Животная модель цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера Российский патент 2022 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области патологической физиологии, а именно к способу создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера. Данная модель характеризуется тем, что увеличение образования амилоидных агрегатов у трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42+(pCL26) mtl-2::GFP]), а также сокращение продолжительности жизни экспериментальных животных, вызывается добавлением в обычную питательную среду следующих двух компонентов: (1) ионов цинка в безвредных для животных концентрациях; (2) синтетического аналога изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого 42-членного бета- амилоида (isoD7-Aβ42).

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется церебральным амилоидогенезом -накоплением в тканях мозга внеклеточных полимерных агрегатов (амилоидных бляшек) [Golde, Т.Е., S.T. DeKosky, and D. Galasko, Alzheimer's disease: The right drug, the right time. Science, 2018. 362(6420): p.1250-1251]. Основным белковым компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоид (Aβ) (включая его изоформы с различной длиной полипептидной цепи и с многочисленными посттрансляционными модификациями) [Masters, C.L. and D.J. Selkoe, Biochemistry of Amyloid β-Protein and Amyloid Deposits in Alzheimer Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2012. 2(6): p.а006262]. Критическим фактором церебрального амилоидогенеза является появление в биологических жидкостях организма изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида 1-42 (isoD7-Aβ42) [Gnoth, K., et al., Targeting isoaspartate-modified Aβ rescues behavioral deficits in transgenic mice with Alzheimer's disease-like pathology. Alzheimer's Research & Therapy, 2020. 12(1): p.149; Kozin, S.A., et al., Peripherally applied synthetic peptide isoAsp7-Aβ(1-42) triggers cerebral β-amyloidosis. Neurotoxicity Research, 2013. 24(3): p.370-376].

В качестве экспериментальных моделей церебрального амилоидогенеза при болезни Альцгеймера используются трансгенные животные, в которых амилоидные бляшки образуются за счет перепроизводства человеческого бета-амилоида в различных тканях, включая нейрон-содержащие. В патенте РФ №2 532 525 публ. 20.06.2014 представлено применение трансгенных мышей линии В6С3-Tg (APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/ J, которым внутривенно вводят препарат isoD7-Aβ42, что приводит к резкому ускорению образования амилоидных бляшек. Этот способ обеспечивает возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования за счет варьирования числа инъекций и/или количества синтетического пептида в одной инъекционной дозе. Однако, как для модели, описанной в патенте РФ №2 532 525, так и для всех других известных к настоящему времени животных моделей, невозможно оценить влияние бинарной комбинации isoD7-Aβ42 и ионов цинка на развитие амилоидоза. Между тем ионы цинка являются ключевым фактором при патогенезе болезни Альцгеймера [Куликова, А.А., А.А. Макаров, and С.А. Козин, Роль ионов цинка и структурного полиморфизма β-амилоида в инициации болезни Альцгеймера. Молекулярная биология, 2015. 49(2): р. 249-263; Friedlich, A.L., et al., Neuronal Zinc Exchange with the Blood Vessel Wall Promotes Cerebral Amyloid Angiopathy in an Animal Model of Alzheimer's Disease. The Journal of Neuroscience, 2004. 24(13): p. 3453-3459]. Более того, ранее было продемонстрировано в экспериментах in vitro, что бинарные комплексы [isoD7-Aβ42 / Цинк] являются потенциальными инициирующими агентами цинк-зависимой олигомеризации эндогенных молекул бета-амилоида при развитии болезни Альцгеймера [Istrate, A.N., et al., Interplay of histidine residues of the Alzheimer's disease Аβ peptide governs its Zn-induced oligomerization. Scientific Reports, 2016. 6: p.21734]. Однако, до настоящего времени не существовало ни одной животной модели, в которой можно было бы наблюдать роль цинк-связанных комплексов с участием изоформ бета-амилоида в амилоидогенезе.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей изобретения является создание животной модели амилоидогенеза, в которой было бы возможным вызывать ускорение появления амилоидных агрегатов под воздействием экзогенных цинк-связанных комплексов с участием изоформ бета-амилоида, и использовать такую модель для тестирования эффективности потенциальных терапевтических агентов, направленных на подавление амилоидогенных свойств таких комплексов.

