СПОСОБ И АППАРАТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ КАРДИОМИОБЛАСТОВ Российский патент 2022 года по МПК C12M3/00 C12N5/775 

Область техники

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, клеточной инженерии и может быть использовано для получения клеточных и тканевых препаратов для заместительной терапии при лечении заболеваний сердца.

Уровень техники

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой мультипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в клетки различных мезенхимальных тканей, в том числе в кардиомиобласты. Доказано, что мезенхимальные стволовые клетки могут быть использованы для восстановления и регенерации поврежденной сердечной мышечной ткани в случаях перенесенного инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, клапанной патологии, у пациентов после операции аортокоронарного шунтирования и др. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10102814). Предпочтение отдается аутологичным мезенхимальным стволовым клеткам, которые могут быть получены из костного мозга, жировой ткани или пуповинной крови. Исследования последних лет (в том числе рандомизированное исследование APOLLO), показывают, что лечение пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда, аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани пациентов, приводит к улучшению кровотока в поврежденном миокарде и увеличению фракции выброса левого желудочка. Однако, несмотря на доступность мезенхимальных стволовых клеток и несложный процесс выделения, остается открытым вопрос о приживаемости трансплантируемых кардиомиобластов и тканевых препаратов, получаемых из мезенхимальных стволовых клеток, а также по-прежнему ведутся поиски оптимальных условий их культивирования с целью направить МСК по определенному пути дифференциации (в кардиомиоциты, нервные клетки, клетки хрящевой ткани и т.д.). Для этого предлагаются различные подходы, связанные с использованием как химических (в том числе ростовых факторов, гормонов, витаминов и так далее), так и физических факторов (механической, электрической, магнитной стимуляции), а также различных их сочетаний (см., например, Devalla H.D. et al. “Cardiac differentiation of pluripotent stem cells and implications for modeling the heart in health and disease” // Sci. Transl. Med. 10, 4 April 2018; 244-265).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является способ и устройство воздействия на аутологичные стволовые клетки в процессе их культивирования импульсным постоянным электрическим полем, синхронизированным с сигналами ЭКГ пациента, с целью их дальнейшего использования в качестве клеточной терапии при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, известный из документа US2010292747 A1. Целью такого воздействия является синхронизация доставки электрической и механической энергии, химических веществ и др. в клеточную культуру в ритме с собственными сердечными клетками пациента для улучшения их дальнейшего «подключения» к клеткам собственного организма, в том числе к проводящей системе сердца.

Сущность изобретения

Технической проблемой, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка метода и аппарата для получения аутологичных кардиомиобластов из мезенхимальных стволовых клеток в специальных аутологичных электромагнитных условиях для создания жизнестойких кардиальных клеточных культур для заместительной трансплантационной терапии поврежденного миокарда.

Технический результат настоящего изобретения заключается в создании способа и устройства для обеспечения максимально аутологичной среды культивирования кардиомиобластов с целью получения жизнестойкой культуры клеток, которые после возврата в организм смогли бы выжить.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, предложен способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты, включающий их культивирование в условиях искусственно сгенерированного электромагнитного поля, аутологичного по отношению к указанному пациенту.

При этом параметры искусственно сгенерированного электромагнитного поля определяются формой сигналов электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента. Магнитное поле создается током, а электрическое поле - напряжением, мгновенное значение которых определяется соответствующим сигналом, определяемым формой сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения магнитное поле и электрическое поле воздействуют на стволовые клетки одновременно, а в некоторых - раздельно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в процессе воздействия на стволовые клетки пациента величину и ориентацию полей изменяют.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мезенхимальные стволовые клетки предварительно помещают в среду, содержащую комитирующий агент, например, деметилирующий агент 5-азацитидин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения электромагнитное поле используют непрерывно на протяжении культивирования клеток.

В соответствии со вторым из аспектов настоящего изобретения, предложено устройство для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты, включающее автономную рабочую камеру, в которой можно размещать клеточные культуры, на противоположных стенках которой расположена по меньшей мере одна пара катушек индуктивности для создания магнитного поля и металлические пластины с контактами для создания электрического поля; аналоговый генератор сигналов, встроенный в указанную камеру, для генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения, повторяющих временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента, подаваемых на катушки индуктивности и на контакты металлических пластин в соответствии с заранее заданной программой; модуль программной обработки, выполненный с возможностью оцифровки зарегистрированного сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента, обработки полученного цифрового кода, преобразования обработанного цифрового кода в аналоговый сигнал посредством цифро-аналогового преобразователя, входящего в состав указанного модуля, и передачи последовательности данных в память аналогового генератора.

