ПЛАНКТОННЫЙ ЭВРИБИОНТНЫЙ ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ CHLORELLA SOROKINIANA AGT, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ Российский патент 2022 года по МПК C12N1/00 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, является составной частью природоподобной технологии «биоремедиация водных объектов» любого назначения и представляет собой новый планктонный эврибионтный штамм Chlorella sorokiniana AGT, предназначенный для улучшения экологического состояния водных объектов.

Уровень техники

Инновационным подходом, позволяющим значительно снизить уровень загрязнения водоемов и улучшить органолептические свойства воды, является биотехнология, основанная на биоремедиации водоемов планктонными штаммами зеленой микроводоросли рода Chlorella. От других представителей фитопланктона она отличается возможностью жизнедеятельности в широком температурном интервале (от 18 до 32°С), устойчивостью к шоковым реакциям (замораживание) и способностью развития в экстремальных условиях.

В процессе фотосинтеза хлорелла выделяет в воду большое количество кислорода (до 14 мг/дм³). Кислород, находясь в период выделения в молекулярном состоянии (in statu nascendi), обладает повышенной способностью к окислению. Утилизация хлореллой различных соединений, содержащих азот и фосфор, происходит настолько эффективно, что хлорелла не оставляет шансов для развития цианобактерий, что (учитывая токсичность и, соответственно, неприятные запахи выделяемых синезелеными водорослями веществ), позитивно сказывается на качестве воды в искусственных и природных водоемах, используемых в рекреационных целях.

С целью структурной перестройки фитопланктонного сообщества и решения экологических проблем проводится альголизация водоемов представителем зеленых микроводорослей - планктонным штаммом Chlorella, для увеличения роли зеленых водорослей и решения экологических проблем и улучшения качественного состава воды.

Известна типовая культура - штамм К.А. Сорокина №7-11-05 - хранится в коллекции Мэриленда, США (Андреева В.М. Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации / Изд-во «Наука», Ленингр. отд., 1975. - 110 с., стр.69). Штамм относится к категории термофильных микроорганизмов, оптимальной температурой которого является 37-39°С.

Известен способ биологической очистки сточных вод рыбообрабатывающих предприятий с использованием штамма Chlorella kessleri IPPA С-112 (патент RU 2064454). Сущность способа заключается в обработке сточных вод микроводорослями Chlorella kessleri IPPA С-112 с целью формирования альгоценоза. Ограничением использования этого способа является узкий спектр очистки - только сточных вод рыбообрабатывающих предприятий - и неполная очистка от микроорганизмов.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri ВКПМ AI-11 ARW (патент RU 2585523), предназначенный для предотвращения «цветения» водоемов синезелеными водорослями (цианобактериями). Ограничивающей характеристикой этого штамма является способность роста при температуре не ниже 17°С.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР N С-111, предназначенный для получения биомассы и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981). Клеточная оболочка этих микроорганизмов состоит из внутреннего и внешнего слоев, причем внешний слой содержит миофибриллярный материал (Skaloud P., Nemcova Y., Pytela J., Bogdanov N.I., Bock С, Pickinpaugn S.H. Planktochlorella nurekis gen. et sp.nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga carrying significant biotechnological potential. Fottea, Olomouc, 14 (1): 53-62, 2014). Ограничением использования штамма Chlorella vulgaris ИФР N С-111 является стойкий асинхронный цикл развития клеток, прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка, а также длительный срок культивирования, который составляет четверо суток.

Известен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 (патент RU 2555519), характеризующийся способностью расти на средах, близких по составу к сточным водам птицефабрик и спиртовых производств, высокой способностью к извлечению биогенных элементов из сточных вод, а также к деструкции содержащихся в сточных водах органических загрязнителей. Ограничивающей характеристикой этого штамма является узкий спектр очищаемых вод.

