Способ получения частиц для специфического таргетинга клеток Российский патент 2022 года по МПК A61K33/08 A61K33/26 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биомедицины и наномедицины, в том числе к способам получения (синтеза) наночастиц на основе гематита, способных специфически распознавать и связываться с клетками-мишенями.

Уровень техники

В последнее время наблюдается активный рост использования нанотехнологий в биологии и медицине, а также других областях науки и техники. При лечении и диагностики (а также тераностики) заболеваний наночастицы имеют ряд преимуществ перед обычными молекулярными лекарствами, особенно таких как возможности создания более сложной структуры, позволяющей осуществлять контролируемое высвобождение активного компонента только в случае необходимости, возможности добавления различных механизмов для его адресной доставки и др. Наибольший интерес представляют частицы, обладающие свойствами, позволяющими детектировать их неинвазивно при помощи широко используемых в медицине аналитических методов таких как магнитно-резонансная томография (МРТ) и при этом обладающими низкой токсичностью. Ввиду этого одними из самых перспективных материалов для создания наночастиц являются оксиды железа, которые в зависимости от структуры могут обладать как Т1 так и Т2 контрастирующими свойствами в МРТ а также обладают самой низкой токсичностью среди переходных металлов. Одними из наиболее интересных наночастиц являются частицы гематита, как самого стабильного оксида железа. Они обладают высокой химической стабильностью, хорошими МРТ-контрастирующими свойствами, способностью деградировать в тканях организма естественным путем, в том числе осуществляя терапевтический эффект в отношении анемии (введение таких частиц, увеличивает уровень гемоглобина в крови).

Поэтому одной из важных задач современной медицины является разработка подходов для создания эффективных методик синтеза наночастиц гематита, обладающих следующими характеристиками:

1) Малое время проведения реакции,

2) Легкодоступные реагенты,

3) Возможность масштабирования синтеза без изменения параметров синтезируемых частиц таких как выход, размер и распределение по размерам,

4) Эффективная иммобилизация рецепторов, обеспечивающих высокоспецифичное связывание с клетками-мишенями.

Для решения данной проблемы известен близкий способ (US 20130251624 А1), в котором частицы гематита получают гидротермальным гидролизом раствора хлорида железа(III)

Недостатки этого способа заключаются в том, что:

1) Реакция проводится при повышенной температуре (от 90°С до 250°С).

2) Реакция проводится в течение продолжительного времени (более суток).

3) Реакция проводится при повышенном давлении.

Известен наиболее близкий способ (Nanomaterials 2020, 10, 323; doi:10.3390/nanol0020323), в котором частицы гематита получают из ферригидрита путем медленной трансформации в водных растворах.

Недостатки этого метода состоят в том, что:

1) Реакция проходит в течение нескольких месяцев.

2) Реакционные условия не предполагают масштабирования.

Таким образом, требуемый технический результат состоит в создании эффективного метода синтеза нетоксичных наночастиц оксида железа - гематита, функционализированных специфическими рецепторными молекулами, позволяющий получать частицы контролируемого размера с использованием легко доступных реагентов, и обладающий возможностью легкой масштабируемости условий синтеза.

Описание изобретения

Для достижения указанного технического результата предложен способ получения частиц гематита для специфического таргетинга (таргетной доставки к) клеток, включающий в себя, по крайней мере: i) смешение частиц ферригидрита с раствором по крайней мере одной кислоты и инкубацию полученной смеси при температуре не выше +4 градусов Цельсия с целью формирования частиц гематита, причем концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 50% от концентрации концентрированной кислоты, ii) перевод упомянутых частиц гематита в водный раствор с рН более 2 с дальнейшим добавлением к суспензии упомянутых частиц гематита раствора полимера для его сорбции на поверхность частиц; iii) конъюгацию специфичного к упомянутым клеткам рецептора с упомянутыми молекулами полимера на поверхности упомянутых частиц.

Кроме того, способ, в котором упомянутый полимер принадлежит группе декстран, карбоксиметилдекстран, полиэтиленимин, полилизин, полиаспарагиновая кислота, полиакриловая кислота.

Кроме того, способ, в котором упомянутый полимер включает в себя карбоксильные группы и упомянутую конъюгацию проводят карбодиимидным способом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является пептидом, полипептидом или белком.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является нуклеиновой кислотой. Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является аптамером.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является белком из группы: трансферрин, лактоглобулин, авидин, стрептавидин, нейтравидин, лектин.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является антителом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является моноклональным антителом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является фрагментом антитела.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является антителом против эритроцитов.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является антителом против эритроцитов, причем введение упомянутой частицы характеризуется более длительным временем циркуляции в кровотоке, чем для таких же антител без упомянутых конъюгированных антител.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является низкомолекулярным рецептором.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является фолиевой кислотой или ее аналогом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый рецептор является биотином или его аналогом.

Кроме того, способ, включающий в себя, по крайней мере: смешение частиц ферригидрита с раствором по крайней мере одной кислоты и инкубацию полученной смеси при температуре не выше +4 градусов Цельсия, причем концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 50% от концентрации концентрированной кислоты.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 70% от концентрации концентрированной кислоты.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90% от концентрации концентрированной кислоты.

Кроме того, способ, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 10 минут.

Кроме того, способ, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 1 часа.

Кроме того, способ, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 24 часов.

Кроме того, способ, в котором упомянутая кислота является сильной минеральной кислотой.

Кроме того, способ, в котором упомянутая кислота является сильной минеральной кислотой из группы: серная, азотная, соляная.

Кроме того, способ, в котором упомянутая кислота является органической кислотой.

Кроме того, способ, в котором упомянутая кислота является органической кислотой из группы: муравьиная, уксусная.

Кроме того, способ, в котором упомянутую инкубацию проводят при температуре от 0.5 до 1 градуса Цельсия.

Кроме того, способ, в котором упомянутую инкубацию проводят при температуре 1.5-2.5 градуса Цельсия.

Кроме того, способ, который кроме того включает шаг синтеза упомянутого ферригидрита, который в свою очередь включает в себя, по крайней мере:

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 100 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 200 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 1000 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний гидродинамический размер менее 100 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний гидродинамический размер менее 200 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний гидродинамический размер менее 1000 нм.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита дополнительно сорбируют полимер.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита коллоидно-стабильны.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.05.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.1.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.2.