В некоторых вариантах осуществления изобретения на противоположных стенках рабочей камеры расположены три пары катушек с взаимно перпендикулярными осями для создания магнитного поля и три пары металлических пластин с контактами для создания электрического поля.

В некоторых вариантах осуществления изобретения генератор выполнен с возможностью управления ориентацией и величиной создаваемых магнитного поля и электрического поля за счет изменения фазового сдвига между сигналами, подаваемыми на разные пары катушек индуктивности и металлических пластин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения генератор выполнен с возможностью одновременной или раздельной подачи сигналов тока и напряжения на катушки индуктивности и на металлические пластины.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рабочая камера дополнительно содержит изолирующие прокладки, расположенные на металлических обкладках

В некоторых вариантах осуществления изобретения модуль программной обработки соединяется с аналоговым генератором сигналов через контактный порт, расположенный на стенке камеры.

В некоторых вариантах осуществления изобретения модуль программной обработки соединяется с входом аналогового генератора с помощью беспроводного канала передачи данных, который функционирует согласно стандарту, выбранному из группы: BLE, Wi-Fi, ATM, SS/7, X.25, WiMAX, SCCP, DUP, B-ISUP, ISUP, TUP, TCAP, SSCOP, H.323, SIP, BICC, IS-41, IS-634, CAS, CS1, CS2, R2, CAMEL, INAP, MAP.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аналоговый генератор сигналов выполнен с возможностью дистанционного включения и генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аналоговый генератор выполнен с возможностью ручного включения посредством тумблера и генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения.

Краткое описание чертежей

Сущность изобретения поясняется чертежами, где

на фиг. 1 приведен общей вид рабочей камеры, генерирующей электромагнитное поле, используемое для дифференцировки стволовых клеток пациента в кардиомиобласты;

на фиг. 2 представлена автономная рабочая камера;

на фиг. 3 представлена автономная рабочая камера и ЦАП, который выполнен в отдельном блоке, расположенном снаружи камеры.

на фиг. 4 приведена блок-схема работы устройства согласно настоящему изобретению в варианте осуществления, когда снимают электрокардиограмму пациента.

Следует понимать, что данные чертежи представляют просто схематические изображения и не соответствуют масштабу.

Термины и определения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий», также как «содержит» и «содержащий» интерпретируются как означающие «включает (содержит), помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «стволовые клетки», применяемый в настоящем документе, относится к основным клеткам, которые способны неограниченно обновляться, формируя определенные клетки тканей и органов. Стволовые клетки представляют собой способные к развитию мультипотентные или плюрипотентные клетки. Стволовая клетка может делиться на две дочерних стволовых клетки или одну дочернюю стволовую клетку и переходную клетку, и затем они пролиферируют, образуя определенные зрелые типы клеток тканей. Эти стволовые клетки можно классифицировать различными способами. Один из наиболее широко используемых способов основан на способности стволовых клеток к дифференцировке. Настоящее изобретение не подразумевает использование эмбриональных стволовых клеток.

Термин «мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки» (МСК) в настоящей заявке - это мультипотентные клетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающие способностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимного ряда: хондроциты, остеоциты, адипоциты. Существуют методы дифференцировки МСК в клетки, которые в организме формируются из других зародышевых листков: эпителиоциты, нейроноподобные клетки. МСК оказывают иммуномодулирующие действие, выделяют ангиогенные факторы, а также способны к миграции к месту повреждения. Кроме того, МСК способны дифференцироваться в клетки поврежденных тканей, способствуя, таким образом, восстановлению функциональной целостности органа или ткани. Подобные свойства позволяют рассматривать МСК как перспективный инструмент регенеративной терапии, основанной на клеточных технологиях.

Термин «дифференцировка», применяемый в настоящем документе, относится к процессу, в ходе которого клетки становятся специализированными по структуре или функциям во время деления, пролиферации и роста клеток, то есть происходит изменение морфологии или функций клеток, в результате чего клетки и формируемые ими ткани и органы могут выполнять свои функции. В целом, это процесс, в ходе которого относительно простая система разделяется на две или более качественно других частичных систем. Дифференцировка относится к состоянию, в котором части определенной биологической системы, бывшие изначально гомогенными, становятся качественно отличными друг от друга, или в результате они делятся на качественно различимые части или частичные системы.

