СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ И ТРАВМ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ Российский патент 2007 года по МПК A61K31/195 A61K35/28 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов с применением мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в сочетании с фармакологическими препаратами.

Известен способ лечения, в котором используют МСК, полученные из костного мозга человека, которые являются аллогенными для реципиента. Клетки костного мозга могут быть получены из подвздошного гребня, ребра или других медуллярных мест (US 20020064519 [1]). В предпочтительных вариантах реализации данный метод используется для ускорения регенерации поврежденных тканей скелета и соединительных тканей.

Недостатком известного способа является ограниченная сфера применения и относительно невысокая эффективность.

Известен способ лечения сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, ишемия, артериальная гипертензия, рестеноз, стенокардия, врожденные сердечно-сосудистые дефекты, воспаления артерий и капилляров, при котором используются стволовые клетки (US 20020098167 [2]). При этом стволовые клетки используются не в чистом виде, а путем приготовления лекарственного средства, которое кроме стволовых клеток содержит цитокины или цитокины с фармацевтически приемлемым носителем, а также с разбавителем или наполнителем. Использование цитокинов позволяет активизировать лечебное воздействие стволовых клеток. Приготовленное лекарственное средство может быть введено в мышечную ткань сердца или в кровеносные сосуды - вены или артерии.

Недостатком данного способа лечения является ограниченность применения, поскольку способ используется для лечения только сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, эффективность стимулирования стволовых клеток цитокинами не очень высока, что снижает, соответственно, и эффективность лечения.

Наиболее близким к заявляемому способу является известный способ лечения, в котором используются стволовые клетки в сочетании с фармацевтическими препаратами - гликоконъюгатами или гликопротеидами, которые направляют стволовые клетки в нужное место. Стволовые клетки получают из костного мозга или из крови. При этом стволовые клетки и гликоконъюгаты могут вводиться либо одновременно, либо в любой последовательности, т.е. стволовые клетки могут быть введены до введения гликоконъюгатов или после их введения (US 20040180040 [3]). С помощью этого способа можно лечить сердечные заболевания, болезни легких, почек, печени.

Недостатком данного способа является его относительно невысокая эффективность, что можно объяснить недостаточной стимуляцией стволовых клеток вводимыми гликоконъюгатами.

Заявляемый способ направлен на повышение эффективности лечения за счет сокращения сроков его проведения и расширения перечня заболеваний и травм, к которым может быть применен способ.

Указанный результат достигается тем, что способ лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов включает введение пациенту стабильных культур МСК, полученных из аутологичных или неаутологичных тканей человека, или введение дифференцированного потомства МСК внутривенно или непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность, после чего пациенту вводят внутримышечно или на пораженную поверхность препарат метапрогерол или лекарственные формы его химических аналогов.

Указанный результат достигается также тем, что для получения культур МСК в качестве аутологичных или неаутологичных тканей человека используют костный мозг.

Указанный результат достигается также тем, что метапрогерол или лекарственные формы его химических аналогов вводят через 15-60 минут после введения культур мезенхимальных стволовых клеток

Указанный результат достигается также тем, что метапрогерол или его аналоги вводят не менее трех раз с интервалом 48 часов.

Указанный результат достигается также тем, что разовая доза метапрогерола или его аналогов содержит не менее 50 мг активного вещества.

