Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris KD BCF, предназначенный для получения биомассы Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для получения биомассы.

Уровень техники

Известен из патента RU 1751981 штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111, предназначенный для получения биомассы. Штамм обладает высокой продуктивностью и отвечает требованиям промышленного культивирования. Продуктивность штамма ИФР № С-111 составляет 30 г/м² сухой биомассы в сутки.

Недостатками штамма Chlorella vulgaris ИФР № C-111 являются низкая биомасса получаемой продукции (0,6 г сухого вещества на литр) и длительный срок ее культивирования (четыре дня), прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка.

Известен из патента RU 2726111 планктонный штамм Parachlorella kessleri MA, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-27. Планктонный штамм Parachlorella kessleri ВКПМ А1-27 может быть использован для производства фармацевтических препаратов, биологически активных добавок, в ветеринарии, при биологической реабилитации водоемов, для повышения плодородия почвы и для получения пищевой продукции. Изобретение позволяет повысить выход биомассы 1 г.

Недостатками являются низкий выход биомассы: за 10-часовой период культивирования биомасса составляет 1,0 г/л сухого вещества и сложное приготовление раствора СО₂ в виде настоя голозерного овса на фугате коньячного спирта и картофельном соке.

Известен из патента RU 2585523 планктонный штамм Chlorella kessleri ВКПМ Al-11 ARW, обладающий способностью предотвращать "цветение" водоемов сине-зелеными водорослями, расти в производственных культиваторах при температуре 25-30°С, а в водоемах сохраняться от 4 до 16°С и расти от 17 до 30°С, отличающийся более высокой продуктивностью при культивировании в производственных установках, имеющего возможность сезонного размножения в условиях естественных водоемов и круглогодичного развития в производственных культиваторах, наделенного адаптацией к условиям водоемов различных климатических зон и к воде различных регионов для производственного культивирования.

Недостатком штамма является узкий спектр применения и низкая производительность биомассы: культура достигает нормативной оптической плотности 1,8-2,0 D (440) за три дня. Клетки штамма в культуре погибают при динамических ударах, например, длительная перевозка в цистернах, а также при механическом перемешивании культуры. При культивировании в установках штамм требователен к соблюдению биотехнологии выращивания, составу питательной среды и подаче раствора углекислого газа.

Наиболее близким аналогом является планктонный штамм Chlorella vulgaris ВКПМ А1-24 GKO, известный из патента RU 2644653 и предназначенный для получения биомассы. Штамм имеет тонкую оболочку, выращивается в синхронном режиме с использованием зерноматериала (голозерного овса) для получения раствора углекислого газа. Цикл выращивания - одни сутки, при этом оптическая плотность суспензии достигает 1,8-2,0 D (440).

К недостаткам штамма Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24 GKO относится очень узкий спектр использования (только для получения пищевой биомассы), слабо выраженная аллелопатия и низкая продуктивность, составляющая за сутки 1,0 г/л сухого веса.

Раскрытие сущности изобретения

Технической проблемой заявляемого изобретения является создание нового планктонного штамма микроводоросли с широким спектром применения биомассы, использующейся как продукт питания, сырье для производства фармацевтических препаратов и биологически активных добавок, для биологической реабилитации водоемов и очистки сточных вод.

Техническим результатом изобретения является получение штамма микроводоросли, отвечающего требованиям промышленного культивирования, имеющего возможность круглогодичного развития в производственных культиваторах, способного активно продуцировать биомассу в автоматическом режиме, выращенного на модифицированной питательной среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды. Регулирование количества фугата в составе питательной среды в период световых фаз, а также увеличение светового потока ламп пропорционально увеличению оптической плотности суспензии, способствует росту производства биомассы.

Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris KD BCF депонированный в Коллекции культур водорослей и простейших (CCAP) (Oban, UK) под номером 211/144, предназначенный для получения биомассы, отвечает требованиям промышленного выращивания и может использоваться для широкого спектра применений: как продукт питания, для изготовления напитка, как сырье для производства фармацевтических препаратов и биологически активных добавок, как корм для сельскохозяйственных животных, как биостимулятор для растений, как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод.

Осуществление изобретения

Исходным для селекции штамма Chlorella vulgaris KD BCF, депонированным в Коллекции культур водорослей и простейших (CCAP) (Oban, UK) под номером 211/144, был штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 из коллекции Института физиологии растений РАН, который культивировался на модифицированной питательной среде с включением в её состав фугата послеспиртовой барды.

В результате селекции был отобран штамм, способный интенсивно продуцировать свою биомассу в автоматическом режиме культивирования. Штамм поддерживает монокультуру в процессе производства.

Для образования бактериально-альгологического микробиоценоза и постоянной поддержки в суспензии хлореллы СО₂ в процессе роста клеток хлореллы в суспензию периодически добавляют фугат послеспиртовой барды, что значительно увеличивает скорость протекание биологических процессов в экосистеме аквакультуры.

