Способ подавления метаногенеза Российский патент 2022 года по МПК C05F17/10 C02F11/148 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам подавления функционирования биокаталитических систем, представляющих собой природные анаэробные консорциумы клеток микроорганизмов, осуществляющих метаногенез, приводящий к накоплению биогаза и метана в его составе. Способ позволяет с высокой скоростью подавить накопление биогаза и одновременно значительно снизить в нем долю метана за счет введения в обрабатываемые среды экологически безопасных веществ, оказывающих комплексное воздействие на клетки, участвующие в метаногенезе. Предлагаемое техническое решение обеспечивает быстрое достижение устойчивого результата за счет использования оригинальной комбинации веществ в определенных концентрациях, ингибирующих образование клетками микроорганизмов биогаза и метана в его составе, и оно может быть использовано для предотвращения появления экологических проблем, связанных с ухудшением состояния окружающей среды вследствие накопления парниковых газов и повышением опасности накопления взрывоопасного и горючего метана, а также может быть применено для регулирования и управления интенсивностью процесса метаногенеза на промышленных биогазовых установках.

Метаногенез представляет собой процесс анаэробной конверсии органических веществ в биогаз, представляющий собой смесь, как правило, двух основных парниковых газов - метана и углекислого газа, катализируется тремя основными группами микроорганизмов: гидролитическими гетеротрофами (бактериями, дрожжами, мицелиальными грибами), ацетогенными бактериями и метаногенами (археями) [Czatzkowska, M., Harnisz, M., Korzeniewska, E., & Koniuszewska, I. (2020). Inhibitors of the methane fermentation process with particular emphasis on the microbiological aspect: A review. Energy Science & Engineering, 8(5), 1880-1897]. Этот процесс может активно развиваться в теле свалок твердых бытовых отходов, в грунтовых плотинах [Максимович Н.Г., Хмурчик В.Т., Деменев А.Д., Сединин A.M. (2019) Биотехнологический метод подавления метаногенеза в грунтовых плотинах. // Гидротехническое строительство, №1, С. 15-22.], в отложениях сточных вод [Пьянкова Е.Д. Оценка и минимизация воздействия на окружающую среду полигонов твердых коммунальных отходов. // Диссертация на соиск. науч. степени к.т.н., г. Санкт-Петербург, 2007, 150 с.] и т.д. Бесконтрольное выделение биогаза приводит к ухудшению состояния окружающей среды вследствие накопления парниковых газов и к опасности накопления взрывоопасного и горючего метана. В этой связи разрабатываются способы подавления метаногенеза, позволяющие снизить скорость накопления биогаза, а также сократить долю накапливающегося в нем метана.

Известен способ подавления метаногенеза путем аэрации тех сред, которые содержат клетки микроорганизмов, катализирующих накопление биогаза) [Fraczek, K., Kozdroj, J., Gorny, R.L., Cyprowski, M., & Golofit-Szymczak, M. (2017) Fungal air contamination in distinct sites within a municipal landfill area. // International journal of environmental science and technology, 14(12), 2637-2648]. Способ обеспечивает аэрацию сред посредством их перекапывания или использования дорогостоящих систем принудительной аэрации.

Недостатком этого способа подавления метаногенеза является то, что аэрация представляет собой технически сложный и экономически затратный процесс, а также происходит стимулирование развития аэробных процессов и замена ими анаэробных процессов, лежащих в основе метаногенеза, что приводит к резкому увеличению численности аэробных клеток, в том числе мицелиальных грибов в составе аэрируемых сред. Так происходит на свалках твердых бытовых отходов, в прилегающих к ним почвах и в воздухе (в виде спор). В свою очередь эти микроорганизмы могут ингибировать рост растений, используемых для рекультивации, а также являются продуцентами микотоксинов, накопление которых опасно для здоровья людей и животных [Mosina L.V., Chupakhina G.N., Maslennikov P.V., Zhandarova J.A., Dovletyarova E.A. (2020). Municipal solid waste landfills as a source of mycotoxins contamination in soil. // IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, V. 548, №2, p. 022063].

Известен способ подавления метаногенеза путем введения 2-бромэтансульфоновой кислоты (BES) в среды с метаногенными консорциумами клеток [Habtewold, J., Gordon, R., Voroney, P., Sokolov, V., VanderZaag, A., Wagner-Riddle, C, Dunfield, K. (2018). Sodium persulfate and potassium permanganate inhibit methanogens and methanogenesis in stored liquid dairy manure. // Journal of Environmental Quality, V. 47, №4, p. 786-794]. Для этого в среды вводят 0,05 M (=10,5 г/л) водный раствор BES, что приводит к тому, что через 15 суток наблюдается 98% подавление образования биогаза и накопления в его составе метана.

