ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ С IL-2 Российский патент 2022 года по МПК A61K38/20 A61K47/20 A61K9/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым фармацевтическим композициям, включающим интерлейкин-2 (IL-2), и их применению при лечении связанных с аутоиммунитетом или воспалительных расстройств.

Уровень техники

Интерлейкин-2 представляет собой цитокин, который изначально описан как благоприятствующий активации и пролиферации Т-лимфоцитов. Его используют клинически для стимуляции эффекторной иммунной реакции при некоторых раковых заболеваниях и инфекционном заболевании. Интерлейкин-2 одобрен в 1998 под товарным знаком пролейкин® для лечения метастазирующего почечно-клеточного рака. Позология пролейкина® включает прерывистое введение высокой дозировки IL-2 – типично 42,10⁶ МЕ за 8 часов для пациента массой 70 кг путем непрерывной инфузии или ежедневной подкожной инъекции в течение 5 дней, которое может повторяться несколько раз после периода без лечения.

Недавно показано, что интерлейкин-2 является существенным для выживания и активации Treg. В дозах, в 10-100 раз меньших, чем пролейкина®, IL-2 не стимулирует иммунитет, но сохраняет аутотолерантность путем специфической активации клеток, которые регулируют иммунитет – регуляторных Т-клеток (Treg). Следовательно, IL-2 проявляет селективное биологическое действие на баланс Treg/Teff – ключевой иммунологический двигатель иммунного гомеостаза. Такое свойство прокладывает путь для применения IL-2 при лечении аутоиммунных заболеваний и воспалительных расстройств (AID) в своей основе из-за недостаточности Treg (Klatzmann & Abbas, Nature Reviews Immunology, 2015, 15, 283–294). В настоящее время проводятся исследования IL-2 в низкой дозе при лечении некоторых аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как диабет 1 типа.

Интерлейкин-2 поддается разложению в присутствии воды и кислорода. Согласно уровню техники, интерлейкин-2 может подвергаться химическому разложению и физической неустойчивости в растворе. Соответственно, инициируется разработка лиофилизованных препаратов для того, чтобы избежать реакций разложения. В этом отношении выполняются некоторые исследования для того, чтобы идентифицировать стабилизаторы для улучшения устойчивости IL-2 в лиофилизованных препаратах. Например, Hora et al. (Develop. Biol. Standard., 1991, vol 74, 295-306) описывают применение аморфных эксципиентов, таких как аминокислоты, неионогенные поверхностно-активные вещества, гидроксипропил-β-циклодекстрин или сывороточный альбумин, в качестве стабилизаторов для лиофилизации для препаратов IL-2. Для того, чтобы получить устойчивые стандарты цитокинов, таких как IL-2, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует сушку белка вымораживанием в присутствии соответствующего эксципиента и буфера и хранение полученного препарата в сухих условиях при низкой температуре и в инертной атмосфере (Mire-Sluis at al., Journal of immunological methods, 1998, 216, 103-116). Заслуживает внимания, что пролейкин® для лечения метастазирующего почечно-клеточного рака продается в виде лиофилизованной композиции, включающей интерлейкин-2, маннит, додецилсульфат натрия и дигидрофосфат натрия, которая упакована во флакон в инертной среде и должна храниться при 2°С – 8°С. Маннит присутствует как стабилизатор для лиофилизации. Пролейкин® для инъекции следует восстанавливать водой. Как только он восстановлен, пролейкин® следует сразу же использовать и, в любом случае, в пределах 24 часов после восстановления (см., например, общее описание свойств продукта для пролейкина® в United Kingdom, January 20, 2015, Novartis Pharmaceuticals UK Ltd).

Такие лиофилизованные препараты не подходят для самостоятельного введения и длительного лечения, поскольку препараты необходимо восстанавливать, и они могут храниться только в течение короткого периода времени после восстановления.

Таким образом, существует потребность в альтернативных фармацевтических композициях с IL-2.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, подходящей для инъекции пациенту, включающей по существу интерлейкин-2 в концентрации 0,1-20 миллионов МЕ/мл, буферирующий агент, поверхностно-активное вещество и необязательный эксципиент, предпочтительно выбранный из антиоксидантов, регуляторов осмолярности и консервантов, в воде. Интерлейкин-2 может присутствовать в концентрации 2-12 мМЕ/мл, предпочтительно от 4 до 10 мМЕ/мл. В некоторых воплощениях поверхностно-активное вещество представляет собой анионное поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия (SDS) и додецилсульфат лития. Поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации примерно 0,05-0,5 мг/мл. Массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 типично составляет от 0,04 до 5, например, от 0,1 до 3,0.

Жидкую фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно получают из нелиофилизованного интерлейкина-2.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция не включает маннит и/или альбумин.

Интерлейкин-2 может представлять собой рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 или его варианты, такие как альдеслейкин.

В другом или дополнительном воплощении жидкая фармацевтическая композиция по существу состоит из

- интерлейкина-2 в дозе 2-12 мМЕ/мл, такой как от 4 до 10 мМЕ/мл,

- додецилсульфата натрия (SDS) в концентрации примерно 0,05-0,5 мг/мл,

- буфера, выбранного из одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия и их комбинации, присутствующих в концентрации, колеблющейся от 5 мМ до 25 мМ,

- необязательно, регулятора осмолярности, такого как NaCl, и

- воды.

Жидкая фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно устойчива при 5°С в течение периода по меньшей мере 6 месяцев.

В некоторых альтернативных или дополнительных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению может иметь по меньшей мере одну из следующих особенностей:

- рН композиции составляет от 7,1 до 7,8, предпочтительно рН составляет 7,5 ± 0,2,

- буферирующий агент предпочтительно представляет собой фосфатный буфер,

- интерлейкин-2 представляет собой альдеслейкин,

- жидкая фармацевтическая композиция подходит для упаковки в устройство для доставки для инъекции, такое как шприц или ручка,

- фармацевтическая композиция не включает какой-либо стабилизатор для лиофилизации.

Настоящее изобретение также относится к применению жидкой фармацевтической композиции по изобретению для введения подкожным путем. Типично жидкую фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать для лечения или предупреждения аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства. В таких применениях указанную композицию типично вводят подкожным путем в количестве, эквивалентном дозе интерлейкина-2 0,1 мМЕ – 3 мМЕ.

Другим предметом изобретения является способ получения жидкой фармацевтической композиции, описанной выше, который включает стадии

а) предоставления концентрированного раствора очищенного интерлейкина-2, предпочтительно содержащего более 20 мМЕ/мг интерлейкина-2,

b) получения композиции указанного концентрированного раствора очищенного интерлейкина-2 путем добавления одного или нескольких эксципиентов с тем, чтобы получить указанную жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2,

с) необязательно, упаковки жидкой фармацевтической композиции во флакон, картридж или устройство для доставки для инъекции, такое как шприц или ручка.

Изобретение также относится к набору, включающему флакон или картридж, наполненный указанной жидкой композицией, и средства для подкожной инъекции, такие как шприц(ы), игла(ы) и/или автоинжектор. Другим предметом изобретения является система доставки для инъекции, предпочтительно для подкожной инъекции, наполненная жидкой композицией, определенной выше.

