ПЛАНКТОННЫЙ ШТАММ Chlorella kessleri, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/12 C12R1/89 

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF, предназначенный для получения биомассы.

Уровень техники

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111, предназначенный для получения биомассы, которая составляет 30 г/м² сухой биомассы в сутки, и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris ИФР № C-111 являются низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, предназначенный для получения биомассы и очистки сточных вод, нетребовательный к питательной среде; при производственном культивировании за одни сутки сухая биомасса составляет 60-65 г/м² (патент RU 2192459).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris BIN являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG, отличающийся высокой продуктивностью при производственном культивировании: 70 г/м² сухой биомассы за сутки (патент RU 2527895).

Недостатками планктонного штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (три дня).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототип) является штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, обладающий высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств, значительной продуктивностью и высоким содержанием ценных соединений в биомассе (патент RU 2555519). При выращивании на модельной среде (вытяжка из куриного помета), сточных водах птицефабрик и сточных водах спиртовых производств с использованием для культивирования фотобиореактора с постоянным освещением и барботированием среды атмосферным воздухом при температуре 25-27°C получена биомасса 160-180 г сухого веса/м² в сутки (1,6-1,8 г сухого веса/л в сутки). Недостатками прототипа являются накопление низкой биомассы культурой Chlorella vulgaris 711-54 (в 5,0-5,5 раз ниже предлагаемого изобретения), сложный состав питательной среды, а также необходимость барботирования культуры атмосферным воздухом.

Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных - основы увеличения привеса, продуктивности, эффективности рационов и повышения сохранности поголовья; как альголизант водоемов при их биологической реабилитации, а также при очистке сточных вод.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, способного активно продуцировать биомассу на среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды, использование которого предельно сокращает срок производства биомассы (см. таблицу 1).

Описание изобретения

Исходным для селекции Chlorella kessleri NF, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-12, был штамм Chlorella vulgaris BIN из коллекции Пензенского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды.

В результате селекции был отобран штамм, отличающийся высокими показателями производства биомассы за предельно минимальный срок.

Морфологические признаки

Взрослые клетки - шаровидные, диаметром 8-10 мкм, при образовании автоспор 11 мкм. Хлоропласт плотно прилегает к оболочке, по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает 2/3 поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. В старых клетках хлоропласт чашевидный. Молодые клетки размером 1-3 мкм. Автоспор образуется 8-16 (редко 32), по форме тетраэдрические или эллипсоидные, после освобождения из материнской клетки часть из них свободные, другие соединены вместе в цепочку по 6-10 клеток, через некоторое время они рассыпаются на отдельные клетки. Число спор бывает только четное. На агаризированной минеральной среде на шестой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 7-8 мкм. Клетки, как молодые, так и взрослые, темно-зеленого цвета.

Физиологические признаки

Штамм автотрофный, как в лабораторных, так и в производственных условиях растет на комплексной питательной среде, состоящей из растворов четырех составов химических реактивов на один литр водопроводной воды и фугата послеспиртовой барды, причем последний вводится в питательную среду до получения уровня pH не ниже 7,0.

Составы питательной среды (1):

состав №1: азотно-фосфорный - 0,30 мл;

состав №2: железисто-натриевый - 0,15 мл;

состав №3: медно-кобальтовый - 0,15 мл;

состав №4: сернокислого калия - 0,33 мл.

Штамм не требует подачи углекислого газа и барботирования культуры воздухом.

Введение фугата в суспензию хлореллы способствует образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в высокопродуктивной экосистеме аквакультуры (см. чертеж) [Богданов Н.И., Эгамов М.С., 1993 (стр. 26)].

Штамм приспособлен к прямому солнечному освещению или освещению лампами, ДНаТ- или ДРИ-250. Суточный ритм освещения как при солнечном, так и при искусственном состоит из двух фаз - световой и темновой, при этом первая составляет 20 часов, вторая 4 часа. Однако световая, как и темновая, включает два равных периода по 10 и по 2 часа. Поле каждой световой фазы на 2 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы. Спорообразование и деление клеток наступает после каждой световой фазы. За период темновой фазы в культуру выходят автоспоры. При солнечном освещении или освещении лампами температура суспензии хлореллы не должна превышать 30°C. Оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°C, в темновой фазе 23-25°C; культура выдерживает температуру до 33°C.

