Штамм вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw и инсектицидный препарат на его основе Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного и сельского хозяйства на основе нового штамма вируса цитоплазматического полиэдроза (ВЦП), патогенного для личинок сибирского шелкопряда (СШ), являющихся опасным вредителем лиственничных, пихтовых и кедровых лесов.

Вирус цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда (Dendrolimus sibiricus Tschetw cytoplasmic polyhedrosis virus) относится к роду Циповирусов (Cypovirus) семейства реовирусы, (Reoviridae).

Первый вирусный препарат против сибирского шелкопряда появился в России после поездки группы исследователей в Японию, откуда был привезен мацукемин - препарат на основе вируса цитоплазматического полиэдроза (Голосова М.А. Насекомые - вредители леса. Биологическое регулирование популяций. М.: МГУЛ, 2004. 189 с. [Golosova Μ.Α. Nasekomye - vrediteli lesa. Biologicheskoe regulirovanie populyatsiy (Insects -forest pests. Biological control of populations). Moscow: MGUL (Moscow St. Univ. For.), 2004. 189 p. (in Russian)].). Японский опыт показал, что в принципе получение эффективного вирусного препарата для защиты от коконопрядов рода Dendrolimus возможно.

Работы по созданию отечественного препарата в России на основе вируса цитоплазматического полиэдроза не предпринимались.

В Китае имеется опыт масштабного производства и применения вирусного препарата против шелкопрядов рода Dendrolimus на основе вируса цитоплазматического полиэдроза D. punctatus (Sun X., Peng Η. Resent advances in biological control of pest insect by using viruses in China // Recent development in research and application of viruses in forest health protection. Pushkino, Beijing, 2010. P. 96-102.). В этом обзоре описаны последние достижения в разработке диких и генетически модифицированных вирусов в качестве инсектицидов. Рассмотрена новая стратегия применения вирусов насекомых в Китае. Опубликовано сообщение о циповирусе (CPV), произведенном в Китае для борьбы с Dendrolimus punctatus, насекомым-вредителем сосновых лесов.

Известен штамм вируса цитоплазматического полиэдроза Clanis bilineata tsingtauica (патент Китая № CN 112961838, МПК C12N 7/00; A01N 63/00, опубликовано 15.06.2021), который предназначен для получения инсектицидного препарата и характеризуется тем, что он депонирован в Китайской Коллекции культур, адрес депонирования является Центр сбора культур китайского типа Уханьского университета, Ухань, Китай, дата депонирования - 29 сентября 2020 года, название объекта - вирус цитоплазматического полиэдроза Clanis bilineata tsingtauica (CbCPV), и номер депозита ССТСС NO: V202064. Clanis bilineata tsingtauica, бархатный бражник с двумя линиями, является мотыльком семейства Sphingidae - главный вредитель соевых бобов в Китае, часто уничтожающий целые поля. Вирус цитоплазматического полиэдроза Clanis bilineata tsingtauica может эффективно контролировать вред, причиняемый Clanis bilineata tsingtauica, непрерывно действует после однократного применения в течение двух-трех лет, удобен в производстве. Вирус цитоплазматического полиэдроза обычно имеет широкий круг хозяев, т.е. обладает сильной инсектицидной способностью не только против изолированного насекомого-хозяина Sphingidae, но также может убивать других насекомых семейства Sphingidae. После 1 года непрерывного использования в течение 2-3 лет на участке больше не будет вспышек вредителей; трупы личинок, размножающихся штаммом вируса, не будут разжижаться, что позволяет избежать корма для других насекомых или фекальных загрязнений.

Однако известный штамм-прототип не поражает личинки насекомых сибирского шелкопряда.

Наиболее близким аналогом (прототипом) по назначению является штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. kurstaki для получения препарата лепидоцида, активного против гусениц шелкопрядов, в том числе против сибирского шелкопряда, депонированный в коллекции ВКПМ №В-5351 (авторское свидетельство СССР №1784156, МПК A01N 63/00, опубл. 30.12.1992 г.)

Техническим результатом является создание штамма вируса цитоплазматического полиэдроза (ВЦП), более активного и эффективного против личинок сибирского шелкопряда (СШ), являющихся опасным вредителем хвойных лесов и препарата на основе указанного штамма.

Указанный технический результат достигается созданием штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw, используемого для получения инсектицидного препарата и депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1109. Дата регистрации 16.09.2021 г.

Указанный технический результат достигается также созданием инсектицидного препарата против сибирского шелкопряда, содержащим в 1 мл раствора: суспензию штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw по п. 1 с титром 2-6×10⁹ полиэдров/мл; глицерин 0,05-0,1 мл; сорбат калия 1,0-2,0 мг; натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 5,0-10,0 мг; аскорбиновая кислота 0,6-0,8 мг; вода остальное до 1 мл.

Вирус относится к виду цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда (Dendrolimus sibiricus cypovirus 1), к роду цитоплазматического полиэдроза (Cypovirus), семейству Реовирусы (Reoviridae).

