Группа изобретений относится к области биомедицины, наномедицины, в частности, к конъюгатам наночастицы состава золото-магнетит с функциональной молекулой и способу их применения в медицине, например, в качестве средств доставки лекарств, диагностических веществ, контрастных веществ и маркеров для иммунохроматографических тестов, КТ, МРТ и др.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время неорганические наночастицы (НЧ) широко используются в качестве каркасов для доставки лекарств/генов [1-4], биосенсоров [3-7], визуализации и терапии [8] благодаря их уникальным оптическим и электронным свойствам и превосходной биосовместимости [9]. Поэтому разработка новых подходов к применению наночастиц и конъюгатов наночастицы с функциональными молекулами является актуальной задачей биомедицины.
Наночастицами называют любые объекты размером от 1 до 100 нанометров (1 нм=1х10-9 м), полученные как с помощью химического синтеза, так и естественным путем [10]. В природе они встречаются повсеместно, и в ряде случаев могут формироваться живыми объектами, как например магнетосомы у некоторых видов бактерий или экзосомы у эукариот.Вследствие небольшого размера наночастицы обладают рядом уникальных физических, химических и биологических свойств, востребованных в различных областях биомедицины.
Высокая поверхностная энергия и ван-дер-ваальсовые взаимодействия между ядрами наночастиц (далее - НЧ) являются наиболее распространенными причинами нестабильности и агрегации НЧ. Таким образом, наиболее простым способом достижения коллоидной стабилизации НЧ является модификация их поверхности лигандом, который должен прочно связываться с поверхностью и предотвращать агрегацию за счет стерического или электростатического отталкивания.
В последнее десятилетие N-гетероциклические карбеновые лиганды (ГКЛ) появились как новая альтернатива классу тиолов и фосфинов лигандов для соединений, содержащих поздние переходные металлы. С момента первых сообщений о стабильных синглетных карбенах Бертрана [10] и Ардуенго [11], эти соединения, особенно NHC [12], привлекли большое внимание в качестве лигандов для различных комплексов металлов переходной или основной группы [13-19]. В настоящее время сильная стабилизирующая способность NHC обусловлена уникальным сочетанием их стерических, электронных свойств, таких как хорошее сродство к металлам и их высокая электронодонорная природа, что, несомненно, доказано различные приложения для генерации и выделения высококаталитически активных частиц [20-22]. Хотя NHC продемонстрировали выдающийся потенциал для использования в качестве поверхностных якорей в синтезе НЧ [23-26], проблема синтеза водорастворимых наночастиц, подходящих для биомедицинских приложений, все еще остается новой областью исследований [2], [27]. MacLeod et al. [28], [29] недавно продемонстрировали стабильность наночастиц золота (AuNP), покрытых NHC, в биологических жидкостях in vitro, открывая двери для потенциальных биомедицинских применений AuNP, покрытых NHC. Crudden et al [30], Mayall et al [31], Li et al [32] представили новые биосенсоры на основе монослоев золота, покрытых карбеновым лигандом.
Несмотря на потенциал наночастиц золота в качестве сенсорной платформы и инструмента для биодоставки различных биоактивных молекул, использование этого материала в реальных условиях ограничено отсутствием долгосрочной коллоидной стабильности в водных растворах при воздействии различных физических и химических факторов (например, контакт с биожидкостями, лиофилизация и градиент ионной силы). Стабильность НЧ является важной предпосылкой для использования их в условиях in vitro и in vivo, и поэтому проблема деградации коллоидных растворов наночастиц золота усложняет их использование в биологических образцах.
Необходимо отметить, что все зарегистрированные золотосодержащие наночастицы, покрытые ГКЛ, обладают низкой стабильностью в биологических условиях и ни один пример не изучался in vivo [21], [27-29], [33-37].
Целью предлагаемого технического решения является создание стабильных конъюгатов наночастиц состава магнетит-золото с функциональными молекулами для медицинского применения, которые могут быть использованы в качестве мультимодальных наноагентов в ряде биомедицинских приложений: магнитно-резонансная томография, компьютерная томография, фототермическая терапия, диагностика, контролируемая доставка лекарств в клеточные мишени и др.
Разработка водосовместимых коллоидностабильных наночастиц состава магнетит-золото является актуальной задачей, это позволит расширить их применение в качестве средств доставки лекарств, контрастных веществ, маркеров для иммунохимических тестов, в области биосенсорики, молекулярной экспресс-диагностики и пр.
Техническая проблема заключается в сложности синтеза конъюгатов водосовместимых коллоидно-стабильных наночастиц состава магнетит-золото (НЧЗМ) с магнитными свойствами с фукциональными молекулами, недостатке сведений об их применении, строении, свойствах и устойчивости в водных растворах для применений in vitro и in vivo.
Для решения данной проблемы было исследовано несколько подходов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Из общедоступного уровня техники до даты испрашиваемого приоритета известен патент на изобретение RU 2620166 от 23.05.2017 «Способ покрытия наночастиц магнетита слоем золота» [39], в котором описан способ получения наночастиц магнетита (Fe3O4), покрытых слоем золота, которые могут быть использованы в качестве контрастного агента для магнитно-резонансной томографии, магнитной сепарации, адресной доставки лекарств и т.д. Изобретение увеличивает выход покрытых золотом наночастиц магнетита в 1,37-1,47 раза и дает возможность получать модифицированные наночастицы с более узким распределением по размерам. Это достигается за счет того, что в способе покрытия наночастиц магнетита слоем золота путем последовательного введения в водный раствор наночастиц магнетита водного раствора цитрата натрия, водного раствора золотохлористоводородной кислоты и водного раствора гидрохлорида гидроксиламина, перед введением водного раствора цитрата натрия наночастицы магнетита дополнительно обрабатывают 1-3 молярным водным раствором хлорной кислоты в течение 1-30 минут.
Недостатком является отсутствие данных о стабильности частиц, отсутствие стабилизирущего лиганда, позволяющего проводить химическую модификацию поверхности наночастиц биомолекулами.
Известен источник информации Franziska Lissel et al. 2020 [40], в котором представлен поли(3-гексилтиофен), функционализированный N-гетероциклическим карбеном как прочным и проводящим лигандом для стабилизации наночастиц золота. В источнике раскрыт способ синтеза с использованием функционализированных комплексов NHC-Au-X в качестве инициаторов полимеризации типа Кумада для получения монофункционализированных региорегулярных P3HT с узким распределением веса, а также показано получение системы НЧ P3HT-NHC@Au в виде хорошо диспергированных НЧ путем прямого восстановления. По сравнению с наночастицами золота, стабилизированными ПЭГ, синтезированные системы наночастиц P3HT-NHC@Au демонстрируют превосходную термическую и электрохимическую окислительно-восстановительную стабильность.
Недостатком предлагаемых наночастиц золота, является отсутствие магнитных свойств, что ограничивает области применения.
Известен источник информации Ефремова М.В., Москва, 2018 г.[41], в котором описан синтез, физико-химические свойства и биомедицинское применение гибридных материалов на основе наночастиц магнетит-золото.
Недостатком является то, что полученные частицы золото-магнетит покрывают ПЭГ, что делает их неспособными к химической модификации различными биомолекулами.
Из источника информации N.S. Elbialy et al., 2018 [42] известны многофункциональные магнитные наночастицы золота (МНЧ). Подготовленные МГНП характеризовались различными физическими приемами. Затем их покрыли и конъюгировали с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и доксорубицином (ДОКС) с образованием МГНП-ДОКС-конъюгатов (MGNP- DOX-конъюгатов). Высокая эффективность МГНП-ДОКС-конъюгатов при комбинированной химио-фототермической терапии наблюдали как in vitro, так и in vivo. Эффективность MGNP-DOX-конъюгатов, как тераностических наночастиц, была подтверждена гистопатологическими и иммуногистохимическими исследованиями. MGNP-DOX-конъюгаты показали хороший потенциал для МРТ и как контрастные вещества для управляемой химио-фототермической синергетической терапии.
Недостатком является то, что данные наночастицы покрыты модифицированным полимером с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и доксорубицином (ДОКС), что делает их неспособными к химической модификации другими различными биомолекулами.
Из источника информации Nihal S. Elbialy et al., 2018 г.[43] известны сильнодействующие тераностические наночастицы, которые сочетают в себе диагностические и терапевтические средства для эффективного лечения рака. Это многофункциональные магнитные наночастицы золота (МНЧ), которые способны (i) избирательно доставлять лекарство к месту опухоли способом с контролируемым высвобождением, либо пассивно, либо с помощью магнитного наведения; (ii) индуцировать фототермическую терапию с помощью производства тепла за счет поглощения лазера в ближней инфракрасной области спектра (БИК); и (iii) служить контрастными веществами для магнитно-резонансной томографии (МРТ) (терапия под визуальным контролем). Подготовленные МГНП характеризовались различными физическими приемами. Затем их покрыли и конъюгировали с полиэтиленгликолем (PEG) и доксорубицином (DOX) с образованием конъюгатов MGNP DOX. Высокая эффективность МГНП-ДОКС при комбинированной химио-фототермической терапию наблюдали как in vitro, так и in vivo. Эффективность MGNP-DOX как тераностических наночастиц была подтверждена гистопатологическими и иммуногистохимическими исследованиями. Более того, MGNP-DOX показали хороший потенциал в качестве контрастного вещества в МРТ для управляемой химио-фототермической синергетической терапии. Указанный источник информации выбран наиболее близким аналогом (прототипом).
Недостатком является то, что на поверхности частицы нет лиганда с функциональной группой для конъюгации с биомолекулами.
Известен патент на изобретение RU 2660149, 05.07.2018 [44], в котором описан способ получения наночастиц магнетита диаметром 4±1 нм, эпитаксиально выращенные на наночастицах золота диаметром 2±1 нм. Строение полученных наночастиц напоминает гантель, в которой наночастица магнетита химически связана с наночастицей золота. Способ включает нагрев до 120°С в атмосфере инертного газа при перемешивании смеси дифенилового эфира, олеиновой кислоты, олеиламина и 1,2-гексадекандиола, введение в смесь пентакарбонила железа, выдерживание полученной смеси с последующим введением раствора, содержащего смесь тригидрата золотохлористоводородной кислоты и олеиламина в дифениловом эфире, предварительно выдержанного в атмосфере инертного газа, повторный нагрев при температуре 250-260°С, выдерживание нагретой смеси при температуре 250-260°С в течение 25-30 мин, ее последующее охлаждение до комнатной температуры, проводимые в атмосфере инертного газа, выдерживание смеси в присутствии воздуха, добавление в смесь одноатомного спирта и отделение наночастиц магнетита центрифугированием. НЧ могут быть использованы в магнитно-резонансной томографии в качестве контрастного агента, в магнитной сепарации, магнитной гипертермии, адресной доставке лекарств при помощи внешнего магнитного поля.
Недостатком является то, что данные наночастицы не имеют коллоидной стабильности в воде, поскольку покрыты гидрофобным лигандом.
Известен источник информации С. В. Сайкова и др., 2020 [45], в котором описано получение магнитных гибридных наночастиц магнетит-золото, заключающееся в одновременной модификации поверхности магнитного ядра и восстановлении золота на поверхности солянокислым гидразином (или l-метионином). Показано, что в зависимости от размера магнитного ядра формируются гибридные наночастицы различной природы: инкрустированные золотыми зародышами или типа «ядро-оболочка».
Недостатком является то, что. на поверхности частицы нет лиганда с функциональной группой для конъюгации с биомолекулами.
Известен источник информации Е.М. Семенова и др., 2010 [46], в котором описан метод получения бифункциональных наночастиц Fe3O4/Au межфазным восстановлением борогидридом натрия раствора комплекса золотохлористо-водородной кислоты с четвертичным аммониевым соединением в органической фазе, образованной коллоидным раствором магнетита. Наночастицы Fe3O4/Au образуются в смеси с частицами золота и магнетита или продуктов его межфазного восстановления. Для выделения и дальнейшего практического использования наночастиц Fe3O4/Au необходима очистка продуктов межфазного синтеза методом высокоградиентной магнитной фильтрации.
Недостатком является то, что наночастицы, полученные предлагаемым методом, являются стабильными в водном растворе в течение только 7 дней, а далее подвергаются агрегации.
Одной из задач заявленной группы изобретений является применение максимально устойчивых к внешним физическим и химическим воздействиям конъюгатов водорастворимых наночастиц состава магнетит-золото с различными функциональными молекулами для биологических и медицинских применений, что включает в себя устранение недостатков вышеописанных аналогов, связанных с недостаточной коллоидной стабильностью в водных растворах, биологических средах, а также при высушивании и заморозке.
В результате проведенного анализа уровня техники можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение может быть признано соответствующим критериям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень» до даты испрашиваемого приоритета.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для решения технической проблемы, а также устранения недостатков имеющихся аналогов и прототипа, заявителем предложены конъюгаты наночастиц состава магнетит-золото (Fe3O4@AuNP@NHC) с функциональными молекулами (варианты) и способы их применения (варианты). Группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом. Указанные конъюгаты обладают исключительным свойством: они могут выдерживать несколько аддитивных циклов сушки/редиспергирования на воздухе без ухудшения их коллоидных свойств. Кроме того, наночастицы, входящие в состав конъюгата, содержат карбеновый лиганд NHC, содержащий карбоксильные группы, что позволило изготовить конъюгаты наночастиц Fe3O4@AuNP@NHC, ковалентно функционализированные биомолекулами.
Технический результат заключается в повышении коллоидной устойчивости конъюгатов наночастиц состава магнетит-золото (Fe3O4@AuNP@NHC) с функциональными молекулами к внешним физическим и химическим воздействиям, в том числе и в биологических средах, а также облегчение процесса хранения и транспортировки за счет способности указанных конъюгатов к сохранению коллоидной стабильности при высушивании, в обеспечении возможности доставки диагностических и лекарственных веществ к клеткам-мишеням.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР, ТАБЛИЦ, ИНЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами.