Введение пациенту стабильных культур аутологичных или неаутологичных МСК человека для лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов позволяет повысить эффективность лечения, заключающуюся в ускорении сроков выздоровления. В ряде случаев целесообразно введение дифференцированного потомства стабильных культур МСК аутологичных или неаутологичных тканей человека, поскольку дифференцированные в определенном направлении МСК обладают более выраженным лечебным эффектом, например МСК, дифференцированные в направлении кардиомиобластов, обладают большим лечебным эффектом при заболеваниях, связанных с поражением сердечной мышцы человека. Культуры упомянутых клеток можно вводить внутривенно, непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность в зависимости от характера заболевания или травмы. Например, внутривенное введение целесообразно осуществлять при таких заболеваниях, как диллятационная кардиомиопатия, травмы головного мозга, устойчивые к существующим методам лечения формы туберкулеза и др. Если в качестве пораженного органа выступает сердечная мышца, особенно при проведении операций на выключенном сердце (например, во время операции аортокоронарного шунтирования), кишечник со свищями (после оперативного лечения или при болезни Крона), то целесообразно вводить стволовые клетки путем инъекций в соответствующие участки поврежденного органа. Если же пораженными оказываются кожные или слизистые покровы (например, вследствие развития трофических язв, при диабетических язвах и др.), то целесообразно стволовые клетки наносить на пораженную поверхность (иногда совместно с проведением терапии теми же клетками, вводимыми внутривенно). Как установлено экспериментально, использование для лечения упомянутых выше МСК и последующего введения метапрогерола или его аналогов пациенту существенно ускоряет процесс выздоровления. В качестве аналогов метапрогерола можно использовать 2-(3'-диметиламинопропил)-5-метилгексен-4-овую кислоту (соединение М1) и 2-(3'-диметиламинопропил)-5,9,13-триметилтетрадекадиен-4,8,12-овую кислоту (соединение М2). По-видимому, это можно объяснить тем, что эти соединения, как и метапрогерол, имеют следующие ключевые группы в своей молекуле: пренильную (пренильные), карбоксильную и диалкиламиногруппу. Наличие этих групп свидетельствует о структурном сходстве этих соединений с природными веществами, в частности, с производными аминокислот и витаминами групп А, Е и К, и, вероятно, обусловливает фармакологическую активность этих соединений. Также в зависимости от характера заболевания или травмы раствор метапрогерола можно вводить внутримышечно или же на поверхность поражения. Как установлено экспериментально, можно применять не только метапрогерол, но и его аналоги, отличающиеся друг от друга числом пренильных групп, типом углеводородного спейсера, разделяющего карбоксильную и диалкиламино-группы и строением алкильных групп, связанных с атомом азота.

Наиболее целесообразно в качестве аутологичных или неаутологичных тканей человека, применяемых для получения культур МСК или их дифференцированных потомков, использовать костный мозг, хотя можно использовать и жировую ткань, в которой также содержатся МСК. Некоторым недостатком жировой ткани для получения культур МСК является относительная трудность разделения этой ткани для получения клеточной суспензии, которая высаживается в культуру, а также большая склонность полученных таким образом культур к дифференцировке в костную ткань.

Введение метапрогерола наиболее целесообразно осуществлять через 15-60 минут после введения культур мезенхимальных стволовых клеток, так как в этом случае трансплантированные клетки практически к моменту завершения процесса "хоминга" (поступление в ткани, где они выполняют репаративные функции) попадают в условия "активированного микроокружения" и могут участвовать в процессах пролиферации и дифференцировки.

Как показывает практика, для того чтобы обеспечить достаточно высокий лечебный эффект, можно ограничиться и одной инъекцией метапрогерола или его аналогов, но наиболее целесообразно осуществить не менее трех инъекций (или орошений) с интервалом 48 часов. Если интервал между инъекциями будет менее или более 48 часов, то из-за особенностей фармакокинетики препарата и обмена производимых им цитокинов и ростовых факторов стимулирующий эффект препарата на трансплантированные или резидентные МСК будет слабее выражен, чем при введении препарата через каждые 48 часов.

Разовая доза метапрогерола или его аналогов для "среднего" человека (массой 70 кг, что соответствует разовой дозе, составляющей примерно 0,7 мг/кг массы пациента) должна содержать не менее 50 мг активного вещества. Если количество активного вещества будет менее 50 мг, то это снижает эффективность лечения, хотя установлено, что ускорение процесса выздоровления имеет место при использовании стабильных культур МСК аутологичных или неаутологичных тканей человека или их дифференцированного потомства даже при использовании минимальных доз метапрогерола или его аналогов (на порядок ниже рекомендованных в качестве оптимальных) по сравнению с использованием только одних стволовых клеток.

Сущность заявляемого способа лечения заболеваний различной этиологии и травм различных органов поясняется примерами его реализации.