Подача фугата послеспиртовой барды в суспензию хлореллы производится не только в момент запуска установки (культиватора хлореллы) в работу при включении ламп до получения уровня pH равным 7,0, но и далее в течение периода роста клеток хлореллы (световая фаза), таким образом, чтобы значение рН суспензии хлореллы находилось в диапазоне 7,0 -7,5 в течение 12 часов 18-ти часовой световой фазы.

За сутки проходят две 9-ти часовые световые фазы (лампы установки включены) и две 3-х часовые темновые фазы (лампы установки выключены).

Перед началом первой 9-ти часовой световой фазы в установку вносят питательную среду и маточную культуру плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1, затем в установку вносят фугат послеспиртовой барды до достижения рН суспензии равным значению 7,0.

В течение первой световой фазы клетки активно растут и набирают биомассу. В процессе фотосинтеза значение рН суспензии растет, и при достижении 7,5 автоматически производится добавление фугата до значения рН суспензии равным 7,0. Так происходит в течение 6-ти часов первой 9-ми часовой световой фазы. После 6-ти часов и до конца (9-ти часов) первой световой фазы больше фугат не добавляется. Размеры клеток увеличиваются до 10-11 мкм.

В конце первой световой фазы часть клеток образуют споры. В течение первой темновой фазы клетки интенсивно делятся и начинаю расходиться. К концу первой темновой фазы большинство клеток поделились и разошлись.

Вторая 9-ти часовая световая фаза начинается после окончания первой темновой фазы, то есть через 12 часов после запуска установки в работу.

При этом мощность светового потока ламп увеличивают в 1,5 раза, а фугат послеспиртовой барды добавляется автоматически в суспензию по такому же принципу, что и в первую световую фазу, чтобы значение рН поддерживалось в диапазоне значений от 7,0 до 7,5 в течение первых 6-ти часов второй световой фазы. После 6-ти часов фугат не добавляется. В течение второй световой фазы клетки активно растут и набирают биомассу, размер клеток увеличивается до 10-11 мкн. К концу второй световой фазы часть клеток образуют споры.

После окончания второй 9-ти часовой световой фазы начинается вторая 3-х часовая темновая фаза (лампы выключаются). В течение второй темновой фазы клетки интенсивно делятся и расходятся.

За час до окончания второй темновой фазы вся суспензия перекачивается в приёмную ёмкость. Половина готовой суспензии используется по назначению, а половина объема готовой суспензии используется как маточная для следующего суточного цикла выращивания.

После перекачивания готовой суспензии в приёмную ёмкость производится автоматическая мойка ёмкости фотореактора, набор воды и приготовление питательной среды для следующего суточного цикла, а также добавление маточной культуры из приёмной ёмкости. Соотношение питательной среды и маточной культуры соответствует 1:1.

Непосредственно перед началом первой 9-ти часовой световой фазы следующего суточного цикла и включения ламп в суспензию добавляется фугат послеспиртовой барды до значения рН суспензии равным 7,0. Затем включаются лампы культиватора и начинается второй суточный цикл работы установки.

Продуктивность штамма за сутки составляет 2,5 г/л сухого веса.

Физиологические признаки.

Штамм автотрофный, растёт на модифицированной комплексной питательной среде, состоящей из шести растворов химических реактивов, одного литра водопроводной воды и фугата послеспиртовой барды. Фугат послеспиртовой барды вносится в процессе культивирования в течение 12 часов световой фазы, причем значение рН суспензии поддерживается автоматически в пределах значений 7,0-7,5.

Состав питательной среды (1):

1. Аммиачная селитра, ГОСТ 2-2013 - 0,24 г.

2. Аммофос, ГОСТ 18918-85, 15% раствор.

3. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор.

4. Магний сернокислый, ГОСТ 4523-77,10% раствор.

5. Марганец сернокислый, ГОСТ 435-77, 1,0% раствор.

6. Железо хлорид, ГОСТ 4147-74, 3% раствор.

7. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,6% раствор.

8. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,6% раствор.

9. Натрия хлорид, ГОСТ 51574-2000 - 0,40 гр.

10. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) - 2,0-5,0 мл.

11. Водопроводная вода по СанПиН 2.1.4.1074-01 - 1000 мл.

Состав рабочей питательной среды (2) на один литр водопроводной воды по СанПиН 2.1.4.1074-01 следующий:

1. Азотно-фосфорный - 0,30 мл.

2. Железо-натриевый - 0,05 мл.

3. Медно-кобальтовый - 0,0167 мл.

4. Сернокислый калий - 0,30 мл.

5. Сернокислый магний - 0,30 мл

6. Сернокислый марганец - 0,05 мл

7. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) - 2,0-5,0 мл.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования.