Недостатками этого способа подавления метаногенеза является то, что сам реагент BES является лабораторным веществом, имеющим чрезвычайно высокую стоимость, а атомы брома, которые элиминируются из этого вещества, приводят к образованию бромистого водорода - ядовитого газообразного вещества, обладающего удушающим действием (ПДК=10 мг/м³), которое при растворении в воде образует сильную одноосновную кислоту, что делает это вещество неприемлемым для решения экологических задач.

Известен способ подавления метаногенеза путем введения персульфата натрия в среды с метаногенными клетками [Habtewold, J., Gordon, R., Voroney, P., Sokolov, V., VanderZaag, A., Wagner-Riddle, C., Dunfield, K. (2018). Sodium persulfate and potassium permanganate inhibit methanogens and methanogenesis in stored liquid dairy manure.// Journal of environmental quality, V. 47, №4, p. 786-794]. Персульфат натрия (Na₂S₂O₈) представляет собой окислитель и служит акцептором электронов, которые выводятся из реакций, связанных с образованием, прежде всего, метана в метаногенных биокаталитических системах. Для этого в концентрации 9 г/л персульфат натрия вводится в виде водного раствора в анаэробные среды с органическими субстратами и метаногенами, что приводит к 92%-ному подавлению образования биогаза на 15-е сутки после его введения, однако через 60 суток ингибирование метаногенеза прекращается, и процесс интенсивного образования биогаза вновь восстанавливается.

Недостатком этого способа подавления метаногенеза является неполное и всего лишь временное ингибирующее воздействие Na₂S₂O₈ на метаногенную биокаталитическую систему за счет того, что персульфат разлагается в присутствии влаги в метаногенных средах до перекиси водорода, а затем и до кислорода с водой, катализируя процессы окисления, которое, собственно и воздействует на анаэробные клетки, но, согласно способу, требуется достаточно высокая концентрация исходного вещества -персульфата натрия - применение которой необходимо для получения заметного эффекта в подавлении метаногенеза.

Известен способ подавления метаногенеза путем введения в среды с метаногенными биокаталитическими системами химически модифицированных гуминовых веществ, а именно, нафтохинонового производного гуминовых кислот (2-гидрокси-1,4-нафтохинон)[Efremenko Е., Senko О., Stepanov N., Mareev N., Volikov A., Perminova I. (2020) Suppression of methane generation during methanogenesis by chemically modified humic compounds. Antioxidants, V.9, №11, p.1140]. Введение в химическую структуру гуминовых кислот хиноновой функциональной группы приводит к усилению их роли как акцепторов электронов, поскольку оно изменяет их оксилительно-восстановительный потенциал [Volikov А.В., Mareev N.V., Konstantinov A.I., Molodykh A.A., Melnikova S.V., Bazhanova A.E., Gasanov M.E., Nikolaev E.N., Zherebker A.Ya, Volkov D.S., Zykova M.V., Perminova I.V. (2021) Directed synthesis of humic and fulvic derivatives with enhanced antioxidant properties. // AGRONOMY-BASEL, V. 11, №10, P. 2047.]. Окислительно-восстановительный потенциал, называемый также редокс-потенциалом (от английского RedOx - Reduction/Oxidation), характеризует степень активности электронов в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с присоединением или передачей электронов. В результате хинон-содержащие производные гуминовых кислот имеют измененный по отношению к природным гуминовым кислотам редокс-потенциал, и они более активно «забирают» на себя те электроны в биохимических реакциях, которые могут участвовать в образовании метана. Таким образом, их введение в среды с метан-продуцирующими клетками, способствует снижению уровня накопления метана, при этом сами гуминовые кислоты для их редокс-модификации могут быть получены из различных природных источников (торфа, каменного угля, почвы), а поэтому способ их применения в отношении подавления метаногенеза может считаться «природоподобным» процессом.

Существенным недостатком этого способа подавления метаногенеза и применения редокс-модифицированных (нафтохинон-содержащих) гуминовых кислот является возможность снижения скорости накопления биогаза только на 40% при снижении в его составе метана на 100% на 16-е сутки после введения в среды с метаногенами достаточно высокой концентрации ингибитора (10 г/л). Далее процесс метаногенеза вновь восстанавливается, так как ингибирование при реализации этого способа подавления метаногенеза является неустойчивым и краткосрочным.