«Кардиомиобласты» - бластные клетки-предшественники кардиомиоцитов, получаемые из мезенхимальных стволовых клеток предложенным согласно настоящему изобретению способом, после их получения клетки можно собрать, выделить и очистить известными способами, чтобы эффективно получить большие количества высокоочищенных кардиомиобластов. Полученные таким образом кардиомиобласты далее называются кардиомиобластами, полученными в соответствии с настоящим изобретением. После введения кардиомиобластов пациенту, в результате дальнейшей дифференцировки, кардиомиобласты способны дифференцироваться в кардиомиоциты.

Кардиомиоциты, представляют собой клетки, которые обладают морфологическими, физиологическими и/или иммуноцитологическими характеристиками кардиомиоцитов. Например, в контексте физиологических и/или иммуноцитологических характеристик, клетки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут экспрессировать один или более маркеров, специфических для кардиомиоцитов, благодаря чему распознаются как кардиомиоциты.

Применяемый в настоящей заявке термин «аутологичное электромагнитное поле» относится к электромагнитному полю, которое создается на основе снятого физиологического параметра пациента, в частности, на основе электрокардиограммы или магнитокардиограммы.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу воздействия электромагнитного поля, аналогичного электромагнитному полю сердца конкретного пациента (т.е. аутологичного), на культуру мезенхимальных стволовых клеток, и к устройству, с помощью которого формируют электромагнитное поле и осуществляют указанное воздействие, с целью получения жизнестойких кардиальных клеточных культур, которые можно использовать для заместительной трансплантационной терапии поврежденного миокарда.

При осуществлении настоящего изобретения мезенхимальные стволовые клетки выделяются, например, из висцеральной жировой ткани пациента, полученной, например, во время операции аортокоронарного шунтирования. Жировая ткань может также забираться у пациента в амбулаторных условиях вне операции, а также при малоинвазивной липосакции. Далее ферментативным методом или иным известным методом из жировой ткани выделяют культуру МСК. Культура МКС может быть выделена из других типов тканей пациента. Приведенный пример не является ограничивающим.

Предварительно снимают сигнал ЭКГ или магнитокардиограмму пациента, у которого осуществляли забор мезенхимальных стволовых клеток, и осуществляют оцифровку снятого сигнала ЭКГ пациента или оцифровку сигнала магнитокардиограммы пациента. Полученные данные подвергаются обработке и передаются (копируются) в генератор разработанного устройства для формирования аналогового электромагнитного сигнала. Эти данные хранятся неопределенно долго в памяти генератора сигналов.

Полученные аутологичные МСК высевают в сосуды (флаконы или чашки Петри), в некоторых вариантах осуществления изобретения в сосуды добавляют среду, содержащую деметилирующий агент 5-азацитидин или другой комитирующий агент (например, аутологичную плазму пациента), и помещают в разработанное устройство (электромагнитную камеру), которое, в свою очередь, может быть размещено в СО₂ инкубаторе. Генератор сигналов электромагнитной камеры включается, и культивирование МСК начинается в условиях аутологичного электромагнитного поля, которое генерируется на основании записанных ранее в памяти генератора сигналов.

То есть, в одном из вариантов осуществления МСК под воздействием деметилирующего агента 5-азацитидин или любого другого известного комитирующего агента комитируют в кардиомиобласты. При этом типовая культивация происходит в дополнительных условиях аутологичного электромагнитного поля, в частности, в присутствии внешнего искусственно сгенерированного электромагнитного поля, получаемого в режиме реального времени и параметры которого определяются параметрами электрокардиограммы или магнитокардиограммы, снимаемой у того же самого пациента, у которого был произведен забор стволовых клеток.

В некоторых вариантах осуществления способа согласно настоящему изобретению для культивирования кардиомиобластов из МСК достаточно только условий аутологичного электромагнитного поля, создаваемого предлагаемымустройством.

Таким образом, в обоих вариантах осуществления изобретения, осуществляется способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты, включающий их культивирование в условиях искусственно сгенерированного электромагнитного поля, аутологичного по отношению к указанному пациенту. Параметры искусственно сгенерированного электромагнитного поля определяются формой сигналов электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента.

На выходе полученную стерильную культуру клеток вводят человеку «обратно» с использованием известных методов. Например, во время аортокоронарного шунтирования полученную культуру клеток вводят в рубцовые участки миокарда. В других вариантах используют специальные эндоваскулярные катетеры для трансэндокардиального введения клеток (инъекций клеток) в зону миокарда или внутрикоронарного введения в течение эндоваскулярной процедуры.