Кроме того, способ, в котором на упомянутые частицы гематита дополнительно сорбируют полимер из группы: декстран, карбоксиметилдекстран, карбоксиметилцелюлюза, разветвленный полиэтиленимин, линейный полиэтиленимин, поливинилпирролидон, поливинилацетат, хитозан, полилизин, полиаспарагиновая кислота, полиакриловая кислота, полиоктадецен-альт-малеиновая кислота, полистиролсульфоновая кислота.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита дополнительно конъюгируют с меткой из группы: флуоресцентную, магнитную, МРТ-контрастирующую, рентгентоконтрастирующую, люминесцентную, радиоактивную.

Кроме того, способ, в котором упомянутые частицы гематита дополнительно включают в себя цитостатические, цитотоксические или терапевтические соединения.

Кроме того, способ получения частиц гематита, включающий в себя, по крайней мере:

i) смешение частиц ферригидрита с раствором по крайней мере одной концентрированной кислоты, выбранной из группы: серная, азотная, соляная, фосфорная, уксусная, муравьиная,

ii) инкубацию полученной смеси при температуре не выше +4 градусов Цельсия, причем:

в случае, когда упомянутая кислота является серной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, а время упомянутой инкубации составляет не более 30 минут,

в случае, когда упомянутая кислота является азотной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, а время упомянутой инкубации составляет не более 30 минут,

в случае, когда упомянутая кислота является соляной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, а время упомянутой инкубации составляет не более 30 минут,

в случае, когда упомянутая кислота является фосфорной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, а время упомянутой инкубации составляет не более 30 минут,

в случае, когда упомянутая кислота является уксусной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, время упомянутой инкубации составляет не более 24 часов, а упомянутая инкубация проводится при температуре не выше +20 градусов Цельсия,

в случае, когда упомянутая кислота является муравьиной кислотой, концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 90 массовых процентов, время упомянутой инкубации составляет не более 24 часов, а упомянутая инкубация проводится при температуре не выше +20 градусов Цельсия.

Кроме того, способ получения (синтеза) частиц гематита, включающий в себя, по крайней мере: смешение частиц ферригидрита с раствором по крайней мере одной концентрированной кислоты (90 массовых процентов и выше для серной кислоты, 60 массовых процентов и выше для азотной кислоты, 30 массовых процентов и выше для соляной кислоты, 80 массовых процентов и выше для фосфорной кислоты 90 массовых процентов и выше для уксусной и муравьиной кислоты) и инкубацию полученной смеси при температуре не выше +4 градусов Цельсия в течение не более 10 минут при использовании минеральных кислот, и при температуре не выше +20 градусов Цельсия и не более 24 часов при использовании органических кислот причем эффективная концентрация упомянутой кислоты после смешения с упомянутыми частицами ферригидрита составляет не менее 70% от концентрации исходной концентрированной кислоты.

Характеристики и преимущества способов согласно данному изобретению будут далее проиллюстрированы в следующем подробном описании. Хотя изготовление и использование различных вариантов настоящего изобретения подробно обсуждается ниже, следует понимать, что настоящее изобретение обеспечивает множество применимых изобретательских концепций, которые могут быть воплощены в широком спектре конкретных контекстов. Конкретные варианты осуществления, обсуждаемые здесь, просто иллюстрируют различные способы создания и использования изобретения и не ограничивают объем изобретения. Все содержание приведенных здесь (ранее и далее) включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

Следует отметить, что во всей заявке альтернативы записаны в группах Маркуша, например, каждое положение терапевтического агента, может содержать более одного возможного терапевтического агента. В частности, предполагается, что каждый член группы Маркуша следует рассматривать отдельно, тем самым, содержащий другой вариант осуществления, и группа Маркуша не должна читаться как единое целое. Кроме того, все цитируемые ссылки включены в настоящее описание посредством ссылки.

Подробное описание воплощений изобретения.

Разработка новых способов получения наноразмерных материалов с четко определенной формой, узким распределением по размерам и высокой стабильностью имеет огромное значение для такой быстро развивающейся области науки, как нанотехнологии. Мы обнаружили необычное взаимодействие между аморфным ферригидритом и концентрированной серной или другими минеральными и органическими кислотами. Вместо ожидаемого растворения ферригидрита мы наблюдали образование новых кирпично-красных наночастиц (НЧ) гематита, обладающих узким распределением по размерам. Согласно данным сканирующей (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (в том числе в режиме дифракционного контраста), рентгенофазового анализа (РФА), инфракрасной спектроскопии (ИКС) и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии проведение реакции с различными кислотами производит к образованию схожих наночастиц. Раскрытая здесь реакция гидроксида железа с концентрированными кислотами идет по другому пути, что открывает новые возможности для синтеза устойчивых к воздействию кислот наночастиц оксида железа. Описанный ниже новый способ синтеза может быть полезен для разработки наноматериалов на основе оксида железа для таких требовательных к специфичности приложений, как наносенсоры, визуализация и терапия. Частицы легко модифицируются полимерами, флуоресцентными метками, антителами, и нуклеиновыми кислотами. Примеры применения наночастиц: i) специфический таргетинг эритроцитов для создания системы доставки лекарств на базе эритроцитов (red blood cell-hitchhiking); ii) таргетинг раковых клеток in vitro; iii) инфракрасная биовизуализация ex vivo.

