СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ЭФФЕКТОМ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/06 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине (фармакологии, травматологии, хирургии), ветеринарии и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран и иммунную функцию организма.

Известны репаранты, стимулирующие заживление кожных ран: метилурацил, пентоксил, бетамецил, декспантенол и другие. Однако при травмах многие из них влияют только на отдельные звенья патогенеза (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 1155-1156). В связи с этим часто приходится использовать комплексную терапию. Однако такой подход к лечению ран и травм опасен взаимодействием препаратов вследствие полипрагмазии. Одновременно с этим многие препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение (Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. - М.: Универсум паблишинт, 1997, - 532 с.).

Известны также регуляторные пептиды, обладающие репаративным и ранозаживляющим действием (Pickart, L. The human tri-peptide GHK and tissue remodeling // J. Biomater Sci. Polym. Ed. - 2008. - Vol.19, № 8. - P. 969-988). Преимуществом пептидных средств является то, что они инактивируются путем протеолиза и распадаются до обычных аминокислот, которые не являются чужеродными (ксенобиотиками) для организма и, следовательно, обладают менее выраженными по сравнению с последними побочными эффектами (Белоусов Ю.Б., Кукес В.Г., В.К. Лепахин В.К., Петров В.И. Клиническая фармакология Национальное руководство. - М. Гэотар-Медиа, 2009. - 965 с.).

Известен пептидный препарат - тимоген, представляющий собой дипептид (H₂N-L-Glu-L-Trp-COOH), который является иммуномодулятором, но при этом часто используется как репарант для стимуляции заживления ран, а также для лечения травм различной этиологии (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850). В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования тимогена для стимуляции заживления кожных ран и активации функции нейтрофилов крови (Синергичное иммунотропное и репаративное действие тимогена, даларгина и регуляторного пептида GLY-HIS-LYS при экспериментальной травме кожи / В.Ю. Чердаков, М.Ю. Смахтин, Г.М. Дубровин, И.И. Бобынцев // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2013. - №1. - С. 38-42). Но к недостаткам этого препарата можно отнести то, что он может быстро инактивироваться под действием протеолитических ферментов (протеаз), уровень которых особенно высок в зоне воспаления (Robson, M.C. Wound infection: a failure of wound healing caused by an imbalance of bacteria / M.C. Robson // Surg. Clin. North. Am. - 1997. - Vol. 77. - P. 637-650). Протеазам достаточно разрушить только одну пептидную связь между двумя аминокислотами, что объясняет малое время полужизни этого пептида (J.A. Bergeon, Y.N. Chan, B.G. Charles, I. Toth Oral absorption enhancement of dipeptide L-Glu-L-Trp-OH by lipid and glycosyl conjugation // Biopolymers. - 2008. - T. 90, № 5. - P. 633-643.). Поэтому этот препарат может иметь недостаточную эффективность особенно при местном применении (Saidakhmedova, Z.T. Immunomodulating activity of thymogen in acute pancreatitis / Z.T. Saidakhmedova // Vopr. Pitan. - 2000. - T. 69, № 6. - P. 35-36).

Все вышеперечисленное обуславливает необходимость поиска новых пептидных репаративных средств, обладающих более высокой биологической активностью.

Технический результат изобретения заключается в создании нового синтетического ранозаживляющего средства с более высокой биологической активностью.

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства применяют пептид общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH.

Благодаря введению в молекулу пептида с С-конца аминокислоты D-Ala (D-аланина) усиливается ранозаживляющая активность, вероятно, потому, что введение D-аминокислот повышает их устойчивость к действию протеаз (Greven Н.М., De Wied D. Influence of peptides structurally related to ACTH and MSH on active avoidance in rats // Frontiers of Hormone research. 1977, v. 4, p. 140-152).

Предлагаемый в качестве ранозаживляющего средства пептид получают путем химического синтеза из отдельных аминокислот. Пептид может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. В качестве препарата сравнения был использован тимоген, имеющий формулу H₂N-L-Glu-L-Trp-СООН, который является общедоступным фармацевтическим средством и производится фирмой МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО (Россия).

Выявление эффектов препарата проводили на крысах Вистар массой 180-220 грамм. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно). При этом полнослойные раны стандартного размера (1 см²) наносили на холке животных (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. - М., 1981. - 157 с.).

Пептиды вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно) - тимоген в рекомендованной терапевтической дозе - 1 мкг на 1 кг массы тела (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850), а аналог тимогена - пептид с общей формулой H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH вводили в эквимолярной разовой дозе - 1,2 мкг/кг. Соответствующую навеску пептида растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в объеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. Крысам контрольной группы вводили изотоничный раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме в течение того же периода времени.

Для оценки активности заживления кожных ран проводили их гистологическое исследование. Материал, взятый для исследования, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После обезвоживания и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые затем окрашивали гематоксилин-эозином. При морфометрии на световом микроскопе Leica СМЕ определяли процентное соотношение фибробластов, как известно, непосредственно участвующих в процессе ранозаживления, в сосочковом слое кожи на 100 клеток (Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. СПб.: Наука, 2005. 375 с.).

Важную роль в ранозаживлении также играет иммунная функция и особенно активность нейтрофилов. Как известно, они первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит вероятность нагноения раны, а следовательно, длительность раневого процесса (Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 2001. - 390 с.). Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом (Медведев А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - №2. - С. 19-20), определяя фагоцитарное число (ФЧ) (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) в мазках, окрашенных по Романовскому. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов (Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.). Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan МС 400 (Labsystems, Финляндия) (Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека // Клин. лаб. диагност. - 2004. - №8. - С. 26-29).

Пример конкретного выполнения.

Пример 1. Эффекты пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при внутрибрюшинном введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см²) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. - М., 1981. - 157 с.). Пептид с общей формулой H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в объеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи. Выявленные эффекты представлены в таблице 1.

Пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности. Также пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COCH стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови, что свидетельствует о его иммуностимулирующей активности. При этом в отношении кислородзависимой активности нейтрофилов, определяемой по уровню НСТ-теста, он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (таблица 1).

Пример 2. Эффекты пептида H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH при внутрикожном (местном) введении.

Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см²) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. - М., 1981. - 157 с.). Пептид с общей формулой H²N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в объеме 0,1 мл внутрикожно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 часа между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.

Выявленные эффекты представлены в таблице 2.

При внутрикожном введении пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности. При этом он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном. Также при внутрикожном введении пептид H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови, что свидетельствует о его иммуностимулирующей активности (таблица 2).

Таким образом, пептид, имеющий формулу H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-СООН стимулирует процессы репаративной регенерации кожи, повышая число фибробластов, а следовательно, активирует процесс заживления ран, и при этом он обладает иммуностимулирующим действием в отношении нейтрофилов как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном (местном) введении.

Изобретение относится к медицине и касается применения синтетического пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH в качестве средства для заживления ран, обладающего иммуностимулирующим эффектом. Изобретение обеспечивает создание нового синтетического ранозаживляющего средства с высокой биологической активностью. 2 табл., 2 пр.

Применение синтетического пептида общей формулы H₂N-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH в качестве средства для заживления ран, обладающего иммуностимулирующим эффектом.