Реовирусы - семейство голых вирусов с вирионами кубической симметрии, содержащими двуцепочечную фрагментированную РНК в качестве генома. Вирус поражает клетки эпителия средней кишки гусеницы, где образует полиэдры (цитоплазматические белковые включения, состоящие массу вирионов). Вирус в полиэдрах стойко выдерживает внешние воздействия, изолированные же из них вирионы более чувствительны. Это в особенности относится к спирту, хлороформу, дезоксихолевой (желчной) кислоте, но не к эфиру и не к щелочи (рН 11) или к комнатной температуре, действие которых они сравнительно хорошо переносят.

Штамм ВЦПСШ-01 выделен в 2020 г. Объект выделения и способ выделения: погибшая личинка сибирского шелкопряда собранная в Красноярском крае; гомогенат гусеницы. Место выделения (место взятия биопробы): Красноярский край, Ибрейский район, в сосновом бору расположенном в 18 км на юго-востоке от д. Степановка (55.059652° с. ш., 96.050832° в.д.).

Способ получения штамма. Штамм идентифицирован в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, р.п. Кольцово в январе 2021 года. Выделение осуществлялось путем слепого двукратного пассирования образца на личинках (Dendrolimus sibiricus Tsch.) путем заражения per os и приготовления гомогената из погибших личинок после каждого пассажа. Идентификация проводилась в марте 2021 года в отделе «Коллекция микроорганизмов». Получена полногеномная последовательность штамма с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina MiSeq. Среднее покрытие 10 сегментов составило 1924-7894. Сборка генома проводилась картированием на референс-последовательность с помощью алгоритма BWA (v. 0.7.15).

Пассажная история штамма. Штамм прошел 2 пассажа при заражении гусениц сибирского шелкопряда лабораторной линии перорально.

Характеристика штамма.

Культурально-морфологические особенности штамма. Размеры полиэдров (мкм): ∅ 0,8-1,5 мкм, размеры вирионов (нм): 90 нуклеокапсидов, 40 нм. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью, хорошо хранится при плюс 4°С. Возможно культивирование вируса in vivo на личинках непарного шелкопряда Lymantria dispar L.

Способ, условия и состав сред для размножения. Штамм вируса цитоплазматического полиэдроза ВЦПСШ-01 размножают путем инфицирования личинок непарного шелкопряда и дальнейшего их содержания при температуре 25°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) в течение 18 суток. Состав ИПС: соевая мука - 15 г, кукурузная мука - 75 г, дрожжи кормовые - 30 г, аскорбиновая кислота - 4,5 г, бензойная кислота - 5,0 мл, агар - 6 г, вода дистиллированная - 351 мл.

Активность (продуктивность) штамма (с указанием условий культивирования). Выход вируса составляет 5×10⁸ полиэдров на гусеницу при его культивировании на личинках Lymantria dispar L. 4-го возраста.

Биохимическая активность. Чувствителен к спирту, формалину, хлорамину, хлороформу; нечувствителен к эфиру.

Серологические свойства: 34 полипептида, М.в. основных: от 18 до 75 МД.

Генетические характеристики штамма [установленные нуклеотидные последовательности генома штамма (длина и позиции генома, литературные ссылки на публикацию установленных нуклеотидных последовательностей, номер в GeneBank,)]. Фрагментированная двуцепочечная РНК кольцевая ковалентнозамкнутая. Длина генома 24731 п.н. Доля GC - 43.28%. Установлены сайты рестрикции (количество) для HindIII - 6, EcoRI - 9, PstI - 4, BamH1 - 4. Ближайшая опубликованная полная последовательность - AY163247.1 AY147187.1 AY167578.1 AF542082.1 AY163248.1 AY163249.1 AY211092.1 AY211091.1 AY211093.1 AY211094.1 (Dendrolimus punctatus cypovirus 1) - 673 замены.

Вирулентность (патогенность). Группа патогенности для человека по российской классификации: не патогенен.

Патогенность для животных. Высоко патогенен для личинок сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tsch и непарного шелкопряда Lymantria dispar L.

Патогенность для растений: не патогенен.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

1. Лиофильное высушивание и дальнейшее хранение при Т=4°С.

2. В погибших гусеницах, помещенных в 50% водный раствор глицерина при Т=4°С.

Дата и результат последней проверки жизнеспособности культуры. 12-25.05.2021 г. ЛД₅₀=2×10⁴ полиэдров/гусеницу. Активность штамма вируса цитоплазматического полиэдроза ВЦПСШ-01 проверяли путем инфицирования личинок непарного шелкопряда и дальнейшего их содержания при температуре 25°С и влажности 60% на ИПС в течение 18 суток.