Реакция свежеосажденного ферригидрита с разбавленной серной кислотой является важным примером проявления основности железа(III) [Schwertmann, U. et al. Schwertmann, U., Cornell, R.M., Eds.; Wiley: Weinheim, Germany, 2000]. Более того, эта реакция представляет интерес для ученых, работающих в области так называемой планетной химии, поскольку предполагается, что подобные реакции могут происходить на Марсе во время столкновения с астероидами [Dehouck, Ε. et al. J. Geophys. Res. Planets, 2017], а также могут протекать на Венере [Sill, G.T. American Geophysical Union: Washington, DC, USA, 1976]. Обычно считается, что эта реакция заканчивается быстрым растворением осадка с образованием полностью прозрачного раствора сульфата железа(III). С другой стороны, сообщалось, что реакция ферригидрита с разбавленными кислотами может длиться месяцами или даже годами и приводит к образованию микро- и наночастиц гематита и гетита [Schwertmann, U. et al. Schwertmann, U., Cornell, R.M., Eds.; Wiley: Weinheim, Germany, 2000; Schwertmann, U. et al. Clays Clay Miner., 1983; Waychunas, G.A. et al. J. Nanoparticle Res., 2005; Burleson, D.J. et al. Langmuir, 2006; Cudennec, Y. et al. J. Solid State Chem., 2006; Das, S. et al. Environ. Sci. Technol., 2011; Jiang, Z. et al. Sci. Rep., 2016]. Кроме того, известно, что получить наночастицы гематита можно с помощью принудительного гидролиза солей железа(III) [Raming, Т.P. et al. J. Colloid Interface Sci., 2002], гидротермальным методом [Wang, S.B. et al. J. Phys. Chem. C, 2007] и методами зеленой химии [Basavegowda, N. et al. Adv. Nat. Sci. Nanosci. Nanotechnol., 2017]. Недавно авторы работы [Lunin, A.V. et al. J. Colloid Interface Sci., 2019] сообщили о быстром и простом синтезе наночастиц водного оксида железа путем индуцированного азотной кислотой превращения ферригидрита. Из-за в целом низкой токсичности наночастиц гематита [Lunin, A.V. et al. RSC Adv., 2020] такие материалы перспективны для различных областей биомедицины. Более того, наночастицы с контролируемой формой и узким распределением по размерам могут быть использованы в качестве строительных блоков для самых требовательных и передовых приложений на сегодняшний день, таких как разработка «умных» агентов для диагностики in vitro [Shevchenko, K.G. et al. Biosens. Bioelectron., 2017; Cherkasov, V.R. et al. ACS Nano, 2020] и доставки лекарств [Sokolov, I.L. et al. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 2017; Tregubov, A.A. et al. Chem. Rev., 2018; Zelepukin, I.V. et al. Nanoscale, 2019]. В связи с этим мы попытались провести этот синтез более тщательно и обнаружили необычную реакцию между концентрированными кислотами и ферригидритом. Эта реакция вела к образованию почти монодисперсных наночастиц гематита вместо их полного растворения.

Нас заинтересовала идея о том, что в сильнокислой среде возможно образование гематита и других оксидов железа вместо их полного растворения. Поэтому была проведена попытка изучения свойств ферригидрита в условиях, похожих на условия на поверхности Венеры, ранней Земли и Марса во время интенсивных столкновений с астероидами. В качестве критических факторов в нашей упрощенной модельной системе были использованы низкие температуры и серная кислота, которая в избытке присутствует в данных условиях. Для моделирования природных условий на Марсе было изучено взаимодействие между ферригидритом и 35%-ным раствором серной кислоты при типичной для поверхности этой планеты температуре (-60°С). Ферригидрит был синтезирован реакцией между водными растворами хлорида железа и аммиака; ферригидритная паста на водной основе была приготовлена центрифугированием суспензии ферригидрита.

После добавления этой пасты в раствор серной кислоты цвет смеси сразу становился кирпично-красным. Мы отбирали образцы для анализа во время реакции, и, к удивлению, обнаружили, что несколько капель раствора, оставшихся на пипетке, оставались мутными и кирпично-красными в течение, по меньшей мере, нескольких часов при комнатной температуре. Только через два дня смесь превратилась в полностью прозрачный раствор, что указывало на образование сульфата железа. Поэтому мы решили провести аналогичную реакцию с концентрированной серной кислотой (98 мас.%) при более высокой температуре (0-4°С). Реакцию проводили следующим образом: серную кислоту охлаждали на ледяной бане, затем при интенсивном перемешивании к ней добавляли ферригидритную пасту, перемешивали в течение 5 мин, останавливали реакцию резким выливанием смеси в лед. Полученную смесь дважды центрифугировали и промывали водой. Для анализа образца использовали рентгенофазовый анализ. Рентгенограмма, приведенная на Фиг. 1, полностью соответствует фазе чистого гематита α-Fe₂O₃ (карточка JCPDS: №00-033-0664) без значительных примесей других фаз. Парамагнитная природа полученных частиц была подтверждена методом количественного определения магнитных частиц (MPQ-цитометрия) [Nikitin, М.Р. et al. Nanoscale, 2018], который выявил отсутствие ферро- и суперпарамагнитных фракций на уровне 0,1 нг/мл.

Методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что осадок состоит из почти что кубических частиц размером примерно 50 нм (Фиг. 2). Дальнейший анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) выявил более сложные формы частиц, которые отличались от кубической и были похожи на описанные ранее в литературе нанокристаллы гематита (Фиг. 2) [Echigo, Т. et al. Am. Mineral., 2013]. Анализ методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии показал, что наночастицы (НЧ) не содержат никаких следов других элементов. Атомное соотношение Fe:O в образце составляет примерно 1:2,8, что ниже ожидаемого для гематита из-за низкой точности метода при анализе легких элементов (z<11). Таким образом, составы стандартного образца гематита, приготовленного по литературной методике [Schwertmann, U. et al. Schwertmann, U., Cornell, R.M., Eds.; Wiley: Weinheim, Germany, 2000] и приготовленного нами, показали примерно одинаковое соотношение Fe:O.