При этом магнитное поле создается током, а электрическое поле - напряжением, мгновенное значение которых определяется соответствующим сигналом, определяемым формой сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения магнитное поле и электрическое поле воздействуют на стволовые клетки одновременно. В некоторых вариантах осуществления изобретения магнитное поле и электрическое поле воздействуют на стволовые клетки раздельно.

При этом электромагнитное поле воздействует непрерывно на протяжении культивирования/дифференцировки клеток. Длительность воздействия определяется временем преобразования стволовых клеток в кардиомиобласты.

В процессе воздействия величина и ориентация электромагнитного поля может изменяться.

В некоторых вариантах осуществления, культивирование клеток с использованием аутологичного электромагнитного поля проводят в присутствии биохимических факторов дифференцировки стволовых клеток в кардиомиобласты.

Формирование электромагнитного поля осуществляется с помощью устройства, выполненного с возможностью создания управляемых магнитных и электрических полей для воздействия на сосуд (резервуар) с культурой клеток.

Согласно настоящему изобретению, данное устройство (устройство для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты) предназначено, в первую очередь, для генерации аутологичного по отношению к пациенту электромагнитного поля и включает модуль программной обработки снятого с пациента сигнала ЭКГ или магнитокардиограммы, аналоговый генератор сигналов с встроенной памятью для записи на нее параметров сигнала и автономную рабочую камеру, в которую встроен аналоговый генератор сигнала, и которая выполнена с возможностью генерации аутологичного электромагнитного поля на основании записанных данных в память аналогового генератора.

Модуль программной обработки выполнен с возможностью оцифровки зарегистрированного сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента, обработки полученного цифрового кода и передачи его через ЦАП в рабочую камеру. На выходе получается файл, описывающий определенные аутологичные электромагнитные параметры.

Генератор встроен в рабочую камеру. Внутри камеры помещается культура клеток. Например, генератор может располагаться на дне камеры. В качестве источника питания генератор сигналов имеет сменную или перезаряжаемую аккумуляторную батарею.

Рабочая камера является автономной и в предпочтительном варианте осуществления изобретения выполнена в виде диэлектрического полого куба (четырехгранной оболочки или кожуха), изготовленного из подходящего немагнитного материала (парамагнитные материалы здесь рассматриваются как немагнитные), например, алюминия или нержавеющей стали. В предпочтительном варианте осуществления изобретения стенки куба перфорированы для использования его в СО₂ инкубаторе.

Внутри рабочей камеры размещают резервуар (сосуд) с клеточными культурами, в частности, с суспензией, содержащей аутологичные МСК. Резервуар может быть расположен на держателе образцов.

На противоположных стенках рабочей камеры расположена по меньшей мере одна пара индукционных катушек для создания переменного магнитного поля и металлические пластины, являющиеся обкладками конденсаторов, с контактами для создания электрического поля. С целью обеспечения безопасности металлические пластины закрыты изолирующими прокладками.

В одном из вариантов изобретения в электромагнитной камере размещают одну пару катушек индуктивности и одну пару металлических пластин на противоположных стенках рабочей камеры. В предпочтительном варианте осуществления изобретения на противоположных стенках рабочей камеры расположены три пары катушек с взаимно перпендикулярными осями для создания магнитного поля и три пары металлических пластин с контактами для создания электрического поля. В этом случае возможно изменение взаимной ориентации электрического и магнитного полей (они могут быть параллельны или ортогональны), причем ориентация может изменяться в процессе воздействия.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве катушек индуктивности используются, не ограничиваясь, кольца Гельмгольца. Система колец Гельмгольца предназначена для получения постоянного или переменного магнитного поля с зоной однородности. Для питания систем колец Гельмгольца могут применяться различные блоки питания, генераторы мощных импульсов тока, регуляторы мощности, размещенные на интегральной схеме генератора сигналов.

Технические данные используемых катушек Гельмгольца:

• коэффициент преобразования - 180 мкТл/А (в центре системы),

• суммарное сопротивление при последовательном включении катушек около - 1 Ом,

• индуктивность при последовательном включении катушек - около 50 мкГн,

• максимальный непрерывный ток - 0.5 А,

• максимальный ток при повторно-кратковременном режиме работы - до 1 А,

• диаметр проходного отверстия - 60 мм,

• расстояние между катушками - 45 мм,

• габаритные размеры, не более: диаметр - 104 мм, высота - 55 мм,

• масса - не более 0.1 кг

Однако, в связи с тем, что для дифференцировки МСК в кардиомиобласты нет жестких требований к однородности магнитного поля, могут использоваться любые типы катушек индуктивности. При этом катушки должны быть подключены последовательно.