Осуществление изобретения

Авторы изобретения показали, что возможно получить жидкий водный препарат интерлейкина-2, который готов для инъекции, и который можно хранить несколько месяцев при температуре между 2°С и 8°С без какого-либо существенного разложения или потери биологической активности. Авторы изобретения таким образом преодолели предвзятое мнение путем разработки высоко устойчивой водной фармацевтической композиции интерлейкина-2, в то время как известный уровень техники показывает плохую устойчивость интерлейкина-2 в воде и ясно ведет к разработке лиофилизованных препаратов.

Фармацевтическая композиция, разработанная авторами изобретения, очень проста и не опирается на применение добавляемых и дорогостоящих эксципиентов. Препарат содержит очень мало эксципиентов, типично поверхностно-активное вещество, буферирующий агент и необязательный эксципиент. Необязательный эксципиент может представлять собой, например, антиоксидант, консервант или регулятор осмолярности. Способ получения не требует какой-либо стадии лиофилизации интерлейкина-2. Действительно лиофилизация белка не требуется и должна быть аннулирована, поскольку она может пагубно влиять на биологическую активность и устойчивость интерлейкина-2 в восстановленном растворе.

Жидкая фармацевтическая композиция по изобретению включает низкую концентрацию интерлейкина-2, например, от 1.10⁶ до 5.10⁶ МЕ/мл. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что даже в таких низких концентрациях IL-2 может быть устойчивым в жидкой композиции по изобретению. Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция по изобретению особенно подходит для применения при затяжном лечении. Указанная композиция подходит для частого введения и может быть использована при лечении AID такого типа, как диабет типа 1, рассеянный склероз и ревматоидный артрит. Так как фармацевтическая композиция по изобретению готова для инъекции, указанная фармацевтическая композиция может быть заключена в устройства-ручки или шприцы и таким образом особенно адаптирована для самостоятельного введения.

Кроме того, ожидается, что жидкая фармацевтическая композиция по изобретению произведет меньше локальных побочных действий, таких как локальные кожные реакции (покраснение и/или опухание) в месте инъекции по сравнению с пролейкином®.

Наконец, способ получения жидкой фармацевтической композиции по изобретению проще и быстрее, чем способы, описанные на известном уровне техники, поскольку интерлейкин-2 включают в композицию только после стадий очистки без какой-либо лиофилизации.

▪ Фармацевтическая композиция согласно изобретению

Первым объектом изобретения является водная фармацевтическая композиция, подходящая для инъекции пациенту, включающая от 1.10⁶ до 20.10⁶ МЕ/мл интерлейкина-2.

Используемый в настоящем описании термин «подходящая для инъекции» означает, что жидкую фармацевтическую композицию можно вводить пациенту инъекцией, предпочтительно, внутривенным, внутримышечным, интрадермальным или подкожным путем.

В предпочтительном воплощении жидкая фармацевтическая композиция по изобретению подходит для интрадермальной или подкожной инъекции.

Предпочтительно водная жидкая фармацевтическая композиция по изобретению готова к применению, в частности, готова для инъекции. Использование в настоящем описании «готова для инъекции» означает, что жидкую фармацевтическую композицию можно вводить пациенту непосредственно, не подвергая какой-либо дополнительной стадии получения.

Используемый в настоящем описании термин «стадия получения» относится к добавлению к композиции одного или нескольких эксципиентов.

Предпочтительно интерлейкин-2, присутствующий в жидкой фармацевтической композиции по изобретению, не подвергается сушке вымораживанием (или процессу лиофилизации). Используемые в настоящем описании термины «сушка вымораживанием» или «лиофилизация» относятся к способу дегидратации, включающему замораживание материала, включающего воду, и снижение давления таким образом, чтобы создать возможность удаления сублимацией замороженной воды в материале.

Например, пролейкин® представляет собой твердую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2, полученную лиофилизацией.

Таким образом, жидкую фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно получают из нелиофилизованного интерлейкина-2, т.е., из интерлейкина-2, который не подвергался какому-либо процессу лиофилизации. В более общем аспекте жидкую фармацевтическую композицию по изобретению можно получить способом изготовления, который не включает стадию, на которой интерлейкин-2 сушат вымораживанием даже в присутствии стабилизатора для лиофилизации. Подходящие способы получения жидкой фармацевтической композиции по изобретению также описаны ниже.

Используемый в настоящем изобретении интерлейкин-2 (IL-2) охватывает интерлейкин-2 дикого типа млекопитающих и его варианты. Предпочтительно IL-2 представляет собой человеческий IL-2 или его варианты.

Активные варианты IL-2 описаны в литературе. Варианты нативного IL-2 могут представлять собой его фрагменты, аналоги и производные. Под «фрагментом» подразумевается полипептид, включающий только часть интактной последовательности полипептида. «Аналог» обозначает полипептид, включающий нативную последовательность полипептида с одной или несколькими заменами, вставками или делециями аминокислот. Мутеины и псевдопептиды являются конкретными примерами аналогов. «Производные» включают любой модифицированный нативный полипептид IL-2 или его фрагмент или аналог, такой как гликозилированный, фосфорилированный, слитый с другим полипептидом или молекулой, полимеризованный и т.д., или модифицированный через химическую или ферментативную модификацию или присоединение для улучшения свойств IL-2 (например. устойчивости, специфичности и т.д.). Активные варианты эталонного полипептида IL-2 обычно имеют по меньшей мере 75%, предпочтительно 85%, предпочтительнее по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида IL-2, например, зрелого человеческого IL-2 дикого типа.

Способы определения того, является ли вариант полипептида IL-2 активным, доступны в технике и конкретно описаны в настоящем изобретении. Активным вариантом является, наиболее предпочтительно, вариант, который стимулирует Treg.

Примеры вариантов IL-2 раскрываются, например, в EP109748, EP136489, US4752585, EP200280 или EP118617.

IL-2 можно получить методом рекомбинантных ДНК. Организм-хозяин, используемый для экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей IL-2, может быть прокариотным (бактерией, такой как E. coli) или эукариотным (например, клеткой дрожжей, гриба, растения или млекопитающего). Способы получения IL-2 описаны, например, в US4656132, US4748234, US4530787 или US4748234, включенных в настоящее описание в качестве ссылок.

С другой стороны, IL-2 можно получить химическим пептидным синтезом. Например, IL-2 можно получить параллельным синтезом более коротких пептидов, которые затем собирают с образованием полной последовательности IL-2 с правильной дисульфидной связью. Полный синтез интерлейкина-2 поясняется, например, в Asahina et al., Angewandte Chemie International Edition, 2015, Vol.54, Issue 28, 8226-8230, полностью включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

В каком-то воплощении IL-2 является вариантом, имеющим по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, 95%, 98%, 99% идентичность последовательностей со зрелым человеческим IL-2 дикого типа. Вариант может являться гликозилированным или негликозилированным. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность человеческого IL-2 раскрыты, например, в Genbank, ref 3558 или P60568, соответственно.