Дата предполагаемого пересева планируется в мае 2026 года. Штамм ВЦПСШ-01 следует пересеять путем инфицирования личинок непарного шелкопряда и дальнейшего их содержания при температуре 25°С и влажности 60% на ИПС.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены гусеницы, погибшие от вируса ВЦПСШ-01. а) личинка последнего возраста D. sibiricus larva; b) личинки среднего возраста D. sibiricus, погибшие в эксперименте; с) Мертвые личинки М. sexta последнего возраста, погибшие в эксперименте. На фиг. 2 представлены микрофотографии штамма вируса ВЦПСШ-01: а) световая микроскопия; b) световая микроскопия с использованием контраста Номарского; с) просвечивающая электронная микроскопия. На фиг. 3 приведены выравнивания последовательностей всего генома между D. sibiricus ВЦПСШ-01 и доступными полными геномами других вирусов ЦПСШ типа 1. Расхождение в последовательностях обозначены штриховкой более темного цвета. (b) Проведенное методом максимального правдоподобия оценка топологического несоответствия между деревьями сегментов 2 и 3, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) и структурный белок VP3, соответственно. На фиг. 4 представлена вирулентность штамма ВЦПСШ-01 для личинок второго возраста D. sibiricus и L. dispar. а) ЛД₅₀; b) ЛВ₅₀ - На фиг. 5. приведена динамика смертности личинок D. sibiricus после заражения штаммом ВЦПСШ-01. На фиг. 6 представлен диапазон хозяев ВЦПСШ-01, нанесенный на карту филогенетического древа чешуекрылых. Исходное дерево максимального правдоподобия было взято из [Kawahara, A. Y. et al. Phylogenomics reveals the evolutionary timing and pattern of butterflies and moths. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 22657-22663 (2019)] и свернуто до уровня семьи / суперсемейства. Статус анализируемых видов чешуекрылых обозначен красными (восприимчивые виды) и серыми (устойчивые виды) кружками на листьях соответствующего семейства. Немонофилетические надсемейства обозначены звездочками. Синие полосы отображают 95%-ные интервалы достоверности возраста узла.

Ниже приведены примеры исследования заявляемого штамма ВЦПСШ-01 и сравнение его активности против личинок сибирского шелкопряда с наиболее близким аналогом по назначению.

Пример 1. Выделение вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда (Dendrolimus sibiricus cypovirus 1).

Вирус был выделен из мертвых личинок Dendrolimus sibiricus, собранных в 2020 году в елово-кедровых лесах, расположенных в предгорьях Восточных Саян (55,059652° Северной широты, 96,050832° Восточной долготы). Мертвые личинки не разжижались, что указывает на отсутствие вируса ядерного полиэдроза NPV (фиг. 1а). Первая идентификация вируса была проведена путем микроскопического анализа содержимого мертвых личинок на гистологическом предметном стекле. Для последующих манипуляций с вирусом мертвые личинки гомогенизировали в дистиллированной воде, а затем полиэдры вируса отделяли от грубых остатков фильтрованием через марлю с последующим центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Полученные образцы вируса затем использовали для электронной микроскопии, геномного секвенирования и биотестов.

Пример 2. Световая микроскопия.

Водную суспензию полиэдров исследовали под световым микроскопом (Axioscope 40, Carl Zeiss, Германия) с использованием иммерсионного масла при 1000-кратном увеличении. Для лучшей визуализации формы цитоплазматических полиэдров был использован контраст Номарского. Световой микроскопический анализ мертвых личинок выявил множество полиэдров с размером 1,0-2,0 мкм (фиг. 2 а,б).

Пример 3. Электронная микроскопия.

Выделенные цитоплазматические полиэдры фиксировали в суспензии путем добавления равного объема 8% раствора параформальдегида. Смесь инкубировали при 4°С в течение 24 ч. Затем полиэдры промывали раствором Хэнка, дополнительно фиксировали 1%-ным раствором осминовой кислоты, обезвоживали в возрастающих концентрациях этанола и ацетона и заделывали в смесь Эпон-аралдит. Полутонкие и ультратонкие срезы были получены на микротоме Райхерта-Юнга (Австрия). Полутонкие срезы окрашивали раствором azure-II, рассматривали под световым микроскопом Axiolmager Z1 (ZEISS, Германия) и отбирали интересующие области для последующего ультраструктурного анализа. Ультратонкие срезы были окрашены уранилацетатом и цитратом свинца. Электронную микроскопию проводили с использованием электронного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония). Фотографии были сделаны цифровой камерой Veleta (SIS, Германия). Анализ изображений проводился с помощью программного обеспечения iTEM (SIS, Германия).

Просвечивающая электронная микроскопия подтвердила наличие сферических вирусных частиц (со средним размером 50-60 нм), закрытых кристаллическим белком, который типичен для рода CPV. Многогранники имели разную форму (фиг. 2с).

Пример 4. Полное секвенирование генома.

