СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СПОР МИКРОСПОРИДИИ Nosema pyrausta Российский патент 2021 года по МПК C12N3/00 C12N1/14 A01N63/30 

Изобретение относится к биотехнологии и касается производства средств защиты растений, в частности, способа размножения продуцента микробиологических препаратов против опасных сельскохозяйственных вредителей чешуекрылых насекомых-фитофагов.

Микроспоридии известны своей высокой патогенностью для насекомых, и многие виды этих паразитов снижают показатели жизнеспособности, репродуктивной активности и устойчивости к негативным факторам внешней среды и длительное время сохраняются в популяциях насекомых-хозяев благодаря горизонтальной (среди особей одного поколения) и вертикальной (в ряду поколений) передачи за счет разнообразных способов заражения насекомых (Becnel, Andreadis, 1999 [1]). Это позволяет достигать долговременного эффекта на популяции вредителей сельского и лесного хозяйства, таких как капустная белянка Pieris brassicae, луговой мотылек Loxostege stisticalis, непарный шелкопряд Lymantria dispar и др. [2-4]. В частности, виды рода Nosema имеют важное значение в ограничении численности вредных чешуекрылых, среди которых еловая листовертка-почкоед Choristoneura fumiferanae [5-7], а также вредитель сахарного тростника Diatraea saccharalis [8].

Микроспоридия Nosema pyrausta - важный фактор динамики численности опасного вредителя кукурузы кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis из семейства огневок-травянок Crambidae (Pyraloidea) [9]. Кроме того, данный патоген проявляет высокую биологическую эффективность по отношению к другому представителю указанного семейства особо опасному сельскохозяйственному вредителю луговому мотыльку Loxostege sticticalis, для борьбы с которым был создан высоковирулентный штамм N. pyrausta, депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЗР под регистрационным номером М-1 ВИЗР. Для массовой наработки спор этого энтомопатогена используется способ искусственного заражения гусениц типового хозяина кукурузного мотылька, с последующим выращиванием зараженных насекомых в лабораторных условиях и выделением спор из куколок, что позволяет получить около 50 млн спор с одной куколки [10].

Для выкармливания насекомых на стадии гусеницы используется стандартный состав искусственной питательной среды (ИПС), включающий кукурузную муку, зародыши пшеницы, пивные дрожжи, комплекс витаминов, агара, антибиотики на 1 л воды [11].

Данный способ разведения насекомых, как наиболее близкий по совокупности существенных признаков, был использован в качестве прототипа. Его основной недостаток - сравнительно низкая продуктивность агента микробиологической защиты растений.

Таким образом, технической проблемой, существующей в настоящее время, является низкая продуктивность агента микробиологической защиты растений при разведении зараженных насекомых. Данное изобретение направлено на решение этой проблемы путем создания способа с повышенным выходом спор микроспоридии N. pyrausta в расчете на 1 куколку насекомого-хозяина.

Техническим результатом является значительное повышение продуктивности спор микроспоридии.

Технического результата удается достичь путем повышения питательной ценности кормового субстрата за счет частичной замены одного из компонентов, кукурузной муки, на соевую муку, которая характеризуется аминокислотным составом, близким к таковому продуктов животного происхождения [12].

Таким образом, технический результат достигается тем, что в способе производства спор микроспоридии Nosema pyrausta для борьбы с многоядными чешуекрылыми вредителями, включающем выращивание искусственно зараженных гусениц кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis при температуре +24°С в течение 30 дней на агаризованной питательной среде, содержащей крупяную муку, пшеничные отруби, дрожжевой экстракт и смесь витаминов и антибиотиков, и выделение спор продуцента из окуклившихся насекомых, предлагается в качестве крупяной муки использовать кукурузную и соевую муку в соотношении 1:1.

Дополнительным отличием способа является то, что состав компонентов агаризованной питательный среду следующий, в масс %:

Кукурузная мука 6,5% Соевая мука 6,5% Зародыши пшеницы 3,0% Агар агар 1,6% Пивные дрожжи 4,8% Аскорбиновая кислота 0,5% Бензойная кислота 0,2% Смесь поливитаминов 0,2% Канамицин 0,01% Нистатин 0,0111% Аугментин 0,02% Дистиллированная вода остальное

Авторами в результате длительных исследований удалось установить, что насекомые, выкармливаемые на ИПС с добавлением сои (ИПС-соя), быстрее набирают вес, в результате чего образуются более крупные куколки, содержащие в среднем 70 млн спор на куколку. Это позволяет повысить продуктивность спор микроспоридии в среднем на 35%.