IL-2 коммерчески доступен, включая фармацевтические применения, и разрешен к применению для пациентов людей. Подходящие коммерческие формы включают, например,

- пролейкин® (альдеслейкин), который представляет собой рекомбинантный негликозилированный дезаланил-1, серин-125, человеческий интерлейкин-2, продуцированный в E. coli;

- ронколейкин®, который представляет собой рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, продуцированный в дрожжах.

В предпочтительном воплощении IL-2 представляет собой альдеслейкин. Альдеслейкин является активным ингредиентом пролейкина®. Альдеслейкин представляет собой негликозилированный вариант зрелого человеческого интерлейкина-2, включающий две аминокислотные модификации по сравнению с последовательностью зрелого человеческого интерлейкина-2: делецию первой аминокислоты (аланина) и замену цистеина в позиции 125 на серин. IL-2 для применения в настоящем изобретении предпочтительно находится в по существу чистой форме, например, с чистотой 95% или больше, предпочтительнее с чистотой 96, 97, 98 или 99%.

IL-2 для применения в настоящем изобретении типично имеет специфическую активность 1,2-2,4 миллиона Международных единиц (мМЕ) на мг белка, предпочтительно от 8 до 18 мМЕ/мг белка. Например, IL-2, присутствующий в композиции по изобретению, может иметь специфическую активность 12±3 мМЕ на мг белка.

Например, если IL-2 имеет специфическую активность 12 мМЕ на мг белка, жидкая композиция по изобретению может включать от примерно 0,008 до примерно 1,67 мг указанного IL-2 на мл.

Биологическую активность IL-2 предпочтительно определяют клеточным анализом, выполняемым на клеточной линии НТ-2 (клон A5E, ATCC® CRL-1841™), рост которой зависит от IL-2. Рост клеток в присутствии разных количеств испытываемого продукта интерлейкина-2 сравнивают с ростом, регистрируемым с Международным стандартом IL-2 (2-ой Международный стандарт ВОЗ для интерлейкина-2 (человеческий, установленная рДНК) NIBSC, код 86/500). Рост клеток измеряют после добавления и трансформации [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолия (внутренняя соль, MTS) в формазан активными жизнеспособными клетками. Затем концентрацию формазана определяют спектрофотометрией при 490 нм.

В некоторых воплощениях интерлейкин-2 присутствует в жидкой композиции по изобретению в форме мономеров, агрегатов и их комбинаций.

Жидкая композиция по изобретению предпочтительно состоит по существу из интерлейкина-2 в концентрации 0,1-20 миллионов МЕ/мл, буферирующего агента, поверхностно-активного вещества и необязательного эксципиента, выбранного из антиоксидантов, регуляторов осмолярности и консервантов, в воде. Используемый в настоящем описании термин «состоит по существу из» означает, что перечисленные компоненты представляют более 95 мас.% жидкой композиции. Иными словами, интерлейкин-2, буферирующий агент, поверхностно-активное вещество, необязательный эксципиент и вода предпочтительно отвечают за 95 мас.%, например, за более чем 96 мас.%, 97 мас.%, 98 мас.%, 99 мас.% или 99,9 мас.% от всей массы жидкой композиции.

Вода является носителем раствора. Типично вода является водой фармацевтического сорта. Поверхностно-активное вещество присутствует с тем, чтобы промотировать растворение и устойчивость интерлейкина-2 в растворе. Подходящие поверхностно-активные вещества охватывают, без ограничения, соли С₈-С₂₀-алкилсульфаты, некоторые фосфолипиды, такие как фосфатидаты, соли холата, дезоксихолата, соли лауроилсаркозината (такие как натриевая соль, известная как саркозил), CHAPS, CHAPSO, тритон X100, тритон X114, NP40, октилглюкозид, додециловые эфиры полиэтиленгликоля, например, продаваемые под товарным знаком Brij^tm35, гексадециловые эфиры полиэтиленгликоля, например, продаваемые под товарным знаком Brij^tm58, производные полиоксиэтилена монолауратов сорбитана, такие как твин 20 и твин 80, эфиры сорбитана, такие как моностеарат сорбитана или монолаурат сорбитана, и их комбинации.

В некоторых воплощениях поверхностно-активное вещество является анионным поверхностно-активным веществом. Соответственно, поверхностно-активное вещество можно выбрать из солей С₈-С₂₀-алкилсульфатов, солей лауроилсаркозината, солей холата, дезоксихолата и их комбинаций.

Предпочтительными анионными поверхностно-активными веществами согласно изобретению являются додецилсульфаты, такие как додецилсульфат натрия (SDS) или додецилсульфат лития. Например, поверхностно-активное вещество можно выбрать из додецилсульфатов щелочных металлов и щелочноземельных металлов. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является SDS.

Без связи с какой-либо теорией, авторы изобретения полагают, что концентрация поверхностно-активного вещества в растворе и массовое отношение поверхностно-активного вещества к IL-2 могут оказывать некоторое влияние на устойчивость интердейкина-2 со временем. В некоторых воплощениях поверхностно-активное вещество, в частности додецилсульфат, такой как SDS, присутствует в концентрации 0,01-0,5 мг/мл. Без связи с какой-либо теорией, Заявитель считает, что концентрация поверхностно-активного вещества, в частности додецилсульфата, такого как SDS, превышающая 0,05 мг/мл, может промотировать устойчивость IL-2 в растворе за счет образования мицелл. В предпочтительном воплощении поверхностно-активное вещество, предпочтительно SDS, присутствует в концентрации от 0,05 до 5,0 мг/мл, например, от 0,06, 0,07 или 0,08 до 5,0 мг/мл. Поверхностно-активное вещество в жидкой композиции по изобретению может присутствовать в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл.

В дополнительных или альтернативных воплощениях массовое отношение поверхностно-активного вещества, предпочтительно SDS, к интерлейкину-2 составляет от 0,01 до 5, предпочтительно, от 0,04 до 5, например, от 0,1 до 3. Как пример, массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 может составлять от 0,1 до 4, например, от 0,15 до 0,30 или от 1,0 до 3,0, например, от 1,5 до 2,5.

Буферирующий агент может быть любого типа при условии, что он подходит для композиции с интерлейкином-2 и адаптирован для инъекции, в частности, подкожной инъекции. Буферирующий агент относится к кислотам, солевым формам кислот и их комбинации. Буферирующие агенты включают фосфорную кислоту, трис(гидроксиметил)аминометангидрохлорид (трис.HCl), 4-морфолинпропансульфоновую кислоту (MOPS), 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (HEPES), PIPES, 2,2-бис(гидроксиметил)-2,2',2"-нитрилотриэтанол (бис-трис), трис-глицин, бицин, трицин, TAPS, TAPSO, MES, цитрат, борат, цитрат/фосфат, бикарбонат, глутаровую кислоту, янтарную кислоту, их соли и их комбинации.

Концентрация буферирующего агента в жидкой композиции по изобретению типично составляет от 1 мМ до 10 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 25 мМ, например, от 5 мМ до 15 М.