Цикл развития штамма за суточный период следующий: в световую фазу первого периода, который длится 10 часов, идет активный процесс фотосинтеза, в результате чего клетки интенсивно набирают биомассу. Размеры клеток увеличиваются до 8-10 мкм, клетки со спорами достигают 11 мкм. К концу первой фазы светового периода основная часть клеток со спорами или они уже поделились. В это время наступает первая фаза темнового периода, которая длится 2 часа. К концу первой фазы темнового периода в культуре преобладают молодые клетки. По окончании первой фазы темнового периода наступает вторая световая фаза, которая длится так же, как и первая - 10 часов. Активный процесс фотосинтеза продолжается, молодые клетки увеличиваются в размере до 8-10 мкм и соответственно набирают биомассу. В начале второго темнового периода биомасса становится максимальной, ее сливают и используют в виде суспензии или центрифугируют. Продуктивность штамма за сутки составляет 8-10 г/л сухого веса.

Таким образом, клеточное деление, формирование и освобождение автоспор происходит два раза в течение суток и имеет строгую привязку к определенному времени.

Культуральные свойства

Штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще, а также равномерно распределятся в культуральной среде благодаря тому, что клетки несут на себе отрицательный заряд.

Данная культура не реагирует на сезонность, отмечается высокая бактерицидность к патогенной микрофлоре (Протокол испытаний №16587, прилагается), агглютинация отсутствует, автолиз клеток не наблюдается.

Штамм строго соблюдает условия монокультуры по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.

Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают, например, при длительных перевозках в неприспособленных емкостях, а также при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами. При культивировании штамм требователен к строгому соблюдению биотехнологии выращивания, составу питательной среды и фугату послеспиртовой барды, при этом к использованию допускается зерновой (пшеница, кукуруза, ячмень) фугат.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования

Для культивирования штамма используется «Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2571939), которая позволяет использовать как светильники, так и солнечное освещение. Установка содержит расположенные на каркасе два аквариума для суспензии, светильники, емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии, соединенные с аквариумами трубопроводами. Аквариумы соединены между собой трубопроводом для уравновешивания объема в каждом аквариуме. Один из аквариумов для суспензии выполнен с возможностью выращивания маточной культуры и обеспечивает единый биотехнологический процесс. Светильники в каждом аквариуме расположены эксцентрично по отношению к его продольной оси. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за один день получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.

Культивирование планктонного штамма Chlorella kessleri NF с использованием фугата послеспиртовой барды в составе питательной среды способствует интенсивному набору биомассы, во много раз превышающей известные штаммы (табл.), причем без подачи углекислого газа, барботирования воздухом, а также исключая постоянное перемешивание суспензии.

Пример получения биомассы

В аквариумы «Установки непрерывного выращивания планктонных водорослей» по патенту 2571939 вводят питательную среду (1) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella kessleri NF с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°C. По истечении этого периода лампы отключают на 2 часа. По окончании 2 часов повторно включают лампы на 10 часов. По окончании второго светового периода культуру сливают и используют для выпаивания животным или центрифугируют для получения биомассы. За суточный период культивирования биомасса составляет 10 г/л сухого веса.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена биомасса с использованием планктонного штамма Chlorella kessleri NF на питательной среде (1) с добавлением фугата послеспиртовой барды в модельной установке по патенту 2571939, которая за одни сутки составила 8-10 г/л сухого веса, что превышает показатель прототипа в 5,5 раза.

Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным по сравнению с известными и имеет широкий спектр использования биомассы: как корм для сельскохозяйственных животных; как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод.

Источники информации

1. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris - продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.

2. Патент РФ 2192459 от 18.04.2001, кл. 7 c12N 1/12, C02F 3/34. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris BIN для получения биомассы и очистки сточных вод. Богданов Н.И. 10.11.2002. Бюл. №31.

3. Патент РФ 2527895 от 30.03.2010, кл. C2. Планктонный штамм водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий. Богданов Н. 10.09.2014. Бюл. №25.

4. Патент РФ 2555519 от 12.08.2013, кл. C2. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств. Лобакова Е.С. и др. 10.07.2015.

5. Патент РФ 2571939 от 15.04.2015. кл. C1. Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей. Богданов Н.И. 27.12.2015. Бюл. №36.

6. Богданов Н.И., Эгамов М.С. Микробиологические процессы и рыбоводные результаты интенсивно эксплуатируемых прудов Таджикистана. Деп. ВИНИТИ №197 - B93, 1993. - С. 80.

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF обладает высокой продуктивностью. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-12 и может быть использован для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных, а также как альголизант водоемов при их биологической реабилитации и очистке сточных вод. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Планктонный штамм Chlorella kessleri ВКПМ А1-12, предназначенный для получения биомассы.