Известен штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG (патент RU 2527895), предназначенный для продуцирования биомассы и уничтожения цианобактерий (синезеленых водорослей), отличающийся жизнеспособностью в температурных интервалах от 0 до 16°С, сезонным размножением в естественных бассейнах и обладающий способностью адаптироваться к естественным условиям. Однако ограничением использования штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG является отсутствие способности предотвращения "цветения" водоемов синезелеными водорослями. Для подавления синезеленых водорослей необходимо эквивалентное количество суспензии хлореллы, что легко достижимо в лабораторных условиях, но осуществление проблематично для водоемов.

Также известен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris BIN, являющийся наиболее близким аналогом предлагаемого штамма. Штамм Chlorella vulgaris BIN предназначен для получения биомассы и очистки сточных вод (патент RU 2192459), не требователен к питательной среде и способен к высокой степени очистки различных категорий сточных вод. Штамм Chlorella vulgaris BIN проявляет выраженные антагонистические свойства к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и инфузориям, обладает невосприимчивостью к фагам. Ограничивающей характеристикой штамма Chlorella vulgaris BIN является отсутствие сезонности размножения в условиях естественных водоемов, что затрудняет его использование на водоемах различных климатических зон. Слабовыраженное сохранение жизнеспособности в водоемах при температуре воды от 0 до 16°С требует проведения, кроме основной, многократных дополнительных альголизаций. Недостаточная приспособляемость к естественным условиям водоема требует дополнительной его адаптации. Необходимым условием для использования штамма Chlorella vulgaris BIN является наличие в водоеме растительноядных рыб (белый и пестрый толстолобики) в количестве 1-3 экз./га. Другим ограничением использования штамма Chlorella vulgaris BIN является узкий спектр приспособленности - только к сточным водам.

Одним из основных факторов и дефицита, и избыточности на территории России для биологических систем является температурный режим, поэтому одним из наиболее значимых условий для процесса биоремедиации является адаптация технологии альгоремедиации водных объектов для наиболее широкого температурного спектра. Так, например, в настоящее время в пресноводных водоемах все чаще встречаются вспышки массового цветения Oscillatoria (род гормогониевых водорослей), которые хорошо адаптировались к холодному времени года и способны к фотосинтезу при низких температурах.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение планктонного эврибионтного штамма микроводоросли, обладающего высокой адаптивностью к продуктивному размножению в широких температурных режимах и проявляющего свойства природного катализатора биотических процессов, натурального антиоксиданта и потребителя загрязняющих водоема веществ (включая фосфор, азот, металлы, нефтесодержащие соединения, анионные поверхностно-активные вещества (АПАВ) и СО₂) не только в биореакторе, при наборе биомассы, но и в естественной среде гидробиоценоза водоемов.

Поставленная задача решается путем получения нового планктонного эврибионтного штамма Chlorella sorokiniana AGT, предназначенного для улучшения экологического состояния водных объектов.

Штамм Chlorella sorokiniana AGT депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Al-29.

Еще одним аспектом изобретения является применение нового штамма в борьбе с «цветением» воды в водоемах, а также для очистки сточных вод различного происхождения, предусматривающее альголизацию водоема с использованием нового штамма микроводоросли, благодаря его способности к эффективному удалению избыточных биогенных элементов и повышению уровня концентрации кислорода.

Также аспектом изобретения является способ очистки водных объектов (как естественных, так и искусственных, различного назначения, в том числе сточных вод), предусматривающий биоремедиацию водоема путем внесения суспензий нового штамма микроводоросли. Предлагаемый штамм Chlorella sorokiniana AGT ВКПМ Al-29 имеет ряд преимуществ, которые обеспечивают технический результат настоящего изобретения, заключающийся в следующем:

- штамм способен сохранять активность при широких колебаниях температуры - от 6° до 32°С: при 6°С начинается единичное деление, которое проявляется более активно при более высоких температурах; зоной температурного оптимума, в пределах которого наблюдается наибольшая продуктивность (массовое размножение), является температура 28-30°С;

- штамм обладает способностью понижать продуктивность синезеленых водорослей вследствие снижения содержания биогенных элементов;

- штамм повышает уровень концентрации растворенного кислорода в воде;

- штамм проявляет выраженные антагонистические свойства к альгофлоре, бактериям, грибам, дрожжам и инфузориям, обладает невосприимчивостью к фагам;

- штамм, благодаря своей функциональной активности, способен ускорять процессы биотического самоочищения водоемов.

