МАТРИЧНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2022 года по МПК C12N5/00 C12M3/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к матрице для культивирования клеток, в частности, к структурированной матрице высокой плотности для культивирования клеток. Настоящее изобретение также относится к применению матрицы для культивирования клеток и биореактору, содержащему указанную матрицу.

Уровень техники

Способы культивирования клеток, таких как эукариотические клетки, клетки животных, клетки млекопитающих и/или ткани, являются затруднительными и сложными, поскольку эти клетки являются хрупкими и во время роста имеют потребность в питательных веществах и кислороде, поддерживать которые затруднительно и сложно. Учитывая растущую потребность в культивировании клеток в больших количествах, биореакторы и устройства для культивирования стали важным инструментом в исследованиях и в получении клеток для получения активных белков и/или антител и/или любых побочных клеточных продуктов.

Биореакторы предшествующего уровня техники содержат неструктурированные матрицы для культивирования клеток и снабжены механизмами внутренней или внешней циркуляции для осуществления циркуляции питательной среды. Матрицы для культивирования клеток обычно содержат носители, которые могут иметь форму шариков с регулярной или нерегулярной структурой, или могут содержать тканые или нетканые микроволокна из полимера или любого другого материала, совместимого с выращиванием клеток. Носители могут иметь различные формы и размеры.

Некоторые недостатки могут быть присущи известным биореакторам и их неструктурированным матрицам для культивирования клеток. Отсутствие воспроизводимости однородности матриц для выращивания по объему при их загрузке, а также их перемещении и перераспределении во времени под воздействием потока питательной среды может привести к получению невоспроизводимой питательной среды и очень различающихся микросред в разных частях биореактора. Носители могут собираться в данной области внутри биореактора, что значительно снижает гомогенность при культивировании клеток. Следовательно, часть культивируемых клеток будет иметь очень ограниченный доступ или не будет иметь доступа к питательной среде и/или снабжению кислородом, что приводит к разному метаболизму клеток, различиям в качестве продукта, даже гибели указанных клеток и низкой скорости продуцирования клеток. Кроме того, неоднородные матрицы сложно изготовить и загрузить с учетом переменных размеров и форм носителей, которые могут прилипать друг к другу. Другим недостатком матриц для культивирования клеток предшествующего уровня техники является то, что поверхность их клеточной культуры не может быть определена с точностью. Наконец, загрузка носителей в биореактор является трудоемкой и, следовательно, дорогостоящей.

В патенте США 3948732 описана конструкция, которая включает в себя блок спиральной трубчатой камеры, через которую питательные среды и клетки проходят внутри камеры и вокруг центра спирали и прилипают к внутренней стенке камеры. Конструкция включает в себя разделительный элемент, снабженный разнесенными выступающими опорными элементами, который чередуется с блоком трубчатой камеры. Эти выступающие элементы предназначены для облегчения потока газа через поперечное сечение спиральной конструкции в продольном направлении. Ни при каких обстоятельствах разделительный элемент не вступает в контакт с какими-либо клетками или питательной средой в трубке, впрочем, как не обеспечивает прохождение клеток каким-либо образом.

Задачей настоящего изобретения является создание матрицы для культивирования клеток и биореактора, содержащего указанную матрицу, которые преодолевают по меньшей мере часть вышеупомянутых недостатков. Предпочтительно, матрица для культивирования клеток должна обеспечивать большую поверхность для культивирования клеток в небольшом объеме, в то же время обеспечивая циркуляцию среды и клеток. Следует избегать перепадов давления в системе, поскольку это отрицательно сказывается на жизнеспособности некоторых клеток. Воспроизводимость и однородность должны быть улучшены при сохранении ручного управления и минимальной стоимости. Необходимо обеспечить извилистый путь перемещения клеток и питательной среды в сочетании с разделительным слоем, который способствует прохождению вдоль этого пути и параллельно разделительному слою и слоям для иммобилизации клеток.

Раскрытие изобретения

В первом аспекте в настоящем изобретении предложена матричная конструкция для культивирования клеток или структурированная матрица для культивирования клеток по пп. 1, 8, 14, 22, 29 и 30.

Во втором аспекте в настоящем изобретении предложено применение матричной конструкции или матрицы для культивирования клеток в соответствии с любым вариантом осуществления изобретения для культивирования клеток.

В третьем аспекте в настоящем изобретении предложен биореактор, содержащий матричную конструкцию или матрицу для культивирования клеток в соответствии с любым вариантом осуществления изобретения.

Матричная конструкция или матрица для культивирования клеток по настоящему изобретению обладает несколькими преимуществами по сравнению с известными из уровня техники. Нестабильность в способе культивирования клеток избегают или минимизируют благодаря применению структурированной конструкции. Поверхность культивирования клеток может быть легко и точно определена благодаря известной поверхности культивирования клеток и количеству слоев для иммобилизации. Поверхность культивирования клеток, которая должна быть помещена в биореактор, также может быть легко адаптирована без изменения матрицы и/или модели биореактора.

Матрица обеспечивает улучшенный и организованный поток клеток и питательной среды внутри биореактора.