Катушки индуктивности, расположенные на противоположных гранях камеры, включаются последовательно и подключаются к генератору сигналов, интегральная микросхема которого формирует немодулированный сигнал тока (напряжения), обеспечивающий необходимое временное изменение соответствующей компоненты магнитного поля (направленной перпендикулярно плоскости соответствующих граней). В предпочтительном варианте осуществления изобретения катушки индуктивности, используемые в электромагнитной камере, выбраны из катушек индуктивности с одинаковыми параметрами (количество витков, диаметр, расстояние между катушками, величина тока в катушках).

Однако, в одном из вариантов осуществления изобретения, катушки индуктивности могут отличаться по параметрам. В этом случае эти отличия можно скомпенсировать настройкой усилителей сигналов, подключенных к соответствующим парам катушек индуктивности. Схема генератора сигналов содержит усилитель, а микропроцессор (микросхема) генератора выполнена с возможностью регулировать усиление сигнала, подаваемого на разные пары катушек. Изменение фазового сдвига между сигналами, подаваемыми на разные пары катушек, будет либо изменять ориентацию вектора магнитной индукции, либо приведет к его движению в пространстве.

Металлические пластины, расположенные на противоположных гранях камеры, подключаются своими контактами к генератору сигналов, интегральная микросхема которого формирует немодулированный сигнал напряжения, обеспечивая необходимое временное изменение соответствующей компоненты электрического поля (направленной перпендикулярно плоскости соответствующих граней).

Немодулированные сигналы электрического тока и напряжения, поступающие на катушки индуктивности и на контакты металлических пластин, повторяют временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента.

Аналоговый генератор сигналов встроен в камеру, выводы генератора сигналов подключены к катушкам индуктивности к контактам металлических пластин. Генератор сигналов имеет вход для подключения к внешнему модулю программной обработки. Программная обработка ЭКГ или магнитокардиограммы происходит вне самой камеры

Модуль программной обработки осуществляет программно-реализуемый способ обработки снятого сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы, заключающийся в оцифровке аналогового сигнала и обработке полученного кода с разделением на электрическую составляющую и магнитную составляющую. Далее обработанный цифровой код преобразуется в аналоговый сигнал посредством цифро-аналогового преобразователя, входящего в состав модуля программной обработки.

Пакет данных записывается в файл, который описывает следующие параметры:

- период выдачи данных, мс. Идентификатор - Т. Возможные значения - от 1 до 100. Допускается только один параметр.

- данные тока, мкА. Идентификатор - I. Диапазон значений - от -1000 до 50000.

- данные напряжения, мВ. Идентификатор - V. Диапазон значений - от 0 до 10000.

- количество данных, участвующих в цикле. Идентификатор - N. Диапазон - от 10 до 1024. Допускается только один параметр.

- Команда запуска - R. По этой команде начинается проигрывание последовательности без пульта. Параметр описывает режим проигрывания - 1 - проигрывается ток; 2 - проигрывается напряжение; 3 - проигрывается и ток и напряжение.

Файл состоит из записей. Запись начинается с идентификатора, затем следуют численные параметры.

Сформированный таким образом поток данных сохраняется в память аналогового генератора сигналов. В ответ на каждую запись посылается идентификатор записи и количество принятых параметров этой записи. После приема всех 4-х записей принятые данные активируются и становятся готовы для запуска. Например,

T10

I100,0,0,0,0,0,0

V1000 2000, 3000

4000

N100

R3.

Интегральная схема аналогового генератора сигналов выполнена с возможностью формирования и генерации сигналов электрического тока и напряжения, повторяющих временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента на основе записанных ранее в память генератора потока данных, подаваемых на катушки индуктивности и на контакты металлических пластин.

Как показано на фиг. 3, ЦАП находится в отдельном, независимом от рабочей камеры блоке. На фиг. 2 видно, что с одной стороны рабочей камеры находится выступ, под которым находится входное гнездо для передачи с модуля программной обработки, в состав которой включен ЦАП, в память генератора сигналов записи данных об обработанных сигналов ЭКГ или магнитокардиограммы. К этому гнезду, еще перед началом использования устройства, подключается кабель от модуля программной обработки, и происходит запись сигнала в память встроенного в камеру генератора сигналов. Сформированный таким образом поток данных сохраняется в память. Далее рабочую камеру отсоединяют от модуля программной обработки и используют ее автономно.

