Способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетического анализа Российский патент 2022 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетического анализа.

Преэклампсия (ПЭ) – мультисистемное патологическое состояние, возникающее во второй половине беременности (после 20-й недели), характеризующееся артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией (≥0,3 г/л в суточной моче), нередко, отеками и проявлениями полиорганной/полисистемной дисфункции/недостаточности (Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия: клинические рекомендации (протокол лечения) / Л.В. Адамян, Н.В. Артымук, Н.В. Башмакова [и др.]. – Москва, 2016. – 72 с.).

Как свидетельствуют литературные данные, частота встречаемости преэклампсии во всем мире составляет 2-8% (Сидорова И.С. Обоснование современной концепции развития преэклампсии / И.С. Сидорова, Н.А. Никитина // Акушерство и гинекология. – 2019. – № 4. – С. 26-33). ПЭ является одной из основных причин материнской смертности и перинатальных смертей (The International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) initiative on pre-eclampsia: a pragmatic guide for first-trimester screening and prevention / L.C. Poon, A. Shennan, J.A. Hyett [et al.] // Int. J. Gynecol. Obstet. – 2019. – Vol. 145, suppl. 1. – P. 1-33). При развитии тяжелой преэклампсии и эклампсии существенно повышается риск развития различных осложнений (отслойка плаценты, массивные акушерские кровотечения, ДВС-синдром, HELLP-синдром, острая почечная и печеночная недостаточность и др.) (Почему преэклампсия трансформируется в HELLP-синдром? Роль системы комплемента / А.Н. Стрижаков, Е.В. Тимохина, И.А. Федюнина [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2020. – № 5. – С. 52-57). В последующей жизни у этих женщин значительно чаще регистрируются артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инсульт. Дети, родившиеся в результате беременностей, осложненных ПЭ, имеют низкий вес и высокий риск развития ряда неинфекционных хронических заболеваний (Evaluation of sFlt-1/PlGF ratio for predicting and improving clinical management of pre-eclampsia: experience in a specialized perinatal care center / H. Caillon, C. Tardif, E. Dumontet [et al.] // Ann. Lab. Med. – 2018. – Vol. 38, № 2. – P. 95-101).

Этиопатогенез преэклампсии отражает широкий спектр факторов риска, а также сложность и гетерогенность данного осложнения беременности. В настоящее время к факторам риска преэклампсии относят: возраст, индекс массы тела, ожирение, возраст наступления менархе, первая беременность, многоплодная беременность, преэклампсия в предыдущую беременность, вспомогательные репродуктивные технологии, семейный анамнез преэклампсии, сопутствующая экстрагенитальная патология (сахарный диабет, артериальная гипертензия, заболевания почек и другие), курение, употребление алкоголя (Pre-pregnancy BMI, gestational weight gain and risk of preeclampsia: a birth cohort study in Lanzhou, China / Y. Shao, J. Qiu, H. Huang [et al.]. – DOI: 10.1186/s12884-017-1567-2 // BMC Pregnancy Childbirth. – 2017. – Vol. 17, № 1. – Art. 400. – URL: https://bmcpregnancychildbirth.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12884-017-1567-2).

Современные представления о патогенезе ПЭ состоят в том, что данное осложнение возникает из-за иммунной дезадаптации между матерью и плодом. В норме течение беременности связано с иммунологической толерантностью к плоду, который является генетически чужеродным объектом для организма матери. При этом, чем больше генетические различия между организмом плода и матери, тем выше иммунологическая толерантность.

Многочисленные исследования указывают на мультифакториальность преэклампсии, что предполагает оценку генетического компонента в развитии данного осложнения беременности. В настоящее время научные исследования, посвященные молекулярно-генетическому исследованию преэклампсии, активно проводятся по всему миру.

Поиск генов-кандидатов основан на их возможной роли в патогенезе преэклампсии (A review of candidate genes and pathways in preeclampsia-an integrated bioinformatical analysis / M.A. Mohamad, N.F. Mohd Manzor, N.F. Zulkifli [et al.]. – DOI: 10.3390/biology9040062 // Biology (Basel). – 2020. – Vol. 9, № 4. – Art. 62. – URL: https://www.mdpi.com/2079-7737/9/4/62/htm). Исходя из того, что развитие преэклампсии связывают с развитием окислительного стресса и воспалительного процесса, приводящих к эндотелиальной дисфункции, многие исследования направлены на поиск генов-кандидатов, участвующих в этих процессах: гены эндотелиальной дисфункции, гены вазоактивных факторов, гены иммунных и воспалительных реакций, гены окислительного стресса, гены липидного обмена, гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, гены наследственных тромбофилий.