Нуклеиновые кислоты экстрагировали из очищенных вирусных многогранников с использованием реагента ExtractRNA (ЗАО "Евроген", Россия) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве коосадителя использовали два микролитра водного раствора гликогена (20 мг/мл). Осадок растворяли в 30 мкл деионизированной воды и использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции для синтеза кДНК в соответствии с протоколом SISPA (независимая от последовательности амплификация с одним праймером) и согласно методике приведенной в статье Djikeng А. и др. [Djikeng Α., Halpin R., Kuzmickas R., Depasse J., Feldblyum J., Sengamalay N., Afonso C, Zhang X., Anderson N.G., and Ghedin E. Viral genome sequencing by random priming methods, 2008 BMC Genomics 9:5.]. Синтезированные фрагменты кДНК очищали с помощью ампульных шариков (Beckman Coulter). Концентрацию ДНК определяли с помощью набора для анализа Qubit dsDNA HS на флуорометре Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific). Библиотеки для секвенирования следующего поколения были получены из образцов с использованием набора NEB Next Ultra II FS DNA Library Prep Kit для Illumina. Секвенирование с парным концом (2×250 п.н.) было выполнено на платформе MiSeq (Illumina) с помощью набора реагентов MiSeq v2 (Illumina), что привело к 637-1038-кратному охвату генома.

Сборка генома проводилась в ассемблере MIRA (v.4.9.6) с параметрами по умолчанию. Выравнивание геномов CPV по нескольким последовательностям было выполнено с использованием алгоритма MAFFT (v7.407). Деревья максимального правдоподобия были выведены с помощью RAxML-NG [Kozlov, A.M., D. Darriba, Т. Flouri, В. Morel, and A. Stamatakis. RAxML-NG: A Fast, Scalable and User-Friendly Tool for Maximum Likelihood Phylogenetic Inference, 2019. Bioinformatics (Oxford, England) 35, no. 21: 4453-4455 (2019).] в рамках модели GTR (G+I). Поддержка ветвей оценивалась методом начальной загрузки (1000 повторений).

Прогнозирование сигналов рекомбинации и оценка их статистической значимости проводились с помощью алгоритма 3SEQ [Lam, Η. Μ., Ratmann, О. & Boni, Μ. F. Improved algorithmic complexity for the 3SEQ recombination detection algorithm, 2018. Mol. Biol. Evol. 35, 247-251 (2018).].

Так же, как и в других известных представителях рода Циповирусы, секвенированный двухцепочечный РНК-геном ВЦПСШ-01 состоит из 10 линейных сегментов, каждый из которых содержит один ORF. Согласно филогенетическому анализу РНК зависимая РНК полимераза (фиг. 3), которая является единственным консервативным белковым доменом среди РНК-вирусов и поэтому используется для определения их эволюционных взаимосвязей [Shi, Μ. et al. Redefining the invertebrate RNA virosphere. Nature 540, 539-543 (2016)], существуют лишь незначительные различия между ВЦПСШ-01 и ВЦП D. punctatus-1 CPV 1 (DpCPV1) и одним из изолятов L. dispar ВЦП-1 (LdCPV1 ). Хотя в целом геном очень похож на геном ВЦПСШ-01, выравнивание множественных последовательностей пяти известных геномов CPV1 было довольно мозаичным: например, третий сегмент ВЦПСШ-01 был гораздо ближе к LdCPV1, чем к DpCPV1 (фиг. 3). Вместе с соответствующим несоответствием между филогениями отдельных сегментов (фиг. 3) это открытие указывает на то, что произошли некоторые события рекомбинации (горизонтальная передача) между различными штаммами циповирусов. Соответственно, анализ мозаичности 3SEQ предсказал, что третий сегмент ВЦПСШ-01, скорее всего, является результатом рекомбинации между ВЦПСШ-01 и ВЦПНШ-1 (р=3е-276).

Филогенетический анализ секвенированного генома ВЦПСШ-01 показал, что он, скорее всего, возник в результате события рекомбинации между штаммами DpCPV1 и LdCPV1 , включающего замену третьего сегмента генома DpCPV1 его гомологом LdCPV1 . Недавно сообщалось, что такие эволюционные события, как реассортация и внутригенная рекомбинация, широко распространены среди РНК-вирусов, включая циповирусы, и служат механизмом адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды, включая расширение ареала хозяев [Zhang Zh., Li Ν., Hou Ch., Gao K., Tang X. & Guo X. Analysis of reassortant and intragenic recombination in Cypovirus, 2020. Virology Journal 17: 48 (2020).]. Возможность такого эволюционного механизма дополнительно подтверждается возможностью формировать коинфекции несколькими штаммами CPV в одном хозяине, что происходит в естественных популяциях [Pavlushin S.V., Ilinsky Yu.Yu., Belousova I.A., Bayborodin S.I., Lunev E.A., Kechin A.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Toshchakov S.V., Martemyanov V.V. Appearances are deceptive: Three RNA viruses co-infected with the nucleopolyhedrovirus in host Lymantria dispar, 2021. Virus Research, 297 (2021).]. Поэтому выделенный нами штамм вполне мог возникнуть путем рекомбинации штаммов разных хозяев внутри одного хозяина, и он, таким образом, получил селективное преимущество ввиду расширения спектра хозяев.

Пример 5. Определение ЛД50 и ЛВ50.

Мы использовали популяцию D. sibiricus, собранную в елово-кедровых лесах, расположенных в предгорьях Восточных Саян. Для биотеста мы получили следующее поколение (т.е. F1) насекомых в лабораторных условиях. Личинок выращивали при температуре 24°С и относительной влажности 40-60% в режиме 16/8 (день/ночь) и кормили 2-летними побегами ели Abies sibirica Ledeb.