В жидкой композиции по изобретению рН предпочтительно составляет от 7,0 до 8,0, например, рН 7,5±0,2. В некоторых воплощениях буферирующий(ие) агент(ы) имеет(имеют) рК от примерно 6,5 до примерно 8,5, предпочтительно от 7,0 до 8,0. Предпочтительно буферирующие агенты представляют собой соли фосфорной кислоты, такие как натриевые, кальциевые или калиевые соли фосфорной кислоты. Например, буферирующий агент выбирают из одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия и их комбинации. Иными словами, предпочтительными буферами являются фосфатные буферы.

В предпочтительных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению имеет осмолярность, подходящую для подкожной инъекции. Типично осмолярность композиции по изобретению составляет по меньшей мере 250 мОсм, предпочтительно, по меньшей мере 330 мОсм и в частности по меньшей мере 360 мОсм.

Необязательный эксципиент можно выбрать из консервантов, антиоксидантов и их комбинаций. Консерванты включают, без ограничения, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, сорбиновую кислоту и их соли. Антиоксиданты включают аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, токоферол и их комбинации. Типично необязательный эксципиент отвечает за менее 5 мас.%, предпочтительно менее 3 мас.%, 2 мас.% и даже 0,1 мас.% от общей массы композиции.

Необязательный эксципиент также можно выбрать из регуляторов осмолярности. Регуляторы осмолярности включают фармацевтически приемлемые неорганические соли, такие как хлорид натрия и хлорид калия, и органические соли, такие как органические соли натрия или калия, например, цитрат, аспартат или ацетат калия или натрия. Регуляторы осмолярности типично добавляют в композицию по изобретению в количестве, позволяющем регулировать осмолярность композиции до величины по меньшей мере 330 мОсм или по меньшей мере 360 мОсм. Осмолярность типично составляет от 330 мОсм до 600 мОсм. Предпочтительным регулятором осмолярности согласно изобретению является NaCl.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция не включает какой-либо необязательный эксципиент. В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению содержит регулятор осмолярности, но не содержит какие-либо консерванты или антиоксиданты.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению состоит по существу из интерлейкина-2 в концентрации 0,1-20 миллионов МЕ/мл, буферирующего агента и поверхностно-активного вещества в воде. В других воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению состоит по существу из интерлейкина-2 в концентрации 0,1-20 миллионов МЕ/мл, буферирующего агента, регулятора осмолярности и поверхностно-активного вещества в воде.

Как указано выше, интерлейкин-2, используемый для получения композиции по изобретению, предпочтительно является нелиофилизованным интерлейкином-2. Следовательно, в жидкой фармацевтической композиция по изобретению присутствие стабилизатора для лиофилизации не требуется. При использовании термин «стабилизатор для лиофилизации» или «стабилизатор для сушки вымораживанием» относится к эксципиенту, способному защищать белки, в частности, интерлейкин-2, от денатурации во время лиофилизации. Стабилизаторы для лиофилизации типично включают сахара, такие как маннит, сахароза, декстроза и трегалоза, аминокислоты, гидроксипропил-β-циклодекстрин и сывороточный альбумин.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция не включает какой-либо стабилизатор для лиофилизации. В некоторых других воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению не включает маннит и/или сывороточный альбумин.

Авторы изобретения показали, что жидкая фармацевтическая композиция по изобретению устойчива со временем. Жидкую фармацевтическую композицию можно хранить при температуре от 2°С до 8°С, предпочтительно при 5°С, в инертной атмосфере в течение по меньшей мере 6 месяцев без какой-либо существенной потери биологической активности, т.е. со снижением биологической активности самое большее на 25%, предпочтительно, самое большее на 20%, 15%, 10% или 5%. В частности, после периода хранения 6 месяцев при 5°С снижение биологической активности интерлейкина-2 в растворе составляет менее 30%, предпочтительно, менее 25% или 20%, в частности, менее 15%, 10% или 5% от биологической активности до хранения. Используемое в настоящем описании выражение «жидкая фармацевтическая композиция является устойчивой» означает, что жидкая фармацевтическая композиция по изобретению устойчива, когда хранится при температуре 5°С в инертной атмосфере в течение периода по меньшей мере 6 месяцев, даже по меньшей мере 12 месяцев. В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция может быть устойчивой, когда хранится при температуре от 2°С до 8°С в инертной атмосфере в течение периода одного-трех лет.

Заслуживает внимания, что жидкая фармацевтическая композиция устойчива, даже если интерлейкин-2 присутствует в низкой концентрации, например, менее 12 мМЕ на мл, например, от 2 до 12 мМЕ на мл. Устойчивые жидкие фармацевтические композиции, включающие низкое количество интерлейкина-2, представляют интерес для применения при длительном лечении аутоиммунных и воспалительных расстройств, поскольку они удобны для упаковки в устройства для доставки, такие как шприцы и шприцы-ручки, адаптированные для самостоятельного введения.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению включает интерлейкин-2 в количестве 0,1-12 мМЕ на мл композиции, например, от 0,1 до 10 мМЕ на мл или от 2 до 12 мМЕ на мл композиции. Количество 0,1-12 ММЕ на мл включает количество 0,1-1 мМЕ на мл, 1 мМЕ – 2 мМЕ на мл, 2 мМЕ – 3 мМЕ на мл, 3 мМЕ – 4 мМЕ на мл, 4 мМЕ – 5 мМЕ на мл, 5 мМЕ – 6 мМЕ на мл, of 6 мМЕ – 7 мМЕ на мл, 7 мМЕ – 8 мМЕ на мл, 8 мМЕ – 9 мМЕ на мл, 9 мМЕ – 10 мМЕ на мл, 10 мМЕ – 11 мМЕ на мл, 11 мМЕ – 12 мМЕ на мл. В предпочтительных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению включает интерлейкин-2 в количестве 4 мМЕ – 10 мМЕ на мл, например, в количестве 4 мМЕ – 6 мМЕ на мл.

В некоторых отдельных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению включает интерлейкин-2 в количестве 0,1-6 мМЕ на мл композиции, предпочтительно от 0,5 до 5 мМЕ на мл. Например, количество интерлейкин-2 в композиции по изобретению может составлять 0,5 мМЕ на мл, 1,0 мМЕ на мл, 1,5 мМЕ на мл, 2,0 мМЕ на мл, 2,5 мМЕ на мл, 3,0 мМЕ на мл, 3,5 мМЕ на мл, 4,0 мМЕ на мл, 4,5 мМЕ на мл или 5,0 мМЕ на мл.

В некоторых отдельных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению включает от 1,0 до 3,0 мМЕ интерлейкина-2 на мл.

Например, в указанных воплощениях, если IL-2 имеет специфическую активность примерно 12 мМЕ на мг белка, 1,0-3,0 мМЕ интерлейкина-2 на мл соответствует примерно 0,08 мг IL-2 на мл – примерно 0,24 мг IL-2 на мл.

В некоторых других воплощениях изобретения жидкая фармацевтическая композиция состоит по существу из

- интерлейкина-2 в количестве 1,0-3,0 мМЕ на мл или от 2 мМЕ до 12 мМЕ на мл, таком как 4 мМЕ – 10 мМЕ на мл, или таком как 4 мМЕ – 6 мМЕ на мл,

- поверхностно-активного вещества, предпочтительно додецилсульфата натрия (SDS),

- буферирующего агента, предпочтительно выбранного из солей фосфатов, таких как одноосновный фосфат натрия и двухосновный фосфат натрия,

- необязательного эксципиента, предпочтительно выбранного из консервантов, антиоксидантов и регуляторов осмолярности, и

- воды.