На фиг. 1 показан синтез НЧЗМ с карбеновым лигандом методом лигандного обмена.
На фиг. 2 показаны спектры комбинационного рассеяния вещества A- (1'-Et)(AuX)2 и наночастиц AuNP@1', AuNP@1, Fe3O4@AuNP@1.
На фиг. 3 представлены изображения НЧЗМ, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа и картина дифракции.
На фиг. 4 показаны спектры поглощения НЧЗМ при различных значениях pH.
На фиг. 5 показаны спектры поглощения НЧЗМ при различных значениях ионной силы.
На фиг. 6 показаны спектры поглощения НЧЗМ при циклах высушивания-ресуспендирования.
На фиг. 7 показаны спектры поглощения НЧЗМ при различных воздействиях на частицы.
На фиг. 8 показано биораспределение конъюгата НЧЗМ с белком и флуоресцентным красителем, полученное методом оптической томографии in vivo.
На фиг. 9 представлена количественная оценка биораспределения in vivo конъюгата НЧЗМ с белком и флуоресцентным красителем.
На фиг. 10 показано биораспределение конъюгата НЧЗМ с белком и флуоресцентным красителем, полученное методом магниторезонансной томографии in vivo.
ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Указанный технический результат достигается совокупностью существенных признаков, представленной в формуле изобретения.
В одной неограничивающей реализации изобретения предложен конъюгат наночастицы с функциональной молекулой для медицинского применения, характеризующийся тем, что на поверхности водосовместимой стабильной наночастицы с магнитными свойствами, состоящей из золота и магнетита Fe3O4, иммобилизовано стабилизирующее соединение с карбоксильной группой, представляющее собой карбеновый лиганд формулы (I):
где
R1 и R2 независимо выбраны из группы, включающей COOR5 или COOR6;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей H, или C1-С6 алкил, или C3-С7 циклоалкила, или C1-С6 алкилокси и галогена, или C1-С6 алкила, C3-С7 циклоалкила, или C1-С6 алкилокси и галогена;
R5 и R6 независимо выбраны из группы, включающей H; C1-С6 алкил; C3-С7 циклоалкил; C1-С6 алкилокси и галоген.
Конъюгат сохраняет коллоидную стабильность после высушивания и обладает способностью к ресуспендированию в воде, в буферном водном растворе или биологическом образце, размеры наночастицы находятся в диапазоне от 5 до 100 нм, при этом указанная наночастица связана с функциональной молекулой непосредственно или с помощью линкера, имеющего общую формулу (II):
CONH(CH2)mY,
где Y=COOH, NH2, SH, CONH2, OH, CHO, CO-ПЭГ-OH или CO-ПЭИ-NH2,
m может принимать значения от 3 до 12,
при этом функциональную молекулу выбирают из группы, включающей терапевтический препарат или диагностическое вещество.
Еще в одном примере реализации изобретения указанный конъюгат может включать нацеливающий рецептор.
Еще в одном примере реализации изобретения биологическим образцом является молоко.
Еще в одном примере реализации изобретения биологический образец выбирают из группы, включающей сыворотку крови, плазму крови или цельную кровь.
Еще в одном примере реализации изобретения буферный водный раствор выбирают из группы, включающей фосфатный, аммиачный, ацетатный или карбонатный буферный водный раствор.
Еще в одном примере реализации изобретения конъюгат после высушивания представляет собой сухой порошок.
Еще в одном примере реализации изобретения конъюгат после высушивания представляет собой сухую тонкую пленку на твердых поверхностях, таких как стекло, пластик, полимерное покрытие, металл, бумага, нитроцеллюлоза, керамика или дерево.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу родамин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу флуоресцеин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу - цианиновый краситель.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу - производное флуоресцентных красителей BODIPY, но не ограничивается им.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой кумарин.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор на основе порфирина.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор на основе фталоцианина.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой С-реактивный белок.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок БСА-биотин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок БСА-хлорамфеникол.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок стрептавидин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок лектин WGA или лектин ConA.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело иммуноглобулин G.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело человеческий иммуноглобулин G.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело герцептин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело против хлормафеникола.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело на С-реактивный белок.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело на тропонин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело против флуоресцеина.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой моноклональное антитело трастузумаб.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой иммунологические агенты и/или их комбинации в качестве антитела.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой углевод.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой липид.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой ДНК, в том числе фрагменты и целые молекулы ДНК.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой транспортные, матричные, рибосомальные или микро-РНК.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные нуклеиновые кислоты, морфолиновые нуклеиновые кислоты, закрытые нуклеиновые кислоты, гликолевые нуклеиновые кислоты и треозо-нуклеиновые кислоты.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой синтетический полимер полиэтиленгликоль или полиэтиленимин.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой соединение, выбираемое из липофильного, плохо или совсем не растворимого в воде фармакологически активного соединения.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - противораковое лекарство.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство против рака молочной железы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик темозоломид.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик доксорубицин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик даунорубицин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик паклитаксел.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение - лекарство цитостатик темозоломид, но не ограничиваясь им.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки диагностических веществ характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки диагностических веществ характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой флуоресцентный краситель родамин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки диагностических веществ характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой флуоресцеин.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки диагностических веществ характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой цианиновый краситель.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант конъюгата для адресной доставки в клетки диагностических веществ характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой производное флуоресцентных красителей BODIPY.
Также технический результат достигается за счет того, что предложен вариант способа применения конъюгата в магнитно-резонансной томографии.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата, у которого функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор, в спектрофотометрическом анализе.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата, у которого функциональная молекула представляет собой белок, в иммуноферментном анализе.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата, у которого функциональная молекула представляет собой белок, в иммунохроматографическом анализе.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата в качестве контраста для компьютерной томографии.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата, у которого функциональная молекула представляет собой белок, для детекции целевых молекул.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для детекции целевых молекул, выбираемых из группы, содержащей малые молекулы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для детекции целевых молекул, выбираемых из группы, содержащей белки, включая антитела.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для детекции целевых молекул, выбираемых из группы, содержащей углеводы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для детекции целевых молекул, выбираемых из группы, содержащей липиды.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для детекции целевых молекул, выбираемых из группы, содержащей ДНК или РНК.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей малые молекулы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей белки, включая антитела.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей углеводы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей липиды.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей ДНК или РНК.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата в качестве агента для радиотерапии.
Еще в одном аспекте реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор, выбираемый из группы, включающей малые молекулы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор, выбираемый из группы, включающей белки, в том числе антитела.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор, выбираемый из группы, включающей углеводы.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор, выбираемый из группы, включающей липиды.
Еще в одном примере реализации изобретения представлен вариант способа применения конъюгата для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор, выбираемый из группы, включающей ДНК или РНК.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения и общая терминология.
Далее будут приведены ссылки на определенные варианты осуществления изобретения, примеры которых проиллюстрированы прилагаемыми наночастицами, конъюгатами, структурами и способами. Подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.
Специалисту в данной области известны многие способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, которые могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения.
Настоящее изобретение не ограничивается изложенными в данном документе способами и материалами. В случае, если один или несколько из включенных литературных ссылок, патентов и аналогичных материалов отличается от или противоречит данной заявке, включая, в частности, определенные термины, использование терминов, описанные приемы и т.п., преимущественную силу имеет настоящая заявка.
Далее следует принять во внимание, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления изобретения, могут быть представлены также совместно в одном варианте. И наоборот, разнообразные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления изобретения, могут быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.
Если представлен диапазон значений, то следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное между верхней и нижней границами этого диапазона и любые другие указанные или промежуточные значения в этом установленном интервале охватываются настоящим изобретением. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, что также входит в объем изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указано, что диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любое из обоих включенных пределов, также входят в объем изобретения.
Термин «пациент» или «субъект» используется в описании для обозначения животного, предпочтительно человека, или одомашненного животного, которому проводят лечение, включая профилактическое лечение, с помощью композиций в соответствии с настоящим изобретением. При лечении таких инфекций, состояний или заболеваний, которые являются специфическими для конкретного животного, такого как пациент-человек, термин «пациент» относится к конкретным животным, включая домашних животных, таких как собаки или кошки, грызуны, или сельскохозяйственных животных, таких как лошадь, корова, овца и т.д. В основном, в настоящем изобретении термин «пациент» относится к пациенту-человеку, если другое не указано или не подразумевается из контекста использования термина.
Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.
Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.
Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное.
Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе.
Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.
Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено.
Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.
Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.
Для описания настоящего изобретения используются следующие термины.
Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют такое значение, какое обычно понимается специалистами в области, к которой относится изобретение, если не указано иное. Все патенты и публикации, на которые имеются ссылки в данном документе, полностью включены в изобретение посредством ссылки.
Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны среднему специалисту. Некоторые из сокращений используют как нижеследующие:
AuNP@1 - вариант наночастицы золота
AuNP@1' - вариант наночастицы золота
Fe3O4@AuNP@1 - вариант наночастицы состава магнетит-золото
Fe3O4@AuNP@1' - вариант наночастицы состава магнетит-золото
Fe3O4@AuNP@NHC - наночастица состава магнетит-золото с карбеновым лигандом
НЧЗМ - наночастица состава золото-магнетит
Карбеновый лиганд (1-Me)(HBr)2 - прекурсор комплекса наночастиц с золотом
ПТСА- п-толуолсульфокислота
BODIPY - производное флуоресцентных красителей, техническое общее название химического соединения с формулой C9H7BN2F2, молекула которого состоит из дифторида BF2, присоединенной к дипиррометеновой группе C9H7N2; в частности, соединение 4,4-дифтор-4-бора-3a,4a-диаза-s-индацен в номенклатуре IUPAC. Общее название является сокращением от «бор-дипиррометен». Это красное кристаллическое твердое вещество, стабильное при температуре окружающей среды, растворимое в метаноле.
MW- микроволновое излучение
MES- 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота
EDC- N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид
Сульфо-NHS- N-гидроксисульфосукцинимид натриевая соль
SERS- поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия
XPS- рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС)
БСА- бычий сывороточный альбумин
PBS- фосфатно-солевой буферный раствор
ДМСО- диметилсульфоксид
ИПС- изопропанол
ПЭГ- полиэтиленгликоль
ПЭИ- полиэтиленимин
SPR- поверхностный плазмонный резонанс (ППР)
ПАВ- поверхностно-активное вещество
РСА- рентгеноструктурный анализ
ПЭМ- просвечивающая эмиссионная спектроскопия
ИХА- иммунохроматографический анализ
ХЕПЕС- 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)
Среда DMEM- среда ДМЕМ, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (Dulbecco's modified Eagles medium)
КТ- компьютерная томография
Малая молекула - термин в молекулярной биологии, биохимии и фармакологии, обозначает химические соединения со сравнительно малой молекулярной массой не более 900 дальтон, размером не более 10-9 м, способные проникать в клетку и покидать ее, обладающие той или иной биологической активностью, то есть способностью регулировать или воздействовать на те или иные биологические процессы в клетке (например, лекарства)
Функциональная молекула - это макромолекула с функциональной группой
Функциональная группа - это структурный фрагмент молекулы (атом или группа атомов), обусловливающий ее способность участвовать в химических превращениях определенного типа. Наличие в молекулах конкретных функциональных групп служит основой классификации органических соединений (например, карбоновые кислоты содержат карбоксильную группу, спирты - гидроксильную, альдегиды и кетоны - карбонильную, нитросоединения - нитрогруппу).
СИНТЕЗ
Далее описана общая схема синтеза заявленных объектов.
Карбеновый лиганд (1-Me)(HBr)2, являющийся прекурсором комплекса наночастиц с золотом, был синтезирован в 4 стадии (Схема 1). Взаимодействие метил 4-хлор-3-нитробензоата с изопропиламином, последующие восстановление гидразин гидратом нитро-группы до амино-группы и циклизация с триэтилортоформиатом приводят к получению бензимидазола 4. Последний алкилируют 0,5 экв дибромпропана и получают соль заявленного бидентатного лиганда (1-Me)(HBr)2, структура которого была подтверждена спектром 1H ЯМР (наличие синглета на 10,33 мд, характерного для азолиевого протона), масс-спектрометрией высокого разрешения (m/z 239,1290 ([M-2Br]2+; расчетное 239,1285), а также РСА.
Схема 1.
Комплекс лиганда с золотом (1-Me)(AuCl)(AuX), где X=Cl, Br получали через in situ образование комплекса с серебром (1-Me)(AgBr)2 и последующим трансметаллированием. Когда в качестве источника серебра использовали оксид серебра (I), реакция протекала очень медленно, и при этом происходило частичное разложение образующегося комплекса. Замена его на карбонат серебра значительно ускорила реакцию. После полного растворения карбоната серебра, в реакционную смесь добавляли (Me2S)AuCl. Структура комплекса (1-Me)(AuCl)(AuX), где X=Cl, Br была подтверждена спектроскопией 13С ЯМР за счет появления слегка смещенного в область сильного поля сигнала на 180,46 мд, масс-спектроскопии высокого разрешения (m/z 905,1439 ([(1-Me)Au2Cl]+; расчетное 905,1439) и 949,0930 ([(1-Me)Au2Br]+; расчетное 949,0933)) и РСА.
Схема 2.
Поскольку положение карбоксильной группы в бензимидазоле не влияет на стабилизацию наночастиц золото-магнетит (НЧЗМ), исходное соединение (1'-Et)(HBr)2 было получено и использовалось в следующих стадиях в виде смеси трех изомеров (Схема 2). Соль карбенового лиганда (1'-Et)(HBr)2 была получена из коммерчески доступной бензимидазол-5-карбоновой кислоты. Следуя известной методике, из вышеупомянутой кислоты был получен этиловый эфир 5, который далее алкилировали изопропилбромидом. Соединение 6 использовали для получения соответствующей бензимидазолиевой соли, а также комплексов с серебром и золотом в соответствии с вышеописанными методиками для метилового эфира. Их строение было подтверждено спектроскопией ЯМР, а также масс-спектроскопией высокого разрешения.
