СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ/ПОДДЕРЖАНИЯ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЛИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, СПОСОБ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЛИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК C12N5/00 C12N5/06 A61K35/12 

Область и предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к способу и устройствам для поддержания жизнедеятельности и размножения гемопоэтических стволовых клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к поршневому проточному биореактору с трехмерным наполнением стромальных клеток, предназначенному для поддержания жизнедеятельности и/или размножения гемопоэтических стволовых клеток, и/или для производства кондиционированной среды для поддержания жизнедеятельности и/или размножения гемопоэтических стволовых клеток.

Гемопоэтическая система у млекопитающих состоит из гетерогенной популяции клеток, которые по функциям находятся в пределах от взрослых клеток с ограниченной возможностью пролиферации до плюрипотентных стволовых клеток с широкими возможностями для пролиферации, дифференцировки и самообновления (1-3). Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) являются исключительно необходимыми для гемопоэтического восстановления после трансплантации и служат в качестве первичной мишени для генной терапии. Несмотря на ключевую роль стволовых клеток в поддержании гемопоэтической системы, их исключительно низкая частота встречаемости в гемопоэтической ткани, а также ограниченная способность к поддержанию жизнедеятельности или размножению недифференцированных стволовых клеток в условиях ex-vivo в течение длительных периодов времени, не только остается главным недостатком для клинического применения данных клеток, но также отражает существующую в настоящее время недоступность новых регуляторов стволовых клеток и необходимость в них.

Распространено мнение, что стволовые клетки тесно связаны in vivo с дискретными нишами внутри костного мозга (4-6), которые обеспечивают молекулярные сигналы, которые коллективно опосредуют их дифференцировку и самообновление, путем контактов клетка-клетка или близкодействующих взаимодействий (7). Эти ниши являются частью "гемопоэтического индуктивного микроокружения" (HIM), состоящего из стромальных клеток костного мозга, например макрофагов, фибробластов, адипоцитов и эндотелиальных клеток (8). Стромальные клетки костного мозга поддерживают функциональную целостность HIM путем создания белков межклеточного матрикса (ЕСМ) и компонентов базальной мембраны, которые облегчают контакт клетка-клетка (9-11). Они также создают различные растворимые или резидентные цитокины, необходимые для контролируемой дифференцировки и пролиферации гемопоэтических клеток (12-14).

С учетом всего сказанного выше не покажется неожиданным то, что попытки развития систем культивирования для длительного поддержания жизнедеятельности HSC человека сосредоточены в основном на использовании предварительно созданных первичных монослоев стромальных клеток костного мозга. Они содержат долгоживущие культуры из необлученных (декстеровские культуры, 15) или облученных (16-19) первичных стромальных клеток костного мозга человека, а также линий стромальных клеток человека или мыши (16, 19-24), с добавленными экзогенно цитокинами или без них. Анализ продуцирования HSC сначала основывался на способности таких клеток к продуцированию миелоидного потомства (инициируя клетки для долгоживущей культуры; LTC-IC) или к генерации колоний с "булыжниковой" морфологией (клеток, формирующих области наподобие булыжниковых; CAFC) после длительного культивирования (5-7 недель) на таких стромальных клетках (16, 17). Несмотря на широкое использование анализов на основе LTC-IC и CAFC, становится все более ясно, однако, что они скорее регистрируют очень примитивные недифференцированные клетки-предшественники, чем истинные гемопоэтические стволовые клетки, воспроизводящие популяцию (25, 26).

В разработанном недавно анализе стволовых клеток человека регистрируются репопулирующие клетки SCID (SRC), которые заселяют костный мозг нетучных диабетических (NOD)/SCID мышей (27), где они дают жизнь миелоидным, лимфоидным, эритроидным и CD34+ популяциям недифференцированных клеток-предшественников человека (28-30). SRC находят исключительно во фракциях гемопоэтических клеток, экспрессирующих CD34+38- поверхностный антиген (31), и их частота в СВ (1/3×10⁵ клеток) возрастает по сравнению с ВМ (1/9×10⁵ клеток) или иммобилизованными РВ (1/6×10⁶ клеток) (32). Самые последние исследования показывают, что SRC живут в субпопуляции клеток CD34+/38-/CXCR4+ (33). CXCR4, поверхностный рецептор для фактора хемокина 1, полученного из стромальных клеток (SDF-1, 34), со всей очевидностью является наиболее важным для заселения и приживаемости гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге человека NOD/SCID (33).

Исследования, имеющие целью длительное поддержание жизнедеятельности/размножение HSC человека на стромальных клетках, в основном основываются на анализе конечного фенотипа CAFC, LTC-1C или CD34+38- (16, 19-24). Редкие сообщения о поддержании жизнедеятельности/размножении SRC на культурах стромальных клеток терпят неудачу при выявлении значительной поддержки долговременной жизнедеятельности. Например, аллогенная стромальная ткань костного мозга человека, как обнаружено, индуцирует кратковременную (7-дневную) поддержку жизнедеятельности SRC, с последующим быстрым, заметным уменьшением (6-кратным) активности (26). Неспособность долговременного поддержания жизнедеятельности/размножения трансплантируемых стволовых клеток человека на слоях стромальных клеток может быть приписано нескольким факторам, связанным с культурами этих клеток in vitro. Один из них может включать в себя использование монослоев стромальных клеток, которое не отражает условия роста in vivo внутри природной, трехмерной структуры костного мозга. Такие условия могут уменьшать способность стромальных клеток к обеспечению оптимального, соответствующего в качестве носителя микроокружения, а также способность стволовых клеток к локализации в специфических нишах и к физическому взаимодействию со стромальными клетками и их продуктами. В самом деле, доказательство важности трехмерной (3D) структуры для биологической активности гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается превосходным ростом линии гемопоэтических клеток человека на стромальных клетках, высеянных на 3D коллагеновом матриксе, по сравнению с их пролиферацией на монослоях таких клеток (35). Более важно то, что 3D покрытый танталом пористый биоматериал, как недавно показано, улучшает кратковременное поддержание жизнедеятельности клеток LTCIC или CD34+38- макаки по сравнению с клетками, культивируемыми отдельно или на монослоях стромальных клеток костного мозга (36). Однако воздействие 3D носителей, покрытых стромальными клетками, не исследовалось.