Кристаллическую структуру частиц определяли с использованием анализа электронной дифракции на выбранной площади (режим дифракционного контраста в ПЭМ), результаты показаны на Фиг. 2. Здесь видны яркие кольца, соответствующие большому количеству нанокристаллов гематита, и точечные рефлексы, которые относятся к отдельным частицам гетита. Некоторые из основных параметров решетки гематита или гетита совпадают. Единственный способ отличить эти фазы на электронограммах - это наличие кольца с параметром решетки 0,369 нм, соответствующим плоскости (012) гематита. Это кольцо расположено рядом с центральным пятном луча и несколькими одиночными пятнами со слабой интенсивностью, полученными от плоскостей (101) и (201) гетита (с межплоскостным расстоянием 0,416 и 0,336 нм, соответственно). Таким образом, НЧ состоят из смеси гематита (α-Fe₂O₃) и следов гетита (α-FeO (ОН)). ИК-спектр полученных НЧ содержит пики, которые идентичны пикам в спектре стандартного образца гематита (Фиг. 3), а также содержит пики при 905 см^-1 и 811 см^-1, характерные для гидратированных разновидности оксида железа, такие как гетит [RRUFF ID: R050142.1]. Поскольку ИК-спектроскопия в режиме отражения показывает в основном природу поверхности наночастиц и не зависит от кристаллической структуры анализируемого соединения, а также, принимая во внимание результаты РФА, можно предположить, что наночастицы состоят из ядра гематита с тонким слоем в основном аморфного гидратированного оксида железа на поверхности.

Выход в реакции составил около 5%, поэтому мы изучили возможность его увеличения. Мы протестировали для этой реакции множество концентрированных кислот, чтобы сравнить их способность образовывать наночастицы гематита. В случае концентрированной азотной кислоты аналогичные НЧ образовывались с гораздо меньшим выходом, при этом осадок оставался стабильным в кислоте в течение, по крайней мере, пары дней.

Соляная кислота дает все тот же осадок гематита, который, однако полностью растворяется менее чем за 30 мин. Органические кислоты, такие как чистая муравьиная и ледяная уксусная кислоты, также образовывали небольшие количества НЧ гематита (≈1%). Однако для завершения реакции, за которым следили по изменению цвета от темно-коричневого до кирпично-красного, требовалось 24-часовое перемешивание при комнатной температуре. С другой стороны, концентрированная фосфорная кислота дала результат, аналогичный серной кислоте, с таким же выходом 5%.

Предполагалось, что образование наночастиц гематита зависит не только от силы кислоты, но и от ее дегидратирующей способности. Поэтому при использовании «100% фосфорной кислоты» (известной как равновесная смесь фосфорной кислоты, пирофосфорной кислоты и воды) выход НЧ был почти вдвое выше (9%). Такой же результат (10%) был получен при использовании смеси серной кислоты и пятиокиси фосфора. Таким образом, сильные кислотные дегидратирующие агенты способны превращать ферригидрит в менее гидратированные оксиды железа, а не растворять их. Поскольку ферригидритная паста, использованная в экспериментах, содержала воду, которая могла привести к разбавлению кислоты и снижению ее дегидратирующей способности, в одном из экспериментов воду заменили этанолом, что, однако не привело к увеличению выхода НЧ. Наконец, был проведен эксперимент по масштабированию методики с использованием примерно 10-кратных количеств исходных реагентов и смеси серной кислоты и пятиокиси фосфора. Были получены те же НЧ с выходом 9,7% (0,51 г).

Чтобы оценить потенциал полученных наночастиц гематита для биомедицинских применений, поверхность наночастиц была покрыта несколькими видами полимеров для облегчения последующего биоконъюгирования. Полимеры с карбоксильными группами, такие как натриевая соль карбоксиметилдекстрана (КМД, Μn ~ 15000), натриевая соль полиакриловой кислоты (ПАК, Μn ~ 5100), а также полиэтиленимин (ПЭИ, Μn ~ 25000), содержащий аминогруппы, были иммобилизованы на поверхности частиц с помощью простой процедуры инкубации с избытком полимеров в горячих водных растворах. Гидродинамические радиусы полученных таким образом НЧ, определенные методом динамического рассеяния света (ДРС), составили 65±9 нм, 62±8 нм и 76±8 нм для ГНЧ@КМД, ГНЧ@ПАК и ГНЧ@ПЭИ, соответственно. Радиусы оказались немного меньше по сравнению с 90±8 нм для непокрытых ГНЧ, что говорит о более высокой стабилизации НЧ полимерами и, как следствие, более низкой агрегации. Присутствие органического покрытия было также подтверждено с помощью ИК-спектроскопии, результаты показаны на Фиг.3. В случае покрытия КМД и ПАК характерные полосы карбоксильных групп КМД (1618 см^-1 и 1560 см^-1) и ПАК (1556 см^-1 и 1601 см^-1) уширены и немного сдвинуты из-за наличия неэквивалентных групп, так как только часть карбоксильных групп скоординирована с поверхностью оксида железа. Аналогичным образом, более сложная картина наблюдалась для ПЭИ после координации с поверхностью НЧ.

Возможность функционализации наночастиц с помощью антител была исследована методом проточной цитометрии и флуоресцентного иммуноанализа, как показано на Фиг.4. Эритроциты являются удобной моделью для разработки агентов для доставки лекарств, поскольку эти клетки лишены эндоцитарного аппарата; таким образом, на анализ взаимодействия мембрана-ГНЧ не влияет поглощение [Shang, L. et al. J. Nanobiotechnol., 2014]. Установлено, что наночастицы, модифицированные положительно заряженным ПЭИ, имеют тенденцию неспецифически связываться с клетками, в то время как частицы, покрытые КМД и ПАК не проявляют подобных свойств. Поэтому ГНЧ, покрытые КМД и ПАК, были сконъюгированы карбодиимидным методом [Hermanson, G.T. Academic Press: New York, NY, USA, 2008] с моноклональным антителом TER-119 (TER), которое распознает эритроид-специфические антигены TER-119. Полученные ГНЧ@КМД@TER и ГНЧ@ПАК@TER были помечены флуоресцентным красителем Су3 путем обработки НЧ н-гидроксисульфосукцинимидным эфиром Су3 (Су3-sulfo-NHS). Эффективность покрытия частиц антителами и флуоресцентными метками оценивали с помощью прямого флуоресцентного иммуноанализа [Luppa, Р.В. et al. Clin. Chim. Acta, 2001]. В этом эксперименте козий антимышиный иммуноглобулин (Ig), общий Ig человека и бычий сывороточный альбумин (БСА) адсорбировались на полистирольной поверхности 96-луночного планшета с последующим добавлением ГНЧ@КМД@TER-Су3 и ГНЧ@ПАК@TER-Cy3. После тщательной промывки эффективность флуоресцентного мечения оценивали по флуоресцентному сигналу (Фиг. 4), что подтвердило успешную модификацию обоих типов ГНЧ, которые специфически связывались только с козьим антимышиным Ig. Для оценки неспецифического взаимодействия ГНЧ ГНЧ@КМД@TER-Су3 и ГНЧ@ПАК@TER-Су3 вместе с ГНЧ, сконъюгированными с несвязывающими эритроциты антителами в качестве отрицательного контроля, использовали для изучения с помощью метода проточной цитометрии с визуализацией (Фиг. 4). Результаты продемонстрировали более высокую специфичность ГНЧ, модифицированных ПАК, к эритроцитам, чем ГНЧ, модифицированные КМД. Кроме того, специфичность TER-конъюгированных ГНЧ была подтверждена в конкурентном анализе с использованием свободных TER антител вместе с ГНЧ в растворе во время инкубации с клетками. Высокая эффективность связывания TER-конъюгированных НЧ с эритроцитами также подтверждается изображениями, полученными методом визуализирующей проточной цитометрии (Фиг. 4). Таким образом, TER-модифицированные ГНЧ являются перспективными кандидатами для успешной доставки лекарств методом RBC-hitchhiking при лечении рака [Sokolov, I.L. et al. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 2017].