Для выявления инфекции мы провели эксперимент по серийному разведению. В частности, использовались следующие концентрации вируса в суспензиях: 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴ и 10³ полиэдров на миллилитр. Для инокуляции личинок вирусом был применен метод капельного кормления [Hughes P.R., van Beek Ν., Wood Η.Α. A modified droplet feeding method for 437 rapid assay of Bacillus thuringiensis and baculoviruses in noctuid larvae, 1986. J. Invertebr. Pathol. 438, 48:187-192 (1986).]. Личинкам второго возраста по отдельности давали 0,5 мкл суспензии вируса в 10%-ном водном растворе сахарозы. Для лучшей визуализации питьевая суспензия была окрашена пищевым красителем. Личинкам контрольной группы давали безвирусный раствор сахарозы. Для каждой дозы мы использовали 30 индивидуумов. Смертность регистрировалась ежедневно до окукливания. Смертельные дозы, необходимые для уничтожения 50% (LД50) инокулированных личинок, были определены с помощью пакета программного обеспечения drc [Ritz С, Baty F., Streibig J.C., Gerhard D. Dose-response analysis using R, 2015. PLoS ONE 10 (12):e0146021 (2015).]. Различия в ЦД50 считались статистически значимыми, когда доверительные пределы не перекрывались. Среднее время летального исхода (LB50) определяли с помощью анализа выживаемости Каплана-Мейера с последующим тестом Логранк с поправкой Холма-Сидака.

Заражение основного хозяина (личинок D. sibiricus второго возраста) показало LД50 - 68 полиэдров на личинку через 12 дней (фиг. 4а). Следует отметить, что даже при самой низкой дозе ВЦПСШ-01 (0,5 полиэдров на личинку) регистрировали 53% уровень смертности личинок на протяжении всей личиночной стадии (фиг. 5). Зрелые полиэдры также были обнаружены в высокой концентрации в фекалиях инфицированных личинок.

Полученные результаты показали, что род Циповирусов содержит некоторые виды, которые имеют перспективы как агенты для борьбы с вредителями благодаря их высокой вирулентности по отношению к основному хозяину, высокой продуктивности несмотря на то, что этот вирус реплицируется только в тканях средней кишки [Chen, Y., Becnel, J.J., Valles, S.M. RNA Viruses Infecting Pest Insects, 2012. In: Vega, F., Kaya, H.K., editors. Insect Pathology. 2nd edition. Amsterdam: Elsevier, 133-170 (2012).]. Оценка совокупной смертности личинок D. sibiricus (основного хозяина) показала, что даже при дозе всего 0,5 полиэдра на личинку (т.е. только половина особей получила вирус) вирус может убить половину обработанной популяции. Этот высокий уровень инфекционности может быть следствием высокой чувствительности основного хозяина или/и успешной горизонтальной передачи вируса между индивидуумами из-за наличия зрелых полиэдров в фекалиях хозяина, как мы наблюдали в этом исследовании и как сообщалось ранее [Marzban R., Не Q., Zhang Q., Liu Х.Х. Histopathology of cotton bollworm midgut infected with Helicoverpa armigera cytoplasmic polyhedrosis virus, 2013. Braz J Microbiol. 44:1231-1236 (2013).]. Вирулентность нового штамма, DsCPV1, намного выше, чем у другого близкородственного штамма, CPV1 (полученного от других хозяев [Zhou Υ., Qin Т., Xiao Y., Qin F., Lei С.Genomic and Biological Characterization of a New Cypovirus Isolated from Dendrolimus punctatus, 2014. PLoS ONE 9(11): el 13201 doi:10.1371/journal.pone.0113201 (2014).]), и чем вирулентность рода CPV в целом [Shapiro Μ., Im D. J., Adams J. R., Vaughn J. L. Comparative Effectiveness of Lymantria Nuclear Polyhedrosis and Cytoplasmic Polyhedrosis Viruses Against the Gypsy Moth (Lepidoptera: Lymantriidae), 1994. Journal of Economic Entomology 87(l):72-75 (1994).].

Пример 6. Урожайность ВЦПСШ-01 при его наработке на основном хозяине.

Для этого анализа мы использовали личинок, собранных в лиственничных лесах Байкальского региона, поскольку запас саянской популяции D. sibiricus в данном исследовании был ограничен. Личинок выращивали в тех же условиях, что и описанные выше (за исключением растения-хозяина), и кормили побегами лиственницы Larix sibirica Ledeb.

Для заражения личинкам пятого возраста индивидуально спаивали 2 мкл суспензии вируса в окрашенном 10% водном растворе сахарозы. Концентрация вируса в суспензии составляла 2×10⁷ полиэдров/мл. Инфицированная и контрольная группы содержали по 30 особей в каждой. Полиэдры были выделены из мертвых личинок путем измельчения тела личинки в фиксированном объеме воды. Затем суспензию гомогената (без фильтрации, чтобы избежать потери полиэдров) разбавляли, и полиэдры подсчитывали на гемоцитометре при 400-кратном увеличении. Вирусную урожайность определяли как количество полиэдров на личинку.