Последние исследования показали, что линия клеток AFT024 мыши превосходит стромальную ткань человека при поддержании выживания и поддержании жизнедеятельности (хотя и не размножения) SRC СВ человека в течение 2-3 недель (37). Эта линия, как обнаружено, экспрессирует несколько новых генов HIM, кодирующих мембраносвязанные белки (21, 38, 39), которые могут играть главную роль в физиологии стволовых клеток. Возможную экспрессию этих и других генов стромальными клетками в условиях, которые лучше имитируют их 3D микроокружение в костном мозге, и таким образом, позволяют реализовать их оптимальную, физиологически функциональную активность, еще предстоит определить.

Обширные исследования показали, что неконтактные культуры стромальной ткани (19, 21, 22, 40, 41) или среды, кондиционированные стромальной тканью (SCM) (21, 42-44), сами по себе или вместе с цитокинами, могут поддерживать ex-vivo поддержание жизнедеятельности или размножение примитивных гемопоэтических недифференцированных клеток-предшественников. SCM, как также было показано, улучшают выход и эффективность трансдукции таких клеток (45, 46). Хотя эти открытия опять указывают на важность растворимых факторов стромальных клеток, использование LTC-IC, CAFC или CD34+38- в качестве конечных пунктов при таких анализах не может отражать воздействие SCM на поддержание жизнедеятельности/размножение трансплантируемых HSC. Далее, неизвестно, содержат ли такие SCM, полученные из культур монослоев стромальных клеток, все генные продукты, связанные со стромальными клетками, включенные в физиологию HSC человека.

В последнее время внимание, предназначающееся размножению трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток ex-vivo, фокусируется на создании культур суспензий с добавлением цитокинов (47-53). Эти исследования помогли идентифицировать главные цитокины, имеющие отношение к этому процессу, например те из них, которые действуют на ранних стадиях, такие как фактор стволовых клеток (SCF), лиганд FLT3 и тромбопоэтин (ТРО). Тем не менее получены различные результаты, указывающие на быструю потерю (48, 49), поддержание жизнедеятельности (50-52), но также и на некоторые редкие примеры размножения SRC, продолжающегося во время 2-4 недель культивирования (47, 53). Способность этих цитокинов и стромальных клеток к взаимодействию в 3D условиях роста с целью поддержания жизнедеятельности/размножения SRC, еще не определена.

Таким образом, ощущается острая необходимость в способе и устройстве для размножения и/или поддержания жизнедеятельности ex-vivo трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток, свободном от указанных выше ограничений, и было бы в высшей степени полезно, если бы получаемые результаты превосходили таковые, известные в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если свести настоящее изобретение к практике, разработана система поршневого проточного биореактора, которая имитирует 3D микроокружение костного мозга, и которая способна поддерживать рост и длительное поддержание жизнедеятельности стромальных клеток. Последние высеваются на пористых неорганических носителях, изготовленных в виде матриксов из нетканого материала, изготовленного из сложного полиэфира, (54), которая делает возможным размножение больших количеств клеток в относительно небольшом объеме. Структура и плотность упаковки носителя оказывает основное влияние на транспорт кислорода и питания, а также на локальные концентрации высвобождаемых продуктов стромальных клеток (например, белки ЕСМ, цитокины, 55). Кроме того, способность стромальных клеток, культивируемых в данной системе, к стимуляции поддержания жизнедеятельности/размножения трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток человека путем прямого контакта клетка-клетка, как определено, намного превосходит способы, известные в данной области. Более того, способность кондиционированной среды стромальных клеток, культивируемых в данной системе, к стимуляции поддержания жизнедеятельности/ размножения трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток человека с помощью новых факторов стромальных клеток и ассоциированных со стромальными клетками, содержащихся в ней, как определено, намного превосходят способы, известные в данной области.

Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, предлагается способ размножения/ поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, который включает в себя стадии (а) получения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (b) высевания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в поршневом проточном биореакторе в виде стационарной фазы, в котором предварительно создается трехмерная культура стромальных клеток на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с другими особенностями описанных предпочтительных воплощений способ дополнительно включает в себя стадию выделения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, который включает в себя стадии (а) получения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (b) культивирования недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в среде, содержащей кондиционированную среду стромальных клеток, причем кондиционированную среду стромальных клеток получают из поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, в котором создается трехмерная культура стромальных клеток на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя матрикс из нетканых волокон, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ приготовления кондиционированной среды стромальных клеток, пригодной для размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, который включает в себя стадии (а) создания культуры стромальных клеток в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (b) когда достигается желаемая плотность стромальных клеток, отбора среды из поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, с получением тем самым кондиционированной среды стромальных клеток, пригодной для размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников реципиенту, который включает в себя стадии (а) размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников путем (i) получения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (ii) высевания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в поршневой проточный биореактор со стационарной фазой, где предварительно создается трехмерная культура стромальных клеток на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (b) трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, получаемых на стадии (а), реципиенту.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений способ дополнительно включает в себя стадию выделения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников перед стадией (b).