Кроме того, структурированная матрица для культивирования клеток обеспечивает эффективную загрузку в биореактор, тем самым оптимизируя использование внутреннего пространства и увеличивая поверхность для культивирования клеток внутри указанного биореактора. Таким образом, матрица обеспечивает поверхность культивирования с высокой плотностью клеток. Кроме того, благодаря структурированной конструкции матрицы обеспечивается последовательное и воспроизводимое производство биореакторов, содержащих указанную матрицу.

Краткое описание чертежей

На фигурах 1A и 1B показаны поперечные сечения частей матричной конструкции в соответствии с двумя вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фигурах 2A-D показаны неограничивающие примеры матричной конструкции в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фигурах 3А-В показаны вид частично свернутой в соответствии с вариантом осуществления изобретения матричной конструкции в перспективе и сверху; и вариант осуществления конструкции в конфигурации с плотной загрузкой.

На фигуре 3C показан вид полностью свернутой в соответствии с вариантом осуществления изобретения матрицы.

На фигурах 4A-4D показаны примеры структур сетчатого разделительного слоя в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фигуре 5 показана камера биореактора, снабженная матричной конструкцией в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, в которой жидкость и клетки протекают в продольном направлении вдоль поверхностей разделительных слоев и слоев для иммобилизации между верхом и дном или дном и верхом.

На фигуре 6 показан вид сбоку вращающегося биореактора, снабженного матричной конструкцией в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, вращающейся при применении вокруг своей оси.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к матричной конструкции для культивирования клеток, применению последней для культивирования клеток и биореактору, содержащему указанную матричную конструкцию.

Если не указано иное, все термины, применяемые для раскрытия изобретения, включая технические и научные термины, имеют значение, общепринятое для специалиста в области техники, к которой относится данное изобретение. Как приведено далее, определения терминов включены для лучшего понимания идеи настоящего изобретения.

Используемые в настоящем документе термины имеют следующие значения:

Артикли неопределенной и определенной формы в настоящем документе относятся как к единственному, так и к множественному числам, если контекст явно не указывает иное. Например, «ячейка» относится к одной или нескольким ячейкам.

Термин «примерно», используемый в настоящем документе, который относится к измеряемому значению, такому как параметр, величина, временной диапазон и тому подобное, подразумевает, что он охватывает отклонения ± 20% или менее, предпочтительно ± 10% или менее, более предпочтительно ± 5% или менее, еще более предпочтительно ± 1% или менее и еще более предпочтительно ± 0,1% или менее от указанного значения, пока такие изменения подходят для осуществления в раскрытом изобретении. Однако следует понимать, что значение, к которому относится модификатор «примерно», само по себе также раскрыто конкретным образом.

Термины «содержат», «содержащий» и «содержит» и «состоящий из», используемые в настоящем документе, являются синонимами терминов «включают в себя», «включающий в себя», «включает в себя» или «состоят», «состоящий», «состоит» и являются включающими или неограничивающими терминами, которые определяют наличие того элемента, который следует, например, компонента, и не исключают или устраняют наличие дополнительных, не перечисленных компонентов, признаков, элементов, членов, этапов, известных в данной области техники или раскрытых в нем.

Перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа и дроби, включенные в этот диапазон, а также перечисленные конечные точки.

Термины «конструкция», «матричная конструкция» и «матрица» используются взаимозаменяемо по всему тексту.

В первом аспекте в настоящем изобретении предложена матричная конструкция для культивирования клеток, которая содержит один или более слоев для иммобилизации клеток, имеющих поверхность, которая обеспечивает адгезию и рост клеток на поверхности и формирование секции иммобилизации клеток. Рядом с данными слоями для иммобилизации клеток находятся один или более разделительных слоев, в том числе структура, которая образует разделительную секцию, позволяющую клеткам и среде проходить через открытый, но извилистый путь, при условии, что структура или природа разделительных слоев выбрана таким образом, чтобы разделительные слои образовывали извилистый открытый путь для клеток и питательной среды для перемещения параллельно поверхности указанных разделительных и слоев для иммобилизации. Извилистый путь или канал, образованный разделительной секцией, создает турбулентность, которая облегчает проникновение клетки и клеточной среды в слои для иммобилизации.

Упомянутые слои для иммобилизации клеток будут определять секцию иммобилизации клеток, тогда как указанные разделительные слои определяют разделительную секцию.

В дополнительном или альтернативном варианте осуществления в настоящем изобретении предложена структурированная матрица для культивирования клеток, содержащая одну или несколько разделительных секций и одну или несколько секций иммобилизации клеток. Каждая разделительная секция содержит по меньшей мере один разделительный слой, и каждая секция иммобилизации клеток содержит по меньшей мере один слой иммобилизации клеток, причем отношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет по меньшей мере 0,1, а толщина разделительной секции составляет по меньшей мере 0,1 мм. В варианте осуществления разделительная секция включает в себя структуру, которая обеспечивает извилистый путь или канал для перемещения клеток вдоль слоев.

Для осуществления задач настоящего изобретения извилистый путь следует понимать, как путь с направленными компонентами, которые изменяются относительно общего пути и вдоль него.

