СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КВАТЕРНИЗИРОВАННЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ УЛЬТРАЗВУКА Российский патент 2022 года по МПК C08B37/08 

Изобретение относится к области биотехнологии, модификации природных полимеров, в частности с применением «клик-химии» (эффективные реакции для быстрого получения веществ путем соединения между собой отдельных маленьких элементов) и может быть использовано для получения водорастворимых катионных производных природного полисахарида хитозана, обладающих широким спектром биологической активности, которые могут быть использованы в качестве антибактериального, фунгицидного и трансфекционного агента.

Сущность предложенного изобретения заключается в том, что катализ азид-алкинового [3+2] циклоприсоединения (CuAAC) осуществляется в результате формирования Cu(I) in situ, под действием ультразвука (частотой 18-200кГц, мощностью 50-300Вт) в аэробных условиях в присутствии уксусной кислоты и металлической меди (медной проволоки, стружки и т.п.). Модифицированный биополимер, полученный в результате полимераналогичных превращений, содержит гидрофильную функциональную группу (четвертичная аммониевая). В результате синтез осуществляется в водном растворе азидного производного биополимера в 1% уксусной кислоте под действием ультразвука при комнатной температуре, нормальном давлении окружающей среды (760 мм рт.ст.), в течение 5-30 минут. По исчезновению на ИК-спектре интенсивного сигнала азидного производного хитозана в области 2100 см^-1 судят об окончании реакции.

Способ катализа химической реакции присоединения между одним реагентом, содержащим концевую алкиновую группу и вторым реагентом с азидным фрагментом для образования продукта, содержащего триазольную группу (Патент США № 8580970 B2) описан К.Б. Шарплессом и соавторами. С тех пор данная реакция, относящаяся к «клик-химии» находит широкое применение в биоконъюгации (патент США № 2017/0297008), обработке нуклеиновых кислот (EP2751125 B1, EP3146068 A1), полимерных покрытиях и герметиках (патент США № 9790398 B2), разработке новых противораковых лекарственных средств (патент США № 8,865,715 В2, приложение к патенту США, опубликованное 2016/0206754). Таким образом, «клик-химия» является перспективным инструментом модификации природных и полусинтетических соединений.

Химическая модификация хитозана является важным шагом для улучшения его свойств, таких как растворимость, биосовместимость, биологическая активность и др. Введение гидрофильного заместителя в состав полимерной цепи является одним из способов улучшения растворимости биополимера [B. Shagdarova, A. Lunkov, A. Il'ina, V. Varlamov. Investigation of the properties of N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium) propyl] chloride chitosan derivatives. Int. J. Biol. Macromol. 2019. V. 124. P. 994-1001)]. Исходя из того, что большинство физико-химических и биологических свойств биополимера обусловлены его поликатионной структурой, увеличение катионной плотности за счет синтеза производных полисахарида, содержащих четвертичные аммониевые фрагменты, представляет собой перспективное направление в области химии хитозана. Катионные производные хитозана могут быть получены в результате протекания эффективных «клик-реакций» азидных производных хитозана. Известно, что реакция Хьюсгена является медленным, высокотемпературным и неселективным процессом, который дает эквимолярную смесь региоизомеров 1,4- и 1,5-дизамещенных 1,2,3-триазолов, однако в присутствии каталитического количества Cu (I) скорость реакции возрастает на многие порядки [ Nicasio M.C., Copper-catalysed azide-alkyne cycloadditions (CuAAC): An update // Org. Biomol. Chem. 2015. Vol. 13, № 37. P. 9528-9550]. В последнее время в работах исследователей все чаще рассматривается двухстадийная модификация хитозана с использованием клик-реакций, в частности азид-алкиновое [3+2] циклоприсоединение с образованием 1,2,3 - триазольного фрагмента [Kritchenkov A.S., Skorik Y.A. Click reactions in chitosan chemistry // Russ. Chem. Bull. 2017. Vol. 66, № 5. P. 769-781]. Так, в работе [Kritchenkov A.S. et al. Ultrasound-assisted Cu(I)-catalyzed azide-alkyne click cycloaddition as polymer-analogous transformation in chitosan chemistry. High antibacterial and transfection activity of novel triazol betaine chitosan derivatives and their nanoparticles // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V., 2019. Vol. 137. P. 592-603.] были синтезированы триазольные производные хитозана (ММ 37кДа, СД=74%), содержащие четвертичный аммониевый фрагмент. Азидное производное хитозана было получено в результате предварительного алкилирования хитозана азидохлорпропаном или восстановительного алкилирования хлоруксусным альдегидом с последующей обработкой азидом натрия. Полученные азидированные производные имели степень замещения 16-67%. При этом для интенсификации стадии клик-модификации была применена обработка реакционной массы ультразвуком. Для катализа азид-алкинового циклоприсоединения использовалась система на основе медной проволоки и сульфата пентагидрата меди Cu⁰/CuSO₄⋅5H₂O. Диспропорционирование медной проволоки Cu⁰ в присутствии Cu(II) вело к образованию активной формы Cu(I), катализирующей реакцию. Используемая каталитическая система позволяла вести реакцию в аэробных условиях. Реакция протекала при комнатной температуре в течение 15 минут при следующих параметрах ультразвука: частота 200 кГц, мощность 120 Вт. Таким образом, были получены триазолбетаиновые производные.