В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предлагается способ трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников реципиенту, который включает в себя стадии (а) размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников путем (i) получения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников; и (ii) культивирования недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в среде, содержащей кондиционированную среду стромальных клеток, причем кондиционированная среда стромальных клеток получена из поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, в котором создается трехмерная культура стромальных клеток на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения предлагается поршень для биореактора, содержащий контейнер, имеющий выход и вход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, при этом субстрат поддерживает по меньшей мере 5×10⁶ стромальных клеток на кубический сантиметр субстрата.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения предлагается поршневой проточный биореактор, содержащий указанный выше поршень биореактора.

В соответствии с дополнительными особенностями предпочтительных воплощений настоящего изобретения, описываемого ниже, недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой клетки, выделенные из ткани, выбранной из группы, состоящей из пуповинной крови, мобилизированной периферической крови и костного мозга.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток имеют общие HLA-антигены.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у одного индивидуума.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у различных индивидуумов.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у одного и того же вида.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у различных видов.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений стромальные клетки культуры стромальных клеток выращиваются до плотности, равной по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр субстрата.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений стромальные клетки культуры стромальных клеток выращиваются до плотности, равной по меньшей мере 10⁷ клеток на кубический сантиметр субстрата.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений стадия посева недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой осуществляется в то время, когда поток в биореакторе выключается по меньшей мере на 10 часов после посева.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений волокна образуют объем пор, взятый как процент от общего объема, от 40 до 95%, а размер пор составляет от 10 микрон до 100 микрон.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс изготавливается из волокна, выбранного из группы, состоящей из плоских, некруглых и полых волокон, и их смесей, причем волокна составляют от 0,5 микрон до 50 микрон в диаметре или по ширине.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс состоит из волокон в форме лент, имеющих в ширину от 2 микрон. В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описываемых предпочтительных воплощений отношение ширины волокон к их толщине составляет по меньшей мере 2:1.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс имеет объем пор, взятый как процент от общего объема, от 60 до 95%.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс имеет высоту 50-1000 мкм.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений материал матрикса выбран из группы, состоящей из сложных полиэфиров, полиалкиленов, полифторхлорэтиленов, поливинилхлорида, полистирола, полисульфонов, ацетата целлюлозы, стекловолокон и волокон инертного металла.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс находится в форме, выбранной из группы, состоящей из квадратов, дисков, колец и крестиков.

В соответствии с дальнейшими дополнительными особенностями описанных предпочтительных воплощений матрикс покрывается поли-D-лизином.

Настоящее изобретение успешно преодолевает недостатки известных в настоящее время конфигураций путем создания более эффективных средств для размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток.

Воплощение способа и биореактор согласно настоящему изобретению могут включать в себя осуществление или завершение выбранных заданий или стадий вручную, автоматически или путем сочетания обоих способов. Более того, согласно реальному приборному оснащению и оборудованию предпочтительных воплощений способа и биореактора согласно настоящему изобретению несколько выбранных стадий могут осуществляться с помощью аппаратного обеспечения или программного обеспечения на любой операционной системе любого аппаратно реализованного аппаратного обеспечения или их сочетания. Например, как аппаратное обеспечение, отдельные стадии настоящего изобретения могут осуществляться как микросхема или плата. Как программное обеспечение, отдельные стадии настоящего изобретения могут осуществляться как множество программных инструкций, исполняемых компьютером, использующим любую соответствующую операционную систему. В любом случае отдельные стадии способа и биореактор по настоящему изобретению могут быть описаны как осуществляемые с помощью процессора данных, такого как компьютерная платформа для исполнения множества инструкций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение описывается только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи. Теперь, при конкретной ссылке на детали чертежей, имеется в виду, что подробности приводятся только в качестве примера и для целей иллюстративного обсуждения предпочтительных воплощений настоящего изобретения, и представляются при том условии, что, как предполагается, представляют собой наиболее полезное и самое понятное описание принципов и концептуальных аспектов настоящего изобретения. В этом отношении не делается попыток представить структурные детали настоящего изобретения более подробно, чем это необходимо для фундаментального понимания изобретения, описание, взятое вместе с чертежами, дает возможность уяснить специалистам в данной области, как именно несколько форм настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике.

На чертежах:

На фиг.1 представлено схематическое изображение примерного поршневого проточного биореактора, используемого на практике при реализации настоящего изобретения; 1 - резервуар со средой; 2 - контейнер для смеси газов; 3 - газовые фильтры; 4 - пункты введения; 5 - поршень или контейнер поршневого проточного биореактора; 6 - датчики потока; 6а - клапаны для потока; 7 - контейнер для отбора/отделения кондиционированной среды; 8 - контейнер для замены среды; 9 - перистальтический насос; 10 - пункт подготовки и ввода образца; 11 - контейнер для замены среды; 12 - датчик О₂; 14 - устройство для перемешивания; РН - датчик рН.