С противоположной стороны камеры расположена кнопка включения генератора и тумблер переключения режимов, их три: генерация электромагнитного поля, генерация только магнитного поля (подача сигнала на катушки индуктивности) и генерация только электрического поля (подача сигнала на металлические пластины).

В одном из вариантов осуществления изобретения возможно дистанционное включение генератора сигналов и/или дистанционная передача с модуля программной обработки в память генератора сигналов данных для генерации аналогового сигнала и/или возможно дистанционное переключение режимов генерации. В этом случае будет достигаться стерильность камеры и будет исключена возможная контаминация клеточной культуры внутри камеры.

Для изменения ориентации вектора магнитной индукции создаваемого магнитного поля и, соответственно, вектора электромагнитного поля, немодулированный сигнал напряжения, генерируемый генератором сигналов, может подаваться на разные пары катушек индуктивности. В некоторых вариантах осуществления изобретения для изменения движения в пространстве вектора магнитной индукции создаваемого магнитного поля (изменения вектора во времени) и, соответственно, вектора электромагнитного поля, генератор подает сигнал на все катушки индуктивности с разными фазовыми сдвигами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство дополнительно содержит по меньшей мере один дозатор для введения в резервуар для культивирования клеток биохимических факторов дифференцировки стволовых клеток в кардиомиобласты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство содержит модуль для культивирования клеток, содержащий смеситель, приспособленный для создания и поддержания однородной среды для культивирования.

Ниже представлен неограничивающий конкретный вариант осуществления электромагнитной камеры для создания в замкнутом объеме постоянных и переменных электромагнитных полей с заданными параметрам. Электромагнитная камера представляет собой кубический короб с размером сторон порядка 0,15 м.

Технические требования к электромагнитной камере:

Рабочий объем камеры - не менее 0.1×0.1×0.05 м.

Максимальная напряженность создаваемого в рабочем объеме магнитного поля - 100 А/м; однородность магнитного поля в рабочем объеме - не хуже 10%; максимальная напряженность создаваемого в рабочем объеме электрического поля - 100 В/м; однородность электрического поля в рабочем объеме - не хуже 10%. Диапазон частот создаваемых электромагнитных полей - 0-100 Гц.

Электромагнитная камера может быть сконструирована, как показано на фиг.1. Для ее создания пять пластин склеиваются, шестая закрепляется в виде крышки (на штифтах или на петлях). В пазы пластин с внутренней стороны наматывается по 10 витков медного изолированного провода диаметром 1 мм. Противоположные катушки соединяются последовательно.

Витки медного провода, образующие окружности, заклеиваются металлической фольгой (медь или латунь). От каждого листа фольги делается электрический вывод (всего шесть проводов) - для создания электрического поля.

Электромагнитную камеру плотно закрывают и помещают в СО₂-инкубатор в атмосферу газовой смеси, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха при 95% влажности и температуре 37°С.

Для запуска генерации аутологичного электромагнитного поля включается тумблер, или включение производится дистанционно с помощью пульта управления.

На фиг. 4 изображена примерная блок-схема 100 работы устройства для осуществления способа дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты.

На этапе 110 у пациента регистрируется электрокардиограмма или, в некоторых случаях, магнитокардиограмма.

Далее, на этапе 120, осуществляется обработка снятого сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы. В частности, аналоговый сигнал оцифровывается посредством компьютерной программы GetData 2.18, предназначенной для оцифровки графиков и карт и работающей с графическими файлами форматов BMP, JPEG и PCX. Полученные данные можно копировать в буфер обмена или экспортировать в другие форматы TXT (текстовый файл), XLS (MS Excel), XML, DXF (AutoCAD) и EPS (PostScript).

Продолжительность оцифровки должна быть такой, чтобы усреднить сигналы за несколько десятков (до сотни) периодов сердечных сокращений. Окончательный оцифрованный сигнал получается усреднением к одному сердечному циклу. Частота оцифровки должна быть не ниже десятикратной и не выше стократной частоты сердечных сокращений. Дискретность сигнала по амплитуде должна быть не меньше (1/256) - 8 двоичных разрядов. Итоговый цифровой сигнал повторяет временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента.

На этапе 130 осуществляется обработка полученного цифрового кода, в результате которой преобразованный сигнал разделяется на электрическую составляющую и магнитную составляющую.

На этапе 140 полученные данные преобразуются в аналоговые сигналы с помощью цифро-аналогового преобразователя, данные сохраняются в памяти аналогового генератора, встроенного в камеру.