Средняя урожайность ВЦПСШ-01 во время заражения личинок среднего возраста составляла 10⁸ полиэдров на личинку с диапазоном от 2,5×10⁷ до 3,1×10⁸.

Пример 7. Определение уровня хозяйской специфичности.

В эксперименте участвовали личинки девяти видов чешуекрылых из шести семейств (не считая основного хозяина). Пероральное инфицирование осуществлялось двумя способами: капельным вскармливанием и включением в рацион. Кормление каплями состояло в том, что насекомым давали каплю суспензии вируса в окрашенном 10% растворе сахарозы. Если личинки отказались от сладкой капельки, то заражение было осуществлено путем контаминации вируса их питательной среды. В последнем случае схема заражения для всех видов была следующей: 1 мл суспензии вируса наносили кисточкой на корм, предназначенный для одной группы насекомых. Количество зараженного корма было таким, что группа насекомых могла съесть его до того, как он высохнет. После того, как личинки съели зараженный корм или выпили каплю, их помещали в контейнеры в соответствии с плотностью популяции, оптимальной для соответствующего вида. Концентрации вируса в суспензиях во время заражения разных видов были одинаковыми; однако при использовании заражения путем контаминации питательной среды концентрация была выше, чем при капельном кормлении, чтобы скорректировать дозу с учетом потерь, наблюдаемых при этом способе, когда личинки не потребляют весь обработанный корм.

Качественный биотест других потенциальных хозяев чешуекрылых показал, что P. brassicae, Μ. brassicae, Η. cunea, L. dispar и Μ. sexta восприимчивы к инфекции ВЦПСШ-01, тогда как О. nubilalis, G. mellonella, L. sticticalis и Η. armigera не подвержены вирусной инфекции.

Таким образом ВЦПСШ-01 успешно заразил шесть из 10 проанализированных видов чешуекрылых, принадлежащих к пяти семействам (Erebidae, Sphingidae, Pieridae, Noctuidae и Lasiocampidae), инициировав нормальный патогенез у восприимчивого хозяина. Мы приводим фактических чувствительных хозяев на эволюционном дереве чешуекрылых (фиг. 6), и большинство из них принадлежат к разным семействам в пределах клады Obtectomera - относительно молодой клады отряда чешуекрылых [Kawahara, A. Y. et al. Phylogenomics reveals the evolutionary timing and pattern of butterflies and moths. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 22657-22663 (2019).]. Pyraloidea_clade демонстрирует некоторый паттерн толерантности к штамму ВЦПСШ-01, хотя для окончательного подтверждения этого утверждения необходимы дополнительные исследования с увеличенными дозировками. Относительно широкий диапазон хозяев был показан для другого циповируса 17 группы, штамма UsCPV-17, выделенного из комара Uranotaenia sapphirina [A. Shapiro, Т. Green, S. Rao, S. White, G. Carner, P.P.C. Mertens, JJ. Becnel Morphological and molecular characterization of a Cypovirus (Reoviridae) from the Mosquito Uranotaenia sapphirina (Diptera: Culici-dae) J. Virol., 79 (2005), pp. 9430-9438]. Однако в том исследовании круг хозяев был ограничен одним семейством, в то время как в нашем исследовании он ограничен одним порядком. Таким образом, круг хозяев ВЦПСШ-01 значительно шире, чем это было обнаружено для других циповирусов ранее. Вирулентность ВЦПСШ-01 по отношению к альтернативным хозяевам была не такой высокой, как по отношению к основному хозяину, но все еще сопоставима с вирулентностью других энтомопатогенов, используемых в борьбе с вредителями [Sun X. History and current status of development and use of viral insecticides in China, 2015. Viruses, 7:306-319 (2015).]. Известно, что представители циповирусов первого типа были выделены из разных чешуекрылых хозяев, таких как D. punctatus [Zhao S. L., Liang С.Y., Hong J. J., Peng Η. Y. Genomic sequence analyses of segments 1 to 6 of Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus, 2003. Arch Virol. 148(7):1357-68, doi: 10.1007/s00705-003-0103-z (2003).], Bombyx mori [Hukuhara Т., Midorikawa M. Compans R.W., Bishop D.H. (eds) Double-stranded RNA viruses: Pathogenesis of cytoplasmic polyhedrosis in the silkworm (Elsevier, New York, 405-414, 1983).] и L. dispar [Pavlushin S.V., Ilinsky Yu.Yu., Belousova I.A., Bayborodin S.I., Lunev E.A., Kechin A.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Toshchakov S.V., Martemyanov V.V. Appearances are deceptive: Three RNA viruses co-infected with the nucleopolyhedrovirus in host Lymantria dispar, 2021. Virus Research, 297 (2021).], но до нашего исследования не было подтверждения такого широкого диапазона хозяев для циповирусов первого типа или даже для семейства Baculoviridae.