Пример 1. В самом общем случае предлагаемый способ реализуется следующим образом. Сначала у пациента забирают некоторое количество ткани, необходимой для культивирования стволовых клеток. Например, в случае использования костного мозга у пациента методом пункции из грудины или из подвздошной кости забирают примерно 1 мл костного мозга, в котором общая клеточность составляет примерно 10⁷ костномозговых клеток, среди которых 10³ клеток относятся к субпопуляции МСК. Извлеченную ткань культивируют общепринятыми методами получения МСК. Кратко, это заключается в помещении взятого в строго стерильных условиях, образца костного мозга объемом 0,5-1,0 мл в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывается пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмываются в среде 199 (производитель - фирма "Sigma", USA), центрифугируются при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируется в ростовой среде. В качестве ростовой среды служит среда RPMI-1640 (продукт фирмы "Sigma", USA), содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ (продукт фирмы "Sigma", USA), 20% эмбриональной телячей сыворотки ("Sigma", USA). Культивирование проводится в пластиковых флаконах Карреля (производства фирмы "Sigma", USA) с площадью дна 25 см², в которые вносится 5×10⁶-10⁷ клеток исходного костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продуваются газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещаются в обычный термостат, поддерживающий температуру в 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводится каждый раз, когда сменяется ростовая среда в данном флаконе или когда клетки пересеваются в новые культуральные флаконы. Для перевода МСК в дифференцировку в направлении кардиомиобластов используется известный метод воздействия деметилирующим агентом - 5-азацитидином в следующей модификации. К концу 3-х суток от начала культивирования клеток костного мозга во флаконы с клетками вносится 5-азацитидин ("Sigma", USA) в конечной концентрации 3 мМ на 24 часа, после чего среда заменяется на свежую, которая не содержит данный дифференцирующий агент, и продолжается культивирование со сменой среды, которую проводят через каждые 4-5 суток. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересеваются с использованием 0,25% раствора трипсина ("Sigma", USA) в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см²), а впоследствии при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см² ("Sigma", USA). Такой метод позволяет к концу 5-6 недели добиться получения популяции МСК или популяции кардиомиобластов человека в количестве (2-3)×10⁸ клеток, необходимых для трансплантации в организм донора исходного костного мозга (трансплантация аутологичных клеток) или в организм другого пациента (трансплантация неаутологичных клеток). В случае использования жировых тканей у пациента хирургическим путем стерильно извлекают из подкожной жировой прослойки примерно 1 г ткани, которую сначала разобщают механическим, а затем ферментативным путем, а затем культивируют тем же путем, как и описано выше для клеток костного мозга. Подготовленную культуру клеток вводят внутривенно, или внутрь пораженного органа, или на его поверхность. Спустя некоторое время (обычно не позднее, чем через 15-60 минут после трансплантации клеток) пациенту вводят внутримышечно некоторое количество метапрогерола или его аналога. Это может быть разовое введение с содержанием не менее 50 мг активного вещества или неоднократное, не менее трех, с интервалом приблизительно 48 часов.

Пример 2. У пациентки Р., 46 лет, страдающей трофическими язвами кожных покровов нижних конечностей, проводили орошение поверхности язв с последующим наложением стерильных салфеток, смоченные суспензией культуры МСК (всего на одно, ежедневно проводившееся орошение трофических язв применялось около 50 миллионов клеток, приготовленных культивированием ее собственного костного мозга, всего было проведено 5 орошений). Спустя 15 минут больной внутримышечно был введен 1 мл 5% водного раствора метапрогерола с содержанием активного вещества 50 мг. Следующие инъекции были проведены через 48 и 96 часов, соответственно, каждый раз после проведения процедуры орошения пораженной ткани. В результате наблюдалось быстрое (через 1 сутки от начала лечения) появление грануляций на поверхности трофической язвы и ее быстрое (на второй неделе от начала лечения) заживление. Больная наблюдается более полутора лет без рецидива заболевания.

Пример 3. В опытах на крысах линии Вистар, самцах, в возрасте 3 месяцев и массой 160-170 г в сравнительном аспекте изучался лечебный эффект внутривенной трансплантации аутологичных кардиобластов, полученных из МСК, и короткого курса метапрогерола и 2-х его аналогов - препаратов М1 и М2 (3 в/м инъекции соответствующего препарата в дозе 0,7 мг/кг сразу после трансплантации клеток и через 2 и 4 суток после первой инъекции) у животных, которым путем введения препарата антрациклинового ряда - адриамицина (суммарная доза 10 мг/кг) вызывали развитие кардиомиодистрофии. Согласно данным литературы введение адриамицина в использованной дозе приводит к гибели большого количества кардиомиоцитов по апоптотическому и некротическому типу и развитию кардиомиодистрофии, что использовалось уже в ряде исследований для изучения лечебного эффекта различных типов стволовых клеток. Через неделю после завершения введения крысам адриамицина (5 внутрибрюшинных введений по 2 мг/кг) их разделяли на 1 контрольную (интактные животные того же возраста) и 8 опытных групп, в каждой из которых было по 12 крыс, которых лечили трансплантацией аутологичными кардиомиобластами (по 2×10⁶ клеток в/в) с последующим введением метапрогерола или препаратов М1 и М2 троекратно по описанной выше схеме (три группы были с введением кардиомиобластов и одного из препаратов, а три другие - только с введением одного из препаратов; кроме того, дополнительно были сформированы 2 группы крыс, получивших или только воздействие адриамицина, без последующей терапии, или воздействие адриамицина с трансплантацией кардиомиоцитов без введения препаратов). Через 2 и 4 недели после трансплантации кардиомиобластов или начала терапии препаратами по 6 крыс в каждой группе забивали для количественного морфологического изучения состояния миокарда на продольных и поперечных срезах препаратов сердца животных (общая гистологическая и функциональная морфология миокарда), окрашенных гематоксилином и эозином, иммуноокрашенных на PCNA (индекс PCNA отражает фракцию пролиферирующих клеток) и импрегнированных методом AgNOR (метод оценки функциональной активности клеток путем определения зон ядрышковых организаторов). Морфометрические исследования были выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR (Франция) с применением программ Morphostar-2 и Colquant-2 и их данные частично (только по данным забоя через 4 недели после трансплантации кардиомиобластов) представлены в таблице 1.