Как указано выше, поверхностно-активное вещество, в частности, SDS, может присутствовать в количестве 0,01-0,50 мг/мл. Предпочтительно SDS присутствует в концентрации от 0,05 до 0,5 мг/мл. В других или дополнительных воплощениях массовое отношение поверхностно-активного вещества, предпочтительно SDS, к интерлейкину-2 составляет от 0,04 до 5, предпочтительнее от 0,1 до 3,0, например, от 2,0 до 2,5, такое как 2,2, или от 0,10 до 0,30, такое как 0,22.

В некоторых воплощениях жидкая фармацевтическая композиция состоит по существу из

- интерлейкина-2 в количестве 1,0-3,0 мМЕ на мл или от 2 мМЕ до 12 мМЕ на мл, таком как 4 мМЕ – 10 мМЕ на мл,

- додецилсульфата натрия (SDS), присутствующего в концентрации примерно 0,05-0,5 мг/мл,

- фосфатного буфера,

- воды и

- необязательно, регулятора осмолярности, предпочтительно NaCl.

В некоторых других воплощениях изобретения жидкая фармацевтическая композиция характеризуется одной или несколькими из следующих особенностей:

- жидкая композиция подходит для инъекции пациенту,

- жидкая композиция состоит по существу из интерлейкина-2 в количестве 2,0-12 мМЕ на мл, поверхностно-активного вещества, буферирующего агента, регулятора осмолярности и воды,

- поверхностно-активным веществом является SDS, который присутствует в концентрации 0,1-0,4 мг/мл,

- буферирующий агент представляет собой соли фосфаты в общей концентрации от 1 мМ до 100 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 25 мМ,

- рН композиции составляет от 7,0 до 8,0, предпочтительно рН составляет 7,5 ± 0,2,

- массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 составляет от 1,0 до 3,0,

- интерлейкин-2 представляет собой нелиофилизованный интерлейкин-2,

- интерлейкин-2 имеет специфическую активность 12±3 мМЕ на мг белка,

- интерлейкин-2 представляет собой альдеслейкин,

- фармацевтическая композиция не включает какой-либо стабилизатор для лиофилизации, включая маннит,

- регулятором осмолярности является NaCl,

- осмолярность жидкой композиции составляет по меньшей мере 330 мОсм, предпочтительно по меньшей мере 360 мОсм,

- фармацевтическая композиция устойчива, когда хранится при температуре 5°С и в инертной атмосфере в течение периода по меньшей мере 6 месяцев,

- жидкая фармацевтическая композиция упакована в устройство для доставки для инъекции, например, шприц или ручку,

- жидкая фармацевтическая композиция подходит для подкожного введения.

В некоторых воплощениях жидкая композиция характеризуется всеми вышеперечисленными особенностями.

▪ Способ получения жидкой фармацевтической композиции по изобретению

Настоящее изобретение также относится к способу получения жидкой фармацевтической композиции с интерлейкином-2, подходящей для инъекции пациенту, раскрытой в настоящем описании выше, который включает

а) предоставление концентрированного раствора очищенного интерлейкина-2 и

b) получение композиции концентрированного раствора очищенного интерлейкина-2 путем добавления одного или нескольких эксципиентов с тем, чтобы получить указанную жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2.

Типично концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 со стадии а) включает воду в качестве носителя и буфер. Интерлейкин-2 присутствует в концентрированном растворе в концентрации более 20 мМЕ/мл, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 25 мМЕ, например, от 25 мМЕ до 50 мМЕ на мл. Концентрированный раствор, как правило, находится при рН от 7,0 до 8,0. Концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 получают стандартным способом получения IL-2. Указанный стандартный способ может включать рекомбинантное получение IL-2 в культуре-хозяине и извлечение и очистку интерлейкина-2 от культуры-хозяина с тем, чтобы получить концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2. Способ, используемый для получения концентрированного раствора интерлейкина-2, предпочтительно не включает стадию лиофилизации. В некоем воплощении указанный способ также не включает стадию восстановления, на которой жидкий носитель добавляют к твердой композиции с IL-2, например, лиофилизованной композиции с IL-2.

В некоторых воплощениях концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 можно получить способом, включающим

i) получение интерлейкина-2 в рекомбинантной культуре E. coli,

ii) извлечение интерлейкина-2 из рекомбинантной культуры E. coli, и очистку интерлейкина-2 с тем, чтобы получить концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2.

Получение интерлейкина-2 в E. coli можно выполнить стандартными методами. Извлечение интерлейкина-2 и очистку интерлейкина-2 от культуры E. coli также можно выполнить стандартными методами, которые могут включать такие стадии, как гомогенизация и центрифугирование культуры E. coli, извлечение и солюбилизация телец включения, рефолдинг белка, одну или несколько стадий хроматографии, такой как эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, мультимодальная хроматография, хроматография с обращенной фазой, ВЭЖХ или гидроксиапатитная хроматография, одну или несколько стадий фильтрации, такой как глубокая фильтрация, ультрафильтрация, тангенциальная ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос. Раствор очищенного интерлейкина-2 можно сконцентрировать ультрафильтрацией с тем, чтобы получить желательную концентрацию IL-2 (например, концентрацию по меньшей мере 15 мМЕ/мл). Перед очисткой IL-2, извлеченный из клеточной культуры, можно подвергнуть стадии рефолдинга.

С другой стороны, концентрированный раствор очищенного IL-2 можно получить химическим синтезом. Например, способ получения указанного концентрированного раствора может включать получение IL-2 пептидным синтезом и очистку указанного полученного химически IL-2 с тем, чтобы получить указанный концентрированный раствор. Например, IL-2 можно получить параллельным синтезом более коротких пептидов в твердой или жидкой фазе, предпочтительно, твердофазным методом. Затем полученные пептиды лигируют вместе, что приводит к полной последовательности IL-2. Затем полученный IL-2 очищают стандартными методами, такими как стадии препаративной хроматографии, и подвергают рефолдингу при необходимости.

Перед получением композиции концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 можно подвергнуть стадиям стерилизации и/или инактивации вирусов. Типично концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 можно подвергнуть стерильной фильтрации. Концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 также может включать поверхностно-активное вещество или другие эксципиенты, такие как антиоксиданты и консерванты.

Предпочтительно концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2 состоит по существу из интерлейкина-2 в концентрации по меньшей мере 15 мМЕ/мл, предпочтительно по меньшей мере 20 мМЕ/мл, буфера, воды и, необязательно, поверхностно-активного вещества. Предпочтительным буферирующим агентом является фосфатный буфер, и предпочтительным поверхностно-активным веществом является SDS.