Матричный узел спроектирован таким образом, что он позволяет жидкости и клеткам течь в продольном направлении вдоль поверхностей разделительного слоя и слоя иммобилизации клеток в стационарном биореакторе или, в случае вращающегося биореактора, тангенциально вдоль поверхностей обоих слоев. Таким образом, следует выбирать структуру разделительных слоев, чтобы она создавала извилистый, но открытый путь между слоями иммобилизации, тем самым создавая турбулентность. Данная турбулентность будет помещать клетки и среду в слои для иммобилизации.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что такое разделение извилистых путей может быть достигнуто несколькими способами, которые хорошо известны в данной области техники. В одном варианте осуществления разделительный слой состоит из несущей структуры или сферических, почти сферических или яйцевидных объектов, таких как шарики, загруженных в виде трехмерной структуры друг на друга (см. фигуру 1В). Под несущей структурой следует понимать структуру, состоящую из шариков или сфер, необязательно зафиксированных на поверхностной опоре, которые образуют извилистый путь, по которому может протекать жидкость.

В другом варианте осуществления разделительный слой может представлять собой сетку или содержать сетчатую структуру. Для осуществления задач настоящего изобретения под сетчатой структурой или сеткой следует понимать структуру, включающую в себя переплетение или сетчатый рисунок из волокна, проволоки или нити, причем указанное переплетение определяет поры, отверстия или каналы, сформированные трехмерным плетением. Примеры сетчатых структур приведены на фигурах 4А-4D. Следует понимать, что их нельзя рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.

Матричная конструкция или матрица для культивирования клеток в соответствии с настоящим изобретением предусматривает субстрат, который обеспечивает рост клеток с высокой плотностью. Предпочтительно, биореактор с высокой плотностью клеток обеспечивает максимальную поверхность роста клеток при минимальном объеме. Модель настоящей матричной конструкции для культивирования клеток оптимизирована для удовлетворения данных требований. Посредством разделительной секции, прилегающей к секции иммобилизации, обеспечивают поток клеток и среды. Эти разделительные секции способствуют турбулентности и обеспечивают по существу тангенциальный поток между секциями адгезии клеток, в дополнение к случайному перпендикулярному потоку через слои для иммобилизации. Это увеличивает адгезию клеток на слои для иммобилизации в секциях иммобилизации.

Кроме того, клетки более равномерно распределяются внутри биореактора благодаря разделительным секциям, которые обеспечивают пространство для перемещения клеток до их адгезии и которые предотвращают действие секций иммобилизации в качестве фильтров. Разделение дополнительно позволяет улучшить удаление токсичных метаболитов, обеспечивая пространство для перемещения указанных метаболитов.

Разделительная секция дополнительно обеспечивает лучшее распределение питательной среды и, таким образом, питательных веществ внутри биореактора. Все клетки внутри биореактора в равной степени обеспечены питательной средой. Учитывая структурированную модель матрицы, предпочтительный путь питательной среды внутри биореактора не будет обеспечен. Это является улучшением по сравнению с неструктурированными матрицами предшествующего уровня техники, где создают предпочтительные пути для питательной среды при применении в биореакторе, когда неструктурированные носители перемещаются под воздействием потока питательной среды. Результатом является неоднородное распределение клеток.

Чтобы обеспечить минимальный перепад давления и потерю объема, разделительная секция состоит из конструкции, включающей извилистый путь для потока клеток и жидкости. В одном варианте осуществления структура представляет собой сетку. Посредством применения сетчатой структуры для разделительной секции поддерживают минимальную толщину физического барьера, что обеспечивает постоянное давление и тем не менее достаточное пространство между соседними секциями иммобилизации.

В варианте осуществления структура или размер ячейки разделительного слоя составляет от 0,05 мм до 5 мм. Выбор структуры или размера ячейки является важным, поскольку он в свою очередь влияет на баланс между обеспечением достаточного барьера между секциями иммобилизации, тем самым обеспечивая прохождение клетки и среды, обеспечивая при этом соответствующее давление в системе и достигая высокой плотности клеток. Отверстия в сетке или решетке могут иметь любую форму, например, круглую, эллиптическую, квадратную или прямоугольную. В варианте осуществления размер отверстий составляет по меньшей мере 0,05 мм, по меньшей мере 0,06 мм, по меньшей мере 0,08 мм, по меньшей мере 0,1 мм, по меньшей мере 0,15 мм, по меньшей мере 0,2 мм или по меньшей мере 0,25 мм. В другом или дополнительном варианте осуществления размер отверстий составляет не более 5 мм, не более 4,5 мм, не более 4 мм, не более 3,5 мм, не более 3 мм или любое значение, заключенное между вышеупомянутыми значениями.

Следует понимать, что толщина разделительной секции, которая состоит из одного или более разделительных слоев, будет влиять на функционирование матричной конструкции. В варианте осуществления толщина разделительной секции составляет по меньшей мере 0,1 мм, более предпочтительно от 0,1 мм до 5 мм, более предпочтительно от 0,2 мм до 1 мм. В варианте осуществления толщина разделительной секции составляет от 0,25 до 0,6 мм, например, 0,4 мм или 0,5 мм.