На фиг.2 демонстрируется поддержание жизнедеятельности CAFC с помощью 14F1.1 - клеток. Клетки пуповинной крови CD34+ высевают при предельном разведении на облученные 14F1.1 или первичную стромальную ткань костного мозга человека. Образование "булыжниковой" структуры определяется 5 недель спустя. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичную дисперсию (SD) из 2 независимых экспериментов.

На фиг.3 демонстрируется поддержание жизнедеятельности LTC-IC с помощью 14F1.1 - клеток. Клетки пуповинной крови CD34+ высевают при предельном разведении на облученные 14F1.1 или первичную стромальную ткань костного мозга человека. Образование миелоидной колонии определяют 7 недель спустя. Лиганд FLT-3 (300 нг/мл), ТРО (300 нг/мл) и SCF (100 нг/мл) добавляют при еженедельной замене среды. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичную дисперсию из 2 независимых экспериментов.

На фиг.4 демонстрируется размножение клеток CD34+38- на 14F1.1 и первичной стромальной ткани костного мозга человека. Клетки CD34+ высевают на 14F1.1 или стромальную ткань костного мозга человека - 70 клеток СD34+38-/лунка. Цитокины добавляют еженедельно. Культуры трипсинизируют через 7-21 дней. CD34+38-определяются путем FACS-анализа. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичную дисперсию из 2 независимых экспериментов.

На фиг.5а-b показаны фотографии, сделанные с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), носителя, засеянного линией стромальных клеток 14F1.1 через 10 дней (фигура 5а) или через 40 дней (фигура 5 b). Увеличение: х 150.

На фиг.6а-b демонстрируется воздействие 3D и 2D кондиционированной среды 14F1.1 на размножение CD34+38-. Клетки CD34+ высевают в культуры суспензий в присутствии различных концентраций кондиционированной среды от 14F1.1 и первичной стромальной ткани костного мозга человека. Количества клеток CD34+38- определяют путем FACS-анализа. Результаты представляют собой среднее значение ± среднеквадратичную дисперсию из 2 независимых экспериментов.

На фиг.7 показано поддержание жизнедеятельности клеток CD34+38- на носителях, покрытых стромальными клетками. Носители, покрытые стромальными клетками, удаляют из 3D системы в 96-луночных планшетах, покрытых силиконом, с последующим добавлением 1,5×10⁴ клеток CD34+. Контроли содержат только носители и эквивалентные носителю количества клеток 14F1.1, выращенных в монослое (2D). Клетки собирают в обозначенные моменты времени и анализируют с помощью FACS. Результаты представляют собой среднее значение±среднеквадратичную дисперсию из 2 независимых экспериментов.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Настоящее изобретение представляет способы и биореактор для размножения/поддержания жизнедеятельности гемопоэтических стволовых клеток, которые могут быть использованы для трансплантации реципиенту или для других целей, как ниже изложено более подробно. Конкретно, настоящее изобретение относится к поршневому проточному биореактору с трехмерной системой стромальных клеток, предназначенному для поддержания жизнедеятельности и/или размножения гемопоэтических стволовых клеток и/или для производства кондиционированной среды для поддержания жизнедеятельности и/или размножения гемопоэтических стволовых клеток, которые могут быть использованы в различных применениях.

Принципы и практика согласно настоящему изобретению могут быть лучше поняты с помощью ссылок на чертежи и сопровождаемых их описаний.

Перед объяснением по меньшей мере одного воплощения настоящего изобретения в деталях необходимо понять, что изобретение не ограничивается в его применении деталями конструкции и расположением компонентов, представленными в следующем далее описании или иллюстрируемыми на чертежах. Настоящее изобретение дает возможность других воплощений и может быть осуществлено или воспроизведено различными путями. Кроме того, необходимо понять, что фразеология и терминология, используемая в данном описании, представлена с целью описания и не должна рассматриваться как ограничивающая.

Существующие в настоящее время стратегии, имеющие целью поддержание жизнедеятельности или размножения ex-vivo трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток (HSC), пока имеют только ограниченный успех. В данном описании описан новый трехмерный (3D) поршневой проточный биореактор, который имитирует микроокружение костного мозга, и который способен поддерживать рост и длительное поддержание жизнедеятельности стромальных клеток костного мозга. Последние высеваются на пористых носителях, изготовленных из волокнистого матрикса из нетканого материала, состоящей из сложного полиэфира, набитого в стеклянную колонку, тем самым способствуя размножению больших количеств клеток в относительно небольшом объеме. В примерах, приведенных в разделе Примеры, которые следуют далее, биореактор засевают линией стромальных клеток 14F1.1 мыши или, альтернативно, первичными стромальными клетками костного мозга человека. Ко дню 40 после посева носители содержат 100-кратно увеличившуюся плотность клеток. Плотность на различных уровнях колонки является одной и той же, что указывает на гомогенный транспорт кислорода и питания к клеткам. Среды, кондиционированные с помощью стромальных клеток внутри биореактора (3D SCM), превосходят SCM из монослоя стромальных клеток (2D), когда они поддерживают долговременную жизнедеятельность клеток пуповинной крови (СВ) человека CD34+38-. 3D SCM также способны поддерживать размножение клеток CD34+38-CXCR4+, которые представляют собой возобновляемые клетки (SRC) SCID/NOD. В присутствии цитокинов (лиганд FLT3 и ТРО) 3D SCM ускоряет самообновление стволовых клеток и ингибирует дифференцировку, в то время как обратное воздействие индуцируется с помощью 2D SCM+цитокины. Трехмерные совместные культуры стромальных и стволовых клеток также демонстрируют превосходство при поддержании жизнедеятельности клеток CD34+38- над совместными культурами на монослоях стромальных клеток. Эти открытия демонстрируют, что 3D поршневой проточный биореактор обеспечивает подходящую систему для поддержания жизнедеятельности/размножения ex-vivo HSC человека с помощью превосходного контакта между стромальными и стволовыми клетками и, возможно, путем продуцирования известных и/или новых регуляторов стволовых клеток.