Установка для культивирования содержит ёмкость фотореактора, станцию подготовки питательного раствора, приёмную ёмкость для готовой суспензии, ёмкость для фугата послеспиртовой барды, регулятор значения рН в суспензии, светильники светодиодных ламп.

Ёмкость фотореактора и приёмная ёмкость для готовой суспензии снабжены устройствами мойки и регулирования заполнения.

Установка для культивирования отвечает требованиям промышленного выращивания хлореллы в автоматическом режиме.

Интенсивные условия культивирования, созданные в установке, обеспечивают оптическую плотностью 1,8-2,0 D (440).

Культивирование планктонного штамма Chlorella vulgaris KD BCF с периодическим добавлением фугата послеспиртовой барды в питательную среду и регулированием значения рН в суспензии хлореллы в пределах 7,0-7,5 в течение первых 6-ти часов каждой световой фазы, а также увеличение мощности светового потока в период второй световой фазы пропорционально росту оптической плотности суспензии, способствует более интенсивному набору биомассы.

Пример получения биомассы

В ёмкость фотореактора установки вносят питательную среду (1) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella vulgaris KD BCF с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1.

Перед включением ламп установки в фотореактор добавляют фугат послеспиртовой барды до значения рН суспензии хлореллы равным 7,0. Температура суспензии в фотореакторе поддерживается в пределах 28-32°С, первая световая фаза длится 9 часов.

В процессе культивирования рН суспензии увеличивается, и при достижении значения рН=7,5 происходит автоматическое добавление фугата послеспиртовой барды до значение рН=7,0. Автоматическое регулирование и поддерживание значения рН в суспензии в пределах 7,0-7,5 производится в течение 6-ти первых часов культивирования. Последние 3 часа световой фазы фугат послеспиртовой барды не добавляется.

После окончания первой 9-ти часовой световой фазы лампы выключаются и начинается первая 3-х часовая темновая фаза.

После окончания первой темновой фазы начинается вторая 9-ти часовая световая фаза, при этом световой поток увеличивается в 1,5 раза пропорционально росту оптической плотности суспензии. Благодаря увеличению мощности светового потока в период второй световой фазы создаются условия для более интенсивного роста биомассы хлореллы. Автоматическое регулирование и поддержание значения рН в суспензии в пределах 7,0-7,5 производится в течение 6-ти первых часов второй световой фазы также, как и в первую световую фазу.

После окончания второй 9-ти часовой световой фазы, начинается вторая 3-х часовая темновая фаза (лампы выключены).

За час до окончания второй темновой фазы вся суспензия перекачивается в приёмную ёмкость. Половина готовой суспензии используется по назначению, а половина объема готовой суспензии используется как маточная для следующего суточного цикла выращивания.

После перекачивания готовой суспензии в приёмную ёмкость производится автоматическая мойка ёмкости фотореактора, набор воды и приготовление питательной среды для следующего суточного цикла, а также добавление маточной культуры из приёмной ёмкости. Соотношение питательной среды и маточной культуры соответствует 1:1.

Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным по сравнению с наиболее близким аналогом в 2,5 раза, имеет широкий спектр использования биомассы: как продукт питания, для изготовления напитка, как сырье для производства фармацевтических препаратов и биологически активных добавок, как корм для сельскохозяйственных животных; как биостимулятор для растений, как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод.

Секвенирование ДНК штамма KD BCF микроводоросли Chlorella vulgaris было проведено в генетической лаборатории Hylabs (Израиль) в феврале - мае 2024 года и дало следующие результаты:

Методы: Подготовка библиотеки ДНК для NGS: ДНК из KD BCF использовалась для создания библиотек ДНК для NGS с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext® Ultra™ II для платформ Illumina® и NEBNext ® Multiplex Oligos для Illumina® в соответствии с инструкциями к набору. Для создания индексированных библиотек для секвенирования Illumina. Конечную концентрацию библиотеки для каждого образца определяли с использованием Qubit (Invitrogen) и набора Denovix dsDNA High Sensitivity Kit в соответствии с инструкциями к набору Denovix. Размер каждой библиотеки определялся с помощью анализа TapeStation с использованием D1000 Screentape в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование NGS: Библиотеку загружали в Illumina Miseq и секвенировали с использованием набора циклов Miseq V2-500 для генерации 2x250 парных считываний. Данные были демультиплексированы на Basespace, сервере Illumina, для создания файлов FASTQ для каждого образца.

Отчет о секвенировании представлен в Таблице.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для получения биомассы. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris KD BCF депонирован в CCAP под номером 211/144, предназначен для получения биомассы, отвечает требованиям промышленного выращивания и может использоваться для широкого спектра применений: как продукт питания, для изготовления напитка, как сырье для производства фармацевтических препаратов и биологически активных добавок, как корм для сельскохозяйственных животных, как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод. 1 табл., 2 пр.

Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris KD BCF CCAP 211/144, предназначенный для получения биомассы.