СПОСОБ МАССОВОЙ НАРАБОТКИ СПОР МИКРОСПОРИДИИ Nosema pyrausta Российский патент 2022 года по МПК A01N63/00 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии и касается производства средств защиты растений, в частности, способа размножения продуцента микробиологических препаратов против опасных сельскохозяйственных вредителей чешуекрылых насекомых-фитофагов.

Микроспоридии - облигатные внутриклеточные паразиты животных, широко распространенные в природе как патогены насекомых [1]. Для значительного числа видов этих паразитов показано ярко выраженное негативное влияние на жизнеспособность, скорость развития, метаморфоз, фертильность и устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды насекомых-хозяев. Микроспоридии способны сохраняться в экосистемах за счет горизонтальной (среди особей одного поколения) и вертикальной (в ряду поколений) передачи [2], а также способности заражать насекомых разных видов, семейств и отрядов. Благодаря постоянной циркуляции в популяциях вредителей сельского и лесного хозяйства, микроспоридии способны существенно ограничивать численность капустной белянки Pieris brassicae, лугового мотылька Loxostege stisticalis, непарного шелкопряда Lymantria dispar и др., предотвращая вспышки их массового размножения [3-5]. Особое значение имеют виды рода Nosema, способные подавлять популяции вредных чешуекрылых различных видов [6-9], в том числе Nosema pyrausta. В природе он выполняет роль важного фактора динамики численности опасного вредителя кукурузы кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis из семейства огневок-травянок Crambidae (Pyraloidea) [10], а в биологической защите растений рассматривается как высоковирулентный агент микробиологической борьбы с другим представителем этого семейства луговым мотыльком [11]. Для контроля этого особо опасного сельскохозяйственного вредителя был создан высоковирулентный штамм N. pyrausta, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЗР под регистрационным номером М-1 ВИЗР [12]. Для массовой наработки спор этого энтомопатогена используется способ искусственного заражения гусениц стеблевых мотыльков рода Ostrinia, с последующим выращиванием зараженных насекомых в лабораторных условиях на модифицированной искусственной питательной среде [13] и выделением спор из куколок, что позволяет получить около 70 млн спор с одной куколки [14].

Данный способ разведения насекомых, как наиболее близкий по совокупности существенных признаков, был использован в качестве прототипа. Его основной недостаток определяется относительно небольшими размерами насекомого-хозяина (размах крыльев имаго составляет от 20 до 25 мм) [16], в результате чего количество спор, получаемых с одной особи, остается неудовлетворительным. При искусственном заражении гусениц других видов чешуекрылых более крупных размеров, а именно большой пчелиной огневки Galleria mellonella [16] и непарного шелкопряда [17], уровень зараженности колебался в пределах 0-20%, при этом в тканях внутренних органов насекомых наблюдались лишь отдельные очаги массовой спорогонии.

Таким образом, техническая проблема, существующая в настоящее время, заключается в низкой продуктивности агента микробиологической защиты растений при культивировании в насекомых. Данное изобретение направлено на решение этой проблемы путем подбора восприимчивого вида насекомого-хозяина более крупных размеров.

Техническим результатом служит значительное повышение продуктивности спор микроспоридии.

Технического результата удается достичь путем использования для массового размножения паразита гусениц другого чешуекрылого, крапивницы обыкновенной Aglais urticae из семейства Nymphalidae, показавшей высокий уровень восприимчивости к паразиту (что проявляется в интенсивном развитии микроспоридии в тканях внутренних органов насекомого при 100%-ной зараженности особей) и при этом обладающей гораздо большими размерами тела (размах крыльев от 45 до 62 мм) [18], нежели мотыльки рода Ostrinia.

Таким образом, технический результат достигается тем, что в способе производства микроспоридии Nosema pyrausta, включающем а) разведение насекомого хозяина в лабораторных условиях; б) искусственное заражение групповым методом гусениц II возраста путем добавления в корм спор N. pyrausta; в) выращивание зараженных гусениц при температуре +24°С в течение 25 дней до окукливания на свежих листьях крапивы и г) выделение спор продуцента из окуклившихся насекомых, предлагается в качестве насекомого-хозяина использовать крапивницу обыкновенную, а в качестве корма для гусениц использовать листья крапивы двудомной.

Авторами в результате длительных исследований удалось установить, что микроспоридия N. pyrausta при скармливании гусеницам крапивницы заражает 100% особей, а продуктивность паразита составляет в среднем 246 млн спор на куколку. Это позволяет повысить продуктивность микроспоридии в среднем в 3.5 раза.