Далее была продемонстрирована высокая специфичность полученных агентов для таргетинга раковых клеток (Фиг. 4). В качестве модели для изучения таргетинга мы выбрали клетки ВТ-474, оверэкспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста HER2/neu, очень важный клинический маркер рака, который оверэкспрессируется на многих типах злокачественных опухолей у человека [Yan, Μ. et al. Cancer Metastasis Rev., 2015]. Клетки CHO использовали в качестве HER2/neu-отрицательного контроля. Мы использовали антитело к HER2/neu трастузумаб, которое было сконъюгировано с ГНЧs@ПАК и помечено Су3. Как видно из фигуры, наночастицы, сконъюгированные с трастузумабом, специфически связываются с клетками ВТ-474. Таким образом, НЧ показали высокую специфичность к рецептору HER2/neu и могут быть использованы для таргетинга раковых клеток. Соответственно, у нас есть возможность разработать наноагенты для различных применений (например, для биосенсорики или удаления токсичных агентов) посредством функционализации соответствующими антителами.

Также мы сконъюгировали ГНЧ@ ПАК с общим человеческим иммуноглобулином IgG и пометили конъюгат с помощью Cy7.5-sulfo-NHS (ГНЧ@ПАК @IgG-Cy7.5) и изучили его биораспределение. НЧ вводили мышам, и после 40-минутной инкубации извлеченные органы мыши исследовали с использованием инфракрасной оптической визуализации (Фиг. 5). Флуоресцентный анализ показал, что почти все НЧ накапливались в печени. Этот результат можно объяснить существованием ассоциированной с печенью субпопуляции макрофагов, которая поглощает НЧ. Этот факт позволяет сделать вывод, что НЧ являются подходящим агентом для адресной доставки лекарств благодаря своему незначительному неспецифическому накоплению НЧ почти во всех органах (кроме печени). Дальнейшие исследования будут сосредоточены на рецептор-специфичной доставке НЧ в опухоли и на адсорбции агентов для химиотерапии или фотодинамической терапии на поверхности НЧ.

Удивительно, но ожидаемое полное растворение гидратированного оксида с образованием растворимых солей произошло только в небольшом количестве случаев. Реакция оказалась более сложной, она протекает только с частичным растворением с параллельным образованием наночастиц гематита. Выход НЧ возрастает с увеличением дегидратирующей способности смеси кислот. Реакцию можно легко масштабировать для получения значительных количеств наночастиц с выходом до 10%. В нашей работе полученные наночастицы были модифицированы различными органическими полимерами и использованы для успешного таргетинга in vitro раковых клеток после биомодификации. Таким образом, описанные НЧ являются перспективным материалом для разработки функционализированных наноагентов для различных биомедицинских приложений.

Предложенный способ предпочтительно реализовывать при использовании высокого содержания кислоты, это позволяет существенно сократить время синтеза частиц гематита. Предпочтительно достигать концентрации кислоты в смеси (комбинации) с частицами ферригидрита, более 30%, предпочтительно более 40%, предпочтительно более 50%, предпочтительно более 60%, предпочтительно более 70%, предпочтительно более 80%, предпочтительно более 90%, предпочтительно более 95% от концентрации концентрированной кислоты. Под концентрированной кислотой понимают стандартную в области техники максимальную концентрацию кислоты, например:

В частности, в одних воплощениях изобретения финальная концентрация кислот (в моль/л) (по крайней мере не менее): Серная кислота 18.3, Азотная кислота 15.7, Соляная кислота (40 мас.%) 13.1, Фосфорная кислота 14.6, Уксусная кислота (ледяная) 17.4, Муравьиная кислота 26.5.

Работа предлагаемого способа иллюстрируется чертежами фиг. 1-7.

Список фигур чертежей.

Фиг. 1 - Рентгенограмма полученных наночастиц и эталонный образец.

Фиг. 2 - Фото образцов НЧ, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии; просвечивающей электронной микроскопии; в режиме дифракционного контраста (электронограмма на выбранных участках наночастиц).

Фиг. 3 - Спектры, полученные методом ИК-спектроскопии при ослабленном полном отражении. Сравнение спектра наночастиц гематита (ГНЧ) со спектром стандартного образца; спектры ГНЧ с полимерным покрытием в диапазоне 770-3200 см-1 в сравнении со спектрами чистых полимеров.