Пример 1. Получение биомассы микроспоридии Nosema pyrausta

Яйца кукурузного мотылька Ostrinia furnacalis из постоянной лабораторной культуры помещали на слой стандартной агаризованной ИПС (таблица 1), разлитой в стеклянные сосуды объемом 0.5 л, которые ставили вверх дном, потому что отродившиеся гусеницы перемещаются вверх из-за отрицательной геотаксической реакции, что позволяет им быстро находить корм.

Группы гусениц II возраста в количестве 25 особей через 1-3 дня после линьки отсаживали на сложенный в несколько слоев отрезок листа офисной бумаги в герметично закрытую емкость на 2 часа без корма. Споры микроспоридии N. pyrausta в количестве 2.5×10⁶ смешивали с порцией ИПС массой 0.5 г и прилепляли на дно стеклянного сосуда банки объемом 0.5 л. В банку с кормом, содержащим споры, пересаживали ранее отсаженных гусениц, банку накрывали слоем плотной ткани, фиксировали резинкой и переворачивали вверх дном. После полного потребления корма со спорами гусениц пересаживали в банки со стандартной ИПС или с ИПС-соя (Таблица 2) и содержали при температуре +24°С и фотопериоде 18С:6Т в течение 20-30 дней до окукливания. Выживших куколок отбирали через 3-5 дней после окукливания, и хранили в холодильнике в течение 5-10 дней. Куколок индивидуально помещали в пластиковую пробирку Эппендорфа объемом 1.5 мл, добавляли 100 мкл дистиллированной воды и гомогенизировали пластиковым пестиком в течение 30 сек. Пробирки центрифугировали при 4000 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость декантировали, осадок ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды и подсчитывали концентрацию спор в камере Горяева. Данным методом получали от 23 до 80 млн спор на куколку, в среднем 52.0±3.51 млн (количество проанализированных насекомых N=20), при выкармливании гусениц на стандартной ИПС; и от 19 до 128 млн спор на куколку, в среднем 69.9±6.79 млн спор (N=19). Выявленные различия в споропродуктивности микроспоридии при выкармливании насекомого-хозяина на ИПС различного состава статистически достоверны на 5%-ном уровне значимости.

Таким образом, при использовании предлагаемого способа размножения микроспоридии N. pyrausta достигается высокая споропродуктивность паразита, значительно превышающая таковую при использовании аналога, в частности, способа выращивания зараженных гусениц на стандартной ИПС (Таблица 2, строка 1). Продуктивность N. pyrausta, выраженная как количество спор, образующихся на 1 куколку насекомого-хозяина, при выращивании насекомых на ИПС с добавлением сои выше на 35% по сравнению со стандартной ИПС. Данный способ может быть рекомендован для производства спор микроспоридии, перспективной для защиты сельскохозяйственных культур от многоядных чешуекрылых вредителей семейства Crambidae.

Список литературы:

1. Becnel J.J., Andreadis T.G. Microspridia in insects. In: The Microsporidia and Microsporidiosis (Eds. M. Wittner and L. M. Weiss). ASM Press, Washington D. 1999. P. 447-501.

2. Токарев Ю.С., Малыш Ю.М., Дубинина Ε.В., Алексеев А.Н., Фролов Α.Η., Исси И.В. Значение микроспоридий для микробиологического контроля численности вредных членистоногих. Защита и карантин растений. 2007. V. 12. Р. 14-16.

3. Фролов А.Н., Малыш Ю.М., Токарев Ю.С.Особенности биологии и прогнозирования динамики численности лугового мотылька Pyrausta sticticalis L. (Lepidoptera, Pyraustidae) в период низкой его численности в Краснодарском крае. Энтомологическое обозрение. 2008. V. 87(2). Р. 291-302.