Настоящее изобретение состоит в использовании цинк-связанных комплексов isoD7-Aβ42 в качестве экзогенных молекулярных агентов, инициирующих резкое ускорение агрегации эндогенных молекул бета-амилоида человека (Аβ) в тканях животных, оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид(Aβ42). Трансгенные нематоды, которые оверэкспрессируют человеческий Аβ, представляют собой популярную животную модель в исследованиях церебрального амилоидогенеза при БА [Alexander, A.G., V. Marfil, and С. Li, Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet, 2014. 5: p. 279; Chen, X., et al., Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central journal, 2015. 9: p. 65-65; Dostal, V. and CD. Link, Assaying β-amyloid toxicity using a transgenic C. elegans model. J Vis Exp, 2010 (44); Ewald, C.Y. and C. Li, Understanding the molecular basis of Alzheimer's disease using a Caenorhabditis elegans model system. Brain structure & function, 2010. 214(2-3): p. 263-283]. У таких нематод по мере старения происходит появление фибриллярных амилоидных бляшек в различных тканях организма, а также наблюдаются многообразные функциональные отклонения, однако, средняя продолжительность жизни животных не изменяется. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что введение isoD7-Aβ42 в организм трансгенных нематод не вызывает никаких эффектов на уровень амилоидоза у этих животных, однако, бинарная смесь isoD7-Аβ42 и ионов цинка при попадании внутрь нематод резко увеличивает амилоидную нагрузку в тканях животных и приводит к значительному сокращению продолжительности жизни нематод.

Преимуществом данного изобретения по сравнению с существующими в настоящее время конституциональными (трансгенными), индуцируемыми и смешанными животными моделями болезни Альцгеймера является возможность контролировать роль цинк-зависимых комплексов в инициировании патологической агрегации эндогенных молекул человеческого бета-амилоида, которые конституционально оверэкспрессируются в организме трансгенных модельных животных. Дополнительным преимуществом данного изобретения является возможность тестировать в животной модели терапевтический потенциал прототипов анти-амилоидных средств лечения болезни Альцгеймера, направленных на подавления цинк-зависимой агрегации бета-амилоида.

Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, заключается в создании животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при болезни Альцгеймера. В рамках настоящего изобретения впервые в мире показано, что комплексы ионов цинка и изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида 1-42 вызывают резкое ускорение образование амилоидных агрегатов у трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvisl4 [(pCL12) unc-54::beta 1-42+(pCL26) mtl-2::GFP] и приводят к значительному сокращению продолжительности жизни животных. Патогенные эффекты таких комплексов полностью нейтрализуются эналаприлатом, образующим, как было показано ранее, тройной комплекс [isoD7-Aβ42 / Цинк / Эналаприлат] [Козин, С.А., et al., Эналаприлат ингибирует цинк-зависимую олигомеризацию металл-связывающего домена изоформ бета-амилоида и защищает клетки нейробластомы человека от их токсического действия. Молекулярная биология, 2018. 52(4): р. 683-691].

Осуществление изобретения

В экспериментах использовались трансгенные нематоды С. elegans CL2120 (dvisl4 [(pCL12) unc-54:: beta 1-42+(pCL26) mtl-2:: GFP]) и С. elegans CL2122 (dvisl5 [(pPD30.38) unc-54 (вектор)+(pCL26) mtl-2::GFP], которые были получены из Центра генетики Caenorhaditis. С червями обращались согласно стандартным методам [Brenner, S., The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics, 1974. 77(1): p.71-94]. Бактерии Е. coli OP50 выращивали в течение ночи в бульоне Лурия-Бертани. На следующий день на чашки с NGM или NGMZn (NGMZn содержит 20 мкм ZnSO4) разливали по 50 мкл бактериальной массы.. Засеянные планшеты инкубировали при 30°С в течение ~ 16 часов, а затем в течение 1-2 часов при 15 или 25°С перед переносом червей.

Для введения в организм нематод пептидов бета-амилоида (Аβ42, isoD7-Aβ42) и Эналаприлата проводили следующие операции: нематоды очищали от нежелательной микрофлоры методом щелочного гипохлорита [Jorgensen, Е.М. and S.E. Mango, The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet, 2002. 3(5): p.356-69], выращивали до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном. Затем примерно 140 животных помещали в каплю 0,2 мл М9-буфера+/- ZnSO4 (20 мкМ)+/- isoD7-Aβ42 (40 мкМ)+/- Эналаприлат (4 мМ) и культивировали в течение 4 часов при 25°С при перемешивании. Далее все содержимое переносили в чашки Петри с NGM или NGMZn с ОР50 и помещали в термостатируемый инкубатор при 25°С. На следующий день червей переносили на аналогичные среды с бактериальным субстратом и определяли продолжительность жизни при 25°С.