Фиг. 4. Флуоресцентный иммуноанализ и визуализирующая проточная цитометрия. Связывание ГНЧ@ПАК@TER-Су3 и ГНЧ@КМД@TER-Су3, соответственно, с общим иммуноглобулином человека (IgG), бычьим сывороточным альбумином (БСА) и антителами козы к иммуноглобулинам крысы, адсорбированных на полистироле; данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=3). Изучение методом визуализирующий проточной цитометрии взаимодействия между ГНЧ@ПАК@TER-Су3 и ГНЧ@КМД@TER-Су3 с эритроцитами; в качестве контроля была произведена инкубация клеток с частицами в смеси, содержащей моноклональные TER-119 антитела (TER), кроме того, была изучена специфичность частиц, несущих неспецифичные к клеткам антитела (КА - контрольные антитела); проточно-цитометрический анализ взаимодействия клеток ВТ-474 (HER2/neu-положительные) и СНО (HER2/neu-отрицательные) с ГНЧ@ПАК@Трастузумаб-Су3. Изображения взаимодействия между эритроцитами и двумя типами наночастиц, покрытых натриевой солью полиакриловой кислоты (ПАК), конъюгированных с эритроцит-связывающими и эритроцит-несвязывающими антителами (в светлом поле, Су3-канал и канал бокового рассеяния). Масштаб - 10 мкм. Статистическая значимость была рассчитана с использованием непарного одностороннего t-критерия (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; n.s. р>0,05).

Фиг. 5. Флуоресцентное ex vivo изображение органов мыши, которой были вколоты флуоресцентно меченные частицы гематита.

Фиг. 6. Распределение по размерам НЧ, синтезированных с использованием различных кислот слева направо сверху вниз: серная кислота; азотная кислота; уксусная кислота; фосфорная кислота; соляная кислота; смесь серной кислоты и пятиокиси фосфора (размеры определены с использованием изображений СЭМ; размер каждой НЧ рассчитывался как среднее от ее максимального и минимального размера. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n=100); изображения обрабатывались с помощью программы Fiji/ImageJ).

Фиг. 7. Гидродинамические радиусы синтезированных наночастиц согласно данным ДРС-анализа слева направо: ГНЧ@ПАК, ГНЧ@КМД, ГНЧ@ПЭИ, ГНЧ@ПАК@TER, ГНЧ, ГНЧ@КМД@TER.

ПРИМЕРЫ

Варианты реализации изобретения разнообразны. Приведем различные примеры. Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.

Пример 1. Синтез ферригидрита

100 мл 0,33 Μ водного раствора гексагидрата хлорида железа (17,8 г твердого FeCl₃⋅6Н₂О) смешивали с 25 мл водного раствора аммиака (25 мас.%). Реакционную смесь перемешивали при 90°С в течение 2 ч, центрифугировали при 1000 × g в течение 1 мин, промывали 3 раза водой Milli-Q с последующим центрифугированием при 1000 × g с получением ферригидритной пасты (концентрация сухого содержимого составляла 20 мг/мл), которая затем использовалась в синтезе наночастиц гематита.

Пример 2. Синтез наночастиц гематита с использованием серной кислоты

10 мл концентрированной серной кислоты охлаждали на ледяной бане в стакане объемом 50 мл с Х-образной мешалкой, затем при интенсивном перемешивании добавляли 3 мл пасты ферригидрита (концентрация сухого содержимого составляла 20 мг/мл), через 5 минут реакцию останавливали, добавляя 100 мл льда. Объем ферригидритной пасты измеряли с помощью шприца с открытым горлом (диаметром 1 см). Центрифугирование при 2300 × g с последующим повторным промыванием холодной водой Milli-Q привело к получению осадка кирпично-красного цвета, который промывали этанолом, диэтиловым эфиром и сушили в течение ночи при комнатной температуре.

Пример 3. Синтез наночастиц гематита с использованием смеси серной кислоты и пентоксида фосфора.

Смесь серной кислоты и Р₄О₁₀ получали растворением 5 г Р₄О₁₀ в 10 мл 98%-ной серной кислоты. Полученную смесь охлаждали на ледяной бане в стакане объемом 50 мл с Х-образной мешалкой, затем при интенсивном перемешивании добавляли 3 мл пасты ферригидрита (концентрация сухого содержимого составляла 20 мг/мл), через 5 минут реакцию останавливали, добавляя 100 мл льда. Объем ферригидритной пасты измеряли с помощью шприца с открытым горлом (диаметром 1 см). Центрифугирование при 2300 × g с последующим повторным промыванием холодной водой Milli-Q привело к получению осадка кирпично-красного цвета, который промывали этанолом, диэтиловым эфиром и сушили в течение ночи при комнатной температуре.

Пример 4. Синтез наночастиц гематита с использованием муравьиной кислоты.

10 мл муравьиной кислоты охлаждали на ледяной бане в стакане объемом 50 мл с Х-образной мешалкой, затем при интенсивном перемешивании добавляли 3 мл пасты ферригидрита (концентрация сухого содержимого составляла 20 мг/мл), через 24 часа перемешивания при комнатной температуре реакцию останавливали, добавляя 100 мл льда. Объем ферригидритной пасты измеряли с помощью шприца с открытым горлом (диаметром 1 см). Центрифугирование при 2300 × g с последующим повторным промыванием холодной водой Milli-Q привело к получению осадка кирпично-красного цвета, который промывали этанолом, диэтиловым эфиром и сушили в течение ночи при комнатной температуре.

Пример 5. Синтез наночастиц гематита покрытых полиэтиленимином.

10 мг сухих наночастиц гематита обрабатывали ультразвуком с 1 мл 0,1 Μ HCl, промывали водой Milli-Q с последующим трехкратным центрифугированием и смешивали с 2 мл 20 мас.% раствора полиэтиленимина (Μn ~ 25000, >99% чистоты). Смесь инкубировали в течение 5 ч при 95°С, промывали водой Milli-Q с последующим трехкратным центрифугированием и ресуспендировали в воде Milli-Q для с получением раствора модифицированных частиц. Наличие полимера на поверхности проверяли с помощью инфракрасной спектроскопии.

Пример 6. Синтез наночастиц гематита покрытых полиакриловой кислотой.

10 мг сухих наночастиц гематита обрабатывали ультразвуком с 1 мл 0,1 Μ HCl, промывали водой Milli-Q с последующим трехкратным центрифугированием и смешивали с 2 мл 20 мас. % раствора полиакриловой кислоты (Μn ~ 5100). Смесь инкубировали в течение 5 ч при 95°С, промывали водой Milli-Q с последующим трехкратным центрифугированием и ресуспендировали в воде Milli-Q для с получением раствора модифицированных частиц. Наличие полимера на поверхности проверяли с помощью инфракрасной спектроскопии.