Водосовместимые НЧЗМ Fe3O4@AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1' были синтезированы из Fe3O4@AuNP@OlA, стабилизированного в органической фазе олеиновой кислотой/олеиламином, методом «лигандного обмена», заключающимся в щелочном гидролизе комплекса золота (1-Me)(AuX)2 (X=Cl, Br) или (1'-Et)(AuX)2 (X=Cl, Br) в смеси EtOH/H2O=1:1 в присутствии Fe3O4@AuNP@OlA (фиг. 1).
Благодаря плазмонным свойствам НЧЗМ связывание NHC с НЧЗМ было подтверждено с помощью поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния (SERS) (фиг. 2). Присутствие ГКЛ на поверхности НЧЗМ было подтверждено SERS-спектрами на приборе Confotec MR 350 (Sol instruments, Беларусь). Сигналы бензимидазолиевых колец наблюдаются при 1400-1405 см-1 (фиг. 2): выделены следующие характерные колебания (υ - валентное колебание, δ - деформационное колебание): 1320-1210 см-1 - υ С-О (горизонтальная штриховка), 1440-1395 - δ OH группы COOH (плотная штриховка с наклоном вправо), 1400-1300 - υсимм. С-О и 1650-1550 - υасимм. С-О карбоксилат-аниона соответственно (штриховка с наклоном влево). Данные SERS согласуются с литературными данными (J.F. DeJesus, et.al., 2020; J.F. DeJesus, et. al., 2018; M.J. Trujillo, et.al., 2018), что подтверждает наличие лигандов на поверхности наночастиц.
Полученные наночастицы были проанализированы при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (фиг. 3) с использованием прибора JEOL JEM-2100 (200 кВ, JEOL, Япония). НЧЗМ Fe3O4@AuNP@1 состоит из фаз магнетита и золота, что видно на выбранной области (электронной) дифракции. Состав НЧЗМ Fe3O4@AuNP@1 Fe:Au=3:1 согласно ICP-OES.
Стабильность частиц Fe3O4@AuNP@1' и Fe3O4@AuNP@1 была подтверждена в широком диапазоне pH (1-12) (фиг. 4), градиенте ионной силы (фиг. 5) и в нескольких циклах высушивания/ресуспендирования в различных условиях (фиг. 6), что определяется отсутствием смещения в УФ/вид. спектре пика ППР, положение которого строго зависит от степени агрегирования наночастиц.
Полученные наночастицы показали способность к ресуспендированию в воде, в буферных водных растворах с сохранением коллоидной стабильности даже после воздушной сушки при комнатной (в интервале 15-26°С) или повышенной (в интервале 80-100°С) и пониженной температуре, вакуумной сушке, лиофильной сушке, высушивание проводили до сухого порошка или до тонкой пленки на различных твердых фазах (стекло, пластик, полимерное покрытие, металл, бумага, нитроцеллюлоза, керамика, дерево) непосредственно из водного раствора без добавления каких-либо дополнительных ПАВов и стабилизаторов.
Высушивание на воздухе проводили следующим образом: в определенную тару (виала, пробирки типа эппендорф, пробирка стеклянная, пробирка пластиковая) или на определенную поверхность (стекло, пластик, полимерное покрытие, металл, бумага, нитроцеллюлоза, керамика, дерево) помещали определенный объем раствора, содержащего Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 и инкубировали на воздухе при определенной температуре до полного высыхания (испарения воды из раствора). Ресуспендирование (смывание НЧЗМ с поверхности) проводили путем добавления к сухим частицам воды или водного буферного раствора, например, PBS, MES, HEPES, ацетатного буфера.
Так, например, частичная агрегация наблюдалась только после третьего цикла высушивания/ресуспендирования, но добавление NaHCO3 или раствора NaHCO3 и NaOAc приводило к ее исчезновению. Можно предположить, что причиной агрегации является образование водородных связей между карбоксильными группами лигандов, находящихся на поверхности наночастиц (фиг. 6), а не удалением лиганда с поверхности НЧЗ.
НЧЗМ высаживали из нейтрального pH добавлением кислоты (при pH≤4), затем ресуспендировали добавлением раствора щелочи, фиксировали положение пика ППР, снимая спектр поглощения, и повторяли описанную процедуру 2-3 раза. Данный эксперимент позволяет сделать вывод об обратимом агрегировании частиц при pH меньше 4.
Проверка термической стабильности (при 100 и 120°С), а также устойчивость к различным внешним условиям (длительное хранение и замораживание до -20°С) была проведена на НЧЗМ. Частицы Fe3O4@AuNP@1 показали повышенную стабильность при замораживании и хранении как минимум 60 дней в как в растворе так и в виде сухого порошка (фиг. 7).
Полученные данные позволяют сделать вывод о высокой стабильности заявленных НЧЗМ по сравнению с известными аналогами, а также демонстрируют возможность конъюгации НЧЗМ с функциональными биомолекулами за счет наличия карбоксильной группы на поверхности.
Заявителем получены результаты, подтверждающие успешную работу мультимодальных наночастиц Fe3O4@AuNP@NHC в трех различных приложениях: тестах латерального потока, нацеливании на специфические раковые клетки и биовизуализации in vivo. Эти результаты демонстрируют заметные преимущества карбенового покрытия неорганических наночастиц и их привлекательность для сложных биомедицинских приложений.
Заявленная группа изобретений показывает возможность связывания наночастиц с функциональными молекулами, в частности посредством ковалентной конъюгации с карбоксильной группой. Полученные конъюгаты в том числе, могут нести в себе различные молекулы: малые молекулы (родамин, флуоресцеин, цианиновые красители, производные BODIPY и т.п.), цитостатики и цитотоксические вещества (доксорубицин, даунорубицин, паклитаксел, темозоломид и другие), фотосенсибилизаторы (порфирины, фталоцианины и др.). Ковалентная конъюгация функциональных молекул с поверхностью частиц является одним из вариантов воплощения.
Для разработки тестов иммунохроматографического анализа (ИХА) Fe3O4@AuNP@1' ковалентно модифицировали с помощью природных антиген-специфических белков-антител. Для этого наночастицы конъюгируют с антителом, например, карбодиимидным методом с анти-человеческим IgG (Fe3O4@AuNP@1'@анти-человеческий IgG), герцептином (трастузумабом - Fe3O4@AuNP@1'@герцептин) или антителами против хлорамфеникола, флуоресцеина или тропонина. Анализ показал, что наночастицы Fe3O4@AuNP@1'@анти-человеческий IgG, Fe3O4@AuNP@1'@герцептин специфическим образом взаимодействуют только с антигеном-мишенью. Более того, указанные наночастицы не взаимодействуют с типичными белками сыворотки крови - альбумином и иммуноглобулинами. Эти белки играют важную роль в опсонизации и ускоряют выведение из кровотока. Такой результат позволил сделать вывод, что НЧЗМ являются перспективными агентами для приложений in vivo. Кроме того, наночастицы Fe3O4@AuNP@1'@анти-человеческий IgG, Fe3O4@AuNP@1'@герцептин, которые подвергались сушке и ресуспендированию, сохранили сродство к антигену, что упрощает способ хранения и транспортировки тестов ИХА. Кроме того, наночастицы, функционализированные антителами против хлормафеникола, флуоресцеина или человеческих иммуноглобулинов показали чувствительную регистрацию соответствующих аналитов в различных образцах - молока, сыворотки и плазме крови, а также цельной крови.
Чтобы продемонстрировать возможность использования разработанных наночастиц для специфического таргетинга клеток, Fe3O4@AuNP@1' были сконъюгированы с одним из наиболее клинически успешных моноклональных антител - Трастузумабом, который связывается с рецептором эпидермального фактора роста человека (HER2/neu), который гиперэкспрессируется на поверхности опухолевых клеток примерно в 30% случаев рака груди и 20% рака яичников (P. Yousefpour, et. al., 2011). Полученные функционализированные наночастицы Fe3O4@AuNP@1'@анти-HER2/neu инкубировали с клеточными линиями SK-BR-3 (суперэкспрессия HER2/neu) и CHO (HER2/neu-отрицательная). Затем образцы были проанализированы на проточном цитометре Amnis ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, США, увеличение 40X, 488 нм лазер (200 мВ) для возбуждения флуоресценции и 785 нм лазер (0,5 мВ) для измерения бокового рассеяния. Программное обеспечение Amnis INSPIRE). Поскольку наночастицы имеют значительный сигнал в канале бокового светорассеяния (БС), была исследована зависимость средней интенсивности БС от концентрации частиц, чтобы оценить эффективность связывания частиц с клетками. Результаты показали, что частицы связываются с раковыми клетками SK-BR-3, в то время как связывание с клетками CHO практически не наблюдается. Более того, для клеток SK-BR-3 чем выше концентрация частиц, тем выше эффективность связывания. Изображения, полученные как в канале светлого поля, так и в канале БС, также подтверждают специфичность связывания частиц.
Настоящее изобретение позволяет доставлять in vitro и in vivo различные средства (вещества), включающие, например, терапевтические (например, противораковые), питательные вещества (например, липиды, углеводы и т.д.), профилактические субстанции, диагностические (например, флуоресцентные, люминесцентные, контрастные и магнитные вещества), и/или могут быть доставлены агентами по данному изобретению. В некоторых вариантах использования изобретения агент, который должен быть доставлен, полезен для лечения рака (например, рака молочной железы).
Примеры фармакологически активных соединений, которые могут быть доставлены к клеточным мишеням с помощью настоящего изобретения, включают липофильные, плохо или совсем не растворимые в воде соединения, перечисленные в разделе «Индекс терапевтических категорий и биологической активности» индекса Merck (12th Ed'n, 1996).
Предварительные результаты МТТ-теста показывают очень низкую цитотоксичность НЧЗМ. Выживаемость клеток в данном случае сопоставима с результатами контрольного теста.
Для анализа биораспределения наночастиц in vivo и ex vivo конъюгировали и Fe3O4@AuNP@1' с человеческим IgG и пометили полученные наночастицы эфиром сульфоцианина7 NHS (Cy7). Полученный агент для биоимиджинга Fe3O4@AuNP@1'@IgG@Cy7 вводили внутривенно выбритым мышам BALB/c. Через 3 часа мышей анализировали с помощью системы биовизуализации LumoTrace FLUO (фиг. 8), в качестве контроля использовали бритых мышей BALB/c без инъекций. Кроме того, уровни флуоресценции измеряли ex vivo в печени, легких, селезенке, мышцах, костях, сердце, почках, головном мозге и крови. Яркость и контрастность изображений регулировали для устранения сигнала автофлуоресценции контрольных образцов. Кроме того, содержание золота в органах и тканях анализировали методом оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES) (фиг. 9). Результаты выявили накопление НЧЗМ преимущественно в двух основных органах системы мононуклеарных фагоцитов - печени и селезенке, и относительно низкое поглощение в легких, костях и почках. Также был проведен анализ биораспределения НЧЗМ с помощью магнитно-резонансной томографии (фиг. 10). Результаты подтверждают накопление наночастиц в основном в печени и селезенке.
Таким образом, авторами разработаны и синтезированы новые карбеновые лиганды, обеспечивающие водорастворимым Fe3O4@AuNP@NHC беспрецедентную устойчивость к биологическим условиям и сушке на воздухе. Была впервые продемонстрирована возможность и прямые примеры применения in vitro и in vivo золотых магнитных наночастиц, покрытых карбеном. Карбоксильные группы на поверхности соответствующих НЧ обеспечивают легкую биомодификацию белками и дальнейшее успешное использование конъюгатов в анализе латерального потока и для нацеливания на клетки. Были протестированы и Fe3O4@AuNP@NHC в качестве агента биоимиджинга in vivo и установлено биораспределение. В целом было показано, что N-гетероциклические карбены могут занять достойное место в качестве нового поколения лигандов с металлической поверхностью для нанобиомедицинских приложений.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
Наличие данных и кода.
Данные о кристаллической структуре соединений (1-Me)(HBr)2, (1-Me)(AuX)2 (X=Cl, Br) был депонирован в структурной базе данных Кембриджа под номером 2111560, 2111561, соответственно.
Описание оборудования, материалов и методов, использованных в экспериментальной части.
Реагенты: Органические растворители получали из коммерческих источников и использовали без какой-либо очистки. Карбонат натрия (Na2CO3, 99,5-100,5%), 5-бензимидазолкарбоновая кислота (96%), карбонат цезия (Cs2CO3, ReagentPlus®, 99%), нитрат серебра (AgNO3) получали растворением 99,99 г. % слитка серебра в особо чистой азотной кислоте с последующей перекристаллизацией.
Просвечивающую электронную микроскопию выполняли на ПЭМ JEOL JEM 2100 200 кВ (Токио, Япония).
Спектры комбинационного рассеяния измеряли с помощью микрорамановской системы Bruker Senterra, объектив 20x, возбуждение 785 нм (50 мВт для молекулярных соединений и 0,5 мВт для наночастиц (SERS); время сбора данных составляло 2x20 с для молекулярных соединений и 4x60 с для наночастиц).
Данные рентгеноструктурного анализа получены на дифрактометре высокого разрешения SMART APEX II (Bruker, Германия) при температуре 120 К (графитовый монохроматор, ПЗС-детектор APEX II, MoKα-излучение, λ 0,71073 Å, ω-скан). Для определения параметров ячейки и измерения интенсивности дифракционных рефлексов использовали пакет программ SHELXTL PLUS.
Исследование состава образцов проводили методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии на фотоэлектронном спектрометре «KRATOS AXIS ULTRA DLD».