На этапе 150 рабочую камеру отключают от модуля программной обработки, и она начинает работать автономно.

На этапе 160 включают аналоговый генератор.

На этапе 170 генератор формирует аналоговые немодулированные сигналы в соответствии с записанной в его памяти программой, подавая электрическую составляющую сигнала на обкладки конденсатора на всех внутренних стенках рабочей камеры, что дает возможность создать внутри электрическое поле. Магнитная составляющая передается катушкам, также расположенным на всех внутренних стенках рабочей камеры. Таким образом, создается возможность генерировать как электрическое, так и магнитное поле внутри камеры.

Магнитное поле создается током, проходящим по катушкам, при этом мгновенное значение тока определяется соответствующим сигналом, определяемым формой считанного ЭКГ сигнала или сигнала магнитокардиограммы. Поля могут прикладываться как одновременно, так и раздельно в зависимости от требуемого эффекта.

На этапе 180 в результате воздействия электромагнитного поля на мезенхимальные стволовые клетки, размещенные в рабочей камере электромагнитной камеры, культивируются в кардиомиобласты. В результате такого воздействия, обеспечивающего максимально аутологичную среду культивирования кардиобластов, полученные кардиомиобласты обладают повышенной жизнестойкостью и, после возврата в организм, имеют высокие шансы выжить. Полученная таким образом культура кардиомиобластов может непосредственно вводиться пациенту во время оперативных вмешательств на сердце или вводиться пациенту с помощью специальных эндоваскулярных инъекционных катетеров через пункционный сосудистый доступ. Также возможно введение полученной клеточной культуры парентерально в физиологическом растворе. Кардиомиобласты вводятся пациенту, чтобы в последующем дифференцироваться в кардиомиоциты в сердце.

Полученные кардиомиобласты возможно применять для заместительной клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с дефицитом, повреждением и/или разрушением ткани сердца, включающий доставку эффективного количества кардиомиобластов, полученных с использованием заявленного устройства, в сердечно-сосудистую систему пациента. Например, применение полученных кардиомиобластов возможно для заместительной клеточной терапии после инфаркта миокарда, при застойной сердечной недостаточности, а также после открытых вмешательств на сердце. Такой метод лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, не связанный с повреждением сердечной мышцы, является нетоксичным и безопасным.

При внутримиокардиальном введении клеток, полученных с использованием заявленного устройства, оптимизируется процесс приживаемости кардиомиобластов в процессе клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. При этом бластные формы, способные к паравазальной миграции и выращенные в «родных» условиях, выживают и трансформируются в кардиомиоциты. Имеет место быть действительно тканевая заместительная терапия, а не стимуляция ангиогенеза за счет элементов, выделившихся при разрушении клеток.

Также полученные кардиомиобласты могут быть использованы в биопринтинге при создании искусственного сердца.

Теоретическое обоснование метода.

В результате многочисленных экспериментов по исследованию влияния электромагнитных полей на биообъекты было выявлено, что переменные магнитные поля с амплитудами, близкими к естественным (10 нТл) в диапазоне частот 0.01-100 Гц могут оказывать значимые биологические воздействия. Например, на основе обширных экспериментов в [1] показано, что магнитное поле частотой 0.01 Гц и амплитудой 10 нТл способно сократить размножение бактерий E.coli на 37.7%, а в [2] показано, что переменные магнитные поля амплитудой 5.1 нТл и с частотами 0.01, 0.04, 0.08, 0.6, 1, 6, 10, 11, 26 Гц оказывают значимые воздействия на систему крови белых крыс.

Не менее очевидным является улучшение функционирования органов, оказавшихся в поле, аналогичном собственному полю [3].

Таким образом, логично предположить, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток пациента в кардиомиобласты в условиях искусственно сгенерированного электромагнитного поля, аутологичного по отношению к указанному пациенту, будет имитировать аутологичную среду для кардиальных клеточных культур, усиливая их рост и устойчивость для заместительной трансплантационной терапии поврежденного миокарда.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Литература.

1. Ачкасова Ю. Н. Избирательная чувствительность бактерий к инфранизкочастотным магнитным полям // Электромагнитные поля в биосфере, - М.: Наука, 1984, т. 2, с. 72.

2. Макеев В. Б., Темурьянц Н. А., Владимирский Б. М., Тишкина О. Г. Физиологически активные инфранизкочастотные магнитные поля // Электромагнитные поля в биосфере, - М.: Наука, 1984, т. 2, с. 62-72.