Пример 1. Получение биомассы микроспоридии Nosema pyrausta

Яйца и гусениц I возраста крапивницы обыкновенной собирали в естественных местообитаниях на крапиве обыкновенной. Насекомых транспортировали в лабораторию, содержали в стеклянных сосудах объемом 3 л, накрытых слоем хлопчатобумажной ткани, зафиксированной резинкой, и кормили свежими листьями крапивы.

Группы гусениц II возраста в количестве 20 особей через 1-2 дня после линьки помещали в стеклянные банки объемом 0.5 л, накрытые слоем хлопчатобумажной ткани, зафиксированной резинкой, и оставляли на 4 часа без корма. Споры микроспоридии N. pyrausta из расчета 1 млн спор на гусеницу наносили с двух сторон на лист крапивы площадью около 5 см², черешок листа помещали в стеклянный флакон объемом 10 мл с водой и заматывали пищевой пленкой. Флакон с листом помещали в банку с гусеницами до полного потребления контаминированного корма, после чего кормили гусениц свежими листьями крапивы без добавления спор. Насекомых содержали при температуре +24°С и фотопериоде 18С:6Т в течение 25 дней. Выживших куколок отбирали через 3-5 дней после окукливания и хранили в холодильнике в течение 5-10 дней.

Для количественной характеристики различий размеров куколок двух видов насекомых проведено измерение длины и ширины, показавшее, что по обоим показателям куколки крапивницы обыкновенной в 1.6 раза длиннее и в 2.2 раза шире, чем куколки стеблевого мотылька. При этом отношение длины к ширине у куколок первого вида составляет 3.3, у второго 4.9, то есть куколки стеблевого мотылька более вытянутые, а крапивницы более объемные (Таблица 1).

Насекомых индивидуально помещали в пластиковую пробирку объемом 1.5 мл, добавляли 100 мкл дистиллированной воды и гомогенизировали пластиковым пестиком в течение 30 сек. Пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, отбирали аликвоту объемом 10 мкл для подсчета количества полученных спор в камере Горяева. Основную массу спор центрифугировали, как описано выше, чтобы сформировать осадок для длительного хранения, который в дальнейшем может быть использован для заражения насекомых. Данным методом получали от 4 до 625 млн спор на особь, в среднем 246±54.3 млн на куколку (количество проанализированных насекомых N=12). Полученные данные сравнивали с таковыми, полученными ранее на стеблевом мотыльке рода Ostrinia, где количество спор составляло в среднем 70 спор на куколку [14]. Выявленные различия в споропродуктивности микроспоридии при размножении на крапивнице обыкновенной по сравнению со стеблевым мотыльком статистически достоверны на 1%-ном уровне значимости (Таблица 2).

Таким образом, при использовании предлагаемого способа размножения микроспоридии N. pyrausta достигается высокая споропродуктивность паразита, многократно превышающая таковую при использовании аналога, в частности, способа размножения микроспоридии на гусеницах Ostrinia (Таблица 2, строка 1), благодаря использованию восприимчивого вида насекомых более крупных размеров. Продуктивность N. pyrausta, выраженная как количество спор, образующихся на 1 особь насекомого-хозяина, при размножении в гусеницах крапивницы обыкновенной выше в 3.5 раза по сравнению с гусеницами стеблевого мотылька. Данный способ может быть рекомендован для производства спор микроспоридии, перспективной для защиты сельскохозяйственных культур от лугового мотылька L. sticticalis [11] и стеблевых мотыльков рода Ostrinia [10].

Список литературы:

1. Becnel J.J., Andreadis T.G. Microsporidia in insects. In: The Microsporidia and Microsporidiosis (Eds. M. Wittner and L. M. Weiss). ASM Press, Washington D. 1999. P. 447-501.

2. Исси И.В. Развитие микроспоридиологии в России. Вестник защиты растений. 2020. Вып. 103 (3). С. 161-176.

3. Токарев Ю.С., Малыш Ю.М., Дубинина Е.В., Алексеев А.Н., Фролов А.Н., Исси И.В. Значение микроспоридий для микробиологического контроля численности вредных членистоногих. Защита и карантин растений. 2007. №. 12. С. 14-16.

4. Фролов А.Н., Малыш Ю.М., Токарев Ю.С. Особенности биологии и прогнозирования динамики численности лугового мотылька Pyrausta sticticalis L. (Lepidoptera, Pyraustidae) в период низкой его численности в Краснодарском крае. Энтомологическое обозрение. 2008. Т. 87 (2). С. 291-302.