Вместе с этим данная разработка по сущности (по использованию для подавления метаногенеза хинон-содержащих производных гуминовых кислот) и достигаемому результату (снижению скорости накопления биогаза и доли метана в его составе) является самой близкой к заявляемому техническому решению и принята за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа подавления метаногенеза, который обеспечивает быстрое, устойчивое и значительное снижение скорости образования биогаза, а содержание в нем метана снижается на 92-100%.

Поставленная задача решается тем, что реализуется способ, согласно которому для подавления метаногенеза в среду с клетками микроорганизмов, продуцирующих биогаз, вводят модифицированный нафтохиноном гумат калия (А), персульфат калия (Б), фермент полигистидинсодержащую органофосфтагидролазу (His₆-OPH) (В) и антимикробное вещество бацитрацин (Г) так, чтобы их конечные концентрации в среде составляли соответственно для А - 2-5 г/л, для Б - 2-5 г/л, для В - 2-4 мг/л, для Г - 25-100 мг/л, а само их введение в обрабатываемые среды для подавления метаногенеза осуществляется во влажном виде, получаемом после их растворения в буферных неорганических растворах с рН 7,5-10,5. Применение такого способа подавления метаногенеза снижает скорость образования биогаза за 7 суток на 65-75%, а содержание метана в биогазе - на 92-100%.

В предлагаемом техническом решении применяется известный из прототипа модифицированный нафтохиноном гумат калия, способный выполнять роль акцептора электронов в метаногенных биокаталитических системах, который способствует тому, что часть электронов при этом не направляется на синтез метана, а идет на восстановление нафтохинона в составе гумата до нафтогидрохинона [Efremenko E., Senko О., Stepanov N., Mareev N., Volikov A., Perminova I. (2020) Suppression of methane generation during methanogenesis by chemically modified humic compounds. Antioxidants, V. 9, №11, p. 1140], однако используемая концентрация модифицированного нафтохиноном гумата калия (2-5 г/л) в сравнении с прототипом снижена в 2-5 раз в предлагаемом способе. Это снижение достигается в заявляемом способе за счет введения в среду других компонентов, имеющих разнонаправленное воздействие на метаногенный консорциум, но обеспечивающее более значимый и быстрый эффект по подавлению метаногенеза, чем в прототипе.

Согласно заявляемому техническому решению, в метаногенные среды вводится персульфат калия (K₂S₂O₈) до концентрации 2-5 г/л, который проявляет свойства окислителя, разлагающегося во влажной среде до выделения перекиси водорода как активной формы кислорода, а далее и она разлагается до воды и молекулярного кислорода. Все это в совокупности приводит к увеличению концентрации активных форм кислорода и к окислительным реакциям в анаэробной среде с метаногенными консорциумами, подавляя их метаболическую активность. Концентрации K₂S₂O₈, используемые в предлагаемом техническом решении установлены экспериментально. Персульфат калия в минимальной концентрации обеспечивает значимый эффект именно в подавлении метаногенеза, а в максимальной концентрации из указанного диапазона вызывает значительное торможение функциональной активности клеток, но не их гибель, что делает предлагаемый способ экологически приемлемым для применения в том числе в отношении объектов окружающей среды. При этом концентрации K₂S₂O₈, используемые в заявляемом способе, в 1,8-4,5 раза меньше, чем в указанном выше аналоге с применением Na₂S₂O₈.

Также, согласно предлагаемому изобретению, для обработки метаногенных консурциумов с целью подавления метаногенеза в среды вводится фермент гексагистидин-содержащая органофосфатгидролаза (His₆-ОРН) до концентрации 2-4 мг/л, который проявляет лактоназную активность в отношении широкого спектра субстратов, чем выделяется среди других известных лактоназ [Aslanli A., Lyagin I., Efremenko E. (2018) Novel approach to quorum quenching: rational design of antibacterials in combination with hexahistidine-tagged organophosphorous hydrolase. // Biol. Chem., V. 399, P.869-879.] Субстратами для лактоназ являются лактон-содержащие молекулы, участвующие в формировании популяций клеток бактерий и архей, устойчивых к воздействию различных факторов, включая антимикробные агенты [Song, L.; Wang, Y.; Zhao, H.; Long, D.T. (2015) Composition of bacterial and archaeal communities during landfill refuse decomposition processes. // Microbiol. Res.,V. 181, P.105-1 П.]. Сам фермент получается по известному методу [Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I.; Mattiasson В. (2006) Purification of His₆-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microbiol. Biotechnol., V. 70, P. 558-563.], a его концентрации, применяемые, согласно заявляемому способу, найден экспериментально. Их диапазон обусловлен тем, что нижняя граница интервала используемых концентраций соответствует проявлению значимого эффекта от используемого фермента, а верхняя граница соответствует максимуму, превышение которого не целесообразно по технологическим причинам и излишней трате фермента.