Площадь анализа для каждого образца составляла 300x700 мк2. Глубина анализа поверхности - до 3 нм.
Источник света: Al-монохроматор (Kα=1486,6 эВ).
Спектры UW/Vis собирали на спектрометре CLARIOstar® Plus.
Визуализация на проточном цитометре выполнялась с использованием ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, США) с использованием объектива 40× и лазера 785 нм для измерения бокового рассеяния (0,25 мВт).
Оптическую визуализацию выполняли на системе биоимиджинга LumoTrace FLUO (Abisense, Россия).
Магнитно-резонансная томография была выполнена на аппарат ICON1TMRI (Bruker, США).
Оптоэмиссионный спектрометрический анализ с индуктивно связанной плазмой проводили на приборе Avio 200 ICP-OES (PerkinElmer, США).
Использовали прибор для магнитной гипертермии TOR ultraHT.
Реакции под действием микроволнового излучения проводились в микроволновом реакторе CEM Discover® (CEM Corporation, Мэтьюз, США).
Спектры ЯМР были измерены на приборе Varian Unity Inova 500 M WB (Agilent, США, 500 МГц).
Масс-спектры были получены на приборе NexION 2000 (PerkinElmer, США).
Элементный анализ синтезированных соединений был проведен с помощью элементного анализатора Vario micro cube (Elementar, Германия).
Контроль за ходом реакций производили методом ТСХ на SiO2 (Merk TLC Silica gel 60 F254) по исчезновению исходных соединений.
Тест-полоска для ИХА представляет собой изделие из специального пористого материала, состоящего из природных полимеров, например, целлюлозы и материалов на ее основе (например, волокнистые полимеры - фильтровальная бумага, бумага для хроматографии и пр.); минеральных гранул, например, сульфата алюминия, солей магния, кремния; синтетических или модифицированных природных полимеров, таких как поливинилхлорид, полиакрилаты, декстран различных степеней сшивки, нитроцеллюлоза, ацетилцеллюлоза, полиакриламиды и др.; стекло; керамические материалы; и подобные материалы. Тест-полоска ИХА имеет зону нанесения образца и зону связывания, как указано выше.
Для использования описываемого изобретения одним их возможных материалов является нитроцеллюлоза.
Иммобилизация целевых молекул с поверхностью мембраны полоски ИХА может проводится по известным методикам (Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) и Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 1970, 245:3059).
Первым шагом ИХА является иммобилизация целевой молекулы на тест-полоску, вторым действием является помещение тест-полоски в специальный буферный раствор со значениями pH в интервале 4-11, для настоящего изобретения может осуществляться, например, в интервале 5-9. Возможные варианты буферных систем перечислены ниже: боратный, диэтилбарбитуровый, фосфатный, карбонатный, Tris, ацетатный, HEPES, MES и др.
Проводить ИХА с использованием данного изобретения может осуществляться, например, при температуре близкой к комнатной 16-26°C, но также возможно в интервале температур 11-40° C.
Синтез комплекса NHC-Au (1' - Et)(Au(Cl,Br))2
Ag2CO3(103 мг, 0,375 ммоль) добавляли к раствору (1'- Et)(HBr)2 (249 мг, 0,375 ммоль) в 15 мл CH2 Cl 2 и обрабатывали ультразвуком 3 мин до полного растворения. К полученному раствору добавляли Me2SAuCl (220 мг, 0,750 ммоль) при минимальном освещении и обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут.Полученную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 2300 g, надосадочную жидкость концентрируют в вакууме при комнатной температуре, получая белые кристаллы чистого продукта.
Синтез AuNP@1'
75 мг (1'- Et)(Au(Cl,Br))2 суспендировали в 5 мл EtOH в стеклянном флаконе с широким горлышком на 20 мл, снабженном магнитной мешалкой, добавляли 5 мл Milli-Q и 302 мкл 1 М КОН. Реакционную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд и нагревали на магнитной мешалке до легкого кипения и испарения этанола в течение 2 часов, конечный объем реакционной смеси составил 5 мл. Полученную смесь темно-красного цвета смешивали с 5 мл i-PrOH, осадок центрифугировали в течение 10 минут при 10000 g и дважды промывали i-PrOH, центрифугировали и чистые наночастицы повторно растворяли в воде Milli-Q.
Синтез Fe3O4 @AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1'
Синтез кэпированного олеиновой кислотой Fe3O4 проводили согласно литературным данным [38]: 100 мкл олеиновой кислоты добавляли к 1 мл суспензии Fe3O4 (d=5,4 мг/мл) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 min и НЧ Fe3O4 разделяли магнитом. Затем НЧ Fe3O4 промывали дважды 10 мл EtOH и один раз 5 мл гексана с магнитной сепарацией. Fe3O4@OlA НЧ ресуспендировали в 4,3 мл гексана. 1 мл суспензии Fe3O4@OlA, 25 мг HAuCl4*3H2O, 158 мкл олеиламина и 985 мкл суспендировали в Ph2O, помещали в инертную атмосферу и нагревали до 160°C в течение 90 мин. После охлаждения до комнатной температуры нанокомпозит Fe3O4@AuNP@OlA отделяли от реакционной смеси магнитом и трижды промывали 10 мл EtOH с магнитной сепарацией.
Далее Fe3O4 @AuNP@OlA смешивали с 10 мл EtOH, 7,5 мг (1 -Me)(Au(Cl,Br)) 2 или (1'-Et)(Au(Cl,Br))2, при перемешивании добавляли 10 мл воды (MQ) и 1 мл 1М КОН. Реакционную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 5 секунд и нагревали на магнитной мешалке до легкого кипения и испарения этанола в течение 2 часов, конечный объем реакционной смеси составил 10 мл. Fe3O4 @AuNP@NHC отделяли от супернатанта магнитным полем и промывали 10 мл EtOH.
Конъюгация наночастиц Fe3O4 @AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1' с α-HER2/neu
50 мкл Fe3O4 @AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1' в буфере MES (pH 4,7) смешивали с 50 мкл буфера MES с 2,0 мг EDC и 1,9 мг сульфо-NHS. НЧ инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15 ООО г, 10 мин) 100 мкл воды MilliQ. Суспензию смешивали со смесью α-HER2/neu (100 мкл, 0,4 г/л) в боратном буфере (рН 8,5). Конечную смесь кратковременно обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Наконец, НЧ трижды промывали PBS и хранили в 100 мкл PBS перед использованием.
Эксперименты по нацеливанию клеток.
Свежесобранные клетки SK-BR-3 (0,25 млн) и СНО (0,25 млн) инкубировали в 25 мкл 1% БСА в PBS с наночастицами Fe3O4 @AuNP@1@α-HER2/neu или Fe3O4 @AuNP@1'@α-HER2/neu в разных концентрациях в течение 15 мин и отмывали в 1% BSA в PBS. Затем клетки сразу же обрабатывали на визуализирующем проточном цитометре ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, США) с использованием объектива 40× и лазера с длиной волны 785 нм для измерения бокового рассеяния (0,25 мВт). Сфокусированные популяции одиночных клеток были отобраны во время сбора данных в программном обеспечении Amnis INSPIRE по среднеквадратичному градиенту светлого поля (35-100) и по площади светлого поля (200-900) в зависимости от соотношения сторон (0,75-1,00). Для каждой выборки было собрано 3000 событий.
Оптическая визуализация биораспределения наночастиц in vivo и ex vivo.
Все методики были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных ИБХ РАН. Визуализацию проводили на системе биоимиджинга LumoTrace FLUO (Abisense, Россия). Прежде всего, Fe3O4@AuNP@1@IgG метили сульфоцианин7 NHS-эфиром (Lumiprobe, Россия). 300 мкг полученных Fe3O4@AuNP@1@ IgG@Cy7 в 100 мкл 5% раствора глюкозы вводили внутривенно выбритым мышам линии BALB/c, n=3 для каждого типа наночастиц. Через 3 ч после инъекции мышей анестезировали и визуализировали с помощью диода возбуждения 730 нм и длинноволнового фильтра 780 нм. В качестве контроля использовали бритых мышей BALB/c без инъекций. Затем уровни флуоресценции измеряли ex vivo в печени, легких, селезенке, мышцах, костях, сердце, почках, головном мозге и крови при тех же настройках.
Анализ оптической эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES).
Органы и ткани, взятые у умерщвленных мышей (см. раздел «Оптическая визуализация биораспределения наночастиц in vivo и ex vivo»), взвешивали и расщепляли концентрированной азотной кислотой в конечном объеме, равном семи объемам органов или тканей, при 70° С в течение 12 часов. Затем 300 мкл каждого образца доводили до 3 мл водой Milli-Q. Содержание золота в каждом образце анализировали с помощью ИСП-ОЭС Avio 200 (PerkinElmer, США) при длине волны 267,595 нм.
Магнитно-резонансная томография.
Мышам BALB/c внутривенно вводили 300 мкг Fe3O4@AuNP@1' в 100 мкл 5% раствора глюкозы, n=3,3 ч после инъекции, мышей умерщвляли и визуализировали с помощью МРТ-системы ICON 1T (Bruker, США)) с использованием РЧ-катушки объемом всего тела мыши. Мышей BALB/c без инъекций использовали в качестве контроля. Применяли FLASH-последовательность со следующими параметрами: время повторения - 1000 мс, время эха - 5 мс, угол поворота - 60 градусов, поле зрения - 8/5 см, 17 срезов на сканирование, толщина срезов - 1 мм.
Сущность и промышленная применимость заявленной группы изобретений поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение карбоната серебра (Ag2CO3).
Раствор нитрата серебра (1,70 г, 10,0 ммоль) в 20 мл воды Milli-Q смешали с раствором карбоната натрия (0,530 г, 5,0 ммоль) в 20 мл воды Milli-Q. Образовавшийся осадок центрифугировали в течение 10 мин при 2,300 g, промывали три раза водой Milli-Q, затем снова центрифугировали и высушивали на воздухе при минимальном освещении. Выход: 1,365 г (99%).
Пример 2. Получение хлор(диметилсульфид)золота (I) (Me2SAuCl).
Золото (0,890 г, 4,5 ммоль) растворили в 16 мл царской водки (смесь концентрированных азотной и соляной кислот, взятых в соотношении 1:3 по объему), затем полученный раствор концентрировали до объема 5 мл, добавили 10 мл концентрированной соляной кислоты и снова концентрировали до объема 5 мл. Процедуру повторяли, пока не прекратилось выделение коричневого газа. Далее смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли 20 мл метанола. К полученному метанольному раствору добавляли по каплям Me2S (1 мл, 13,5 ммоль) и интенсивно перемешивали до исчезновения красного цвета. Полученную суспензию перемешивали в течение 1 ч в темноте, отфильтровывали белый осадок и сушили в вакууме. Выход: 1,20 г (91%).
Пример 3. Общая методика А получения (1-Me)(HBr)2 и (1'-Et)(HBr)2.
К раствору соединения 4 или 6 (10 ммоль) в 20 мл ацетонитрила добавили 1,3-дибромпропан (0,51 мл, 50,0 ммоль). После нагревания в микроволновом реакторе при 100° в течение 6 ч реакционную смесь охладили до комнатной температуры, растворитель отогнали в вакууме. Продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
Пример 4. Общая методика Б получения (1-Me)(AuCl)(AuX) и (1'-Et)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br.
К раствору (1-Me)(HBr)2 или (1'-Et)(HBr)2 (0.375 ммоль) в 15 мл дихлорметана добавили Ag2CO3 (103 мг, 0,375 ммоль) и подвергли воздействию ультразвука до полного растворения (3 мин). К полученному раствору добавили Me2SAuCl (220 мг, 0,750 ммоль) и обработали ультразвуком (2 мин) при минимальном воздействии света, полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 2300 g, супернатант концентрировали в вакууме при комнатной температуре. Продукт получали в виде белых кристаллов.
Пример 5. Общая методика В получения ГКЛ стабилизированных наночастиц состава магнетит золото Fe3O4@AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1'.
Синтез покрытого олеиновой кислотой магнетита (Fe3O4) проводили следующим образом: 100 мкл олеиновой кислоты добавляли к 1 мл суспензии Fe3O4 в воде (d=5,4 мг/мл) и помещали в ультразвуковую ванну на 15 минут и НЧ Fe3O4 отделяли магнитом. Затем НЧ полученные Fe3O4@OlA промывали дважды 10 мл EtOH и один раз 5 мл гексана с магнитной сепарацией. Fe3O4@OlA НЧ ресуспендировали в 4,3 мл гексана. 1 мл суспензии Fe3O4@OlA, 25 мг HAuCl4•3H2O, 158 мкл олеиламина и 985 мкл суспендировали в Ph2O, помещали в инертную атмосферу и нагревали при 140-180°C в течение 90 мин. После охлаждения до комнатной температуры наночастицы Fe3O4@AuNP@OlA отделяли от реакционной смеси магнитом и трижды промывали 10 мл EtOH с магнитной сепарацией.
Затем Fe3O4@AuNP@OlA смешивали с 10 мл EtOH, 7,5 мг (1-Me)(Au(Cl,Br))2 или (1-Me)(Au(Cl,Br))2, 10 мл воды и 1 мл 1М КОН при перемешивании. Реакционную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 5 секунд и нагревали на магнитной мешалке до слабого кипения при 78 до 100°С и испарения этанола в течение 2-8 часов, конечный объем реакционной смеси составил 10 мл. Fe3O4@AuNP@1 или Fe3O4@AuNP@1' магнитно отделяли от супернатанта и промывали 10 мл EtOH.
Пример 6. Высушивание водосодержащего раствора НЧЗМ до сухого порошка.
Высушивание водосодержащего раствора НЧЗМ до сухого порошка проводили одним из следующих способов:
1. воздушное высушивание при комнатной температуре в интервале от+15 до+26°С.
2. воздушное высушивание при повышенной температуре в интервале от+80 до+100°С.
3. воздушное высушивание при пониженной температуре от 0 до+14°С.