Ранее нами было обнаружено, а в данном опыте было подтверждено то, что через две недели после окончания введения адриамицина в миокарде подопытных крыс выявляются морфологические признаки токсико-дистрофических изменений. Эти изменения охватывают практически все клеточные элементы миокарда. Определяется отек интерстициальной ткани и нарушение правильной ориентации мышечных волокон, практически во всех зонах миокарда периваскулярно и/или интерстициально определяются небольшие локальные пролифераты из стромальных клеток; миоциты с пикнотичными или лизированными ядрами диффузно рассеяны по миокарду, однако более часто такие гибнущие клетки выявляются в зоне межжелудочковой перегородки, наблюдается некроз кардиомиоцитов. На препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, регистрируется угнетение пролиферации кардиомиоцитов и соединительнотканных элементов. Через две недели после введения кардиомиоцитов крысам, которые получили введение адриамицина, гистопатологический рисунок миокарда крыс мало отличается от наблюдаемого при действии одного только адриамицина. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, отчетливо просматриваются очаговые дистрофические изменения со стороны кардиомиоцитов. Вместе с тем, у животных этих групп в субэпикардиальных зонах левого и правого желудочков определяются изменения со стороны микроциркуляторного русла и в периваскулярной строме. В просвете капилляров и периваскулярно появляются небольшие группы клеток с ярко выраженной реакцией на PCNA (т.е. делящиеся клетки). Для миокарда животных группы, получивших вместе с трансплантацией кардиомиобластов дополнительную терапию всех трех исследованных препаратов, в этот период характерно более "диффузное" распространение в тканях интенсивно пролиферирующих клеток. Вокруг капилляров отмечается повышенное содержание перицитов. При изучении препаратов сердца этих групп крыс обращало внимание то, что в ядрах кардиомиоцитов увеличиваются размеры ядрышек и усиливается базофилия саркоплазмы. В зонах миокарда, пораженных адриамицином, визуализировалось частичное восстановление поперечной исчерченности и миофибриллярной структуры мышечных волокон. В те же сроки эффект только одной терапии одним из трех использованных препаратов без введения кардиомиобластов был мало выражен и большинство использованных количественных показателей были близкими к таковым при действии одного только адриамицина. Можно только отметить, что визуально интерстициальное пространство в этих трех группах было более густо заполнено клетками соединительнотканной стромы и отек стромы был выражен менее интенсивно, кроме того, в достаточно большой мере выявлялись клетки, которые давали реакцию на PCNA. Через 4 недели после начала опыта при введении одного только адриамицина в сердце подопытных животных определялись морфологические признаки как токсико-дистрофических изменений, так и начинающейся репаративной регенерации миокарда (см. таблицу 1). По данным иммуногистохимии, резко усиливалось число PCNA-позитивных ядер клеток стромы, и чаще визуализировались меченые на PCNA ядра кардиомиоцитов. Репаративные процессы в миокарде были усилены в значительно большей степени через 4 недели от начала опыта, если проводилось введение аутологичных кардиомиоцитов отдельно или на фоне дополнительных курсов кратковременной терапии метапрогеролом или его аналогами (таблица 1). Подтверждением этому служит статистически достоверное увеличение размеров кардиомиоцитов и рост их пролиферативной и/или репаративной активности, а также частичное восстановление исходной гистологической картины сердечной мышцы при сравнении с нелеченным контролем (животными, которые подвергались только воздействию адриамицина). Одновременно лечебный эффект трансплантации кардиомиобластов отдельно или в сочетании с введением метапрогерола или его аналогов регистрировался и по такому простому и интегральному тесту, которым являлся средний вес сердца крыс в каждой группе (таблица 1).