Гидролиз под действием His₆-OPH лактон-содержащих молекул, синтезируемых клетками анаэробного консорциума и находящихся в среде с ними, приводит к ослаблению устойчивости клеток к воздействию других вводимых в среду веществ, и, в первую очередь, к окислителям и антимикробным агентам, поэтому, согласно заявляемому способу подавления метаногенеза, в среду вводится также бацитрацин, обладающий антимикробным действием, до концентрации 25-100 мг/л. Диапазон концентраций бацитрацина найден экспериментально, при этом нижний предел концентраций обусловлен проявляемой им эподавляющей эффективностью действия по отношению к анаэробному метаногенному консорциуму, а верхний предел - тем, что дальнейшее повышение концентрации становится избыточным и не приводящим к большему эффекту воздействия данного антимикробного агента на клетки консорциума.

Выбор самого бацитрацина для введения в среды с целью подавления метаногенеза обусловлен тем, что он обладает широким антимикробным спектром действия, воздействует на грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки, а также на отдельные клетки архей, дрожжей и мицелиальных грибов [Varnava K.G.; Ronimus R.S.; Sarojini V. (2017) A review on comparative mechanistic studies of antimicrobial peptides against archaea. // Biotechnol. Bioeng., V. 114, P. 2457-2473].

Бацитрацин является природным антимикробным веществом полипептидной природы, синтезируется клетками бактерий Bacillus subtilis [M.Rukmini, D.Sahoo, J.Dalei, R.Ray (2015) Production, purification and characterization of bacitracin from Bacillus subtilis. // The Pharma Innovation Journal 2015; V.3, №12, P.77-82.], имеет хорошо изученные свойства и возможность постепенной биодеградации, как полипептид, в том числе в природных системах. Последнее его свойство делает потенциально возможным масштабирование практического применения заявляемого способа подавления метаногенеза без создания существенной экологической нагрузки по этому антимикробному агенту.

Известно, что фермент His₆-OPH способен образовывать множественные межмолекулярные взаимодействия, в том числе полиэлектролитные комплексы, с различными полипептидами, обладающими антимикробными свойствами [Aslanli A.; Lyagin I.; Efremenko E. (2018) Novel approach to quorum quenching: rational design of antibacterials in combination with hexahistidine-tagged organophosphorus hydrolase. // Boil. Chem., V.399, P.869-879.]. При этом происходит заметная стабилизация фермента и длительное проявление им каталитической активности.

В этой связи заявляемое техническое решение использует такую способность фермента для его взаимодействия с бацитрацином, и оно происходит в ходе приготовления водных буферных растворов всех веществ, вносимых в среду с метаногенным анаэробным консорциумом. В результате указанных взаимодействий с бацитрацином происходит стабилизация каталитической активности фермента His₆-OPH, которая длительно сохраняется при внесении в метаногенные консорциумы, обеспечивая успех реализации заявляемого способа.

Экспериментально установлено, чтобы избежать лишних возможных участников подобных взаимодействий фермента, для приготовления растворов веществ, используемых, согласно заявляемому способу, применяются только неорганические буферные системы, а не органические.

Для обеспечения эффективного гидролиза лактон-содержащих молекул под действием фермента His₆-OPH все вещества, применяемые, согласно заявляемому способу, растворяются в буферных растворах с рН 7,5-10,5. Диапазон рН определяется оптимумом действия фермента, используемого для реализации заявляемого способа.

Использование веществ, согласно заявляемому способу, в растворенном состоянии способствует повышению их биодоступности для клеток микроорганизмов, осуществляющих метаногенез.

Предлагаемое техническое решение в виде способа подавления метаногенеза предназначено для универсального подавления метаногенеза в различных местах, где обнаруживается метаболическая активность анаэробных метаногенных консорциумов и выделение биогаза, содержащего метан, а именно, на мусорных свалках твердых бытовых отходов, в грунтовых плотинах, в отложениях сточных вод, в канализационных стоках и т.д..