В варианте осуществления толщина разделительной секции в миллиметрах составляет по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,2, по меньшей мере 0,3, по меньшей мере 0,4, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,6, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, по меньшей мере 2,1, по меньшей мере 2,2, по меньшей мере 2,3, по меньшей мере 2,4, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 2,6, по меньшей мере 2,7, по меньшей мере 2,8, по меньшей мере 2,9, по меньшей мере 3, по меньшей мере 3,1, по меньшей мере 3,2, по меньшей мере 3,4, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 3,6, по меньшей мере 3,7, по меньшей мере 3,8, по меньшей мере 3,9, по меньшей мере 4, по меньшей мере 4,1, по меньшей мере 4,2, по меньшей мере 4,3, по меньшей мере 4,4, по меньшей мере 4,5, по меньшей мере 4,6, по меньшей мере 4,7, по меньшей мере 4,8, по меньшей мере 4,9, по меньшей мере 5, по меньшей мере 5,5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 6,5, по меньшей мере 7, по меньшей мере 7,5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 8,5, по меньшей мере 9, по меньшей мере 9,5, по меньшей мере 10 или любое значение, заключенное между вышеупомянутыми значениями.

В дополнительном или альтернативном варианте осуществления толщина разделительной секции в миллиметрах составляет не более 1000, не более 950, не более 900, не более 850, не более 800, не более 750, не более 700, не более 650, не более 600, не более 550, не более 500, не более 450, не более 400, не более 350, не более 300, не более 250, не более 200, не более 190, не более 180, не более 170, не более 160, не более 150, не более 140, не более 130, не более 120, не более 110, не более 100, не более 95, не более 90, не более 85, не более 80, не более 75, не более 70, не более 65, не более 60, не более 55, не более 50, не более 45, не более 40, не более 35, не более 30 не более 25, не более 20, не более 15, не более 12 или любое значение, заключенное между вышеупомянутыми значениями.

Толщина секции иммобилизации клеток в равной степени важна для функционирования системы. Секция иммобилизации клеток, которая имеет слишком большую толщину, приведет к плохо заселенной области, тогда как секция, которая является слишком тонкой, будет отрицательно влиять на доступную поверхность роста клеток, также отрицательно влияя на рост клеток. Предпочтительно толщина секции иммобилизации составляет от 0,1 мм до 15 мм, более предпочтительно от 0,1 мм до 10 мм, еще более предпочтительно от 1 до 5 мм или от 0,1 мм до 1 мм.

Существует необходимость баланса между достаточным потоком клеток и среды между поверхностями роста клеток и достаточно большой поверхностью клеток для роста клеток. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в идеальном случае соотношение между толщиной секции иммобилизации клетки и разделительной секции должно составлять по меньшей мере 0,1, и более предпочтительно от 0,1 до 5, еще более предпочтительно от 0,1 до 2, такое как, например, 1:1. Таким образом, потребности системы будут удовлетворены.

В варианте осуществления отношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,2, по меньшей мере 0,3, по меньшей мере 0,4, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 0,6, по меньшей мере 0,7, по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 0,9, по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,2, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,4, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,6, по меньшей мере 1,7, по меньшей мере 1,8, по меньшей мере 1,9, по меньшей мере 2, по меньшей мере 2,1, по меньшей мере 2,2, по меньшей мере 2,3, по меньшей мере 2,4, по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 2,6, по меньшей мере 2,7, по меньшей мере 2,8, по меньшей мере 2,9, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 или любое значение, заключенное между вышеупомянутыми значениями.

В дополнительном или альтернативном варианте осуществления отношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет не более 50, не более 45, не более 40, не более 35, не более 30, не более 25, не более 20, не более 19, не более 18, не более 17, не более 16, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11 или любое значение, заключенное между вышеупомянутыми значениями.

Разделительные слои и/или слои для иммобилизации клеток, которые составляют соответственно разделительную секцию и секцию иммобилизации в матричной конструкции, предпочтительно выполнены из биосовместимого полимера, выбранного из полиэфира, полиэтилена, полипропилена, полиамида, обработанного плазмой полиэтилена, обработанного плазмой полиэфира, обработанного плазмой полипропилена или обработанного плазмой полиамида. Указанные слои могут быть гидрофильными или гидрофобными. Слои для иммобилизации клеток предпочтительно являются гидрофильными.

Толщина обоих слоев предпочтительно составляет от 0,05 до 3 мм, более предпочтительно от 0,1 до 2 мм или от 0,1 до 1 мм.

Подходящий материал для слоя иммобилизации клеток может представлять собой тканый или нетканый материал. Предпочтительно применяют нетканый материал. Нетканый материал, в отличие от тканого материала, представляет собой полотно, которое создано не путем плетения или вязания и не требует преобразования волокон в пряжу. Нетканые материалы в широком смысле определяют как листовые или рулонные структуры, связанные друг с другом посредством переплетения волокон или нитей (и посредством перфорации пленок) механическим, термическим или химическим способом. Природа нетканого материала, применяемого в настоящей заявке, может быть любой, включая натуральные или синтетические волокна. Предпочтительно нетканый материал изготовлен из полимера, такого как полиэстер или полипропилен. Слои для иммобилизации клеток, применяемые в настоящем изобретении, могут быть выбраны из нетканого полиэтилентерефталата. Нетканый материал может быть обработан плазмой для улучшения адгезии клеток и потока.