Получение композиции с концентрированным раствором очищенного интерлейкина-2 выполняют так, чтобы получить желательную жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2. В зависимости от особенностей исходного концентрированного раствора очищенного интерлейкина-2 и желательного конечного фармацевтического продукта, стадия b) может включать

- разбавление раствора с тем, чтобы установить концентрацию интерлейкина-2 в интервале 0,1 мМЕ – 20 мМЕ на мл, например, от 2 мМЕ до 12 мМЕ на мл, от 4 мМЕ до 10 мМЕ на мл, от 0,1 мМЕ до 10 мМЕ на мл или от 0,1 мМЕ до 6 мМЕ на мл, и/или

- добавление поверхностно-активного вещества и/или регулирование концентрации поверхностно-активного вещества,

- добавление одного или нескольких буферов с тем, чтобы установить рН между 7,0 и 8,0 и/или с тем, чтобы отрегулировать молярность буфера в растворе до величины между 1 мМ и 100 мМ, например, от 5 мМ до 25 мМ, и/или

- добавление необязательного эксципиента, выбранного из антиоксидантов, консервантов, регуляторов осмолярности и их комбинации.

Способ по изобретению может дополнительно включать стадию упаковки с). Типично жидкую фармацевтическую композицию по изобретению можно упаковывать в устройство для инъекции, например, в шприц или ручку для инъекции, в инертной атмосфере или модифицированной атмосфере, такой как аргон или азот. С другой стороны, жидкий фармацевтический препарат можно заключить во флакон или картридж в инертной атмосфере. Указанный флакон или картридж, наполненный жидкой фармацевтической композицией по изобретению, можно упаковать вместе со средствами для инъекции, такими как шприц, игла и система автоинжектора. Упаковывание фармацевтической композиции для инъекции предпочтительно выполняют в асептических условиях. Способ по изобретению также может включать стадии стерилизации и/или инактивации вирусов, например, путем облучения е-лучами. Указанные стадии можно осуществлять до или после упаковки, в зависимости от используемой технологии. Например, жидкую фармацевтическую композицию можно подвергнуть стерильной фильтрации перед упаковкой и/или облучению е-лучами после упаковки.

В некоторых воплощениях способ получения жидкой фармацевтической композиции с интерлейкином-2, подходящей для инъекции пациенту, описанной выше, включает стадии

i) получения интерлейкина-2 в рекомбинантной культуре-хозяине, предпочтительно E. coli,

ii) извлечения интерлейкина-2 из рекомбинантной культуры-хозяина и очистки интерлейкина-2 с тем, чтобы получить концентрированный раствор очищенного интерлейкина-2,

iii) получения композиции с концентрированным раствором очищенного интерлейкина-2 с тем, чтобы получить жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2, и

iv) необязательно, упаковки жидкой фармацевтической композиции с интерлейкином-2 в устройство для инъекции, такое как шприц или ручка.

Как указано выше, способ по изобретению не включает стадию, на которой интерлейкин-2 сушат вымораживанием.

Стадию iv) предпочтительно выполняют в асептических условиях.

Само собой понятно, что настоящее изобретение также относится к жидкой фармацевтической композиции, которую можно получить таким способом, а также устройству для инъекции, наполненному указанной жидкой фармацевтической композицией.

▪ Применения, терапевтические методы, наборы и устройства согласно изобретению

Настоящее изобретение также относится к применению жидкой фармацевтической композиции с интерлейкином-2 по изобретению при лечении или предупреждении аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства у субъекта. Предпочтительное аутоиммунное, связанное с иммунитетом или воспалительное расстройство у субъекта родственно расстройствам, ассоциированным с недостаточностью Treg.

Аутоиммунные, связанные с иммунитетом или воспалительные расстройства включают, без ограничения, HCV-связанный васкулит, увеит, миозит, диабет типа I, системную красную волчанку, системный васкулит, псориаз, аллергию, астму, болезнь Крона, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, атеросклероз, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, нейродегенеративные заболевания, болезнь Альцгеймера, болезнь «трансплантат против хозяина», самопроизвольный аборт и отторжение аллотрансплантата. Предпочтительными аутоиммунными заболеваниями и воспалительными расстройствами (AID) являются диабет типа I, рассеянный склероз, системная красная волчанка и ревматоидный артрит.

Жидкую фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно вводят пациенту инъекцией, например, внутривенным, внутримышечным, интрадермальным или подкожным путем. Предпочтительными путями введения являются подкожный путь и интрадермальный путь. В предпочтительном воплощении жидкая фармацевтическая композиция по изобретению является композицией для подкожной инъекции. Жидкая фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно подходит для доставки дозы IL-2, колеблющейся от 0,1 мМЕ до 3 мМЕ интерлейкина-2, такой как доза в 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, или 3,0 мМЕ.

Соответственно, жидкая фармацевтическая композиция по изобретению может являться композицией для применения при лечении или предупреждении аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства, причем указанную жидкую фармацевтическую композицию вводят подкожным путем с тем, чтобы предоставить пациенту дозу IL-2 от 0,1 мМЕ до 3 мМЕ.

Жидкая фармацевтическая композиция по изобретению подходит для частых введений. Типично жидкую фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить один раз в месяц, один раз в две недели, один раз в неделю, дважды в неделю или ежедневно, в зависимости от заболевания, от которого лечат, и терапевтического эффекта, который получают. Лечение может длиться несколько дней, несколько недель, несколько месяцев и даже несколько лет. Лечение может включать начальный курс, когда жидкую фармацевтическую композицию по изобретению вводят ежедневно в течение нескольких дней, и поддерживающий период, в который жидкую фармацевтическую композицию по изобретению вводят с меньшей частотой, например, один раз в месяц или один раз каждые два месяца.

В некоторых дополнительных или альтернативных воплощениях жидкая фармацевтическая композиция по изобретению является композицией для применения при длительном лечении аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства.

Используемый в настоящем описании термин «длительное лечение» относится к лечению, длящемуся по меньшей мере 3 месяца, причем жидкую фармацевтическую композицию по изобретению вводят по меньшей мере один раз в месяц.

Доза для введения, частота введения, схема введения и длительность лечения будут изменяться в зависимости от расстройства, от которого лечат или которое предупреждают, тяжести расстройства, характеристик пациента, в частности, возраста пациента, массы тела, площади поверхности тела (BSA), общего состояния здоровья, истории болезни.

Изобретение также относится к способу лечения или предупреждения у пациента аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства, причем указанный способ включает введение пациенту жидкой фармацевтической композиции по изобретению. Как указано выше, жидкую фармацевтическую композицию предпочтительно вводят инъекцией, в частности, подкожным путем, в количестве, соответствующем дозе IL-2, колеблющейся от 0,1 мМЕ до3.0 мМЕ.

Другим объектом изобретения является устройство для инъекции, предпочтительно для подкожной инъекции, наполненное жидкой фармацевтической композицией по изобретению. Устройство может представлять собой, например, шприц или ручку. Предпочтительно устройство подходит для обеспечения подкожного введения жидкой фармацевтической композиции по изобретению. Устройство может быть адаптировано для предоставления одной дозы или нескольких доз жидкой фармацевтической композиции по изобретению. Каждая доза жидкой фармацевтической композиции по изобретению предпочтительно соответствует количеству IL-2, колеблющемуся от 0,1 мМЕ до 3,0 мМЕ. Типично устройство по изобретению подходит для доставки объема от 50 мкл до 2 мл, предпочтительно от 100 мкл до 1 мл.