Визуализацию и количественный анализ амилоидных отложений у нематод проводили следующим образом: нематод выращивали на среде NGM или NGMZn со штаммом Е. coli ОР50 при 25°С и обрабатывали пептидами (Аβ42, isoD7-Аβ42) и/или Эналаприлатом, как описано выше. На стадии А1 животных окрашивали 1 мМ Х-34 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в 10 мМ Трис рН 8,0 в течение двух часов. Для обесцвечивания их впоследствии культивировали в течение 16 часов на NGM (ионы цинка отсутствуют) или NGMZn (присутствуют ионы цинка) с бактериальным газоном при той же температуре. Окрашенных отдельных червей помещали на предметные стекла в агаре и анестезировали путем инкубации в 0,1% азида натрия. Амилоидные агрегаты в нематодах визуализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия) с использованием лазера 405 нм для возбуждения и полосового эмиссионного фильтра 430-570 с иммерсионным объективом 63х. Для визуализации использовалось стандартное программное обеспечение Las X (Leica Microsystems GmbH, Вецлар, Германия) с плагином для конфокальной визуализации. Полученные изображения были обработаны с помощью программного обеспечения Las X для получения максимальных проекций. Вычитание фона и определение порогового значения были выполнены WCIF ImageJ с идентичными параметрами для всех изображений. Общая площадь бляшек, средняя интенсивность флуоресценции и количество бляшек были определены для каждого червя в анатомической области от переднего конца до задней луковицы животного.

Анализ продолжительности жизни нематод осуществляли по нижеприведенной методике. Продолжительность жизни контролировали при 25°С, как описано ранее [Apfeld, J. and С. Kenyon, Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature, 1999. 402(6763): p. 804-9; 15, Dillin, А., D.K. Crawford, and C. Kenyon, Timing requirements for insulin/IGF-1 signaling in C. elegans. Science, 2002. 298(5594): p.830-4]. Все эксперименты повторялись не менее трех раз, и в каждом эксперименте использовалось ≈130 червей. Во всех случаях черви стадии L4 использовали при t=0 для анализа продолжительности жизни, при этом червей переносили через день на новые чашки с агаром. Черви считались мертвыми, когда они прекращали откачку крови из глотки и не реагировали на протыкание платиновой проволокой. Сбежавшие животные или животные с внутренним вылуплением не включались в расчет продолжительности жизни. Данные были проанализированы, и кривые выживаемости сигмовидной кривой Больцмана были построены с использованием пакета программного обеспечения для статистического анализа SciDAVis. Средняя продолжительность жизни сравнивалась в Microsoft Excel с использованием t-критерия Стьюдента с применением одностороннего распределения и двухвыборочной равной дисперсии [Gusarov, I., et al., Bacterial nitric oxide extends the lifespan of C. elegans. Cell, 2013. 152(4): p. 818-30]. Все графики продолжительности жизни представляют собой совокупность результатов всех независимых экспериментов. Определялось среднее процентное изменение ± стандартное отклонение продолжительности жизни после обработки относительно необработанного контроля.

Повышение амилоидной нагрузки у С.elegans, инкубированных со смесью isoD7-Aβ42 / Zn²⁺, предотвращается при добавлении Эналаприлата. Для выяснения эффектов экзогенного Аβ42, isoD7-Aβ42 и Zn²⁺ был использован трансгенный штамм С.elegans CL2120, характеризующийся сверхэкспрессией пептида Аβ42 человека. Визуализацию амилоидных агрегатов проводили с помощью специфического окрашивания амилоида у живых червей с использованием красителя Х-34. В соответствии с ранее опубликованными данными [Fay, D.S., et al., In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants. J Neurochem, 1998. 71(4): p. 1616-25], наблюдали зависящее от возраста накопление агрегатов Аβ42 в мышечной ткани нематод CL2120 в отличие от контрольного штамма С. elegans CL2122. У червей, подвергшихся воздействию смеси isoD7-Аβ42 / Zn²⁺, площадь, покрытая бляшками, увеличилась на 50%. С другой стороны, в группе, обработанной isoD7-Aβ42 и Zn²⁺ в присутствии Эналаприлата, ни количество бляшек, ни площадь бляшек не отличались от значений в необработанной группе.