Разделительные слои могут состоять из (биосовместимого) полимера с размером ячейки, как описано выше. В одном варианте осуществления разделительный слой представляет собой синтетическое тканое полотно или структуру. В другом варианте осуществления разделительный слой представляет собой несущую структуру. Такая структура может быть получена из биополимера (например, альгината). Другим подходящим материалом для этой задачи является диоксид кремния, полистирол, агароза, стирол-дивинилбензол, полиакрилонитрил или латекс.

Разделительный слой может быть обработан гамма-излучением для уменьшения бионагрузки.

Модель матричной конструкции может принимать различные формы в зависимости от применения и типа биореактора.

В варианте осуществления настоящего изобретения секция иммобилизации и разделительная секция расположены поочередно. Поочередное расположение означает, что за каждой разделительной секцией следует секция иммобилизации клеток, за которой непосредственно следует разделительная секция. Секции, расположенные поочередно, могут чередоваться в вертикальном положении, как показано на фигурах (см. далее), или в горизонтальном положении в соответствии с применением матрицы и/или биореактора, в который будет введена матрица.

В данном варианте осуществления один или более слоев для иммобилизации клеток наложены на один или более разделительных слоев (или наоборот). Эта конфигурация может повторяться несколько раз, если это считается необходимым для создания блока из нескольких секций иммобилизации и разделительных секций. В идеальном случае конечная конфигурация может содержать от 1 до 500 чередований вышеописанных слоев. Уложенные друг на друга слои могут быть расположены в рамке или кассете, или запечатаны/соединены по своей окружности. В другом варианте осуществления полученный блок может быть свернут вокруг оси или сердечника для получения спиральной конфигурации.

Количество слоев, применяемых как в секции иммобилизации, так и в разделительной секции, может быть выбрано на основе применения, характеристик слоев (габариты, размер и т.д.) и желаемого результата. Следовательно, количество слоев в любой секции иммобилизации или разделительной секции может находиться в диапазоне от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, еще более предпочтительно от 1 до 5.

Как уже упоминалось, наличие разделительных секций создает пространство внутри матрицы, через которое протекает питательная среда. Это обеспечивает улучшенную циркуляцию питательной среды через матрицу, тем самым достигая всех культивируемых клеток. Данный эффект является еще более сильным в варианте осуществления, в котором разделительная секция содержит один разделительный слой, а секция иммобилизации содержит два слоя иммобилизации. Питательная среда, протекающая внутри матрицы через разделительные секции, ориентирована тангенциально относительно секций иммобилизации клеток.

Разделительные секции улучшают жесткость матрицы благодаря жесткости разделительных слоев. Матрица в соответствии с любым вариантом осуществления изобретения может быть сжата любым способом, известным специалисту в данной области. Размер сжатой матрицы уменьшается максимально на 20%, предпочтительно максимально на 15%, более предпочтительно максимально на 10% по сравнению с размером несжатой матрицы.

В варианте осуществления одна поверхность по меньшей мере одного разделительного слоя или секции по меньшей мере частично не покрыта какими-либо слоями для иммобилизации клеток или другим слоем, или секцией. Секция с непокрытым слоем или слой предназначен для размещения в контакте с внутренней стенкой любого биореактора. Такая конструкция позволяет предотвратить поршневой эффект внутри биореактора.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения матричная конструкция состоит из конфигурации одного или более слоев для иммобилизации клеток, как описано выше, образующих секцию иммобилизации, и одного или более разделительных слоев, как описано выше, образующих разделительную секцию, расположенных рядом с (например, выше и/или под) указанными слоями для иммобилизации клеток. Необязательно наслаивание можно повторять для формирования чередующейся конфигурации в форме блока из одного или более слоев для иммобилизации клеток и одного или более разделительных слоев. Указанную полученную конфигурацию впоследствии спирально или концентрически наматывают вдоль оси или сердечника. Толщина разделительной секции может составлять от 0,1 мм до 5 мм, более предпочтительно от 0,2 мм до 1 мм, тогда как толщина секции иммобилизации может составлять от 0,1 до 5 мм. Отношение толщины секции иммобилизации к толщине разделительной секции предпочтительно составляет от 1:2 до 2:1, наиболее предпочтительно 1:1. Хотя количество слоев для его достижения может быть изменено в зависимости от характеристик применяемых слоев и, таким образом, выбрано по усмотрению, как описано выше, было обнаружено, что хороший результат был достигнут при применении двух слоев для иммобилизации и одного разделительного слоя. Толщина разделительных и слоев для иммобилизации составляет от 0,05 до 3 мм, более предпочтительно от 0,1 до 2 мм или от 0,1 до 1 мм. Хотя материал слоя иммобилизации и разделительного слоя не следует рассматривать как ограничивающий, слой иммобилизации предпочтительно изготовляют из тканого или нетканого полотна, или материала, как описано выше для других вариантов осуществления. Упомянутый разделительный слой также может быть сформирован из тканого или нетканого материала и может содержать сетчатую структуру.