В каком-то воплощении устройство по изобретению является устройство для однократного применения. Устройство предпочтительно является одноразовым.

В некоторых других воплощениях устройство по изобретению адаптировано для доставки нескольких доз, как, например, многодозовые ручки.

В каком-то воплощении устройство содержит средства, дающие возможность регулировать количество жидкой фармацевтической композиции для введения. В других воплощениях устройство подходит для введения фиксированного количества жидкой фармацевтической композиции.

Предпочтительно устройство подходит для самостоятельного введения.

В некоторых воплощениях устройство по изобретению может представлять собой предварительно наполненный шприц или предварительно наполненный картридж, который можно использовать с автоинжектором. Автоинжектор может являться электронным или механическим.

Устройства, подходящие для подкожного введения и/или самостоятельного введения, хорошо известны на известном уровне техники. Некоторые гормональные продукты продаются в предварительно наполненных шприцах-ручках или предварительно наполненных шприцах. Например, можно обратиться к устройствам, используемым для введения инсулина, таким как инсулиновые ручки (такие, как продаваемые NovoNordisk под торговыми наименованиями NovoPen®) или инсулиновые шприцы для подкожных инъекций.

Само собой понятно, что к указанным шприцам или ручкам для выполнения инъекций можно адаптировать иглы для подкожных инъекций.

Как другие примеры, можно обратиться к системам для подкожной доставки, продаваемым для введения Rebif® (INF-1a), таким как Rebif® Rebidose, которая представляет собой предварительно наполненную одноразовую ручку, RebiSmart®, которая представляет собой электронное устройство для автоинжекции с многодозовым картриджем, созданное для самостоятельного введения, и Rebiject II®, которая представляет собой созданный для самостоятельного введения автоинжектор с предварительно наполненный шприцем.

Если устройство по изобретению представляет собой шприц, такой шприц предпочтительно является предварительно собранным шприцем, что означает, что игла уже установлена на шприце. Например, можно обратиться к предварительно собранному шприцу Orgalutran®.

В некоторых альтернативных или дополнительных воплощениях шприц адаптирован для применения с автоинжектором.

Предпочтительно устройство представляет собой многодозовую ручку или стеклянный шприц, например, 0,5-1,5-мл шприц. Шприц может быть снабжен колпачком или иглой, извлекаемой колпачком.

Можно использовать другие устройства для самостоятельной инъекции. Например, можно использовать безигольные устройства для доставки, адаптированные для подкожного введения, такие как Zeneo®, продаваемые Crossject. Эта система основана на принципе перекрытия струйки воды; струйку жидкости, заключенной в стеклянную капсулу, выдавливают через иглу для инъекции очень маленького диаметра со скоростью 150 метр/секунда, что достаточно для прохождения через ткани.

В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему

- флакон или картридж, включающий жидкие фармацевтические композиции по изобретению, и

- средства для введения, такие как шприц(ы), игла(ы) и/или устройство(а) автоинжектор(ы).

Следующие далее примеры приводятся только для пояснения, а не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

Исследование устойчивости

Это исследование имеет в виду оценку устойчивости некоторых фармацевтических композиций с активным веществом IL-2 (альдеслейкином) в течение 36 месяцев при 5°С и 12 месяцев при 30°С/75% RH.

1. Получение жидкой фармацевтической композиции по изобретению

Получают растворы стерильного активного вещества IL-2 (концентрированный раствор, включающий 25 мМЕ/мл, эквивалентный 2 мг/мл IL-2) в асептических условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком при комнатной температуре. Активное вещество IL-2 разбавляют и составляют композиции согласно таблице композиций, приведенной ниже. Каждую композицию (1 мл) упаковывают в атмосфере азота во флаконы из стекла с силиконовым покрытием, которые закрывают бромбутиловыми пробками Flurotec.

2. Исследования устойчивости

Полученные композиции хранят в контролируемых камерах при 5°С или 30°С/75% RH в течение 36 месяцев. Каждую композицию (1-10) оценивают на ее устойчивость в месяц 6. Дополнительный анализ на устойчивость будет выполняться до 36 месяцев хранения.

Устойчивость оценивают признанными аналитическими методами, в частности, ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ), для определения чистоты вещества IL-2 и возможного образования продуктов разложения, и анализом на биологическую активность. ОФ-ВЭЖХ выполняют в следующих условиях:

- неподвижная фаза: колонка С4, Jupiter C4, 5 мкм, 300Ǻ, 4,6x250 мм, от Phenomenex;

- градиент: элюирование выполняют в 30-минутном градиенте буфера В (муравьиная кислота, 0,1%, в ацетонитриле) в буфере А (муравьиная кислота, 0,1%, в ультрачистой воде), описанном ниже:

- время удерживания IL-2 составляет 14,0-14,6 минут.

Исходное активное вещество IL-2 в концентрации 1 мМЕ/мл впрыскивают в качестве качественного контроля.

Биологическую активность IL-2 предпочтительно определяют клеточным анализом, выполняемым на клеточной линии НТ-2 (клон A5E, ATCC® CRL-1841™), чей рост зависит от IL-2. Рост клеток в присутствии интервала испытываемого продукта интерлейкина-2 сравнивают с ростом, регистрируемым с Международным стандартом IL-2 (2-ой Международный стандарт ВОЗ для интерлейкина-2 (человеческий, установленная рДНК) NIBSC, код 86/500). Рост клеток измеряют после добавления и конверсии [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолия (внутренняя соль, MTS) в формазан активными жизнеспособными клетками. Затем концентрацию формазана измеряют спектрофотометрией при 490 нм. Такая концентрация прямо пропорциональна числу жизнеспособных клеток, присутствующих в культуре.

Результаты

Чистоту и биологическую активность вещества IL-2 оценивают для каждой композиции и для каждого условия хранения в течение 6 месяцев.

Результаты приводятся в таблицах ниже.

Все испытываемые композиции показывают хорошую устойчивость после хранения 6 месяцев при 5°С, за исключением композиций 3 и 6. Композиции 3 и 6 отображают сильное разложение IL-2 уже после 3 месяцев хранения при 5°С и 30°С. После хранения 3 месяца при 30°С процент остаточной биологической активности составляет примерно 12% и 46% для композиций 3 и 6, соответственно. Такая низкая устойчивость может являться результатом низкой концентрации SDS в растворе. Оказывается, что может требоваться концентрация SDS по меньшей мере 0,05 мг/мл для промотирования устойчивости IL-2 в растворе. В связи с этим хорошую устойчивость при 5°С и 30°С показывает композиция 7, которая содержит 0,088 мг/мл SDS.