4. вакуумную высушивание.
5. Лиофильное высушивание.
Пример 7. Высушивание водосодержащего раствора НЧЗМ до тонкой пленки на поверхностях.
Высушивание водосодержащего раствора НЧЗМ методами по примеру 6 проводят до тонкой пленки на различных твердых поверхностях, таких как
1. стекло,
2. пластик,
3. полимерное покрытие,
4. металл,
5. бумага,
6. нитроцеллюлоза,
7. керамика,
8. дерево,
но не ограничивающихся ими.
Пример 8. Получение соединения (1-Me)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br.
Стадия 1. Получение метил-4-(изопропиламино)-3-нитробензоата (2).
Раствор метил 4-хлор-3-нитробензоата (2,16 г, 10,0 ммоль) в 16 мл ацетонитрила смешали с изопропиламином (1,23 мл, 15,0 ммоль) и раствором NaOAc (1,64 г, 20,0 ммоль) в 5,4 мл воды Milli-Q. После нагревания при 120° в течение 2 ч в микроволновом реакторе реакционную смесь охладили до комнатной температуры и влили в 200 мл ледяной воды, выпавший осадок отфильтровали, высушивали на воздухе. Продукт 2 выделили в виде светло-желтых кристаллов после перекристаллизации из гексана. Выход 1,71 г (79%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ, мд: 8,88 (д, 4J=1,9 Гц, 1H, Ar-H), 8,30 (уш.с, 1H, NH), 8,03 (д, J=9,1 Гц, 1H, Ar-H), 6,88 (д, 3J=9,1 Гц, 1H, Ar-H), 3,92-3,90 (м, 4H, (CH3)2CH-+COOCH3), 1,36 (д, J=6,4 Гц, 6H, (CH3)2CH-).
Стадия 2. Получение метил 3-амино-4-(изопропиламино)бензоата (3).
N2H4·H2O (2.0 мл, 2.25 ммоль) и Fe(AcAc)3 (0.200 г, 0.6 ммоль) добавили к раствору соединения 2 (4,47 г, 18,8 ммоль) в 20 мл этанола. После нагревания в микроволновом реакторе при 150° в течение 8 мин реакционную смесь охладили до комнатной температуры и отфильтровали через слой силикагеля. Фильтрат концентрировали досуха. Продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки. Выход: 3,99 г (98%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ, мд: 7,58 (дд, 3J=8,4 Гц, 4J=2,0 Гц, 1H, Ar-H), 7,40 (д, 4J=1,9 Гц, 1H, Ar-H), 6,59 (д, 3J=8,4 Гц, 1H, Ar-H), 3,90-3,78 (м, 5H, NH2+COOCH3), 3,69 (дт, 3J=12,5, 6,3 Гц, 1H, (CH3)2CH-), 1,26 (д, 3J=6,3 Гц, 1H, (CH3)2CH-).
Стадия 3. Получение метил 1-изопропил-1H-бенз[d]имидазол-5-карбоксилата (4).
ПТСА (0,200 г, 1,2 ммоль) добавили при перемешивании к раствору соединения 3 (3,99 г, 19,2 ммоль) в триэтилортоформиате (20 мл). После нагревания в микроволновом реакторе при 150° в течение 1 ч реакционную смесь охладили до комнатной температуры, отогнали растворитель досуха. Полученный остаток растворили в смеси 100 мл дихлорметана и 50 мл насыщенного раствора NaHCO3. Слои отделили, органический слой промыли рассолом, сушили безводным Na2SO4 и концентрировали в вакууме. Продукт 4 выделили при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюент дихлорметан-метанол (100:1). Выход: 4,19 г (88%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ, мд: 8,54 (с, 1H, N=CH-N), 8,18 (с, 1H, Ar-H), 8,05 (дд, 3J=8,3 Гц, 4J=1,5 Гц, 1H, Ar-H), 7,47 (д, 3J=8,3 Гц, 1H, Ar-H), 4,69 (сеп, J=6,7 Гц, 1H, (CH3)2CH-), 3,69 (с, 3H, COOCH3), 1,66 (д, 3J=6,8 Гц, 1H, (CH3)2CH-).
Стадия 4. Получение 3-изопропил-1-(3-(1-изопропил-5-(метоксикарбонил-1H-бенз[d]имидазол-3-иум-3-ил)пропил)-6-(метоксикарбонил)-1H-бенз[d]имидазол-3-иум бромида ((1-Me)(HBr)2).
Соединение (1-Me)(HBr)2 в виде белого порошка получили по методике А (пример 3), используя соединение 4. Выход: 3,83 г (60%).1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ, мд: 10,33 (с, 2H, N=CH-N), 8,66 (с, 2H, Ar-H), 8,31 (д, 3J=8,8 Гц, 2H, Ar-H), 8,23 (дд, J=8,8 Гц, 4J=1,5 Гц, 2H, Ar-H), 5,13 (сеп, 3J=6,4 Гц, 2H, (CH3)2CH-), 4,80 (т, 3J=7,1 Гц, 4H, CH2-CH2-CH2), 3,94 (с, 6H, COOCH3), 2,76 (квин, 3J=7,3 Гц, 2H, CH2-CH2-CH2), 1,66 (д, J=6,9 Гц, 12H, (CH3)2CH-).13C NMR (100 МГц, DMSO-d6) δ, мд: 165,14 (COOCH3), 143,31 (N=CH-N, определено с помощью спектра HMBC), 133,29 (Ar), 131,37 (Ar), 127,82 (Ar), 126,71 (Ar), 115,11 (Ar), 114,38 (Ar), 52,52 (COOCH3), 51,07 (CH3)2CH-), 43,98 (CH2-CH2-CH2), 28,08 (CH2-CH2-CH2), 21,39 ((CH3)2CH-). ICP-MS: m/z расчетное для [C27H34N4O4]2+239,1285, найденное 239,1290.
Стадия 5. Получение (1-Me)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br.
Продукт (1-Me)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br был получен в виде смеси (1-Me)(AuCl)2 и 26 мол-% (1-Me)(AuCl)(AuBr) по методике Б (пример 4), используя соединение (1-Me)(HBr)2. Выход: 363 мг (99%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ мд 8,10 ̶ 8,22 (м, 4H, Ar-H), 7,72 (д, 3J=8,3 Гц, 2H, Ar-H), 5,44 (сеп, 3J=6,4 Гц, 2H, (CH3)2CH-), 4,74 (т, 3J=6,9 Гц, 6H, CH2-CH2-CH2), 4,00 (с, 6H, COOCH3), 2,73 (квин, 3J=6,4 Гц, 2H, CH2-CH2-CH2), 1,78 (д, J=6,9 Гц, 12H, (CH3)2CH-). 13C NMR (100 МГц, CDCl3) δ, мд: 183,5 (N2C-Au-Br), 180,46 (N2C-Au-Cl), 165,91 (COOMe), 135,04 (Ar), 133,18 (Ar), 127,10 (Ar), 125,94 (Ar), 113,05 (Ar), 112,96 (Ar), 54,54 ((CH3)2CH-), 52,59 (COOCH3), 46,23 (CH2-CH2-CH2), 29,75 (CH2-CH2-CH2), 22,02 ((CH3)2CH-). ICP-MS: m/z расчетное для [C27H32Au2ClN4O4]+905,1448, найденное 905,1439; расчетное для [C27H32Au279BrN4O4] 949,0933, найденное 949,0930; расчетное для [C27H32Au281BrN4O4] 951,0913, найденное 951,0915.
Пример 9. Получение соединения (1'-Et)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br.
Стадия 1. Получение этил 1H-бенз[d]имидазол-5-карбоксилата (5).
Этил 1H-бенз[d]имидазол-5-карбоксилат был получен из бензимидазол-5-карбоновой кислоты по методике, описанной в (Dr. Kirsi Salorinne, et. al. (2017) Water-Soluble N-Heterocyclic Carbene-Protected Gold Nanoparticles: Size-Controlled Synthesis, Stability, and Optical Properties, 56, 22, 6198-6202. DOI: 10.1002/anie.201701605).
Стадия 2. Получение смеси этил 1-изопропил-1H-бенз[d]имидазол-5-карбоксилата и этил 1-изопропил-1H-бенз[d]имидазол-4-карбоксилата (6).
Cs2CO3 (2,80 г, 8,6 ммоль) добавили к раствору соединения 5 (1,0 г, 5,3 ммоль) и 2-бромпропана (0,50 мл, 5,3 ммоль) в 15 мл ацетонитрила. После нагревания в микроволновом реакторе при 100° в течение 6 ч реакционную смесь охладили до комнатной температуры и профильтровали через слой целита. Фильтрат концентрировали досуха. Смесь двух изомеров в соотношении 1:1 была выделена при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюент дихлорметан-метанол (95:5). Выход: 1,10 г (90%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ, мд: 8,54 (д, 4J=0,7 Гц, 1H, N=CH-N), 8,20 (д, 4J=1,0 Гц, 1H, N=CH-N), 8,14 (с, 1H, Ar-H), 8,09 (с, 1H, Ar-H), 8,04 (дд, 3J=8,6, 4J=1,5 Гц, 1 H, Ar-H), 8,00 (дд, 3J=8,6, 4J=1,5 Гц, 1H, Ar-H), 7,82 (дд, 3J=8,6 Гц, 4J=0,5 Гц, 1H, Ar-H), 7,44 (д, 3J=8,3 Гц, 1H, Ar-H), 4,63-4,78 (м, 2H, (CH3)2CH-), 4,39-4,45 (м, 4H, CO2CH2CH3), 1,65 (2д, 3J=6,8 Гц, 12H, (CH3)2CH-), 1,42-1,44 (м, 6H, CO2CH2CH3).
Стадия 3. Получение смеси 3-изопропил-1-(3-(1-изопропил-5-(метоксикарбонил-1H-бенз[d]имидазол-3-иум-3-ил)пропил)-6-(метоксикарбонил)-1H-бенз[d]имидазол-3-иум бромида ((1'-Et)(HBr)2).
Смесь изомеров (1'-Et)(HBr)2 в виде белого порошка была получена по методике А (пример 3), используя соединение 6. Выход: 4,92 г (74%). 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ, мд: 10,48 (с, 1H, N=CH-N), 10,45 (с, 1 H, N=CH-N), 8,61 ̶ 8,68 (м, 2H, N=CH-N, Ar-H), 8,37 (дд, 3J=16,1, 8,8 Гц, 1H, Ar-H), 8,31 (д, J=8,8 Гц, 1H, Ar-H), 8,17-8,24 (м, 2H, Ar-H), 5,25 (дт, J=13,2, 6,6 Гц, 1H, (CH3)2CH-), 5,13 (дт, J=13,2, 6,6 Гц, 1 H, (CH3)2CH-), 4,78-4,88 (м, 4H, CH2-CH2-CH2), 4,36-4,44 (м, 4H, CH2-CH2-CH2), 2,78-2,80 (м, 2H, CH2-CH2-CH2), 1,66 (т, J=6,1 Гц, 12H, (CH3)2CH-), 1,26-1,47 (м, 6H, (CH3)2CH-). 13C ЯМР (100 МГц, DMSO-d6) δ, мд: 164,68, 164,65, 143,29, 143,24, 134,17, 133,23, 131,39, 131,33, 130,45, 130,43, 128,11, 128,06, 126,71, 126,69, 126,63, 115,20, 115,06, 115,04, 114,37, 114,36, 114,17, 114,12, 61,33, 61,32, 51,08, 50,73, 44,21, 44,00, 40,01, 39,84, 39,68, 39,34, 39,18, 39,01, 28,02, 27,99, 21,65, 21,41, 14,00, 13,98. ICP-MS: m/z расчетное для [C29H38N4O4]2+253,1441, найденное 253,1447; m/z расчетное для [C29H38BrN4O4]+585,2071, найденное 585,2072.
Стадия 4. Получение соединения (1'-Et)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br.
Продукт (1'-Et)(AuCl)(AuX), где Х=Cl, Br был получен в виде смеси (1'-Et)(AuCl)2 и 26 мол-% (1'-Et)(AuCl)(AuBr) по методике Б (пример 4) из соединения (1'-Et)(HBr)2 и использовался далее без дополнительной очистки. Выход: 365 мг (97%). Элементный анализ: расчетное для C29H36N4Au2Cl1.48Br0.52 (%) C 35,05, H 3,63, N 5,64, найденное (%) C 35,5, H 3,84, N 5,64. ICP-MS: m/z расчетное для [C29H36Au279BrN4O4]+977,1248, найденное 977,1245; m/z расчетное для [C29H36Au2ClN4O4]+933,1751, найденное 933,1753.
Пример 10. Конъюгация НЧЗМ с белками.
0,5 мг Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) смешивали с 200 мкл буфера PBS с 0,5 мг EDC и 0,5 мг сульфо-NHS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл воды PBS. Суспензию смешивали с одним из следующих белков в боратном буфере (pH 8,5), фосфатном буфере (рН 7,8), или ХЕПЕС-буфере (рН 6,0):
1) анти-человеческий-IgG (объем раствора белка в буфере -100 мкл, концентрация белка в буфере -1 г/л),
2) человеческий-IgG (100 мкл, 1 г/л),
3) герцептин (100 мкл, 0,4 г/л),
4) БСА-биотин (100 мкл, 3 г/л),
5) БСА-хлорамфеникол (100 мкл, 3 г/л),
6) антитела на хлорамфеникол (100 мкл, 3 г/л),
7) стрептавидин (100 мкл, 1 г/л),
8) лектин WGA (100 мкл, 1 г/л),
9) лектин ConA (100 мкл, 1 г/л).
10) антитела на С-реактивный белок (100 мкл, 1 г/л)
11) С-реактивный белок (100 мкл, 1 г/л)
12) антитела на тропонин (100 мкл 1 г/л)
Конечную смесь в течение короткого времени обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Fe3O4@AuNP@1'@белок или Fe3O4@AuNP@1@белок трижды промывали PBS и хранили в 100 мкл PBS перед использованием.