HSC человека представляет собой основную мишень для трансплантации и генной терапии. Очень низкая частота встречаемости HSC, а также недоступность в настоящее время факторов роста, способных индуцировать самообновление стволовых клеток в отсутствие конечной дифференцировки, все еще доставляет главные проблемы при осуществлении таких стратегий, а также создании крупномасштабных "банков" HSC.

Используемые в настоящее время стратегии, имеющие целью долговременное поддержание жизнедеятельности/размножение недифференцированных HSC человека, пока имеют только ограниченный успех. Хотя последние исследования с культурами суспензий, содержащими цитокины, указывают на некоторое размножение SRC, этот процесс также сопровождается массовым уменьшением содержания ранних гемопоэтических клеток-предшественников (53, 62), что указывает на то, что имеет место существенная степень дифференцировки стволовых клеток. Идеальной системой была бы такая, например, в которой SRC размножаются, в то время как LTC-IC остаются присутствовать в малых количествах.

Используемые в настоящее время системы для размножения гемопоэтических клеток используют перфузионные культуры суспензий гемопоэтических клеток самих по себе (см. патент США №5646043) или высеянных на монослое стромальных клеток (см. патент США №5605822). Хотя первая система демонстрирует очень большое продуцирование коммитированных клеток-предшественников, вторая система страдает от нефизиологической природы взаимодействий между стромальными и стволовыми клетками в монослое. Дополнительные системы для размножения стволовых клеток описывают использование кондиционированных сред стромальных клеток (патенты США №4536151 и 5437994). Однако последние получают из культур монослоев стромальных клеток, которые, как ясно показано в данном описании, являются худшими по качеству и отличаются по способности активации стволовых клеток по сравнению с 3D SCM (см. таблицу 3 раздела Примеры). Несмотря на то, что недавно был описан (патент США №5906940) биореактор со стационарной фазой, где используются покрытые стромальными клетками стеклянные шарики, указанные шарики не обеспечивают физиологической 3D структуры и делают возможным размножение стромальных клеток на мл в количестве, в 10 раз меньшем по сравнению с носителями, используемыми при применении настоящего изобретения. Сравнение 3D культуры стромальных клеток с монослоем ясно демонстрируется с помощью сведений, представленных в данном описании, относительно превосходящей способности полученных в 3D условиях SCM или 3D культур стромальных клеток к поддержанию жизнедеятельности клеток CD34+38- (см. фигуры 6 и 7). Превосходящее воздействие 3D SCM может быть приписано повышенным уровням известных цитокинов или новым регуляторам стволовых клеток.

Эксперименты, имеющие целью оценку сочетания воздействий 3D SCM и различных цитокинов (SCF, лиганд FLT3, ТРО) на поддержание жизнедеятельности/размножение CD34+38-CXCR4+ (или SRC) (таблица 3), ясно показывают преимущество воздействия 3D SCM в присутствии лиганда FLT3 и ТРО, но не SCF. Эти данные могут быть приписаны относительному ингибиторному воздействию 3D SCM на дифференцировку стволовых клеток. Эти данные четко показывают, что при 3D условиях продуцируются новые факторы, ассоциируемые со стромальными клетками, которые, возможно, являются менее активными сами по себе, но могут действовать синергически с такими цитокинами. Использование выходных данных LTC-IC и коммитированных недифференцированных клеток-предшественников (GM-CFU), в дополнение к выходу CD34+, позволяет исследовать дифференцировку стволовых клеток.

Биореактор, описываемый в данном описании, является уникальным в том, что он объединяет 3D культуры стромальных клеток с непрерывной проточной системой. Хотя 3D системы стромальных-гемопоэтических клеток без непрерывного потока среды были недавно описаны (патент США №5541107), данные, представленные в настоящем описании (см., например, фигуру 7), ясно демонстрируют уменьшение преимущества 3D культур стромальных клеток по отношению к монослоям в отсутствие непрерывного потока.

3D поршневой проточный биореактор, описанный в данном описании, способен поддерживать долговременный рост линий стромальных клеток, а также первичных стромальных клеток костного мозга. Использование стромальных клеток в биореакторе является не только существенным для создания превосходного контакта между стромальными и стволовыми клетками (с помощью уникальных "ниш" и взаимодействий клетка-клетка, клетка-ЕСМ), но также и для продуцирования стромальными клетками известных и новых растворимых мембраносвязанных цитокинов. Стромальные клетки могут облегчить снабжение таких биореакторов соответствующими цитокинами путем использования полученных с помощью генной инженерии вариантов, продуцирующих цитокины.