Синтез триазольного кватернизированного производного хитозана был также осуществлен в работе [Tashakkorian H. et al. Transparent chitosan based nanobiocomposite hydrogel: Synthesis, thermophysical characterization, cell adhesion and viability assay // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V., 2020. Vol. 144. P. 715-724.]. На первой стадии хитозан обрабатывали хлорацетилхлоридом в присутствии триэтиламина. Продукт представлял собой частично замещенный триэтилацетамидохитозан. Затем свободные хлорацетамидные группы были обработаны азидом натрия, в результате чего было получено азидированное производное. В дальнейшем азидированный хитозан вступал во взаимодействие с пропаргилтриэтиламином в присутствии CuCl и триэтиламина при 80°C в течение 24 часов. Таким образом, было получено производное хитозана, имеющее 1,2,3-триазольный фрагмент.

Кватернизированное производное хитозана, несущее положительно заряженный трифенилфосфониевый фрагмент, было получено в работе [Tan W. et al. Enhanced antifungal activity of novel cationic chitosan derivative bearing triphenylphosphonium salt via azide-alkyne click reaction // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V, 2020. Vol. 165. P. 1765-1772]. Использовался подход, в котором пропаргильный фрагмент сначала был введен в цепь триметилхитозана, а затем была осуществлена клик-модификация с введением активной группы.

Таким образом, «клик-химия» является удобным и перспективным инструментом для включения разнообразных органических структур в полимерную цепь производных хитозана, в том числе, содержащих положительно заряженные функциональные группы.

Настоящее изобретение направлено на решение задачи простого и эффективного подхода для синтеза новых производных на основе биоразлагаемого природного материала (производного хитозана). Наиболее близким к заявляемому является способ получения на основе азидного производного хитозана, описанный в работе [Kritchenkov A. S. и др. Ultrasound-assisted Cu(I)-catalyzed azide-alkyne click cycloaddition as polymer-analogous transformation in chitosan chemistry. High antibacterial and transfection activity of novel triazol betaine chitosan derivatives and their nanoparticles // Int. J. Biol. Macromol. 2019. Т. 137. С. 592-603.], в которой синтез наночастиц осуществлялся под действием ультразвука частотой 45-200 кГц в течение 10-25 минут с последующим осаждением продукта органическим растворителем и диализом реакционной смеси в дистиллированной воде с ЭДТА.

К недостаткам этого метода следует отнести более сложные условия проведения реакции, необходимость вводить дополнительно сульфат меди для формирования активного Cu(I). Кроме того, конечный продукт необходимо в течение продолжительного времени тщательно очищать с использованием большого количества ЭДТА и в результате с большим расходом диализной воды.

Использованный в заявленном способе подход позволил значительно упростить процедуру синтеза производных, содержащих 1,2,3-триазольный фрагмент. Известно, что производные хитозана намного лучше растворимы в кислых условиях за счет протонирования первичных, вторичных и третичных аминогрупп. Уксусная кислота в присутствии кислорода воздуха (через образование CuO) может взаимодействовать с медью с образованием каталитических количеств Cu (II) [DeMeo S. Does copper metal react with acetic acid? // J. Chem. Educ. 1997. Vol. 74, № 7. P. 844-846]. Cu(II) в дальнейшем может диспропорционировать в присутствии металлической меди с образованием активной формы Cu(I) in situ, катализирующей процесс синтеза. Кроме того, на примере реакций низкомолекулярных веществ есть свидетельства того, что уксусная кислота в присутствии оснований (хитозан является полимерным основанием) может способствовать протеканию азид-алкинового циклоприсоединения в водных растворах при комнатной температуре [Sarode, P. B., Bahekar, S. P., & Chandak, H. S. (2016). DABCO/AcOH Jointly Accelerated Copper(I)-Catalysed Cycloaddition of Azides and Alkynes on Water at Room Temperature. Synlett, 27(19), 2681-2684].