Пример 7. Синтез специфичных наночастиц гематита покрытых полиакриловой кислотой и флуоресцентно-меченными белками.

Белки конъюгировали с наночастицами, покрытыми полиакриловой кислотой следующим образом 600 мкг покрытых полиакриловой кислотой ГНЧ инкубировали в 40 мкл буфера MES (рН=5,0) в течение 30 мин с 7 мг ЭДК и 3,5 мг sulfo-NHS. Затем ГНЧ центрифугировали и промывали MES. Наконец, ГНЧ промывали водой Milli-Q и смешивали с 40 мкл раствора белка 1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере. Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Наконец, ГНЧ центрифугировали и трижды промывали фосфатно-солевым буфером. Чтобы прикрепить флуоресцентную метку Су3 к НЧ, 600 мкг ГНЧ, сконъюгированных с белком, диспергировали в 50 мкл 0,1% раствора БСА в фосфатно-солевом буфере. Раствор смешивали с 17 мкг Су3-сульфо-NHS в 50 мкл фосфатно-солевого буфера и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре с получением целевых флуоресцентно-меченных частиц с белком на поверхности.

Пример 8. Синтез специфичных наночастиц гематита покрытых карбоксиметилдекстраном (КМД) и флуоресцентно-меченными белками.

Белки конъюгировали с наночастицами, покрытыми КМД следующим образом 600 мкг покрытых полиакриловой кислотой ГНЧ инкубировали в 40 мкл буфера MES (рН=5,0) в течение 30 мин с 7 мг ЭДК и 3,5 мг sulfo-NHS. Затем ГНЧ центрифугировали и промывали MES. Наконец, ГНЧ промывали водой Milli-Q и смешивали с 40 мкл раствора белка 1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере. Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Наконец, ГНЧ центрифугировали и трижды промывали фосфатно-солевым буфером. Чтобы прикрепить флуоресцентную метку Су3 к НЧ, 600 мкг ГНЧ, сконъюгированных с белком, диспергировали в 50 мкл 0,1% раствора БСА в фосфатно-солевом буфере. Раствор смешивали с 17 мкг Су3-сульфо-NHS в 50 мкл фосфатно-солевого буфера и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре с получением целевых флуоресцентно-меченных частиц с белком на поверхности.

Пример 9. Частицы гематита для специфического таргетинга клеток-мишеней.

Свежесобранные эукариотические клетки СНО (0,25 миллиона), ВТ-474 (0,25 миллиона) и эритроциты (конечная концентрация 0,5%) инкубировали в 50 мкл фосфатно-солевого буфера с 3 мкг покрытых полимером ГНЧ или 10 мкг ГНЧ, покрытых конъюгированным с антителом (TER-119 против эритроцитов или Герцептин против ВТ-474), в течение 10 мин и дважды промывали фосфатно-солевым буфером. Флуоресцентное окрашивание клеток не использовали, чтобы минимально повлиять на взаимодействия клетки с наночастицами. Эритроциты изучали с помощью проточного цитометра ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, Остин, Техас, США) с использованием 488-нм (50 мВт) лазера для возбуждения флуоресценции. Герцептин использовали в качестве отрицательного контроля в экспериментах с эритроцитами. Клетки СНО и ВТ-474 исследовали на проточном цитометре CellStream (Luminex Corporation) с использованием лазера 561 нм (1 мВт). Для ImageStream мы использовали рекомендованную производителем стратегию гейтирования.

Пример 10. Флуоресцентный иммуноанализ.

60 мкл раствора белка (антитела против иммуноглобулина человека, иммуноглобулины крысы), с концентрацией 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере помещали в лунку 96-луночного полистирольного планшета и инкубировали в течение 8 ч при 4°С. Затем раствор заменяли 60 мкл 1% раствора БСА в фосфатно-солевом буфере (блокирующий буфер). Через 30 мин при комнатной температуре раствор удаляли, а лунки промывали 100 мкл фосфатно-солевого буфера. После этого в лунки добавляли 60 мкл блокирующего буфера с различными концентрациями ГНЧ, конъюгированных с Су3-мечеными белками (TER-119, общий иммуноглобулин человека, БСА или антитела козы к иммуноглобулинам крысы), и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Наконец, лунки пять раз промывали 100 мкл фосфатно-солевого буфера, и флуоресценцию, вызванную Су3, измеряли с помощью ридера для микропланшетов ClarioStar (BMG LABTECH, Дарем, Северная Каролина, США). Частицы демонстрировали высокую специфичность как показано на Фиг. 4.

Пример 11. Флуоресцентная оптическая томография с использованием флуоресцентно-меченных частиц гематита

Флуоресцентную оптическую томографию выполняли на системе биовизуализации VerumSight (Abisense, Россия) с использованием источника света 750±20 нм для возбуждения и фильтра 800+ нм. 2 мг ГНЧ@ПАК сконъюгировали с общим человеческим IgG, а затем пометили 50 мкг красителя Cy7,5-sulfo-NHS, как описано в Примере выше. Каждая введенная доза содержала 500 мкг НЧ в 300 мкл физиологического раствора. Для эксперимента использовали самок мышей BALB/c (около 20 г). Через 40 мин после инъекции мышей умерщвляли и регистрировали флуоресценцию частиц в экстрагированных органах. Кроме того, проводили МРТ-томографию для детекции биораспределения частиц. Результаты оптической томографии коррелировали с результатами МРТ-томографии.

Пример 12. Доставка генетических конструкций в клетки с использованием трансфецирующих частиц на основе гематита: доставка гена GFP.

4.6 мкг частиц гематита, покрытых полиэтиленимином в Milli-Q смешивали с 1 мкг ДНК в Milli-Q содержащей ген GFP в 0.5 мл клеточной среды и затем смешивали с 40 тыс клеток HEK 293, инкубировали в течение суток, затем наблюдали эффективность трансфекции с помощью оптической флуоресцентной микроскопии. Наблюдали эффективность трансфекции не менее 40%.

Пример 13. Доставка генетических конструкций в клетки с использованием трансфецирующих частиц на основе гематита: доставка гена люциферазы светлячка.