Подробное описание изобретения

Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды:

Морфологические признаки.

Молодые клетки шаровидной или слабоэллипсоидной формы, размером 2,0-3,0 мкм. Взрослые клетки шаровидные 6,0-9,0 мкм в диаметре. Клетки с уже сформированными автоспорами, но еще находящиеся в материнской оболочке, 8,0-10,0 мкм в диаметре. Размер клеток, готовых к делению, зависит от количества автоспор. Хлоропласт взрослой клетки по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает ⅔ поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. Споры одинакового размера. Число спор 4-8. Чаще всего спор 8, редко 2. Число спор бывает только четное. Деление клеток - синхронное. Клетки, как молодые, так и взрослые, темно-зеленого цвета.

Физиологические признаки.

Штамм автотрофный. Как в лабораторных, так и в производственных условиях растет на питательной среде (1), состоящей из растворов:

- аммиачная селитра (34% раствор) - 0,14 мл;

- аммофос (15% раствор) - 0,10 мл;

- калий сернокислый (12% раствор) - 0,33 мл;

- хлорид железа (1% раствор) - 0,15 мл;

- кобальт азотнокислый (0,1% раствор) - 0,10 мл;

- медь сернокислая (0,1% раствор) - 0,10 мл;

- раствор углекислого газа, органический (рН 3,5-4,5) - 10-20 мл

на один литр очищенной водопроводной воды.

Для приготовления раствора углекислого газа используется настой голозерного овса.

При солнечном освещении или освещении диодными лампами со световой температурой 5000 кельвинов, или лампами (ДРИ-450 или ДНаТ-450) температура суспензии хлореллы не должна превышать 31°С. Оптимальная температура культивирования в дневное время 28-30°С, в ночное 10-15°С. Минимальная температура культивирования 10°С.

Режим освещения, как при солнечном свете, так и лампами, составляет 8-10 часов. Штамм устойчиво развивается как при естественном, так и при искусственном освещении и не зависит от сезона года.

Антагонистические свойства штамма проявляются при наборе культурой оптической плотности 0,85 D (440), при этом наступает лизис прочей альгофлоры, гибель бактерий, грибов и дрожжей. Штамм не поражается фагами.

Штамм строго соблюдает условия монокультуры.

Культуральные свойства.

Для культивирования штамма могут использоваться установки различных типов, емкости которых выполнены из стекла или органических материалов. Для получения синхронной культуры необходимо использовать автоматические установки. Нормативная оптическая плотность суспензии в пределах 1,4-1,8 D (440) достигается менее, чем за двое суток.

Клетки штамма равномерно распределяются в культуральной среде, так как штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще.

Для культивирования штамма не требуется создания условий стерильности. Культивирование ведется как в помещении, так и под открытым небом.

Срок сохранения жизнеспособности клеток в культуре - не менее 3 лет, при условии хранения на рассеянном свету при комнатной температуре.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Способность штамма к росту при температуре культивирования 10°С и при оптимальных температурах.

С целью анализа способности штамма Chlorella sorokiniana AGT к росту при низких температурах были проведены сравнительные исследования скорости набора биомассы анализируемых штаммов при одинаковых условиях культивирования (концентрация питательный среды, интенсивность освещения, температурный режим).

Результаты эксперимента приведены в таблицах 1.1. и 1.2. ниже.

Таблица 1.1. - Сравнительные показатели, характеризующие способность анализируемых штаммов к размножению при температуре культивирования 10°С (усредненные значения по 5 повторам). Показатели Chlorella vulgaris
ИФР С-111 Chlorella vulgaris
BIN Chlorella vulgaris
GKO Chlorella sorokiniana
AGT млн клеток/мл (изначально) 15 15 15 15 количество клеток, образующих споры,
на 100 0 3 3 30 количество спор от одной клетки 0 4 2 4-8 прирост клеток в культуре на 1 мл (8 часов), млн 0 2 1 17 скорость набора оптической плотности культуры (1,4 D (440)), сутки 0 22,5 45 5 Таблица 1.2. - Сравнительные показатели, характеризующие способность анализируемых штаммов к размножению при оптимальных температурах культивирования (28-30°С) (усредненные значения по 5 повторам). Показатели Chlorella vulgaris
ИФР С-111 Chlorella vulgaris
BIN Chlorella vulgaris
GKO Chlorella sorokiniana
AGT скорость набора оптической плотности культуры (1,4 D (440)), сутки 4 3 2 1 количество спор от одной клетки, в основном 2 4 8 8