Предлагаемый способ подавления метаногенеза может быть применен не только в отношении природных источников метаногенеза, но и для регулирования (снижения скорости метаногенеза) в промышленных процессах, направленных на получение биогаза.

Такое сочетание всех основных признаков и характеристик, а также компонентов, которые указаны в заявляемом техническом решении, с применяемой последовательностью осуществляемых операций, а именно, растворение в определенных средах установленных компонентов и их внесение до определенных конечных концентраций в среды с метаногенным консорциумом ранее известно не было и позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Способ подавления метаногенеза.

Готовят водный раствор фосфатного буфера (50 мМ, рН 7,5), в котором растворяют навески модифицированного нафтохиноном гумата калия (А), персульфата калия (Б), полигистидинсодержащей органофосфтагидролазы (В) и антимикробного вещества бацитрацина (Г) в такой концентрации, чтобы при внесении полученного комплексного раствора в обрабатываемый объем среды с присутствующим в ней анаэробным метаногенным консорциумом получилась следующая конечная концентрация соответствующих веществ: для А - 5 г/л, для Б - 5 г/л, для В - 4 мг/л, для Г - 100 мг/л.

При последующем экспонировании анаэробного консорциума в течение 7 суток после введения в среду с ним указанных веществ и их концентраций при заданном значении рН происходит подавление метаногенеза. Это характеризуется тем, что снижается скорость образования биогаза за 7 суток на 75%, а содержание метана в биогазе снижается на 100%.

Скорость образования биогаза при этом рассчитывается как отношение объема накопившегося биогаза ко времени накопления (за 7 суток). Процент снижения скорости вычисляется при соотнесении с аналогичным параметром процесса, получаемым без применения заявляемого способа подавления метаногенеза (в контроле).

Получаемое подавление метаногенеза имеет стабильный характер и сохраняется до появления субстрата в среде анаэробного консорциума.

Остальные примеры, реализуемые по аналогии с Примером №1, иллюстрирующие заявляемое техническое решение, сведены в Таблицу 1.

Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет в сравнении с прототипом существенно сократить использование редокс-производного в виде модифицированного гумата калия (в 2-5 раз), снизить эффективность метаногенеза не на 40%, как в прототипе, а на 65-75%, и повысить скорость достижения результата в подавлении метанообразования в 2,3 раза, получив желаемый результат за 7 суток вместо 16, снизив при этом концентрацию метана в составе образующегося биогаза на 92-100%.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ подавления метаногенеза, развивающегося под действием анаэробных метаногенных консорциумов клеток микроорганизмов, продуцирующих биогаз, в средах, включающий внесение модифицированного нафтохиноном гумата калия (А), персульфата калия (Б), фермента полигистидинсодержащей органофосфтагидролазы (В) и антимикробного вещества бацитрацина (Г) так, чтобы их конечные концентрации в среде составляли соответственно для А - 2-5 г/л, для Б - 2-5 г/л, для В - 2-4 мг/л, для Г - 25-100 мг/л, и их введение в обрабатываемые среды для подавления метаногенеза осуществляется во влажном виде, получаемом после их растворения в буферных неорганических растворах с рН 7,5-10,5. Изобретение обеспечивает подавление накопления биогаза и снижение в нем доли метана и может быть применено для регулирования и управления интенсивностью процесса метаногенеза на промышленных биогазовых установках. 1 табл., 1 пр.

Способ подавления метаногенеза, развивающегося под действием анаэробных метаногенных консорциумов клеток микроорганизмов, приводящий к снижению образования биогаза и доли метана в его составе и основанный на применении редокс-производных гуминовых кислот, отличающийся тем, что в среды с клетками микроорганизмов, продуцирующих биогаз, вводят модифицированный нафтохиноном гумат калия (А), персульфат калия (Б), фермент полигистидинсодержащей органофосфтагидролазы (В) и антимикробное вещество бацитрацин (Г) так, чтобы их конечные концентрации в среде составляли соответственно для А - 2-5 г/л, для Б - 2-5 г/л, для В - 2-4 мг/л, для Г - 25-100 мг/л, а само их введение в обрабатываемые среды для подавления метаногенеза осуществляется во влажном виде, получаемом после их растворения в буферных неорганических растворах с рН 7,5-10,5.