4.6 мкг частиц гематита, покрытых полиэтил енимином в Milli-Q смешивали с 1 мкг ДНК в Milli-Q содержащей ген Firefly Luciferase в 0.5 мл клеточной среды и затем смешивали с 40 тыс клеток HEK 293, инкубировали в течение суток, затем добавляли субстрат люциферазы и регистрировали люминесцентный сигнал, превышавший шум не менее, чем в 100 раз.

Пример 14. Доставка генетических конструкций в клетки с использованием трансфецирующих частиц на основе гематита: доставка антисенс олигонуклеотида.

4.6 мкг частиц гематита, покрытых полиэтиленимином в Milli-Q смешивали с 1 мкг антисенс олигонуклеотида против гена люциферазы в Milli-Q в 0.5 мл клеточной среды и затем смешивали с клетками HEK 293, стабильно экспрессировавшими ген люциферазы. Затем после инкубации, добавляли субстрат люциферазы и регистрировали люминесцентный сигнал, который оказывался на 20% ниже, чем в контрольном образце, в который добавляли частицы инкубированные с неспецифическим олигонуклеотидом.

Изобретение относится к области биомедицины и наномедицины, в частности к способу получения частиц на основе гематита, способных специфически распознавать и связываться с клетками-мишенями. Для осуществления указанного способа сначала смешивают суспензию частиц ферригидрита с раствором кислоты, выбранной из серной, азотной, соляной, муравьиной, фосфорной и уксусной. Указанная кислота является концентрированной, а её концентрация после указанного смешения составляет не менее 50 мас.%. Далее полученную смесь инкубируют при температуре от 0 до +4 градусов Цельсия с целью формирования частиц гематита. Затем указанные частицы гематита переводят в водный раствор с рН более 2 с дальнейшим добавлением к суспензии указанных частиц раствора положительно-заряженного полимера для его сорбции на поверхность указанных частиц. После чего осуществляют конъюгацию специфичного к указанным клеткам рецептора с указанными молекулами полимера на поверхности указанных частиц. Настоящее изобретение позволяет получать нетоксичные наночастицы гематита контролируемого размера, функционализированные специфическими рецепторными молекулами, с использованием легко доступных реагентов способом, обладающим возможностью легкой масштабируемости условий синтеза. 29 з.п. ф-лы, 14 пр., 7 ил.

1. Способ получения частиц на основе гематита, способных специфически распознавать и связываться с клетками-мишенями, включающий:

i) смешение частиц ферригидрита с раствором кислоты, выбранной из серной, азотной, соляной, муравьиной, фосфорной и уксусной, при этом кислота является концентрированной, а концентрация упомянутой кислоты после смешения с частицами ферригидрита составляет не менее 50 мас.% и инкубацию полученной смеси при температуре от 0 до +4 градусов Цельсия с целью формирования частиц гематита;

ii) перевод упомянутых частиц гематита в водный раствор с рН более 2 с целью получения суспензии, с дальнейшим добавлением к суспензии упомянутых частиц гематита раствора положительно-заряженного полимера, для его сорбции на поверхность частиц;

iii) конъюгацию специфичного к упомянутым клеткам рецептора с упомянутыми молекулами полимера на поверхности упомянутых частиц.

2. Способ по п. 1, в котором концентрация упомянутой кислоты после смешения с частицами ферригидрита составляет не менее мас.70%.

3. Способ по п. 1, в котором концентрация упомянутой кислоты после смешения с частицами ферригидрита составляет не менее мас.90%.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 10 минут.

5. Способ по п. 1, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 1 часа.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутую инкубацию осуществляют не более 24 часов.

7. Способ по п. 1, в котором упомянутая кислота является сильной минеральной кислотой из группы: серная, азотная, соляная.

8. Способ по п. 1, в котором упомянутая кислота является органической кислотой из группы: муравьиная, уксусная.

9. Способ по п. 1, в котором упомянутую инкубацию проводят при температуре от 0.5 до 1 градуса Цельсия.

10. Способ по п. 1, в котором упомянутую инкубацию проводят при температуре 1.5-2.5 градуса Цельсия.

11. Способ по п. 1, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 100 нм.

12. Способ по п. 1, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 200 нм.

13. Способ по п. 1, в котором упомянутые частицы гематита имеют средний размер менее 1000 нм.

14. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита дополнительно сорбируют полимер.

15. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита коллоидно-стабильны.

16. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.05.

17. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.1.

18. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита имеют индекс полидисперсности менее 0.2.

19. Способ по п. 1, в котором на упомянутые частицы гематита дополнительно сорбируют полимер из группы: декстран, карбоксиметилдекстран, карбоксиметилцелюлюза, разветвленный полиэтиленимин, линейный полиэтиленимин, поливинилпирролидон, поливинилацетат, хитозан, полилизин, полиаспарагиновая кислота, полиакриловая кислота, полиоктадецен-альт-малеиновая кислота, полистиролсульфоновая кислота.

20. Способ по п. 1, в котором упомянутые частицы гематита дополнительно конъюгируют с меткой из группы: флуоресцентную, магнитную, МРТ-контрастирующую, рентгентоконтрастирующую, люминесцентную, радиоактивную.

21. Способ по п. 1, в котором упомянутые частицы гематита дополнительно включают в себя цитостатические, цитотоксические или терапевтические соединения.

22. Способ по п. 1, в котором упомянутый полимер принадлежит группе декстран, карбоксиметилдекстран, полиэтиленимин, полилизин, полиаспарагиновая кислота, полиакриловая кислота.

23. Способ по п. 1, в котором упомянутый полимер включает в себя карбоксильные группы и упомянутую конъюгацию проводят карбодиимидным способом.

24. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является пептидом, полипептидом или белком.

25. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является нуклеиновой кислотой.

26. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является аптамером.

27. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является белком из группы: трансферрин, лактоглобулин, авидин, стрептавидин, нейтравидин, лектин.

28. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является низкомолекулярным рецептором.

29. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является фолиевой кислотой или ее аналогом.

30. Способ по п. 1, в котором упомянутый рецептор является биотином или его аналогом.