Пример 8. Заражение основного хозяина D. sibiricus вирусом, пропассированным через хозяина М. sexta.

Личинки М. sexta среднего возраста были инфицированы исходным вирусом путем опрыскивания корма. Корм добавляли в концентрации 10⁷ полиэдров/мл, 1 мл на 20 личинок. Мертвых личинок собирали и измельчали с добавлением дистиллированной воды, затем вирусные частицы отделяли от грубых остатков фильтрованием через марлю с последующим центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин.

Для проверки патогенности к исходному хозяину вируса пропассированного через М. sexta были использованы личинки D. sibiricus второго возраста. Мы использовали личинок дочернего поколения, вылупившихся в лаборатории из родительской популяции, собранной в елово-кедровых лесах, расположенных в предгорьях Восточного Саяна. Личинок выращивали при температуре 24°С и относительной влажности 40-60% в режиме 16/8 (день/ночь) и кормили 2-летними побегами ели А. sibirica.

Для заражения личинкам второго возраста индивидуально скармливали 10⁴ полиэдра на личинку. Применяли метод капельного кормления [Hughes P.R., van Beek Ν., Wood Η.Α. A modified droplet feeding method for 437 rapid assay of Bacillus thuringiensis and baculoviruses in noctuid larvae, 1986. J. Invertebr. Pathol. 438, 48:187-192 (1986).]. Личинкам второго возраста спаивали по 0,5 мкл суспензии вируса в 10%-ном водном растворе сахарозы. Личинкам контрольной группы давали безвирусный раствор сахарозы. Самая высокая доза была выбрана для качественного подтверждения эффективности вируса против основного хозяина. Смертность регистрировалась ежедневно, пока не умерло последние насекомое.

Проведенное исследование показало, что этот вирус сохранил свою патогенность по отношению к основному хозяину: все инфицированные насекомые (D. sibiricus) погибли. Мы также сравнили эту вирулентность штамма ВЦПСШ-01 с его вирулентностью по отношению к другому альтернативному хозяину: L. dispar. И этот эксперимент показал, что восприимчивость L. dispar к ВЦПСШ-01 была значительно ниже, чем у основного хозяина (фиг. 4 а,б).

Пример 9. Составы препарата на основе штамма ВЦПСШ-01, используемого против сибирского шелкопряда.

Состав 1. Содержание инсектицидного препарата против сибирского шелкопряда в растворе в 1 мл:

суспензия штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw с титром 2×10⁹ полиэдров/мл

глицерин 0,05 мл сорбат калия 1,0 мг натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 5,0 мг аскорбиновая кислота 0,6 мг вода остальное до 1 мл.

Состав 2. Содержание инсектицидного препарата против сибирского шелкопряда в растворе в 1 мл:

суспензия штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw с титром 6×10⁹ полиэдров на 1 мл;

глицерин 0,1 мл; сорбат калия 2,0 мг; натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 10,0 мг; аскорбиновая кислота 0,8 мг; вода остальное до 1 мл.

Препарат удобен для применения в полевых условиях с использованием аэрозольных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - сибирскому шелкопряду. Состав 1 применяется для профилактики или при низкой степени зараженности леса сибирским шелкопрядом. Состав 2 применяется при высокой степени зараженности леса сибирским шелкопрядом.

Пример 10. Сравнение эффективности применения против сибирского шекопряда препарата на основе штамма ВЦПСШ-01 с применяемым в настоящее время препаратом Лепидоцид СК.

Проведенные нами исследования показали, что, для достижения эффективности (73±13)% данного вируса против НШ требуется расходовать 1,67×10¹³ полиэдров/га. Согласно нашим экспериментальным данным ЛД50 ВЦПСШ-01 против сибирского шелкопряда составляет 68 полиэдров/гус. Результаты испытаний, представленные в паспорте штамма ВЦПСШ-01 свидетельствуют, что ЛД50 для НШ составляет 2×10⁴ полиэдров/гус. Таким образом суспензия данного вируса при одинаковой концентрации, по ЕА является в 295 раз более летальной для СШ, чем для НШ. Соответственно для достижения эффективности (73±13) % против СШ потребуется расходовать 5,67×10¹⁰ полиэдров/га.

Из биологических препаратов для подавления сибирского шелкопряда в настоящее время используется «Лепидоцид СК». Согласно литературным данным [Фатеев Александр Андреевич «Защита леса от сибирского шелкопряда в Колпашевском районе»:

https://vital.lib.tsu.ru/vital/access/manager/Repository/vital:7261:

СИБИРСКИЙ ЛЕСНОЙ ЖУРНАЛ. 2021. No 5. С.9-25 УДК 630*411:595.787 ФАКТОРЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ СИБИРСКОГО ШЕЛКОПРЯДА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЗАЩИТЕ ЛЕСА Ю. И. Гниненко, Ю. Н. Баранчиков:

https://сибирскийлеснойжурнал.рф/upload/iblock/1a3/1a3fadb530f586fe4a b21 e76fb19f509.pdfl эффективность (73±13) % достигается при расходе 3 л данного препарата на 1 га. Согласно представленным расчетам такую же эффективность можно получить при использовании 0,028 л препарата на основе ВЦПСШ-01. Плюс к этому мы будем иметь пролонгированный эффект сдерживания численности сибирского шелкопряда за счет вертикальной передачи вируса (от одного поколения насекомых к другому).