Пример 11. Конъюгация НЧЗМ с малыми молекулами.
0,5 мг Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) смешивали с 200 мкл буфера PBS с 0,5 мг EDC и 0,5 мг сульфо-NHS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл воды PBS. Суспензию смешивали с одной из следующих малых молекул в боратном буфере (pH 8,5), фосфатном буфере (рН 7,8), или ХЕПЕС-буфере (рН 6,0) или ДМСО:
1. производное родамина,
2. производное флуоресцеина,
3. цианиновый краситель, но не ограничивается им,
4. производное флуоресцентных красителей BODIPY,
5. производное фотосенсибилизатора кумарина,
6. производное фотосенсибилизатора порфирина,
7. производное фотосенсибилизатора фталоцианина, но не ограничиваясь им.
8. противораковое лекарство,
9. лекарство против рака молочной железы,
10. цитостатик,
11. производное темозоломида,
12. производное доксорубицина,
13. производное даунорубицина,
14. производное паклитаксела.
Конечную смесь в течение короткого времени обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Fe3O4@AuNP@1'@малая молекула или Fe3O4@AuNP@1@малая молекула трижды промывали PBS и хранили в 100 мкл PBS перед использованием.
Пример 12. Конъюгация НЧЗМ с производными углеводов.
0,5 мг Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) смешивали с 200 мкл буфера PBS с 0,5 мг EDC и 0,5 мг сульфо-NHS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл воды PBS. Суспензию смешивали с одним из следующих углеводов в боратном буфере (pH 8,5), фосфатном буфере (рН 7,8), или ХЕПЕС-буфере (рН 6,0) или ДМСО:
1. производное декстрана,
2. производное гиалоурановой кислоты,
3. производное целлюлозы,
Конечную смесь в течение короткого времени обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Fe3O4@AuNP@1'@углевод или Fe3O4@AuNP@1@углевод трижды промывали PBS и хранили в 100 мкл PBS перед использованием.
Пример 13. Конъюгация НЧЗМ с производными нуклеиновых кислот.
0,5 мг Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) смешивали с 200 мкл буфера PBS с 0,5 мг EDC и 0,5 мг сульфо-NHS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл PBS и инкубировали с 0,5 мг полимера ПЭИ (полиэтиленимин) в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) течение 12 ч при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл PBS. Полученную суспензию смешивали с одним из следующих производных нуклеиновых кислот в боратном буфере (pH 8,5), фосфатном буфере (рН 7,8), или ХЕПЕС-буфере (рН 6,0) или ДМСО:
1. производное ДНК,
2. производное транспортных, матричных, рибосомальных или микро-РНК,
3. синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные нуклеиновые кислоты, морфолиновые нуклеиновые кислоты, закрытые нуклеиновые кислоты, гликолевые нуклеиновые кислоты или треозо-нуклеиновые кислоты.
Конечную смесь в течение короткого времени обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
Пример 14. Конъюгация НЧЗМ с полимерами.
0,5 мг Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) смешивали с 200 мкл буфера PBS с 0,5 мг EDC и 0,5 мг сульфо-NHS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл PBS и инкубировали с 0,5 мг полимера ПЭИ (полиэтиленимин) или ПЭГ (полиэтиленгликоль) в 1 мл буфера PBS (pH 7,8) течение 12 ч при комнатной температуре, а затем дважды промывали (15000 g, 10 мин) 200 мкл PBS. Конечную смесь в течение короткого времени обрабатывали ультразвуком и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
Пример 15. Подготовка тест-полосок для ИХА-теста.
В одном из вариантов белковые растворы (1 г/л) наносили на нитроцеллюлозные мембраны длиной 300 мм (каталожный номер HF075MC100, EMD Millipore Corporation, Берлингтон, Массачусетс, США) с помощью адсорбирующей прокладки (каталожный номер CFSP203000, EMD Millipore Corporation, Берлингтон, Массачусетс, США) со скоростью впрыска 4 мкл/см с использованием дозирующей системы XYZ3060 (BioDot, Ирвин, Калифорния, США) для формирования тестовой линии. Мембраны сушили при комнатной температуре не менее 24 часов. Тест-полоски (шириной 2,0 мм) нарезали автоматическим резаком CM4000 (BioDot, Irvine CA, USA) и хранили при комнатной температуре в темноте перед экспериментом.
Пример 16. Определение специфичности конъюгатов НЧЗМ методом ИХА.
2 мкл наночастиц Fe3O4@AuNP@1'@антитело или Fe3O4@AuNP@1@антитело (0,5 г/л) в PBS смешивали с 19 мкл 1% раствора БСА в PBS. Смесь помещали в пробирку на 0,6 мл, инкубировали в течение нескольких минут при комнатной температуре. Полоску, с предварительно нанесенным антигеном, помещали в пробирку после быстрой обработки ультразвуком. Все полоски сушили не менее 24 часов перед сканированием с помощью сканера Perfection V800 Photo (Epson, Suwa, Japan). Для проведения эксперимента с высушенными наночастицами растворы наночастиц сушили на воздухе и ресуспендировали с использованием воды MilliQ того же объема, что и исходный.
Наблюдали появление окрашенной тест-полоски в области нанесения антигена.
Для проведения эксперимента с высушенными наночастицами растворы наночастиц сушили на воздухе и ресуспендировали с использованием воды MilliQ того же объема, что и исходный.
Пример 17. Проведение ИХА теста с использованием конъюгатов НЧЗМ для детекции антибиотика хлорамфеникола (CAP) в образце.
В образец (молоко, кровь, сыворотка, плазма крови мыши) добавляли антибиотик хлорамфеникол, чтобы итоговая концентрация была в диапазоне от 1 нг/мл до 1 мг/мл. 2 мкл наночастиц Fe3O4@AuNP@1'@антитела или Fe3O4@AuNP@1@антитела на хлорамфеникол (0,5 г/л) в PBS смешивали с 5 мкл образца (или разбавленного миграционным буфером образца) с 19 мкл миграционного буфера - 1% раствора БСА в PBS. Смесь помещали в пробирку на 0,6 мл, инкубировали в течение нескольких минут при комнатной температуре. Полоску для ИХА с нанесенным 1 мкл конъюгата БСА-хлорамфеникол помещали в пробирку после быстрой обработки ультразвуком. Все полоски сушили не менее 24 часов перед сканированием с помощью сканера Perfection V800 Photo (Epson, Suwa, Japan). Для проведения эксперимента с высушенными наночастицами растворы наночастиц сушили на воздухе и ресуспендировали с использованием воды MilliQ того же объема, что и исходный.
Наблюдали снижение яркости тест-линии при повышении концентрации хлорамфеникола в образце как результат конкурентного анализа. Затем вычисляли концентрацию хлорамфеникола в образце с неизвестной концентрацией на основе калибровочной кривой (по известным образцам).
Пример 18. Проведение ИХА теста с использованием конъюгатов НЧЗМ для детекции флуоресцеина в образце.
В образец (молоко, кровь, сыворотка, плазма крови мыши) добавляли антибиотик хлорамфеникол, чтобы итоговая концентрация была в диапазоне 1 нг/мл до 1 мг/мл. 2 мкл наночастиц Fe3O4@AuNP@1'@антитела или Fe3O4@AuNP@1@антитела на флуоресцеин (0,5 г/л) в PBS смешивали с 5 мкл образца (или разбавленного миграционным буфером образца) с 19 мкл миграционного буфера - 1% раствора БСА в PBS. Смесь помещали в пробирку на 0,6 мл, инкубировали в течение нескольких минут при комнатной температуре. Полоску для ИХА с нанесенным 1 мкл конъюгата БСА-флуоресцеин изотиоцианат помещали в пробирку после быстрой обработки ультразвуком. Все полоски сушили не менее 24 часов перед сканированием с помощью сканера Perfection V800 Photo (Epson, Suwa, Japan). Для проведения эксперимента с высушенными наночастицами растворы наночастиц сушили на воздухе и ресуспендировали с использованием воды MilliQ того же объема, что и исходный.
Наблюдали снижение яркости тест-линии при повышении концентрации флуоресцеина в образце как результат конкурентного анализа. Затем вычисляли концентрацию хлорамфеникола в образце с неизвестной концентрацией на основе калибровочной кривой (по известным образцам).
Пример 19. Проведение ИХА теста с использованием конъюгатов НЧЗМ против тропонина для детекции тропонина белка в образце.
В образец крови мыши или человека добавляли тропонин, чтобы итоговая концентрация была в диапазоне 0.1 нг/мл - 1 мг/мл. 2 мкл наночастиц Fe3O4@AuNP@1'@антитело или Fe3O4@AuNP@1@антитело против тропонина (0,5 г/л) в PBS смешивали с 5 мкл образца и 19 мкл миграционного буфера - 1% раствора БСА в PBS с 0.01% Tween 20, 0.05% Trinton X-100. Смесь помещали в пробирку на 0,6 мл, инкубировали в течение нескольких минут при комнатной температуре. Полоску для ИХА с нанесенными 1 мкл антител против тропонина (1 г/л) помещали в пробирку после быстрой обработки ультразвуком. Все полоски сушили не менее 24 часов перед сканированием с помощью сканера Perfection V800 Photo (Epson, Suwa, Japan). Для проведения эксперимента с высушенными наночастицами растворы наночастиц сушили на воздухе и ресуспендировали с использованием воды MilliQ того же объема, что и исходный.
Наблюдали повышение яркости тест-линии при повышении концентрации тропонина в образце как результат сэндвич-анализа. Затем вычисляли концентрацию тропонина в образце с неизвестной концентрацией на основе калибровочной кривой (по известным образцам).
Пример 20. Измерение биосовместимости НЧЗМ с помощью МТТ-теста.
Клетки HEK293 были культивированы в питательной среде DMEM/F12 в течение 24 часов. Затем среду удалили и добавили раствор частиц Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 в соответствующей концентрации и МТТ (5 мг/мл) (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в питательной среде DMEM/F12. Полученную систему инкубировали в течение 24 часов. Затем удалили среду и добавили ДМСО. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при 550 нм на мультимодальном ридере CLARIOstar (BMG Labtech, Германия).
Выживаемость клеток, обработанных Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1, сопоставима с контрольным образцом, то есть частицы не проявляют острой цитотоксичности in vitro.
Пример 21. Специфическая доставка конъюгатов НЧЗМ в клетки.
Конъюгат Fe3O4@AuNP@1'@Трастозумаб или Fe3O4@AuNP@1@Трастозумаб икубировали с клеточными линиями SK-BR-3 (суперэкспрессия HER2/neu, 0,25 миллионов клеток) и CHO (HER2/neu-отрицательная, 0,25 миллионов клеток) 25 мкл 1% BSA в PBS при различных концентрациях в течение 15 мин. и промывали 1% BSA в PBS. Затем клетки немедленно обрабатывали с помощью проточного цитометра ImageStream X Mark II (Luminex Corporation, США) с использованием 40-кратного объектива и лазера 785 нм для измерения бокового рассеяния (0,25 мВт). Сфокусированные популяции одиночных клеток регистрировались во время сбора данных в программе Amnis INSPIRE по среднеквадратичному градиенту светлого поля (35-100) и площади светлого поля (200-900) по отношению к соотношению сторон (0,75-1,00). Для каждого образца было собрано 3000 стробированных событий.
Результаты показали, что частицы специфически связываются с раковыми клетками SK-BR-3, в то время как связывание с клетками CHO практически не наблюдается. Более того, для клеток SK-BR-3 чем выше концентрация частиц, тем выше эффективность связывания.
Пример 22. Использование НЧЗМ в радиотерапии.
Конъюгат Fe3O4@AuNP@1'@Трастозумаб или Fe3O4@AuNP@1@Трастозумаб инкубировали с клеточными линиями SK-BR-3 (суперэкспрессия HER2/neu, 0,25 миллионов клеток) 25 мкл 1% BSA в PBS при различных концентрациях конъюгата в течение 15 мин и промывали 1% BSA в PBS. Далее клетки с доставленными НЧЗ облучали рентгеновским излучением и наблюдали сокращение количества опухолевых клеток SK-BR-3 в образце как минимум на 20% в сравнении с контрольными образцами.
Пример 23. Применение НЧЗМ в КТ in vitro.
Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 или конюгаты, производные от Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1, инкубировали с клеточными линиями SK-BR-3 (суперэкспрессия HER2/neu, 0,25 миллионов клеток) 25 мкл 1% BSA в PBS при различных концентрациях Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 или конюгатов, производных от Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1, в течение 15 мин и промывали 1% BSA в PBS. Полученные образцы клеток с частицами помещали в микротомограф MARS-CT (MARS Bioimaging Ltd., США) и наблюдали появление контраста в сравнении с контрольными образцами. Сканирование проводилось при напряжении на рентгеновской трубке (SB-120-350) от 60 до 120 кВ. Изображения реконструировались из полученных срезов (размер вокселя 30 мкм) с полем зрения 100 мм (Field of View, FoV).
Пример 24. Применение НЧЗМ в КТ in vivo.
Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4@AuNP@1 вводили мышам подкожно в дозах 0,17, 0,85 и 4,26 мг/кг.Через 30 минут, 7 часов и 24 часа после инъекции мыши были гуманно умерщвлены и помещены в микротомограф MARS-CT, наблюдали появление контраста в местах введения Fe3O4@AuNP@1' или Fe3O4
@AuNP@1 в сравнении с контрольными образцами. Сканирование проводилось при напряжении на рентгеновской трубке (SB-120-350) от 60 до 120 кВ. Изображения реконструировались из полученных срезов (размер вокселя 30 мкм) с полем зрения 100 мм (Field of View, FoV).
Пример 25. Применение НЧЗМ в флуоресцентном биоимиджинге in vivo.