В основе патогенеза преэклампсии лежит эндотелиальная дисфункция, связанная с развитием окислительного стресса и воспалительных реакций. В формирование этих процессов вовлечены множество различных факторов (материнские, средовые, генетические). При этом генетические факторы играют наиболее значимую роль.

Ген UGT2B4 кодирует фермент УДФ-глюкуронозилтрансферазы 2B4, который участвует в процессах образования коньюгатов (глюкуронирования) ксенобиотиков, половых гормонов, билирубина и др. с молекулами глюкуроновой кислоты, обеспечивая их инактивацию (http://www.genecards.org/). Полиморфные локусы rs13111134 и rs2013573 гена UGT2B4 находятся в неравновесии по сцеплению между собой (r²=0,69) и связаны с уровнем транскрипции генов UGT2B4 и UGT2A3P7 (11 SNPs, сильно сцепленных (r²≥0,8) с rs13111134 также связаны с уровнем экспрессии этих генов). Также rs13111134 UGT2B4 имеет важное регуляторное значение: находится в TF-связывающих доменах для 4 факторов транскрипции: SIX5_disc2, Znf143_disc1, ATF3_known3, AP-1_disc7. При этом аллель А rs13111134 UGT2B4, связанный с повышенным риском возникновения ПЭ, способствует повышению афинности ко всем 4 факторам транскрипции. Результаты ранее проведенных исследований указывают на наличие ассоциаций полиморфных маркеров rs2013573 UGT2B4, rs13111134 UGT2B4 с возрастом менархе (Yermachenko, A. UGT2B4 previously implicated in the risk of breast cancer is associated with menarche timing in Ukrainian females / A. Yermachenko, V. Dvornyk // Gene. – 2016. – Vol. 590, № 1. – P. 85-89.). Согласно результатов работы He C. et al. (A large-scale candidate gene association study of age at menarche and age at natural menopause / C. He, P. Kraft, D. I. Chasman [et al.] // Hum. Genet. – 2010. – Vol. 128, № 5. – Р. 515-527), аллель С rs13111134 UGT2B4 и аллель C rs2013573 UGT2B4 связаны с поздним менархе.

С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ПЭ на основании исследованных полиморфных вариантов гена UGT2B4 и других возможных факторов риска с целью выявления беременных, предрасположенных к преэклампсии.

В Российской Федерации исследования о вовлеченности генетических вариантов rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4 в формирование предрасположенности к ПЭ отсутствуют.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров гена UGT2B4. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ПЭ на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4.

Из области техники известен патент № 2730958 «Способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных» по заявке № 2019122327, от 16.07.2019. Способ включает определение в плазме крови беременной концентрации внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1; в ядерной ДНК лейкоцитов определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК) и при вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл - диагностируют тяжелую преэклампсию. Недостатком этого способа является возможность прогнозирования только тяжелого течения преэклампсии, трудоемкость выполнения, сложность подсчетов, и кроме того не учитывается роль генетических полиморфизмов.

Известен способ диагностики преэклампсии путем определения в крови беременных женщин концентрации фактора некроза опухоли альфа (ФНОα), фактора роста плаценты (ФРП) и плацентарного альфа-1 микроглобулина (ПАМГ), значения индекса инсулинорезистентности (HOMA-IR), уровней инсулина и лептина, и при значении этих показателей в сроки 11-14 недель и 18-21 недель беременности (RU 2693412 С1, Тезиков Е.Ю. и др. 20.11.2018). На основании данных полученных маркеров прогнозируют риск развития ранней или поздней ПЭ. Недостатком данного способа является его трудоемкость, заключающаяся в определении достаточно большого количества показателей в первом и втором триместрах беременности. Каждый из перечисленных в методе параметров может быть повышен при наличии различных патологических состояний, не связанных с беременностью, что может снижать специфичность данного метода. Не учитываются генетические факторы.

За прототип выбран патент № 2699974 (по заявке 2018142290 от 30.11.2018) описан способ прогнозирования риска развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией. Способ включает забор венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и исследование полиморфизма гена альдостеронсинтазы CYP11B2 С(-344)Т и ангиотензиногена AGT T704C, оценивают уровень среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности, учитывают факт наличия или отсутствия регулярной антигипертензивной терапии до наступления беременности и рассчитывают дискриминантную функцию (Y) по формуле: Y=0,21×Ф1+0,18×Ф2+0,31×Ф3+0,29×Ф4, где Ф1 - присутствие в генотипе женщины аллеля AGT 704С: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф2 - присутствие в генотипе женщины аллеля CYP11B2 (-344)Т: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф3 - наличие среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности выше 95 мм рт.ст.: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф4 - регулярная антигипертензивная терапия до наступления беременности: отсутствие - 1 балл, наличие - 0 баллов, и при значении Y, равном 0,68 или более, прогнозируют повышенный риск развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией, уроженок Центрального региона России. Недостатком данного способа является возможность его применения только у женщин с хронической артериальной гипертензией, установленной до наступления беременности, не учитываются другие генетические полиморфизмы.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития ПЭ на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4.

Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ПЭ у беременных русской национальности, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4;

- прогнозирование высокого риска развития ПЭ у беременных при выявлении гаплотипа GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития ПЭ у беременных на основе данных о гаплотипе GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S.A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. – 1988. – Vol. 16, № 3. – P. 1215) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Генотипирование образцов ДНК было выполнено в Центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского национального исследовательского медицинского центра РАН на базе НИИ медицинской генетики (использовался метод MALDI и масс-спектрометр MassARRAY Analyzer 4 (фирма производитель “Seqeunom”, страна производства США). Для генотипирования использовали образцы ДНК в концентрации 10-20 нг в микролитре общим обьемом 10 мкл. В процессе экспериментального анализа образцов выполняли следующие этапы: проведение мультиплексной ПЦР; осуществление SAP-реакции; выполнение iPLEX реакции с последующим обессоливанием и нанесением на SpectroCHIP; процедуры ионизации и анализа спектров с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Степанов, В.А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека / В. А. Степанов, Е. А. Трифонова // Молекулярная биология. – 2013. – Т. 47, № 6. – С. 976-986).

Гаплоблоки конструировались на основе алгоритма «Confidence intervals» (Gabriel S.B. et al., 2002) (при D’>0,8), имплементированном в программу gPLINK v2.050 (279. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses / S. Purcell, B. Neale, K. Todd-Brown [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 2007. – Vol. 81, № 3. – Р. 559-575). Так же с помощью вышеуказанного программного обеспечения проводился анализ ассоциаций гаплотипов с изучаемыми фенотипами методами логистической регрессии с необходимыми ковариатами и пермутационными процедурами (выполнялось 1000 пермутаций). Показатель p_perm<0,05 при анализе ассоциаций гаплотипов был принят за статистически значимый.

Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ПЭ у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 997 пациенток, из них 366 беременных с ПЭ и 631 женщин контрольной группы. Основные медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики беременных с преэклампсией и женщин группы контроля отражены в таблице 1.

Общая характеристика беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы

Таблица 1

В выборку для исследования вошли женщины с преэклампсией и/или задержкой роста плода и женщины контрольной группы (с физиологическим течением беременности), давшие свое информированное согласие на участие в данной исследовательской работе и соответствующие ряду критериев: русский этнос, место рождения и проживания – регион Центрального Черноземья России. Основаниями для исключения женщин из исследовательской выборки были отказ от участия в данной работе, наличие родства между ними различной степени, выявление тяжелых хронических заболеваний, проводящих к декомпенсации, нерусский этнос и иные (нежели Центральное Черноземье России) места рождения и/или проживания.

Клиническое, клинико-лабораторное, клинико-инструментальное обследование беременных и новорожденных детей, верификация диагноза осложнений беременности – ПЭ, ЗРП (или их отсутствие), сбор медико-биологической информации, результатов клинического, клинико-лабораторного, клинико-инструментального обследования беременных и новорожденных детей в специально разработанные анкеты и формирование электронной базы данных проводилось сертифицированными врачами профильных отделений перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.

При расчете частот гаплотипов и анализе их ассоциаций у индивидуумов установлена связь с формированием преэклампсии гаплотипа GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4. Гаплотип GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4 является фактором риска развития ПЭ у женщин (OR_adj=1,88).

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственницами между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.

У пациентки Г. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу больных с высоким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение подтвердило данное осложнение беременности у пациентки.

У пациентки Д. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип AG гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение не подтвердило преэклампию у пациентки Д.

У пациентки Л. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип АA гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение не подтвердило преэклампию у пациентки.

У пациентки Е. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GG гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. При дальнейшем наблюдение данное осложнение беременности у беременной не подтвердилось.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациенток группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ПЭ.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития преэклампсии (ПЭ) у неродственных русских индивидуумов, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ. Осущеcтвляют анализ генетических маркеров гена UGT2B4. Высокий риск развития ПЭ прогнозируют при выявлении гаплотипа GA гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4. Изобретение обеспечивает получение критериев оценки риска развития ПЭ у беременных русской национальности, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования риска развития преэклампсии у неродственных русских индивидуумов, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что осущеcтвляют анализ генетических маркеров гена UGT2B4, причем высокий риск развития преэклампсии прогнозируют при выявлении гаплотипа GA гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.