Из приведенных данных следует, что предлагаемый штамм обладает более высокой скоростью прироста биомассы при температуре 10°С по сравнению с другими известными штаммами, при этом нормативная оптическая плотность суспензии штамма Chlorella sorokiniana AGT в пределах 1,4 D (440) достигалась за пять дней, что более чем в 4 раза быстрее штамма-аналога (Chlorella vulgaris BIN) при данной температуре.

При оптимальных температурах 28-30°С было установлено, что штамм Chlorella sorokiniana AGT обладает высокой степенью деления материнского ядра (на 8 клеток преимущественно), при этом состояние нормативной оптической плотности культуры в 1,4 D (440) достигается за одни сутки, в то время как для штаммов сравнения этот показатель достигается лишь за 2-4 суток (см. таблицу 1.2.).

Таким образом, срок культивирования штамма Chlorella sorokiniana AGT до состояния нормативной оптической плотности 1,4 D (440) значительно меньше по сравнению с другими штаммами. Так, по сравнению даже с ближайшим аналогом (штаммом Chlorella vulgaris BIN) состояние нормативной оптической плотности достигается более чем в 4 раза быстрее при температуре 10°С и в 3 раза быстрее при температурах 28-30°С.

Пример 2. Эффективность штамма в качестве потребителя загрязняющих водоемы веществ.

Для изучения способности нового штамма восстанавливать равновесие в водных системах посредством снижения уровня загрязняющих веществ, а также повышения уровня концентрации растворенного кислорода в воде, были проведены следующие эксперименты. Было взято по 10 л воды из загрязненного водоема (эвтрофированный водоем с ярко выраженными абиотическими и биотическими признаками, включая устойчивое «цветение» воды, наличие неприятного запаха и т.д.) для каждого тестируемого штамма, после чего в пробы добавлены суспензии штаммов с одинаковой нормативной оптической плотностью 1,4-1,8 D (440). Кроме того, в пробы был введен раствор углекислого газа на основе клетчаткосодержащего материала - голозерного овса. Через 48 часов был замерен остаточный осадок органических веществ, содержащийся в 10-литровых емкостях культуральной среды. После этого была рассчитана относительная величина эффективности поглощения биогенных элементов для каждого анализируемого штамма, отражающая степень эффективности изъятия биогенов. Для ее расчета, значение осадка, полученное для штамма Chlorella vulgaris ИФР С-111, было принято за единицу.

Таблица 2.1. - Сравнительные показатели эффективности штамма Chlorella sorokiniana AGT. Показатели Chlorella vulgaris
ИФР С-111 Chlorella vulgaris
BIN Chlorella vulgaris
GKO Chlorella sorokiniana
AGT Остаточный осадок органических веществ,
г асв 4,54 3,88 2,33 0,96 Относительная величина эффективности поглощения биогенных элементов (ИФР С-111=1) 1 1,25 1,95 4,73 Лизис цианобактерии Oscillatoria princeps при 26°С, сутки н.п. н.п. н.п. 3

Обозначения: «г асв» - грамм абсолютно сухого вещества; «н.п.» - не подавляет

Как видно из таблицы 2.1., планктонный эврибионтный штамм Chlorella sorokiniana AGT значительно эффективнее снижает концентрацию основных биогенных элементов по сравнению со штаммами сравнения, в том числе в 3,8 раза эффективнее штамма-аналога (Chlorella vulgaris BIN), что способствует активному подавлению новым штаммом Chlorella sorokiniana AGT роста цианобактерии Oscillatoria princeps, тогда как другие известные штаммы не оказывали никакого влияния на ее рост.