Стромальные клетки в биореакторе могут также быть сконструированы таким образом, чтобы служить в качестве линий упаковочных клеток для ретровирусов, делая возможной эффективную трансдукцию генетического материала в стволовые клетки внутри самого биореактора. Использование различных стромальных клеток в биореакторе может также сделать возможным селекцию наиболее подходящего субстрата для десенсибилизации Ph-положительных стволовых клеток, последние известны своей меньшей способностью к слипанию со стромальными клетками (63). Первичные стромальные клетки имеют то преимущество, что они делают возможным создание "аутологичных" биореакторов со стромальными стволовыми клетками, в которых могут размножаться аутологичные или даже стволовые клетки пуповинной крови, и которые устраняют необходимость в удалении стромальных клеток перед трансплантацией.

Хотя начальные эксперименты по высеванию клеток в биореакторе показывают скорей небольшой выход клеток CD34+38-в носителе, скорость потока среды после посева, а также начальные количества клеток CD34+, посеянных в биореакторе, легко могут быть оптимизированы. Анализ по CD34+38-CXCR4+ в ранние периоды (1-4 дня) после посева является главным для такой оптимизации.

В качестве четкого отличия от способов, известных в данной области, в биореакторе согласно настоящему изобретению используется ростовой матрикс, который существенно увеличивает доступную площадь соприкосновения для адгезии стромальных клеток с тем, чтобы воспроизвести механическую инфраструктуру костного мозга. Например, для ростового матрикса высотой 0,5 мм прирост составляет, самое меньшее, от 5 до 30 раз, если считать по проекции на основание ростового матрикса. Такой прирост примерно в 5-30 раз происходит на один слой, а если используется множество таких слоев, либо собранных в пакет, либо разделенных прокладками, либо как-то еще, множитель в 5-30 раз приложим к каждой такой структуре. Когда используется матрикс в виде пласта предпочтительно волокнистых пластов из нетканых материалов или пластов из вспененных полимеров с открытыми порами, предпочтительная толщина пласта составляет примерно от 50 до 1000 мкм или более, и обеспечивается необходимая пористость для ввода клеток, ввода питания и удаления побочных продуктов из пласта. В соответствии с предпочтительным воплощением поры имеют эффективный диаметр от 10 мкм до 100 мкм. Такие пласты могут быть получены из волокон различной толщины, предпочтительная толщина волокон или диаметр волокон находятся в пределах примерно от 0,5 мкм до 20 мкм, еще более предпочтительные волокна имеют диаметр в пределах от 10 мкм до 15 мкм.

Структуры согласно настоящему изобретению могут поддерживаться или даже лучше быть прикрепленными к пласту пористого субстрата или сетки, обеспечивающей стабильность размеров и физическую прочность.

Такие пласты матрикса могут также разрезаться, штамповаться, или измельчаться для создания частиц с проецируемой площадью порядка примерно от 0,2 мм² до 10 мм², с тем же самым порядком толщины (примерно от 50 до 1000 мкм).

Дополнительные детали, относящиеся к изготовлению, использованию и/или преимуществам ростового матрикса, который используется при практической реализации настоящего изобретения, описаны в патентах США №5168085 и в особенности 5266476, оба они включены сюда в виде ссылок.

Как легко заметит специалист в данной области, настоящее изобретение предусматривает размножающуюся популяцию недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток, которая может быть использована во множестве применений, таких, например, как нижеследующие, но не ограничиваясь ими: (i) размножение стволовых клеток человека (из аутологичного источника или пуповинной крови) на стромальной ткани реципиента, без необходимости в разделении стромальных и стволовых клеток перед трансплантацией; (ii) истощение стволовых клеток Ph+CML при аутологичном продуцировании путем взаимодействия стромальных и стволовых клеток; (iii) перенос гена в самообновляющиеся стволовые клетки внутри биореактора или после отбора из биореактора; (iv) продуцирование кондиционированной среды (SCM) 3D стромальных клеток для поддержания жизнедеятельности/размножения ex-vivo недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток в культурах суспензий или в биореакторе для стволовых клеток; (v) выделение новых белков, индуцирующих самовозобновление стволовых клеток в отсутствие дифференцировки, а также белков, имеющих дополнительные биологические функции; (vi) выделение РНК 3D стромальных клеток для клонирования новых регуляторов стромальных клеток и связанных с ними стволовых клеток, и дополнительных функциональных генных продуктов стромальных клеток.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предлагается способ размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения осуществляется путем реализации следующих стадий. Во-первых, получают недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники. Во-вторых, недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники высевают в поршневой проточный биореактор со стационарной фазой, пример которого изображен на фигуре 1 вместе со ссылочными номерами, в которых трехмерная культура стромальных клеток - либо из линии стромальных клеток, либо из культуры первичных стромальных клеток - предварительно создается на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым, как дополнительно объяснялось выше и объясняется в разделе Примеры, который следует ниже, способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В данном описании и в формуле изобретения, которая следует далее, фраза "недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки" относится к некоммитированным гемопоэтическим клеткам.

В данном описании и в формуле изобретения, которая следует ниже, фраза "клетки-предшественники" относится к коммитированным, еще незрелым гемопоэтическим клеткам.

Как недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки, так и клетки-предшественники, представляют собой клетки CD34+. Таким образом, как фраза "получение недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников", так и эквивалентная ей фраза "получают недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники", относятся к получению либо изолированных недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток и/или клеток-предшественников, либо к популяции клеток CD34+, которая содержит недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники.