Сущность способа получения кватернизированных производных в результате «клик-реакции» заключается в том, что навеску (100 мг) азидного производного, помещают в 1% уксусную кислоту (6 мл). Затем на дно колбы помещают металлическую медь (проволока, стружка и т.п.), добавляют алкин, исходя из стехиометрического количества азидных функциональных групп в исходном производном. Полученную реакционную массу обрабатывают ультразвуком в течение 5-30 минут при мощности 50-300 Вт, частоте 18-200 кГц. Полученный продукт высаживают органическим растворителем и диализуют против дистилированной воды, лиофильно высушивают. В результате получают кватернизированное производное хитозана, растворимое в широком интервале рН. Полученный продукт характеризуют аналитическими методами: ИК, ПМР.

На фиг. 1 приведена общая схема реакции и структура реагентов:

R¹ - «спейсеры» между макромолекулой и азидной группой;

R² - «спейсер» между алкином и четвертичным аммонием;

R³ - заместители в четвертичном аммониевом фрагменте. В положении O-6-(R¹-N₃) или H

На фиг.2 приведен типичный ¹H ЯМР спектр водорастворимого триазольного производного хитозана.

Пример 1

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (35 кГц, 100 Вт) в течение 25 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 135 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 2

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (35 кГц, 100 Вт) в течение 25 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 135 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 3

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 28 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (50 кГц, 100 Вт) в течение 20 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 140 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 4

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 28 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (50 кГц, 100 Вт) в течение 20 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 140 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 5

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (100 кГц, 150 Вт) в течение 15 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 145 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 6

100 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 6 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (100 кГц, 150 Вт) в течение 15 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 145 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 7

150 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 9 мл 1% уксусной кислоты, добавили 50 мг N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (150 кГц, 200 Вт) в течение 25 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 190 мг водорастворимого продукта реакции.

Пример 8

150 мг азидного производного хитозана, полученного на основе хитозана с молекулярной массой 47 кДа, растворили в 9 мл 1% уксусной кислоты, добавили 40 мг N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромида. Обработали ультразвуком (150 кГц, 200 Вт) в течение 25 мин. Продукт высадили ацетоном, диализовали против дистилированной воды, лиофильно высушивали. Получили 175 мг водорастворимого продукта реакции.

Изобретение относится к получению производных хитозана. Способ получения кватернизированных водорастворимых производных хитозана под действием ультразвука предусматривает использование в качестве каталитической системы меди в уксусной кислоте с концентрацией 1-20 мг/мл, получаемой путем размещения на дне колбы металлической меди, применяемой в виде стружки или проволоки в количестве 100-200 мг на 6 мл уксусной кислоты. Синтез проводят под действием ультразвука 18-200 кГц, 50-300 Вт при комнатной температуре в течение 5-30 мин, предварительно добавляя к раствору азидного производного хитозана N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромид или N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромид, с последующим высаживанием в органическом растворителе, диализом и лиофильным высушиванием. Изобретение направлено на получение водорастворимого производного. 2 ил., 8 пр.

Способ получения кватернизированных водорастворимых производных хитозана под действием ультразвука, отличающийся тем, что в качестве каталитической системы используют медь в уксусной кислоте с концентрацией 1-20 мг/мл, получаемую путем размещения на дне колбы металлической меди, применяемой в виде стружки или проволоки в количестве 100-200 мг на 6 мл уксусной кислоты, синтез проводят под действием ультразвука 18-200 кГц, 50-300 Вт при комнатной температуре в течение 5-30 мин, предварительно добавляя к раствору азидного производного хитозана N,N,N-триэтилпроп-2-ин-1-аммоний бромид или N,N,N-триметилпроп-2-ин-1-аммоний бромид, с последующим высаживанием в органическом растворителе, диализом и лиофильным высушиванием.