Предпочтительно наружный слой конструкции, который является стороной, обращенной к стенке биореактора при помещении в биореактор, представляет собой разделительный слой. Это предотвращает рост клеток у стенки реактора. Такие биореакторы можно нагревать, и рост клеток в этой области может повлиять на выход и/или качество клеток. В дополнительном варианте осуществления несколько разделительных слоев предусмотрены на внешней границе конструкции, опять же, для обеспечения хорошей изоляции. В другом или дополнительном варианте осуществления предусмотрен изоляционный слой, который выполнен из другого материала в отличие от разделительного слоя.

Матричная конструкция является простой и воспроизводимой по сравнению с аналогами из предшествующего уровня техники. В настоящем изобретении дополнительно предложены масштабируемые матрицы, обеспечивая возможность простого получения матриц, имеющих конкретные размеры и/или поверхность роста клеток. Масштабируемость конструкции/матрицы по изобретению не влияет на однородность и/или качество обеспечиваемого потока питательной среды.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение конструкции/матрицы в соответствии с любым вариантом осуществления, описанным выше, для культивирования клеток.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен биореактор, содержащий конструкцию или матрицу в соответствии с любым вариантом осуществления, описанным выше. Биореактор может содержать более одной конструкции или матрицы. В дополнительном варианте осуществления конструкция/матрица и/или биореактор, содержащий указанную матрицу, являются одноразовыми. Конструкция/матрица может быть расположена в биореакторе вертикально или горизонтально.

Предпочтительно конструкция/матрица составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50% от внутреннего пространства биореактора. Указанная матрица составляет не более 100%, не более 90%, не более 80%, не более 70% или не более 60% от внутреннего пространства биореактора.

Биореактор может представлять собой биореактор любого типа, известный специалисту в данной области, такой как перфузионный биореактор, волновой биореактор, цилиндрический биореактор, вращающийся биореактор, биореактор с мешком, биореактор с подвижным слоем, биореактор с уплотненным слоем, биореактор с волокнистой загрузкой, мембранный биореактор, периодический биореактор или непрерывный биореактор. Биореактор может иметь любую форму и может быть изготовлен из любого материала, например, нержавеющей стали, стекла или пластика.

Предполагается, что настоящее изобретение не ограничено какой-либо формой реализации, описанной ранее, и что некоторые модификации могут быть добавлены в представленный пример без повторной оценки прилагаемой формулы изобретения.

Чертежи

На фигурах 1А и 1В показаны поперечные разрезы частей матричной конструкции в соответствии с двумя вариантами осуществления настоящего изобретения. Обеспечение одного или более разделительных слоев 3 или 3' между одним или более слоями 2 иммобилизации клеток (образующими секцию 10 иммобилизации) способствует возникновению турбулентности (показана черными стрелками) и случайного перпендикулярного потока (горизонтальные открытые стрелки). Конструкция образует канал для прохождения жидкости, который обеспечивает достаточное распределение потока при применении в неподвижном слое. Благодаря такой модели обеспечивают однородность потока жидкости, и, как следствие, ячейки в конструкции распределены в равной степени однородно. При обеспечении разделения, создающего извилистый открытый путь, поток клеток и среды имеет возможность проходить по поверхности обоих слоев. Турбулентность будет продвигать клетки и среду глубже в слои для иммобилизации клеток. В целом, модель обеспечивает воспроизводимость и однородность при применении для получения клеток.

На фигуре 1А изображен вариант осуществления, в котором разделительная секция 11 состоит из одного или более разделительных слоев 3, которые выполнены из сетчатого полотна. Примеры возможных сетчатых полотен, которые можно применять для этой цели, показаны на фигурах 4А-4D, демонстрирующих различные формы отверстий.

На фигуре 1B показан альтернативный вариант осуществления, в котором разделительная секция выполнена из сферических или почти сферических объектов, таких как шарики.

И сетчатая структура, и шарики являются примерами структур или слоев, которые обеспечивают извилистый открытый путь, как описано выше.

На фигурах 2А-2D показаны возможные схемы расположения ряда слоев для иммобилизации относительно разделительных слоев, которые соответственно составляют секцию 10 иммобилизации клеток и разделительную секцию 11.

Толщина каждой секции соответствует сумме толщин, содержащихся в ней слоев. В одном варианте осуществления разделительная секция 11 содержит один разделительный слой, а секция 10 иммобилизации клеток содержит два слоя иммобилизации клеток, как показано на фигурах 2А и 2В. В этой конфигурации по меньшей мере одна поверхность каждого слоя иммобилизации находится в контакте с одной поверхностью разделительного слоя. На фигурах 2С и 2D показаны альтернативные примеры, в которых разделительная секция 11 содержит один разделительный слой, и секция иммобилизации содержит три слоя иммобилизации.

Разделительные секции и секция иммобилизации клеток могут иметь любую форму и могут иметь сходные размеры. Матрица может быть сформирована путем чередования различных секций, тем самым получая трехмерную (3D) матрицу. Указанная матрица может иметь любую геометрическую форму, такую как цилиндрическая, треугольная, прямоугольная или любая неправильная трехмерная форма. Матрица также может иметь другие формы, полученные путем дополнительного формирования трехмерной матрицы, например, сворачивания трехмерной матрицы для получения спирали.