3. Субботина Т.И., Хадарцев А.А., Яшин М.А., Яшин А.А. Воздействие электромагнитного излучения, модулированного частотами дельта-ритма головного мозга // Нижегород. мед. журн. - 2004. - N 3. - С.180-182. - Библиогр.: 5 назв.

Изобретение относится к биотехнологии, клеточной инженерии и медицине, в частности к устройству для культивирования мезенхимальных стволовых клеток пациента в условиях искусственно сгенерированного электромагнитного поля, аутологичного по отношению к указанному пациенту, параметры которого определяются формой сигналов электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента. Указанное устройство содержит автономную рабочую камеру, аналоговый генератор сигналов, встроенный в указанную камеру, а также модуль программной обработки. Указанная рабочая камера предназначена для размещения резервуара с клеточными культурами, на противоположных стенках которой расположена по меньшей мере одна пара катушек индуктивности для создания магнитного поля и металлические пластины с контактами для создания электрического поля. Указанный аналоговый генератор сигналов предназначен для генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения, повторяющих временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента, подаваемых на катушки индуктивности и на контакты металлических пластин в соответствии с заранее заданной программой. И указанный модуль программной обработки выполнен с возможностью оцифровки зарегистрированного сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента, обработки полученного цифрового кода, преобразования обработанного цифрового кода в аналоговый сигнал посредством цифро-аналогового преобразователя, входящего в состав указанного модуля, и передачи последовательности данных в память аналогового генератора. Настоящее изобретение позволяет обеспечить максимально аутологичную среду культивирования кардиомиобластов с целью получения жизнестойкой культуры клеток, которые после возврата в организм смогли бы выжить. 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

1. Устройство для культивирования мезенхимальных стволовых клеток пациента в условиях искусственно сгенерированного электромагнитного поля, аутологичного по отношению к указанному пациенту, параметры которого определяются формой сигналов электрокардиограммы или магнитокардиограммы пациента, включающее

- автономную рабочую камеру для размещения резервуара с клеточными культурами, на противоположных стенках которой расположена по меньшей мере одна пара катушек индуктивности для создания магнитного поля и металлические пластины с контактами для создания электрического поля,

- аналоговый генератор сигналов, встроенный в указанную камеру, для генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения, повторяющих временной ход сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента, подаваемых на катушки индуктивности и на контакты металлических пластин в соответствии с заранее заданной программой,

- модуль программной обработки, выполненный с возможностью оцифровки зарегистрированного сигнала электрокардиограммы или магнитокардиограммы указанного пациента, обработки полученного цифрового кода, преобразования обработанного цифрового кода в аналоговый сигнал посредством цифро-аналогового преобразователя, входящего в состав указанного модуля, и передачи последовательности данных в память аналогового генератора.

2. Устройство по п.1, в котором на противоположных стенках рабочей камеры расположены три пары катушек с взаимно перпендикулярными осями для создания магнитного поля и три пары металлических пластин с контактами для создания электрического поля.

3. Устройство по п.1, в котором генератор выполнен с возможностью управления ориентацией и величиной создаваемых магнитного поля и электрического поля за счет изменения фазового сдвига между сигналами, подаваемыми на разные пары катушек индуктивности и металлических пластин.

4. Устройство по любому из пп.1, 2, в котором генератор выполнен с возможностью одновременной или раздельной подачи сигналов тока и напряжения на катушки индуктивности и на металлические пластины.

5. Устройство по п.1, которое дополнительно содержит изолирующие прокладки, расположенные на металлических обкладках.

6. Устройство по п.1, в котором модуль программной обработки соединяется с аналоговым генератором сигналов через контактный порт, расположенный на стенке камеры.

7. Устройство по п.1, в котором модуль программной обработки соединяется с входом аналогового генератора с помощью беспроводного канала передачи данных, который функционирует согласно стандарту, выбранному из группы: BLE, Wi-Fi, ATM, SS/7, X.25, WiMAX, SCCP, DUP, B-ISUP, ISUP, TUP, TCAP, SSCOP, H.323, SIP, BICC, IS-41, IS-634, CAS, CS1, CS2, R2, CAMEL, INAP, MAP.

8. Устройство по п.1, в котором аналоговый генератор сигналов выполнен с возможностью дистанционного включения и генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения.

9. Устройство по п.1, в котором аналоговый генератор выполнен с возможностью ручного включения посредством тумблера и генерации немодулированных сигналов электрического тока и напряжения.