Таким образом, в этих опытах, в эксперименте на лабораторных животных, был выявлен достоверный лечебный эффект трансплантации полученных из МСК кардиомиоцитов, примененных отдельно или совместно с введением метапрогерола и его аналогов, который превышает лечебное действие терапии одними только препаратами метапрогерола и его аналогов.

Пример 4. Пациент Г., 55 лет, перенесший ранее инфаркт миокарда, который привел к образованию сердечной аневризмы, продолжавший болеть ишемической болезнью сердца с повреждением как мышечной ткани, так и венечных сосудов, в плановом порядке подвергся хирургическому лечению - операции аортокоронарного шунтирования, а также иссечению аневризмы. Во время операции в зону иссеченной аневризмы и окружавших ее участков было введено путем 50 уколов объемом 0,1 мл на глубину не более 5 мм 2×10⁸ клеток - аутологичных кардиомиобластов, полученных из МСК собственного костного мозга. Одновременно на первый, третий и пятый день после операции пациенту ввели в/м по 1,0 мл 5% раствора метапрогерола. Состояние пациента значительно улучшилось (в течение первых 6 месяцев после операции с трансплантацией полученных из аутологичных МСК кардиомиоцитов фракция сердечного выброса возросла с 28% до 43%) и в течение более 1,5 лет он наблюдается без возобновления сердечного заболевания. У большинства аналогичных больных с ИБС и сердечной аневризмой, прооперированных в данной клинике, лечебный эффект операции аортокоронарного шунтирования был выражен слабее, чем у данного пациента (возрастание фракции выброса на 6-8%).

Пример 5. В опытах на крысах линии Вистар самцах, в возрасте 3 месяцев и массой 160-170 г в сравнительном аспекте изучался лечебный эффект местного применения аутологичных МСК и короткого курса метапрогерола (3 в/м инъекции препарата в дозе 0,7 мг/кг сразу после трансплантации клеток и через 2 и 4 суток после первой инъекции) у животных с травмой - тепловым ожогом кожи спины площадью около 3 см², нанесенным за 1 сутки до начала терапии местной аппликацией 10⁶ МСК однократно и 3-кратного введения метапрогерола. Кроме того, были сформированы группы (численностью 12 животных в каждой группе) одного только ожога, а также ожога, леченного или только применением МСК, или введением метапрогерола. Полное заживление кожной травмы в группе только одного ожога наблюдалось в течение 23±4 суток, при дополнительной терапии одним метапрогеролом или аппликацией МСК в течение 18±3 и 15±4 суток, соответственно, а при использовании двух лечебных воздействий совместно в течение 9±2 суток, т.е., в данном случае наблюдался эффект синергизма двух лечебных мероприятий.

Изобретение относится к медицине, к лечению различных заболеваний и травм с помощью мезенхимальных стволовых клеток (МСК) или их дифференцированного потомства. МСК вводят в виде культур, полученных из аутологичных или неаутологичных тканей человека, внутривенно или непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность. После этого пациенту внутримышечно или на пораженную поверхность вводят препарат метапрогерол или его химический аналог: 2-(3'-диметиламинопропил)-5-метилгексен-4-овую кислоту или 2-(3'-диметиламинопропил)-5,9,13-триметилтетрадекадиен-4,8,12-овую кислоту. Способ обеспечивает улучшение результатов лечения за счет ускорения процесса выздоровления даже при использовании минимальных доз метапрогерола или его аналога, усиления распространения в пораженных тканях интенсивно пролиферирующих клеток. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ лечения заболеваний и травм с помощью введения пациенту мезенхимальных стволовых клеток (МСК), отличающийся тем, что в качестве таковых вводят культуры МСК аутологичных или неаутологичных тканей человека или их дифференцированное потомство внутривенно или непосредственно внутрь пораженного органа или на его поверхность, после чего пациенту вводят внутримышечно или на пораженную поверхность метапрогерол или его химический аналог: 2-(3'-диметиламинопропил)-5-метилгексен-4-овую кислоту или 2-(3'-диметиламинопропил)-5,9,13-триметилтетрадекадиен-4,8,12-овую кислоту.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аутологичных или неаутологичных тканей человека используют костный мозг.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что метапрогерол или его химический аналог вводят через 15-60 мин после введения культур МСК.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что метапрогерол или его химический аналог вводят не менее трех раз с интервалом 48 ч.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что разовая доза метапрогерола или его химического аналога содержит не менее 50 мг активного вещества.