В данном описании и в формуле изобретения, которая следует далее, термины "размножают" и "размножение" относятся, по существу, к росту недифференцированных клеток, то есть к увеличению популяции клеток без дифференцировки, сопровождающей такое увеличение.

В данном описании и в формуле изобретения, которая следует далее, термины "поддерживать жизнедеятельность" и "поддержание жизнедеятельности" относятся, по существу, к обновлению недифференцированных клеток, то есть, по существу, к стационарной популяции клеток без дифференцировки, сопровождающей такую стационарность.

Термин "дифференцировка" относится к изменению [клеток] от относительно обобщенных [форм] к специализированным формам в процессе развития. Дифференцировка клеток различных клеточных линий является хорошо документированным процессом и не требует дополнительного описания.

Термин "ex-vivo" относится к клеткам, удаленным из живого организма и размножающимся вне организма (например, в пробирке для исследований).

После размножения размножившиеся недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, например, могут быть изолированы с помощью различных аффинных методик разделения/мечения, таких, например, как (но, не ограничиваясь ими) сортинг флуоресцентно-активированных клеток и аффинное разделение на аффинном субстрате. Аффинные молекулы, которые могут быть использованы для осуществления таких способов разделения, включают в себя, например, антитела против CD34, которые связывают клетки CD34+.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусматривается другой способ размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения осуществляется с помощью реализации следующих стадий. Во-первых, получают недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники. Во-вторых, недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники культивируют в среде, содержащей в качестве единственного ингредиента или в качестве добавки кондиционированную среду стромальных клеток, причем кондиционированную среду стромальных клеток получают из поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, в котором трехмерная культура стромальных клеток - либо из линии стромальных клеток, либо из культуры первичных стромальных клеток - создается на субстрате в виде пласта, при этом субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым, как дополнительно описано выше и объясняется в разделе Примеры, который следует далее, способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ приготовления кондиционированной среды стромальных клеток, пригодной для использования при размножении/поддержании жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения осуществляется путем реализации следующих стадий. Во-первых, создается культура стромальных клеток - либо из линии стромальных клеток, либо из культуры первичных стромальных клеток - в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой на субстрате в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, тем самым способствуя размножению/поддержанию жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. Во-вторых, когда достигается желаемая плотность стромальных клеток, скажем, например, свыше 5 х 10⁶ или свыше 10⁷ клеток на кубический сантиметр матрикса, сбор среды из поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, как дополнительно описано выше и объясняется в разделе Примеры, который следует далее, получение кондиционированной среды стромальных клеток, пригодной для размножения/ поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предусматривается способ трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников реципиенту. Способ в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения осуществляется путем реализации следующих стадий. Во-первых, недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники размножаются/поддерживаются с помощью любого из способов, описанных выше. Во-вторых, недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные в результате первой стадии, трансплантируются реципиенту.

Как показано на фигуре 1, в соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения, предлагается поршень биореактора, включающий в себя контейнер 5, как правило, в виде колонки, имеющей выход и вход и содержащей внутри субстрат в виде пласта, причем субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, при этом субстрат поддерживает по меньшей мере 5 х 10⁶ стромальных клеток, предпочтительно по меньшей мере 10⁷ клеток, либо относящихся к линии стромальных клеток, либо к культуре первичных стромальных клеток, на кубический сантиметр субстрата.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящего изобретения предлагается поршневой проточный биореактор, содержащий указанный выше поршень биореактора.

В этом отношении понятно, что субстрат теоретически может поддерживать вплоть до 5 х 10⁷ клеток на его кубический сантиметр. Как только на субстрате будет аккумулировано достаточное количество клеток, для прекращения дальнейшего роста клеток могут быть применены такие средства, как облучение, с тем, чтобы контролировать точное количество клеток, поддерживаемых субстратом.

Недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, которые используются в качестве источника для таких клеток, когда осуществляются способы согласно настоящему изобретению, могут очищаться или выделяться из ткани, такой, например, как (но, не ограничиваясь этим) пуповинная кровь, цитокин-мобилизированная периферическая кровь (собранная, например, с помощью лейкофереза) и костный мозг, все из которых, как известно, содержат недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники. Способы такого разделения хорошо известны в данной области, наиболее часто используется сортинг флуоресцентно-активированных клеток, при котором клетки сначала метятся путем аффинного мечения с помощью флуорофора, а затем собираются.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток имеют общие HLA-антигены. В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у одного индивидуума. Таким образом, не требуется разделения клеток в случае их трансплантации реципиенту.

В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у различных индивидуумов. Например, будущий реципиент недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников и стромальных клеток используется для получения стромальных клеток, в то время как недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки берутся у донора, выбранного в соответствии с совместимостью по HLA для пересадки таких клеток реципиенту. Таким образом, опять же, не требуется разделения клеток перед трансплантацией.

В соответствии с другим воплощением настоящего изобретения недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у одного и того же вида. Однако в соответствии с еще одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения недифференцированные гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники и стромальные клетки культуры стромальных клеток берутся у различных видов.

В соответствии с предпочтительным в настоящее время воплощением настоящего изобретения стадия посева недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в поршневой проточный биореактор со стационарной фазой осуществляется в то время, когда поток в биореакторе выключается по меньшей мере на 10 часов после такого посева, с тем, чтобы дать возможность клеткам закрепиться на матриксе, покрытом стромальными клетками.