Пример 3. Повышение уровня концентрации растворенного кислорода в воде.

Для проведения эксперимента было взято 20 литров воды из естественного водоема, c начальной концентрацией растворенного кислорода 5,5 мг/л и значением водородного показателя рН 8,0 и разделено на два образца (опытный и контрольный). В опытный образец было добавлено 100 мл суспензии планктонного эврибионтного штамма Chlorella sorokiniana AGT. Через 24 и 48 часов были проведены замеры концентраций растворенного кислорода и значений рН. В результате эксперимента концентрация растворенного кислорода в опытном образце через 24 часа после добавления суспензии нового штамма составила 9,7 мг/л, рН - 8,4, через 48 часов - 10,3 мг/л, рН - 8,0. В контрольном образце не было зафиксировано наблюдаемых изменений. Оба образца содержались на свету в лабораторных условиях при температуре около 24°С.

Как показали проведенные эксперименты, новый штамм Chlorella sorokiniana AGT является высокопродуктивным и способным к активному росту уже при 10°С.Особенностью этого штамма является его высокая адаптивная способность к размножению в широких температурных пределах, что выгодно отличает его от других известных штаммов. Кроме того, новый штамм обладает способностью восстанавливать нарушенное равновесие в водоемах, которое неизбежно теряется в процессе эвтрофикации. Основной причиной эвтрофикации водоемов является чрезмерное использование удобрений в сельском хозяйстве: избыток биогенных элементов, в особенности нитрата и фосфора, вымывается, стекает по поверхности или вымывается грунтовыми водами и таким образом попадает в озера и водоемы. Биогены могут вызывать обильный рост фитопланктона, который препятствует прохождению солнечного света в толщу воды, вследствие чего нарушаются процессы фотосинтеза бентосных растений и тем самым уменьшается концентрация кислорода. Более того, происходит накопление большой массы отмершего фитопланктона - детрита; бактерии, потребляя детрит, уменьшают содержание кислорода, таким образом фитопланктоном вытесняются бентосные растения, наступает гибель рыбы. Предлагаемый штамм способен эффективно поглощать биогенные элементы, например, избыточной азот и фосфор, за счет чего полностью устраняется интенсивное размножение синезеленых водорослей, которые являются начальным звеном развития эвтрофикации. Кроме того, штамм Chlorella sorokiniana AGT является природным антиоксидантом, замедляя процессы гниения, которые начинаются из-за недостатка кислорода. Процесс гниения сопровождается выделением углекислого газа, поэтому торможение процессов гниения новым штаммом способствует предотвращению образования углекислого газа, а выделяемый СО₂ утилизируется штаммом в процессе фотосинтеза.

В результате изучения ремедиационного потенциала нового штамма было установлено, что эврибионтный штамм Chlorella sorokiniana AGT способен эффективно удалять биогенные элементы, а также восстанавливать кислородный режим в эвтрофированных водоемах, вследствие чего предлагаемый штамм может быть использован для стабилизации и восстановления динамического равновесия водоемов любого хозяйственного назначения (от водоемов, предназначенных для питьевого использования, до сильнозагрязненных). Учитывая комплексный полифункциональный биологический механизм и различные группы организмов, которые задействованы при ремедиации, следует также отметить, что новый штамм, благодаря своей функциональной активности, способен ускорять процессы биотического самоочищения водоемов.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Планктонный эврибионтный штамм одноклеточных зеленых микроводорослей Chlorella sorokiniana AGT, способный к фотосинтезу при температуре от 6°С, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Al-29. Штамм Chlorella sorokiniana AGT ВКПМ Al-29 может быть использован для улучшения экологического состояния водных объектов любой категории и назначения, способствуя ускорению процессов биотического самоочищения водоемов вследствие повышения уровня концентрации растворенного кислорода и снижения уровня биогенных элементов в воде. 3 табл., 2 пр.

Планктонный эврибионтный штамм Chlorella sorokiniana AGT ВКПМ Al-29, предназначенный для улучшения экологического состояния водных объектов.