.

13. Димер по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанные два соединения являются идентичными.

14. Фармацевтическая композиция, являющаяся антагонистом интегрина α4β7, содержащая эффективное количество димера по любому из пп. 1-13 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, составленная для пероральной доставки.

16. Фармацевтическая композиция по п. 14, составленная для доставки при местном нанесении.

17. Фармацевтическая композиция по п. 14, составленная для парентеральной доставки.

18. Способ лечения состояния, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, у пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества димера по любому из пп. 1-13.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный димер ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный димер избирательно ингибирует связывание интегрина α4β7 с MAdCAM.

21. Способ по любому из пп. 18-20, отличающийся тем, что пациентом является человек.

22. Применение димера по п. 1 для лечения состояния, связанного с биологической функцией интегрина α4β7, у пациента.