4. Solter L.F., Maddox J.V., McManus M.L. Host specificity of microsporidia (Protista: Microspora) from European populations of Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) to indigenous North American Lepidoptera. Journal of Invertebrate Pathology. 1997. V. 69. P. 135-150.

5. Franz J.M., Huger A.M. Microsporidia causing the collapse of an outbreak of the green tortrix Tortrix viridana L. in Germany. Proc. Int. Colloq. Insect Pathol. 4th College Park, MD, 1971. P. 48-53.

6. Wilson G.G. Incidence of microsporidia in a field population of a spruce budworm. Can For Serv. Bi-monthly Res. Notes. 1973. V. 29. P. 35-60.

7. Lipa J.J. Microsporidians parasitizing the green tortrix in Poland and their role in the collapse of the tortrix outbreak in Puszcza Niepolomicka during 1970-1974. Acta Protozoologica. 1976. V. 15. P. 529-536.

8. Simoes R.A., Feliciano J.R., Solter L.F., Delalibera I.Jr. Impacts of Nosema sp.(Microsporidia: Nosematidae) on the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). J. Invertebr. Pathol. 2015. V. 129. P. 7-12.

9. Lewis L.C., Brack D.J., Prasifka J.R., Raun E.S. Nosema pyrausta: its biology, history, and potential role in a landscape of transgenic insecticidal crops. Biological Control. 2009. V 48(3). P. 223-231.

10. Токарев Ю.С, Малыш Ю.М., Конончук А.Г., Грушевая И.В., Берим Μ.Η., Фролов А.Н. Штамм микроспоридии Nosema pyrausta для борьбы с луговым мотыльком Loxostege sticticalis. Патент РФ 2705003. 2019.

11. Frolov A.N., Berim Μ.Ν., Grushevaya I.V. Rearing of trilobed male uncus Ostrinia species in laboratory for experimental purposes. Plant Protection News. 2019. V. 3. P. 58-62.

12. Петибская B.C. Соя: химический состав и использование. Майкоп.2012. 432 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ производства спор микроспоридии Nosema pyrausta включает разведение стеблевых мотыльков рода Ostrinia в лабораторных условиях, искусственное заражение групповым методом гусениц II возраста путем добавления в корм спор Nosema pyrausta в количестве 1*10⁵ спор на гусеницу и полное потребление корма гусеницами. Проводят выращивание до окукливания искусственно зараженных гусениц кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis при температуре +24°С в течение 20-30 дней на агаризованной питательной среде, содержащей кукурузную муку, соевую муку, зародыши пшеницы, агар-агар, пивные дрожжи, аскорбиновую кислоту, бензойную кислоту, смесь поливитаминов, канамицин, нистатин, аугментин и дистиллированную воду в заданных соотношениях компонентов. Осуществляют выделение спор Nosema pyrausta из куколок мотылька путем гомогенизации куколок в дистиллированной воде, отделения надосадочной жидкости центрифугированием, ресуспендированием осадка в дистиллированной воде с получением спор. Изобретение позволяет повысить продуктивность микроспоридии N. pyrausta. 2 табл., 1 пр.

Способ производства спор микроспоридии Nosema pyrausta, включающий разведение стеблевых мотыльков рода Ostrinia в лабораторных условиях, искусственное заражение групповым методом гусениц II возраста путем добавления в корм спор Nosema pyrausta в количестве 1*10⁵ спор на гусеницу, полное потребление корма гусеницами, выращивание до окукливания искусственно зараженных гусениц кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis при температуре +24°С в течение 20-30 дней на агаризованной питательной среде, выделение спор Nosema pyrausta из куколок мотылька путем гомогенизации куколок в дистиллированной воде, отделение надосадочной жидкости центрифугированием, ресуспендирование осадка в дистиллированной воде с получением спор , при этом в качестве агаризованной питательной среды используют среду, имеющую следующий состав компонентов, масс%:

кукурузная мука 6,5 % соевая мука 6,5 % зародыши пшеницы 3,0 % агар-агар 1, 6 % пивные дрожжи 4,8 % аскорбиновая кислота 0,5 % бензойная кислота 0,2 % смесь поливитаминов 0.2 % канамицин 0.01 % нистатин 0.0111 % аугментин 0.02 % дистиллированная вода остальное