Штаммы нематод, сверхэкспрессирующие Aβ42 и контрольные (CL2120 и CL2122, соответственно), имеют сходную продолжительность жизни [Minniti, A.N., et al., Intracellular amyloid formation in muscle cells of Abeta-transgenic Caenorhabditis elegans: determinants and physiological role in copper detoxification. Molecular neurodegeneration, 2009. 4: p.2-2]. Добавление в культуральную среду isoD7-Aβ42 не повлияло на среднюю продолжительность жизни нематод. В присутствии ионов цинка (среда NGMZn) добавление Aβ42 также не влияло на среднюю продолжительность жизни нематод CL2120 и CL2122.

При выращивании контрольных нематод (С.elegans CL2122) как на NGM (в отсутствии ионов цинка), так и на NGMZn (в присутствии ионов цинка) добавление пептида isoD7-Aβ42 не вызывало каких-либо изменений в продолжительности жизни животных. Обработка пептидом isoD7-Aβ42 нематод, сверхэкспрессирующих Аβ42, выращенных на NGM, также не привела к изменению их продолжительности жизни. Однако, одновременное присутствие ионов цинка и пептида isoD7-Aβ42 в культуральной среде привело к снижению средней продолжительности жизни нематод С.elegans CL2120 с 9,00 дней до 7,62 дней (снижение на 15,32%).

В группе контрольных животных (С. elegans CL2122) добавление Эналаприлата не приводило к изменениям продолжительности жизни ни на NGM, ни на NGMZn. У нематод С. elegans CL2120 на NGM Эналаприлат также не влиял на среднюю продолжительность жизни. В то же время присутствие Эналаприлата в среде NGMZn в концентрациях 0,4 мМ и 4 мМ полностью устраняет эффект индуцированного isoD7-Аβ42 сокращения продолжительности жизни нематод.

Таким образом, используя окрашивание, мы обнаружили, что амилоидная нагрузка у нематод С. elegans CL2120, культивируемых на среде с ионами цинка и isoD7-Aβ, на 50% выше, чем у контрольных нематод. Однако, добавление Эналаприлата к бинарной смеси Zn² +и isoD7-Aβ приводит к значительному снижению развития конституциональных бляшек. Авторами настоящего изобретения впервые продемонстрировано, что одновременное присутствие ионов цинка и isoD7-Aβ в рационе трансгенных нематод С. elegans CL2120 приводит к резкому увеличению амилоидоза и значительному сокращению средней продолжительности жизни животных. В то же время, добавление Эналаприлата в питательную среду полностью нейтрализует негативное влияние комбинации ионов цинка и isoD7-Aβ на продолжительность жизни этих нематод (С.elegans CL2120). Полученные результаты впервые показали на животной модели болезни Альцгеймера, что комплексы isoD7-Aβ с Zn² +действуют как триггер патологической агрегации нативных молекул Aβ и приводят к резкому ускорению амилоидогенеза и падению продолжитльности жизни. Используя Эналаприлат, было обнаружено, что молекулярные агенты, блокирующие способность isoD7-Aβ участвовать в цинк-зависимой олигомеризации, могут действовать как потенциальные антиамилоидные терапевтические агенты, которые останавливают развитие патогенеза AD.

Изобретение относится к патологической физиологии и касается создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при патогенезе болезни Альцгеймера. Для этого выращивают трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis 14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42 +(pCL26) mtl-2::GFP]), оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид (Aβ42), до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном Е. coli OP50. Далее помещают нематод в каплю 0,2 мл М9-буфера, содержащего ZnSO₄ 20 мкМ и isoD7-A42 40 мкМ, и культивируют в течение 4 часов при 25°С при перемешивании. Затем переносят капли с нематодами в чашки Петри с NMGZn, с бактериальным газоном E. coli ОР50 и культивируют в чашке Петри при 25°С. Изобретение обеспечивает создание эффективной животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при патогенезе болезни Альцгеймера.

Способ создания животной модели цинк-зависимого амилоидогенеза при развитии болезни Альцгеймера, включающий следующие пять этапов:

1) выращивание трансгенных нематод С. elegans линии CL2120 (dvis 14 [(pCL12) unc-54::beta 1-42 +(pCL26) mtl-2::GFP]), оверэкспрессирующих человеческий 42-членный бета-амилоид (Aβ42), до стадии L4 при 15°С на пластинах NGM с бактериальным газоном Е. coli OP50;

2) помещение нематод в каплю 0,2 мл М9-буфера, содержащего ZnSO₄ 20 мкМ и isoD7-A42 40 мкМ;

3) культивирование нематод в капле в течение 4 часов при 25°С при перемешивании;

4) перенос капли с нематодами в чашки Петри с NMGZn, с бактериальным газоном E. coli ОР50;

5) культивирование нематод в чашке Петри при 25°С.