Пример 11. Горизонтальное распространение вирусной инфекции среди насекомых.

Эпизоотии в популяциях на стадии нарастания численности спонтанно не возникают. Чтобы контролировать вредителя, необходимо искусственно вносить патоген в популяцию. Ранее [Колосов А.В., Косогова Т.Α., Булычев Л.Е., Сергеев А.Н. Пути горизонтальной передачи бакуловирусной инфекции у непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) // Вопросы вирусологии. - 2010. - №5. - С. 43-47.] нами были показаны пути горизонтального распространения инфекции вирусов насекомых. При совместном питании с искусственно инфицированными насекомыми процент гибели первично незараженных гусениц составил 65%. Эти данные свидетельствуют, что при проведении инсектицидных обработок, учитывая способность личинок к пассивной миграции, не обязательно ставить целью заражение всех насекомых данной экосистемы. Достаточно создать несколько очагов инфекции, которые станут не только источником эпизоотии, но также будут способствовать и общему снижению жизнеспособности популяции вредителя. Использование бактериальных препаратов не приводит к подобному распространению инфекции, поскольку в этом случае основную функцию сдерживания выполняют не сами бактерии, а продукты их жизнедеятельности.

Таким образом, представленные примеры 1-11 свидетельствуют о следующем:

1. Заявляемый штамм ВЦПСШ-01 можно рассматривать как квазиуниверсальный агент для борьбы с популяциями экономически важных чешуекрылых вредителей. Это означает, что универсальная схема производства вирусного инсектицида может быть реализована для создания вирусного продукта для широкого рынка препаратов для борьбы с вредителями. Это положительно скажется на цене инсектицида и его рентабельности.

Возможно организовать массовое производство этого штамма in vivo у наиболее экономически подходящих дешевых видов-хозяев (текущая проблема с массовым культивированием энтомопатогенных вирусов в клеточных линиях [стоимость питательной среды] пока не решена). Например, в нашем исследовании М. sexta оказалась лучшим кандидатом для этой цели, потому что у нее большие быстро развивающиеся личинки, у нее нет диапаузы и ее можно выращивать на относительно дешевой стандартной диете. Передача ВЦПСШ-01 через М. sexta (т.е. альтернативного хозяина) сохранила патогенность по отношению к основному хозяину. Эффективность препарата на основе заявляемого штамма ВЦПСШ-01 в качестве агента контроля численности сибирского шелкопряда позволяет ему успешно конкурировать с используемыми в настоящее время другими биологическими препаратами.

Учитывая, что вирусная инфекция способна распространяться как горизонтально так и вертикально, применение инсектицидов на ее основе позволяет снизить количество обработок и сократить обрабатываемые площади и при этом достаточно эффективно осуществлять контроль за целевыми насекомыми-вредителями.

Вышеприведенные данные о ВЦПСШ-01 должны значительно повысить гибкость производства вирусных инсектицидов и свидетельствуют о хороших перспективах ВЦПСШ-01 в качестве квазиуниверсального биологического инсектицида против чешуекрылых вредителей, поскольку этот вирус оказывает истинное регулирующее влияние на динамику численности вредителей.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного и сельского хозяйства на основе нового штамма вируса цитоплазматического полиэдроза (ВЦП), патогенного для личинок сибирского шелкопряда (СШ), являющихся опасным вредителем лиственичных лесов. Штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw, используемого для получения инсектицидного препарата и депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1109. Инсектицидный препарат против сибирского шелкопряда содержит в 1 мл раствора: суспензию штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw по п.1 с титром 2-6×10⁹ полиэдров/мл; глицерин 0,05-0,1 мл; сорбат калия 1,0-2,0 мг; натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 5,0-10,0 мг; аскорбиновая кислота 0,6-0,8 мг; вода остальное до 1 мл. Изобретение позволяет повысить эффективность борьбы против личинок сибирского шелкопряда (СШ), являющихся опасным вредителем лиственичных лесов и препарата на основе указанного штамма. 6 ил., 9 пр.

1. Штамм ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw, используемый для получения инсектицидного препарата и депонированный в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-1109.

2. Инсектицидный препарат против сибирского шелкопряда, включающий суспензию штамма ВЦПСШ-01 вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw по п. 1 с титром 2-6×10⁹ полиэдров/мл, глицерин, сорбат калия, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, аскорбиновую кислоту и воду при следующем количественном содержании компонентов в растворе на 1 мл:

суспензия штамма ВЦПСШ-01 с титром 2-6×10⁹ полиэдров/мл глицерин 0,05-0,1 мл сорбат калия 1,0-2,0 мг натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы 5,0-10,0 мг аскорбиновая кислота 0,6-0,8 мг вода остальное до 1 мл