НЧЗМ, конъюгированные с БСА-Су7 или БСА-Су5, вводили мышам внутривенно в дозах 50-1000 мкг на мышь. Через 30 минут, 7 часов и 24 часа после инъекции распределение наночастиц в мыши было визуализировано в оптическом томографе Abisense LumoTrace FLUO. Затем биовизуализация была проведена в экстрагированных органах ex vivo. Локализация флуоресцентного сигнала наблюдалась преимущественно в печени, селезенке и легких.
Пример 26. Применение НЧЗМ для доставки в опухоль.
НЧЗМ, конъюгированные с БСА-Су7, вводили мышам с привитыми опухолями CT26 внутривенно в дозах 50-1000 мкг на мышь. Через 30 минут, 7 часов и 24 часа после инъекции регистрировали накопление частиц в опухоли с помощью оптического томографа Abisense LumoTrace FLUO.
Пример 27. Применение конъюгатов НЧЗМ в гипертермии клеток.
Агенты на основе НЧЗМ, конъюгированные с Трастузумабом, инкубировали с клетками SK-BR-3 или СНО (как описано в Примерах 16-17). Затем отмывали не связавшиеся частицы и облучали клетки светом на длине волны 530 нм или 810 нм, 1-2 Вт/см^2 в течение 10-30 минут.Затем через 12-24 часа клетки изучали с помощью проточной цитометрии с окрашиванием пропидий йодидом/ФИТЦ-аннексином V. Тест показал, что процент мертвых клеток и клеток в апоптозе (суммарно) SK-BR-3 в присутствии наночастиц был не менее чем в 4 раза выше, чем для СНО клеток.
Пример 28. Применение НЧЗМ в магнитной гипертермии клеток.
НЧЗМ, конъюгированные с Трастузумабом, инкубировали с клетками SK-BR-3 или СНО (как описано в Примерах 16-17). Затем отмывали не связавшиеся частицы и помещали клетки в постоянное магнитное с интукцией 0,2 Тл, градиент 0.015 Тл/см для термостатирования и затем клетки помещаю в переменное магнитное поле и инкубируют от 20 до 45 минут.Затем через 12-24 часа клетки изучали с помощью проточной цитометрии с окрашиванием пропидий йодидом/ФИТЦ-аннексином V. Тест показал, что процент мертвых клеток и клеток в апоптозе (суммарно) SK-BR-3 в присутствии наночастиц был не менее чем в 4 раза выше, чем для СНО клеток.
Пример 29. Применение в качестве контрастного агента для магнитно-резонансной томографии.
Мышам линии BALB/c внутривенно вводили 300 мкг Fe3O4@AuNP@1' в 100 мкл 5% раствора глюкозы, через 3 часа мышей умерщвляли и визуализировали с помощью МРТ-системы ICON 1T (Bruker, США) с использованием РЧ-катушки объемом всего тела мыши. Мышей BALB/c без инъекций использовали в качестве контроля. Применяли FLASH-последовательность со следующими параметрами: время повторения - 1000 мс, время эха - 5 мс, угол поворота - 60 градусов, поле зрения - 8/5 см, 17 срезов на сканирование, толщина срезов - 1 мм.
Источники информации
1. P. Ghosh, G. Han, M. De, C.K. Kim, V.M. Rotello, Gold nanoparticles in delivery applications, Adv. Drug Deliv. Rev. (2008). https://doi.org/10.1016/j.addr.2008.03.016.
2. D. Pissuwan, T. Niidome, M.B. Cortie, The forthcoming applications of gold nanoparticles in drug and gene delivery systems, J. Control. Release. (2011). https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2009.12.006.
3. M.P. Nikitin, V.O. Shipunova, S.M. Deyev, P.I. Nikitin, Biocomputing based on particle disassembly, Nat. Nanotechnol. (2014). https://doi.org/10.1038/nnano.2014.156.
4. K.G. Shevchenko, V.R. Cherkasov, A.A. Tregubov, P.I. Nikitin, M.P. Nikitin, Surface plasmon resonance as a tool for investigation of non-covalent nanoparticle interactions in heterogeneous self-assembly & disassembly systems, Biosens. Bioelectron. 88 (2017) 3-8. https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.09.042.
5. S. Zeng, K.T. Yong, I. Roy, X.Q. Dinh, X. Yu, F. Luan, A Review on Functionalized Gold Nanoparticles for Biosensing Applications, Plasmonics. (2011). https://doi.org/10.1007/s11468-011-9228-1.
6. K. Saha, S.S. Agasti, C. Kim, X. Li, V.M. Rotello, Gold nanoparticles in chemical and biological sensing, Chem. Rev. (2012). https://doi.org/10.1021/cr2001178.
7. V.R. Cherkasov, E.N. Mochalova, A. V. Babenyshev, A. V. Vasilyeva, P.I. Nikitin, M.P. Nikitin, Nanoparticle Beacons: Supersensitive Smart Materials with On/Off-Switchable Affinity to Biomedical Targets, ACS Nano. (2020). https://doi.org/10.1021/acsnano.9b07569.
8. E. Boisselier, D. Astruc, Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity, Chem. Soc. Rev. (2009). https://doi.org/10.1039/b806051g.
9. E.E. Connor, J. Mwamuka, A. Gole, C.J. Murphy, M.D. Wyatt, Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity, Small. (2005). https://doi.org/10.1002/smll.200400093.
10. A. Igau, H. Grutzmacher, A. Baceiredo, G. Bertrand, Analogous.alpha.,.alpha.'-bis-carbenoid, triply bonded species: synthesis of a stable.lambda.3-phosphino carbene-.lambda.5-phosphaacetylene, J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 6463-6466. https://doi.org/10.1021/ja00227a028.
11. A.J. Arduengo, R.L. Harlow, M. Kline, A stable crystalline carbene, J. Am. Chem. Soc. 113 (1991) 361-363. https://doi.org/10.1021/ja00001a054.
12. M.N. Hopkinson, C. Richter, M. Schedler, F. Glorius, An overview of N-heterocyclic carbenes, Nature. 510 (2014) 485-496. https://doi.org/10.1038/nature13384.
13. V. Nesterov, D. Reiter, P. Bag, P. Frisch, R. Holzner, A. Porzelt, S. Inoue, NHCs in Main Group Chemistry, Chem. Rev. 118 (2018) 9678-9842. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00079.
14. A. Doddi, M. Peters, M. Tamm, N-Heterocyclic Carbene Adducts of Main Group Elements and Their Use as Ligands in Transition Metal Chemistry, Chem. Rev. 119 (2019) 6994-7112. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00791.
15. L.A. Schaper, S.J. Hock, W.A. Herrmann, F.E. Kühn, Synthesis and application of water-soluble NHC transition-metal complexes, Angew. Chemie - Int. Ed. (2013). https://doi.org/10.1002/anie.201205119.
16. M. Mora, M.C. Gimeno, R. Visbal, Recent advances in gold-NHC complexes with biological properties, Chem. Soc. Rev. (2019). https://doi.org/10.1039/c8cs00570b.
17. Ö. Karaca, V. Scalcon, S.M. Meier-Menches, R. Bonsignore, J.M.J.L. Brouwer, F. Tonolo, A. Folda, M.P. Rigobello, F.E. Kühn, A. Casini, Characterization of Hydrophilic Gold(I) N-Heterocyclic Carbene (NHC) Complexes as Potent TrxR Inhibitors Using Biochemical and Mass Spectrometric Approaches, Inorg. Chem. (2017). https://doi.org/10.1021/acs.inorgchem.7b02345.
18. M.A. Reynoso-Esparza, I.I. Rangel-Salas, A.A. Peregrina-Lucano, J.G. Alvarado-Rodríguez, F.A. López-Dellamary-Toral, R. Manríquez-González, M.L. Espinosa-Macías, S.A. Cortes-Llamas, Synthesis and characterization of Au(I) and Au(III) complexes containing N-heterocyclic ligands derived from amino acids, Polyhedron. (2014). https://doi.org/10.1016/j.poly.2014.07.014.
19. C.H.G. Jakob, B. Dominelli, E.M. Hahn, T.O. Berghausen, T. Pinheiro, F. Marques, R.M. Reich, J.D.G. Correia, F.E. Kühn, Antiproliferative Activity of Functionalized Histidine-derived Au(I) bis-NHC Complexes for Bioconjugation, Chem. - An Asian J. (2020). https://doi.org/10.1002/asia.202000620.
20. E. Peris, Smart N-Heterocyclic Carbene Ligands in Catalysis, Chem. Rev. 118 (2018) 9988-10031. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.6b00695.
21. A. Ferry, K. Schaepe, P. Tegeder, C. Richter, K.M. Chepiga, B.J. Ravoo, F. Glorius, Negatively Charged N-Heterocyclic Carbene-Stabilized Pd and Au Nanoparticles and Efficient Catalysis in Water, ACS Catal. (2015). https://doi.org/10.1021/acscatal.5b01160.
22. E.A. Baquero, S. Tricard, J.C. Flores, E. De Jesffls, B. Chaudret, Highly stable water-soluble platinum nanoparticles stabilized by hydrophilic N-heterocyclic carbenes, Angew. Chemie - Int. Ed. (2014). https://doi.org/10.1002/anie.201407758.
23. A.V. Zhukhovitskiy, M.J. MacLeod, J.A. Johnson, Carbene Ligands in Surface Chemistry: From Stabilization of Discrete Elemental Allotropes to Modification of Nanoscale and Bulk Substrates, Chem. Rev. (2015). https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.5b00220.
24. C.A. Smith, M.R. Narouz, P.A. Lummis, I. Singh, A. Nazemi, C.-H. Li, C.M. Crudden, N-Heterocyclic Carbenes in Materials Chemistry, Chem. Rev. 119 (2019) 4986-5056. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00514.
25. S. Engel, E.C. Fritz, B.J. Ravoo, New trends in the functionalization of metallic gold: From organosulfur ligands to N-heterocyclic carbenes, Chem. Soc. Rev. (2017). https://doi.org/10.1039/c7cs00023e.
26. Y.Y. An, J.G. Yu, Y.F. Han, Recent Advances in the Chemistry of N-Heterocyclic-Carbene-Functionalized Metal-Nanoparticles and Their Applications, Chinese J. Chem. (2019). https://doi.org/10.1002/cjoc.201800450.
27. S.R. Thomas, A. Casini, N-Heterocyclic carbenes as “smart” gold nanoparticle stabilizers: State-of-the art and perspectives for biomedical applications, J. Organomet. Chem. (2021). https://doi.org/10.1016/j.jorganchem.2021.121743.
28. M.J. MacLeod, J.A. Johnson, PEGylated N-Heterocyclic Carbene Anchors Designed to Stabilize Gold Nanoparticles in Biologically Relevant Media, J. Am. Chem. Soc. (2015). https://doi.org/10.1021/jacs.5b02452.
29. M.J. MacLeod, A.J. Goodman, H.Z. Ye, H.V.T. Nguyen, T. Van Voorhis, J.A. Johnson, Robust gold nanorods stabilized by bidentate N-heterocyclic-carbene-thiolate ligands, Nat. Chem. (2019). https://doi.org/10.1038/s41557-018-0159-8.
30. C.M. Crudden, J.H. Horton, M.R. Narouz, Z. Li, C.A. Smith, K. Munro, C.J. Baddeley, C.R. Larrea, B. Drevniok, B. Thanabalasingam, A.B. McLean, O. V. Zenkina, I.I. Ebralidze, Z. She, H.B. Kraatz, N.J. Mosey, L.N. Saunders, A. Yagi, Simple direct formation of self-assembled N-heterocyclic carbene monolayers on gold and their application in biosensing, Nat. Commun. (2016). https://doi.org/10.1038/ncomms12654.
31. R.M. Mayall, C.A. Smith, A.S. Hyla, D.S. Lee, C.M. Crudden, V.I. Birss, Ultrasensitive and Label-Free Detection of the Measles Virus Using an N-Heterocyclic Carbene-Based Electrochemical Biosensor, ACS Sensors. (2020). https://doi.org/10.1021/acssensors.0c01250.
32. Z. Li, M.R. Narouz, K. Munro, B. Hao, C.M. Crudden, J.H. Horton, H. Hao, Carboxymethylated Dextran-Modified N-Heterocyclic Carbene Self-Assembled Monolayers on Gold for Use in Surface Plasmon Resonance Biosensing, ACS Appl. Mater. Interfaces. (2017). https://doi.org/10.1021/acsami.7b13114.
33. M.R. Narouz, C.H. Li, A. Nazemi, C.M. Crudden, Amphiphilic N-Heterocyclic Carbene-Stabilized Gold Nanoparticles and Their Self-Assembly in Polar Solvents, Langmuir. (2017). https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.7b02248.
34. A.J. Young, C. Eisen, G.M.D.M. Rubio, J.M. Chin, M.R. Reithofer, pH responsive histidin-2-ylidene stabilized gold nanoparticles, J. Inorg. Biochem. (2019). https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2019.110707.
35. J.F. DeJesus, L.M. Sherman, D.J. Yohannan, J.C. Becca, S.L. Strausser, L.F.P. Karger, L. Jensen, D.M. Jenkins, J.P. Camden, A Benchtop Method for Appending Protic Functional Groups to N-Heterocyclic Carbene Protected Gold Nanoparticles, Angew. Chemie - Int. Ed. (2020). https://doi.org/10.1002/anie.202001440.
36. G.A. Monti, G.A. Fernández, N.M. Correa, R.D. Falcone, F. Moyano, G.F. Silbestri, Gold nanoparticles stabilized with sulphonated imidazolium salts in water and reverse micelles, R. Soc. Open Sci. (2017). https://doi.org/10.1098/rsos.170481.
37. K. Salorinne, R.W.Y. Man, C.-H. Li, M. Taki, M. Nambo, C.M. Crudden, Water-Soluble N-Heterocyclic Carbene-Protected Gold Nanoparticles: Size-Controlled Synthesis, Stability, and Optical Properties, Angew. Chemie Int. Ed. 56 (2017) 6198-6202. https://doi.org/https://doi.org/10.1002/anie.201701605.