Примечательно, что композиции 7, 8 и 10, включающие от 5 до 10 мМЕ/мл IL-2, показывают хороший профиль устойчивости. Наилучшие результаты в смысле чистоты и биологической активности после 6 месяцев хранения при 5°С и 30°С получают с композицией 8. Композиция 8 содержит 10 мМЕ/мл IL-2 и 0,176 мг/мл SDS с отношением SDS/IL-2 0,22. Композиции 1 и 4 являются сопоставимыми композициями, содержащими маннит. Композиции 1 и 4 показывают схожую устойчивость в смысле чистоты и биологической активности с композициями 2 и 5, которые не включают маннит. Таким образом, присутствие маннита не является необходимым для промотирования устойчивости IL-2 во время хранения.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для инъекций для введения интерлейкина. Стабильная готовая для инъекции жидкая фармацевтическая композиция для введения интерлейкина-2 субъекту, включающая: нелиофилизированный интерлейкин-2 (IL-2), имеющий специфическую активность 8-18 ММЕ/мг белка, который присутствует в концентрации 1-20 ММЕ/мл, буферирующий агент в концентрации от 5 мМ до 100 мМ, где буферирующий агент выбран из группы, состоящей из фосфорной кислоты, гидрохлорида трис (гидроксиметил) аминометана (TRIS-HCl), трис-глицина, цитрата, бората, фосфата, цитрата/фосфата, бикарбоната, глутарой кислоты, янтарной кислоты, их соли и их комбинации, и (iii) поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,05 до 0,5 мг/мл, где поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия в воде, где рН композиции составляет от 7,1 до 7,8 и массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 составляет от 0,1 до 3,0. Применение жидкой фармацевтической композиции при лечении или предупреждении аутоиммунного, связанного с иммунитетом или воспалительного расстройства, в котором указанную композицию вводят подкожным путем в количестве, эквивалентном дозе интерлейкина-2 0,1 ММЕ - 3 ММЕ. Способ получения жидкой фармацевтической композиции включающий стадии: а) предоставления концентрированного раствора очищенного нелиофилизированного интерлейкина-2, b) получения композиции концентрированного раствора очищенного нелиофилизированного интерлейкина-2, которое включает стадию добавления указанного очищенного нелиофилизированного интерлейкина-2 в раствор, содержащий буферирующий агент и поверхностно-активное вещество в воде, как определено в п. 1 с тем, чтобы получить указанную жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2, с) необязательно упаковки жидкой фармацевтической композиции во флакон, картридж или устройство доставки для инъекции, выбранное из шприца или ручки. Фармацевтический набор для подкожного введения IL-2 субъекту, включающий флакон или картридж, включающий жидкую композицию по и средства для подкожной инъекции, выбранные из шприца, иглы и/или автоинжектора. Система доставки для подкожной инъекции IL-2 субъекту, представляющая собой шприц или ручку, наполненную жидкой композицией. Вышеописанная композиция является готовой для инъекции интерлейкина-2 и стабильной. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

1. Стабильная готовая для инъекции жидкая фармацевтическая композиция для введения интерлейкина-2 субъекту, включающая:

- нелиофилизированный интерлейкин-2 (IL-2), имеющий специфическую активность 8-18 ММЕ/мг белка, который присутствует в концентрации 1-20 ММЕ/мл,

- буферирующий агент в концентрации от 5 мМ до 100 мМ, где буферирующий агент выбран из группы, состоящей из фосфорной кислоты, гидрохлорида трис (гидроксиметил) аминометана (TRIS-HCl), трис-глицина, цитрата, бората, фосфата, цитрата/фосфата, бикарбоната, глутарой кислоты, янтарной кислоты, их соли и их комбинации, и

(iii) поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,05 до 0,5 мг/мл, где поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия в воде,

где рН композиции составляет от 7,1 до 7,8 и массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 составляет от 0,1 до 3,0.

2. Жидкая фармацевтическая композиция по п. 1, в которой интерлейкин-2 присутствует в концентрации 2-12 ММЕ/мл.

3. Жидкая фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, в которой поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия.

4. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-5, в которой массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 составляет от 0,22 до 2,25.

5. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-4, которая имеет осмолярность не менее 250 мОсмоль.

6. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-5, в которой интерлейкин-2 представляет собой рекомбинантный человеческий интерлейкин-2 или его варианты.

7. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, которая не включает маннит и/или альбумин, сахарозу, декстрозу, трегалозу, аминокислоты и гидроксипропил-b-циклодекстрин.

8. Жидкая фармацевтическая композиция по п. 1, в которой

интерлейкин-2 присутствует в дозе 2-12 ММЕ/мл,

буферирующий агент выбран из одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия и их комбинации и присутствует в концентрации от 5 мМ до 25 мМ,

поверхностно-активное вещество представляет собой додецилсульфат натрия и

массовое отношение поверхностно-активного вещества к интерлейкину-2 составляет от 0,22 до 2,25.

9. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-7, которая характеризуется по меньшей мере одной из следующих особенностей:

- буферирующий агент представляет собой фосфатный буфер в концентрации от 5 мМ до 25 мМ,

- интерлейкин-2 представляет собой альдеслейкин,

- жидкая фармацевтическая композиция подходит для упаковки в устройство доставки для инъекции, выбранное из шприца или автоинжектора,

- фармацевтическая композиция не включает какой-либо стабилизатор для лиофилизации и/или

- жидкая фармацевтическая композиция устойчива при 5°С в течение по меньшей мере 6 месяцев.

10. Жидкая композиция по любому из пп. 1-9, дополнительно включающая агент, регулирующий осмолярность, который представляет собой хлорид натрия.

11. Жидкая фармацевтическая композиция по п. 10, в которой:

интерлейкин-2 присутствует в концентрации 0,40 мг/мл, что соответствует 5 ММЕ/мл,

додецилсульфат натрия присутствует в концентрации 0,36 мг/мл,

хлорид натрия присутствует в концентрации 8,3 мг/мл, и

фосфатный буфер присутствует в концентрации от 10 мМ,

в воде.

12. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11 для применения путем подкожной инъекции.

13. Применение жидкой фармацевтической композиции, определенной в любом из пп. 1-12, при лечении или предупреждении аутоиммунного, связанного с иммунитетом, или воспалительного расстройства, в котором указанную композицию вводят подкожным путем в количестве, эквивалентном дозе интерлейкина-2 0,1 ММЕ - 3 ММЕ.

14. Способ получения жидкой фармацевтической композиции по любому из пп. 1-11, включающий стадии:

а) предоставления концентрированного раствора очищенного нелиофилизированного интерлейкина-2,

b) получения композиции концентрированного раствора очищенного нелиофилизированного интерлейкина-2,

которое включает стадию добавления указанного очищенного нелиофилизированного интерлейкина 2 в раствор, содержащий буферирующий агент и поверхностно-активное вещество в воде, как определено в п. 1, с тем, чтобы получить указанную жидкую фармацевтическую композицию с интерлейкином-2,

с) необязательно упаковки жидкой фармацевтической композиции во флакон, картридж или устройство доставки для инъекции, выбранное из шприца или ручки.

15. Фармацевтический набор для подкожного введения IL-2 субъекту, включающий флакон или картридж, включающий жидкую композицию по любому из пп. 1-11 и средства для подкожной инъекции, выбранные из шприца, иглы и/или автоинжектора.

16. Система доставки для подкожной инъекции IL-2 субъекту, представляющая собой шприц или ручку, наполненную жидкой композицией по любому из пп. 1-11.