5. Sorter L.F., Maddox J.V., McManus M.L. Host specificity of microsporidia (Protista: Microspora) from European populations of Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) to indigenous North American Lepidoptera. Journal of Invertebrate Pathology. 1997. V. 69. P. 135-150.

6. Franz J.M., Huger A.M. Microsporidia causing the collapse of an outbreak of the green tortrix Tortrix viridana L. in Germany. Proc. Int. Colloq. Insect Pathol. 4th College Park, MD, 1971. P. 48-53.

7. Wilson G.G. Incidence of microsporidia in a field population of a spruce budworm. Can For Serv. Bi-monthly Res. Notes. 1973. V. 29. P. 35-60.

8. Lipa J.J. Microsporidians parasitizing the green tortrix in Poland and their role in the collapse of the tortrix outbreak in Puszcza Niepolomicka during 1970-1974. Acta Protozoologica. 1976. V. 15. P. 529-536.

9. Simoes R.A., Feliciano J.R., Solter L.F., Delalibera I.Jr. Impacts of Nosema sp. (Microsporidia: Nosematidae) on the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Journal of Invertebrate Pathology. 2015. V. 129. P. 7-12.

10. Lewis L.C., Brack D.J., Prasifka J.R., Raun E.S. Nosema pyrausta: its biology, history, and potential role in a landscape of transgenic insecticidal crops. Biological Control. 2009. V. 48 (3). P. 223-231.

11. Malysh J.M., Chertkova E.A., Tokarev Y.S. The microsporidium Nosema pyrausta as a potent microbial control agent of the beet webworm Loxostege sticticalis. Journal of Invertebrate Pathology. 2021. V. 186:107675.

12. Токарев Ю.С., Малыш Ю.М., Конончук А.Г., Грушевая И.В., Берим М.Н., Фролов А.Н. Штамм микроспоридии Nosema pyrausta для борьбы с луговым мотыльком Loxostege sticticalis. Патент РФ 2705003. 2019.

13. Frolov A.N., Berim M.N., Grushevaya I.V. Rearing of trilobed male uncus Ostrinia species in laboratory for experimental purposes. Plant Protection News. 2019. V. 3. P. 58-62.

14. Токарев Ю.С., Малыш Ю.М., Грушевая И.В., Фролов А.Н. Способ производства спор микроспоридии Nosema pyrausta. Патент РФ 2753055. 2021.

15. https://en.wikipedia.org/wiki/European_corn_borer

16. Tokarev Y.S., Grizanova E.V., Ignatieva A.N., Dubovskiy I.M. Greater wax moth Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) as a resistant model host for Nosema pyrausta (Microsporidia: Nosematidae). Journal of Invertebrate Pathology. 2018. V. 157. P. 1-3.

17. Kononchuk A.G., Martemyanov V.V., Ignatieva A.N., Belousova I.A., Inoue M.N., Tokarev Y.S. Susceptibility of the Gypsy Moth Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae) to Nosema pyrausta (Microsporidia: Nosematidae). Insects. 2021. V. 12, 447.

18. https://en.wikipedia.org/wiki/Small_tortoiseshell

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к контролю численности особо опасных сельскохозяйственных вредителей. Способ включает выращивание гусениц крапивницы обыкновенной Aglais urticae, искусственно зараженных спорами микроспоридии Nosema pyrausta, на естественном корме (свежие листья крапивы двудомной). Выращивание ведут при температуре +24°С в течение 25 дней, после чего выделяют споры продуцента из окуклившихся насекомых. Изобретение позволяет многократно повысить продуктивность микроспоридии N. pyrausta. 2 табл.

Способ массовой наработки спор микроспоридии Nosema pyrausta, включающий культивирование насекомого-хозяина в лабораторных условиях, искусственное заражение групповым методом гусениц II возраста путем нанесения спор N. pyrausta в дозировке 1 млн спор/гусеницу на корм и предоставления этого корма гусеницам до полного потребления, выращивание до гибели или окукливания искусственно зараженных гусениц при температуре +24°С в течение 25 дней и выделение спор продуцента из насекомых методом гомогенизирования в дистиллированной воде и центрифугирования гомогената с последующим хранением полученного осадка спор под слоем воды при +4°С, отличающийся тем, что в качестве насекомого-хозяина используется крапивница обыкновенная Aglais urticae, гусеницы которой выращиваются на естественном корме – свежих листьях крапивы двудомной.