38. Smith, McKenzie, Maureen McKeague, and Maria C. DeRosa. "Synthesis, transfer, and characterization of core-shell gold-coated magnetic nanoparticles." MethodsX 6 (2019): 333-354. https://doi.org/10.1016/j.mex.2019.02.006
39. Патент на изобретение RU 2620166 C1 (ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА" (МГУ) (RU)), 23.05.2017 «Способ покрытия наночастиц магнетита слоем золота».
40. Franziska Lissel et al. «Poly(3-hexylthiophene) Functionalized with N-Heterocyclic Carbene as Robust and Conductive Ligands to Stabilize Gold Nanoparticles», 2020, Angew. Chem. Int. Ed. 10.1002/anie.202012216, pp.1 - 6.
41. Ефремова М.В. «Синтез, физико-химические свойства и биомедицинское применение гибридных материалов на основе наночастиц магнетит-золото» диссертация на соиск. уч. степ.к.х.н., Москва, 2018 г.
42. N.S. Elbialy et al. «Multifunctional magnetic-gold nanoparticles for efficient combined targeted drug delivery and interstitial photothermal therapy», International Journal of Pharmaceutics (2018), doi:https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2018.11.021.
43. Nihal S. Elbialy et al. «Multifunctional magnetic-gold nanoparticles for efficient combined targeted drug delivery and interstitial photothermal therapy», International Journal of Pharmaceutics (2018), https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2018.11.021 (прототип).
44. Патент на изобретение RU 2660149 С1 (Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС» (RU)), 05.07.2018 "Способ получения наночастиц магнетита, эпитаксиально выращенных на наночастицах золота".
45. С.В. Сайкова и др. «Получение магнитных гибридных наночастиц магнетит-золото», ISSN 1026-3500 Известия Академии наук. Серия химическая, 2020, №7, с. 1284-1289.
46. Е.М. Семенова и др. «Межфазный синтез наночастиц магнетита с золотой оболочкой», Вестник БГУ. Сер. 2. 2010. №2, с. 12-16.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Наночастица состава золото-магнетит, способ получения наночастицы (варианты), конъюгат на ее основе (варианты), способ получения конъюгата и тест-набор | 2023 |
|
RU2814660C1 |
| НАНОАГЕНТЫ ДЛЯ СКРИНИНГА ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ | 2022 |
|
RU2804488C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ | 2022 |
|
RU2802435C1 |
| КАРБЕНОВЫЙ ЛИГАНД И УЛЬТРАСТАБИЛЬНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ЗОЛОТА НА ЕГО ОСНОВЕ | 2021 |
|
RU2792581C1 |
| НАНОКОНЪЮГАТЫ ДОКСОРУБИЦИН-ЗОЛОТО НАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ | 2018 |
|
RU2773707C2 |
| ИОНИЗИРУЕМЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2023 |
|
RU2823298C1 |
| РЕЦЕПТОР-НАПРАВЛЕННЫЕ КОНСТРУКЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2682335C2 |
| Способ получения фармацевтически подходящих лекарственных форм и их применение в комбинированной химиотерапии и фотодинамической терапии злокачественных новообразований | 2023 |
|
RU2822629C1 |
| Лекарственный препарат для лечения рака молочной железы | 2017 |
|
RU2657545C1 |
| НОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2599449C1 |
Изобретение относится к области биомедицины, наномедицины, в частности к конъюгатам наночастицы с функциональной молекулой для медицинского применения, характеризующимся тем, что на поверхности водосовместимой стабильной наночастицы с магнитными свойствами, состоящей из золота и магнетита Fe3O4, иммобилизовано стабилизирующее соединение с карбоксильной группой, представляющее собой карбеновый лиганд формулы (I), где R1 и R2 независимо выбраны из группы, включающей COOR5 или COOR6; R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей H, C1-С6 алкил, C3-С7 циклоалкил, C1-С6 алкилокси и галоген; R5 и R6 независимо выбраны из группы, включающей H; C1-С6 алкил; C3-С7 циклоалкил; C1-С6 алкилокси и галоген. Предложенный конъюгат сохраняет коллоидную стабильность после высушивания и обладает способностью к ресуспендированию в воде, в буферном водном растворе или биологическом образце. Размеры наночастицы находятся в диапазоне от 5 до 100 нм. При этом указанная наночастица связана с функциональной молекулой непосредственно или с помощью линкера, имеющего общую формулу СONH(CH2)mY, где Y=COOH, NH2, SH, CONH2, OH, CHO, CO-ПЭГ-OH или CO-ПЭИ-NH2, m может принимать значения от 3 до 12, функциональную молекулу выбирают из группы, включающей терапевтический препарат или диагностическое вещество. В частности, функциональная группа может представлять собой малую молекулу, кумарин, фотосенсибилизатор, белок, углевод, липид, ДНК, транспортные, матричные, рибосомальные или микроРНК, синтетические аналоги нуклеиновых кислот, синетический полимер полиэтиленгликоль или полиэтиленимин, фармакологически активное соединение. Также изобретение относится к способу применения указанного конъюгата в магнитно-резонансной томографии, спектрофотометрическом анализе, иммуноферментном анализе, иммунохроматографическом анализе, в качестве контраста для компьютерной томографии, для детекции целевых молекул, для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы, в качестве агента для радиотерапии, для адресной доставки в клетки терапевтического препарата. Технический результат изобретения заключается в повышении коллоидной устойчивости конъюгатов наночастиц состава магнетит-золото (Fe3O4@AuNP@NHC) с функциональными молекулами к внешним физическим и химическим воздействиям, в том числе и в биологических средах, а также облегчение процесса хранения и транспортировки за счет способности указанных конъюгатов к сохранению коллоидной стабильности при высушивании, в обеспечении возможности доставки диагностических и лекарственных веществ к клеткам-мишеням. 22 н. и 55 з.п. ф-лы, 10 ил., 29 пр.
1. Конъюгат наночастицы с функциональной молекулой для медицинского применения, характеризующийся тем, что на поверхности водосовместимой стабильной наночастицы с магнитными свойствами, состоящей из золота и магнетита Fe3O4, иммобилизовано стабилизирующее соединение с карбоксильной группой, представляющее собой карбеновый лиганд формулы (I)
(I),
где R1 и R2 независимо выбраны из группы, включающей COOR5 или COOR6;
R3 и R4 независимо выбраны из группы, включающей H или C1-С6 алкил, или C3-С7 циклоалкила, или C1-С6 алкилокси и галогена, или C1-С6 алкила, C3-С7 циклоалкила, или C1-С6 алкилокси и галогена;
R5 и R6 независимо выбраны из группы, включающей H; C1-С6 алкил; C3-С7 циклоалкил; C1-С6 алкилокси и галоген,
характеризующийся тем, что сохраняет коллоидную стабильность после высушивания и обладает способностью к ресуспендированию в воде, в буферном водном растворе или биологическом образце, размеры наночастицы находятся в диапазоне от 5 до 100 нм, при этом указанная наночастица связана с функциональной молекулой непосредственно или с помощью линкера, имеющего общую формулу (II)
СONH(CH2)mY,
где Y=COOH, NH2, SH, CONH2, OH, CHO, CO-ПЭГ-OH или CO-ПЭИ-NH2,
m может принимать значения от 3 до 12,
функциональную молекулу выбирают из группы, включающей терапевтический препарат или диагностическое вещество.
2. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что может включать нацеливающий рецептор.
3. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что биологическим образцом является молоко.
4. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что биологический образец выбирают из группы, включающей сыворотку крови, плазму крови или цельную кровь.
5. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что буферный водный раствор выбирают из группы, включающей фосфатный, аммиачный, ацетатный или карбонатный буферный водный раствор.
6. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что конъюгат после высушивания представляет собой сухой порошок.
7. Конъюгат п.1, характеризующийся тем, что конъюгат после высушивания представляет собой сухую тонкую пленку на твердых поверхностях, таких как стекло, пластик, полимерное покрытие, металл, бумага, нитроцеллюлоза, керамика или дерево.
8. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой малую молекулу.
9. Конъюгат по п.8, характеризующийся тем, что малая молекула представляет собой родамин.
10. Конъюгат по п.8, характеризующийся тем, что малая молекула представляет собой флуоресцеин.
11. Конъюгат по п.8, характеризующийся тем, что малая молекула представляет собой цианиновый краситель.
12. Конъюгат по п.8, характеризующийся тем, что малая молекула представляет собой производное флуоресцентных красителей BODIPY, но не ограничивается им.
13. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой кумарин.
14. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор.
15. Конъюгат по п.14, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор на основе порфирина.
16. Конъюгат по п.14, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор на основе фталоцианина.
17. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой белок.
18. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что белок представляет собой С-реактивный белок.
19. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что белок представляет собой БСА-биотин.
20. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что белок представляет собой БСА-хлорамфеникол.
21. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что белок представляет собой стрептавидин.
22. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что белок представляет собой лектин WGA или лектин ConA.
23. Конъюгат по п.17, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой антитело.
24. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой иммуноглобулин G.
25. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин G.
26. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой герцептин.
27. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой антитело против хлормафеникола.
28. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой антитело на С-реактивный белок.
29. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой антитело на тропонин.
30. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой антитело против флуоресцеина.
31. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело трастузумаб.
32. Конъюгат по п.23, характеризующийся тем, что антитело представляет собой иммунологические агенты и/или их комбинации.
33. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой углевод.
34. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой липид.
35. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой ДНК, в том числе фрагменты и целые молекулы ДНК.
36. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой транспортные, матричные, рибосомальные или микроРНК.
37. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные нуклеиновые кислоты, морфолиновые нуклеиновые кислоты, закрытые нуклеиновые кислоты, гликолевые нуклеиновые кислоты и треозо-нуклеиновые кислоты.
38. Конъюгат для адресной доставки в клетки терапевтических препаратов, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой синтетический полимер полиэтиленгликоль или полиэтиленимин.
39. Конъюгат для адресной доставки к клеточной мишени терапевтического препарата, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фармакологически активное соединение.
40. Конъюгат по п.39, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой соединение, выбираемое из липофильного, плохо или совсем не растворимого в воде фармакологически активного соединения.
41. Конъюгат по п.39, характеризующийся тем, что фармакологически активное соединение представляет собой противораковое лекарствo.
42. Конъюгат по п. 41, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой лекарствo против рака молочной железы.
43. Конъюгат по п.41, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик.
44. Конъюгат по п.43, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик темозоломид.
45. Конъюгат по п.43, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик доксорубицин.
46. Конъюгат по п.43, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик даунорубицин.
47. Конъюгат по п.43, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик паклитаксел.
48. Конъюгат по п.43, характеризующийся тем, что лекарство представляет собой цитостатик темозоломид, но не ограничиваясь им.
49. Конъюгат для адресной доставки в клетки диагностических веществ, представляющий собой вариант конъюгата по п.1, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой фотосенсибилизатор.
50. Конъюгат по п.49, в котором функциональная молекула представляет собой флуоресцентный краситель родамин.
51. Конъюгат по п.49, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой флуоресцеин.
52. Конъюгат по п.49, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой цианиновый краситель.
53. Конъюгат по п.49, характеризующийся тем, что функциональная молекула представляет собой производное флуоресцентных красителей BODIPY.
54. Способ применения конъюгата по п.1 в магнитно-резонансной томографии.
55. Способ применения конъюгата по п.49 в спектрофотометрическом анализе.
56. Способ применения конъюгата по п.17 в иммуноферментном анализе.
57. Способ применения конъюгата по п.17 в иммунохроматографическом анализе.
58. Способ применения конъюгата по п.1 в качестве контраста для компьютерной томографии.
59. Способ применения конъюгата по п.17 для детекции целевых молекул.
60. Способ по п.59, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей малые молекулы.
61. Способ по п.59, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей белки, включая антитела.
62. Способ по п.59, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей углеводы.
63. Способ по п.59, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей липиды.
64. Способ по п.59, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей ДНК или РНК.
65. Способ применения конъюгата по п.1 для доставки целевых молекул в живые клетки и организмы.
66. Способ по п.65, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей малые молекулы.
67. Способ по п.65, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей белки, включая антитела.
68. Способ по п.65, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей углеводы.
69. Способ по п.65, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей липиды.
70. Способ по п.65, в котором целевую молекулу выбирают из группы, содержащей ДНК или РНК.
71. Способ применения конъюгата по п.1 в качестве агента для радиотерапии.
72. Способ применения конъюгата по п.1 для адресной доставки в клетки терапевтического препарата, при этом используют конъюгат, содержащий нацеливающий рецептор.
73. Способ применения конъюгата по п.72, характеризующийся тем, что нацеливающий рецептор выбирают из группы, включающей малые молекулы.
74. Способ применения конъюгата по п.72, характеризующийся тем, что нацеливающий рецептор выбирают из группы, включающей белки, в том числе антитела.
75.Способ применения конъюгата по п.72, характеризующийся тем, что нацеливающий рецептор выбирают из группы, включающей углеводы.
76. Способ применения конъюгата по п.72, характеризующийся тем, что нацеливающий рецептор выбирают из группы, включающей липиды.
77. Способ применения конъюгата по п.72, характеризующийся тем, что нацеливающий рецептор выбирают из группы, включающей ДНК или РНК.
| ЕФРЕМОВА М.В., Синтез, физико-химические свойства и биомедицинское применение гибридных материалов на основе наночастиц магнетит-золото, диссертация на соиск | |||
| уч | |||
| степ | |||
| к.х.н., Москва, 2018, 144 стр., глава 1 | |||
| РУДАКОВСКАЯ П.Г., Новые бифункциональные органические лиганды для модификации наночастиц золота и магнетита и гибирдные материалы на их |