Пример свернутой матрицы показан на фигурах 3А-3B, показывающих соответственно вид свернутой матрицы в перспективе и вид сверху. На этих фигурах показана матрица или конструкция, которая «свободно» свернута, чтобы проиллюстрировать спиральную структуру. Следует понимать, что степень сворачивания матрицы является переменной в зависимости от применения конструкции и/или желания пользователя. Конструкцию или матрицу плотно сворачивают в структуру, такую как спиральная структура, показанная на фигуре 3С.

На фигуре 3С показан вариант осуществления настоящего изобретения, в соответствии с которым один или несколько слоев 2 иммобилизации клеток примыкают к одному или нескольким разделительным слоям 3, выполненным из сетчатой структуры, и, в результате, при необходимости наслоение можно повторять несколько раз для достижения конфигурации в форме блока. Вариант осуществления, показанный на фигуре 3С, показан как впоследствии свернутый спирально или концентрически вдоль оси или сердечника, при условии, что все слои имеют плотную намотку. Примеры сетчатых структур приведены на фигурах 4А-4D (увеличенный вид). Предпочтительно, сетчатая структура, включенная в разделительные слои по настоящему изобретению, образует извилистый путь для протекания клеток и жидкости, когда они наслоены между двумя слоями иммобилизации. В качестве альтернативы можно применять другие разделительные структуры, которые образуют такие извилистые пути. Диаметр сердечника, длина и/или количество слоев будут в конечном итоге определять размер конструкции или матрицы. Предпочтительно толщина слоев составляет от 0,1 до 5 мм. В варианте осуществления, показанном на фигуре 3D, толщина слоев составляет от 0,25 до 0,7 мм, при этом два слоя иммобилизации клеток чередуются одним разделительным слоем. Предпочтительно внешний слой полученной спиральной конфигурации будет представлять собой один или несколько разделительных слоев. В качестве альтернативы, в качестве внешнего слоя может быть предусмотрен изолирующий слой, который отличается как от разделительного стоя, так и от слоя иммобилизации клеток. Разделительные слои предпочтительно представляют собой тканое сетчатое полотно с размером ячеек от 0,05 до 5 мм. Слои для иммобилизации клеток предпочтительно представляют собой нетканый материал.

На фигурах 5 и 6 показаны соответственно стационарный биореактор и вращающийся биореактор, снабженный матричной конструкцией в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.

На фигурах 5 и 6 матрица, показанная на фигуре 3С, включена в камеры биореактора. В обоих вариантах осуществления поток клеток и среды будет проходить вдоль пути, созданного разделительными слоями.

В варианте осуществления, показанном на фигуре 5, питательные среды и клетки протекают через матричную конструкцию в продольном направлении по поверхности разделительных слоев и слоев для иммобилизации (сверху вниз или снизу вверх).

На фигуре 6 показан вращающийся биореактор, в котором матричная конструкция частично погружена в среду, и биореактор, и матрица вращаются вдоль своей оси. В этом варианте осуществления поток среды и клеток будет проходить в тангенциальном направлении вдоль поверхностей разделительного слоя и слоев для иммобилизации (по спиральной траектории).

Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и биотехнологии, в частности к матричным конструкциям для культивирования клеток, а также биореакторам, содержащим камеру, включающую такие матричные конструкции. Указанные матричные конструкции содержат один или более слоев для иммобилизации клеток, имеющих поверхность для адгезии и роста клеток и определяющих секцию иммобилизации клеток. Также матричные конструкции содержат один или более разделительных слоев, содержащих образующую извилистый путь структуру, которые определяют разделительную секцию, прилегающую к указанной секции иммобилизации клеток. Последняя обеспечивает прохождение клеток и среды по поверхности как секции иммобилизации клеток, так и разделительной секции, но по извилистому пути. При этом указанные клетки эффективно перемещаются в слои для иммобилизации и прилипают в их глубине. Слои для иммобилизации клеток выполнены из тканого или нетканого полотна. Соотношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет от 1:2 до 2:1. Наружный слой конструкции образован из одного или более разделительных слоев. Настоящее изобретение позволяет увеличить поверхность для культивирования клеток в небольшом объеме, в то же время обеспечивая циркуляцию среды и клеток, а также улучшить воспроизводимость и однородность матричных конструкций. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 пр.

1. Матричная конструкция для культивирования клеток, содержащая один или более слоев для иммобилизации клеток, имеющих поверхность для адгезии и роста клеток, указанные один или более слоев для иммобилизации клеток определяют секцию иммобилизации клеток, и один или более разделительных слоев, содержащих образующую извилистый путь структуру, указанные один или более разделительных слоев определяют разделительную секцию, прилегающую к указанной секции иммобилизации клеток, которая обеспечивает прохождение клеток и среды по поверхности как секции иммобилизации клеток, так и разделительной секции, но по извилистому пути, при этом указанные клетки эффективно перемещаются в слои для иммобилизации и прилипают в их глубине, причем один или более слоев для иммобилизации клеток выполнен из тканого или нетканого полотна, причем отношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет от 1:2 до 2:1, при этом наружный слой конструкции образован из одного или более разделительных слоев.

2. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 1, причем указанная матричная конструкция содержит одну или несколько разделительных секций и одну или несколько секций иммобилизации клеток.

3. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 1 или 2, в которой указанный разделительный слой содержит сетчатую структуру.

4. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 3, отличающаяся тем, что размер ячейки разделительного слоя составляет от 0,05 мм до 5 мм.

5. Матричная конструкция для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что толщина разделительной секции составляет по меньшей мере 0,1 мм, предпочтительно, от 0,1 до 5 мм.

6. Матричная конструкция для культивирования клеток, содержащая конфигурацию из одного или более слоев для иммобилизации клеток, выполненных из тканого или нетканого полотна, и одного или более разделительных слоев, выполненных из сетчатой структуры с размером ячеек от 0,05 мм до 5 мм, прилегающей к указанным слоям для иммобилизации клеток, при этом указанная конфигурация имеет спиральную или концентрическую намотку вдоль оси, отличающаяся тем, что толщина разделительных слоев и слоев для иммобилизации составляет от 0,05 мм до 3 мм, и причем отношение толщины секции иммобилизации к разделительной секции составляет от 1:2 до 2:1, при этом наружный слой конструкции образован из одного или более разделительных слоев.

7. Применение матричной конструкции по любому из пп. 1-6 для культивирования клеток.

8. Биореактор для культивирования клеток, содержащий камеру, включающую матричную конструкцию, как описано в любом из пп. 1-6.

9. Биореактор по п. 8, имеющий внутреннее пространство, и в котором матричная конструкция составляет по меньшей мере 10% и не более 100% от указанного внутреннего пространства.

10. Биореактор по любому из предыдущих пунктов, в котором наружный слой матричной конструкции для культивирования клеток, обращенный к стенке биореактора, состоит из одного или более разделительных слоев.

11. Биореактор по любому из предыдущих пунктов, в котором биореактор и/или матричная конструкция являются одноразовыми.

12. Матричная конструкция для культивирования клеток, имеющая спиральную конфигурацию, содержащая один или более слоев для иммобилизации клеток, имеющих поверхность, которая обеспечивает адгезию и рост клеток, и один или более разделительных слоев, содержащих образующую извилистый путь структуру, прилегающих к указанным слоям для иммобилизации клеток, и формирующих канал, обеспечивающий прохождение клеток и среды по поверхности одного или более слоев для иммобилизации клеток, причем образующая извилистый путь структура каждого разделительного слоя, приспособлена для перемещения клеток в один или более слоев для иммобилизации и прилипанию в их глубине, причем один или более слоев для иммобилизации клеток выполнен из тканого или нетканого полотна; причем отношение толщины по меньшей мере одного из одного или более слоев для иммобилизации к по меньшей мере одному из одного или более разделительных слоев составляет от 1:2 до 2:1.

13. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой отношение толщины по меньшей мере одного из одного или более слоев для иммобилизации к по меньшей мере одному из одного или более разделительных слоев составляет 2:1.

14. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой толщина каждого из одного или более разделительных слоев составляет от 0,05 мм до 3 мм.

15. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой толщина каждого из одного или более слоев для иммобилизации составляет от 0,05 мм до 3 мм.

16. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой каждый разделительный слой содержит сетчатую структуру.

17. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 16, в которой размер ячеек каждого разделительного слоя составляет от 0,05 мм до 5 мм.

18. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой один или более слоев для иммобилизации выполнены из биосовместимого полимера, выбранного из полиэфира, полиэтилена, полипропилена, полиамида, обработанного плазмой полиэтилена, обработанного плазмой полиэфира, обработанного плазмой полипропилена или обработанного плазмой полиамида.

19. Матричная конструкция для культивирования клеток по п. 12, в которой один или более разделительных слоев выполнены из биосовместимого полимера, выбранного из полиэфира, полиэтилена, полипропилена, полиамида, обработанного плазмой полиэтилена, обработанного плазмой полиэфира, обработанного плазмой полипропилена или обработанного плазмой полиамида.

20. Матричная конструкция по п. 12, в которой один или более слоев для иммобилизации являются гидрофильными.

21. Матричная конструкция по п. 12, в которой один или более разделительных слоев являются гидрофильными.

22. Матричная конструкция по п. 12, в которой по меньшей мере одна поверхность каждого слоя для иммобилизации находится в контакте с одной поверхностью по меньшей мере одного разделительного слоя.

23. Матричная конструкция по п. 12, в которой каждый разделительный слой формирует канал, обеспечивающий прохождение клеток и среды по поверхности прилегающего слоя для иммобилизации клеток.

24. Биореактор для культивирования клеток, содержащий камеру, включающую матричную конструкцию, как описано в любом из пп. 12-23.

25. Биореактор по п. 24, имеющий внутреннее пространство, и в котором матричная конструкция составляет по меньшей мере 10% и не более 90% от указанного внутреннего пространства.

26. Биореактор по п. 24, в котором биореактор и/или матричная конструкция являются одноразовыми.

27. Биореактор по п. 24, причем биореактор приспособлен для обеспечения потока через матричную конструкцию в продольном направлении снизу вверх.

28. Биореактор по п. 24, причем биореактор приспособлен для обеспечения потока через матричную конструкцию в продольном направлении сверху вниз.