Следующие далее описания обеспечивают понимание в отношении предпочтительных субстратов, которые используются при осуществлении настоящего изобретения.

Таким образом, в соответствии с одним из воплощений волокна субстрата образуют объем пор, взятый как процент от общего объема, от 40 до 95%, а размер пор составляет от 10 микрон до 100 микрон. В соответствии с другим воплощением матрикс, образующий субстрат, изготавливается из волокна, выбранного из группы, состоящей из плоских, некруглых и полых волокон и их смесей, причем волокна имеют диаметр или ширину от 0,5 микрон до 50 микрон. В соответствии с еще одним воплощением матрикс состоит из волокон в форме лент, имеющих в ширину от 2 микрон. В соответствии с еще одним воплощением отношение ширины волокон к их толщине составляет по меньшей мере 2:1. В соответствии с еще одним воплощением матрикс, образующий субстрат, имеет объем пор, взятый как процент от общего объема, от 60 до 95%. В соответствии с еще одним воплощением матрикс имеет высоту 50-1000 мкм, при этом используется наполнение из его материала. В соответствии с еще одним воплощением материал матрикса, образующей субстрат, является выбранным из группы, состоящей из сложного полиэфира, полиалкиленов, полифторхлорэтиленов, поливинилхлорида, полистирола, полисульфонов, ацетата целлюлозы, стекловолокна и волокон инертных металлов. В соответствии с еще одним воплощением матрикс находится в форме, выбранной из группы, состоящей из квадратов, колец, дисков и крестиков. В соответствии с еще одним воплощением матрикс покрывается поли-D-лизином.

Дополнительные цели, преимущества и новые обстоятельства настоящего изобретения станут понятными специалисту в данной области при изучении следующих далее примеров, которые не предназначаются для ограничения. Кроме того, каждое из различных воплощений и аспектов настоящего изобретения, как подчеркнуто выше и описано ниже в Формуле изобретения, находит экспериментальную поддержку в следующих далее примерах.

Теперь будут делаться ссылки на следующие далее примеры, которые вместе с приведенным выше описанием иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивая его.

Как правило, номенклатура и лабораторные процедуры, используемые в настоящем изобретении, включают в себя молекулярные, биохимические, микробиологические методики и методики с рекомбинантной ДНК. Такие методики подробно объясняются в литературе. См. например, "Molecular Cloning: A. laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики, приведенные в патентах США №4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell и Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman и Co., New York (1980); доступные иммуноанализы широко описаны в патентной и научной литературе, см., например, патенты США №3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., и Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods И Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все они включены в данное описание в виде ссылок во всей их полноте. Другие общие ссылки приводятся по всему описанию. Процедуры в них, как предполагается, хорошо известны в данной области, и они приводятся для удобства читателя. Вся информация, содержащаяся в них, включена в данное описание в виде ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Биореактор: Биореактор, используемый в соответствии с концепцией настоящего изобретения, собирают в соответствии с конструкцией, описанной на фигуре 1. Стеклянные детали конструируют и изготавливают у Technion (Israel) и соединяют с помощью силиконовых трубок (Degania, Israel). Носители центрифугируют в течение ночи в фосфатном солевом буфере (PBS; Beit Ha'Emek Industries, Israel) без Са⁺² и Mg⁺², с последующим удалением PBS и высвобожденных остатков. Каждую колонку загружают 10 мл упакованного носителя. Биореактор заполняют PBS-Ca-Mg, все выходы герметизируют и систему подвергают автоклавной обработке (120°С, 30 минут). PBS удаляют через контейнер [8] и биореактор в инкубаторе при 37°С приводят в контакт с 300 мл циркулирующей среды Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM; GIBCO BRL), содержащей 10% термически инактивированной фетальной сыворотки теленка (FCS; Beit Ha'Emek Industries, Israel) и смесь пенициллин-стрептамицин-нистатин (100 м.е./мл:100 мкг/мл:1,25 мкг/мл; Belt Ha'Emek), в течение периода в 48 часов. Циркулирующую среду заменяют свежей DMEM, содержащей то же, что и выше + 2 мМ L-глютамина (Beit Ha'Emek).

Стромальные клетки: Линии стромальных клеток поддерживаются при 37°С в DMEM, содержащей 10% FCS, в полностью увлажненном инкубаторе с 5% СO₂ в воздухе. Клетки выращивают во флаконах для культур тканей (Corning) и разделяют с помощью трипсинизации при достижении конфлуэнта. Первичные культуры стромальных клеток костного мозга человека получают на основе отсасываемого костного мозга грудины гематологически здоровых доноров, подвергающихся операции на открытом сердце. В общих чертах, аспираты костного мозга 3-кратно разводят в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS; GIBCO BRL) и подвергают центрифугированию в градиенте плотности в среде Фиколл-Пак (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA). Одноядерные клетки костного мозга (<1,077 гм/см³) собирают, промывают 3 раза в HBSS и повторно суспендируют в среде для долговременного культивирования (LTC), состоящей из DMEM, содержащей 12,5% FCS, 12,5% сыворотки лошади (Beit Ha'Emek), 10^-4 M β-меркаптоэтанола (Merck) и 10^-6 моль/л гидрокортвазонсукцината натрия (Sigma). Клетки инкубируют в 25 мл флаконах для культивирования тканей (Corning) в течение 3 дней при 37°С (5% CO₂), а затем при 33°С (при тех же условиях) при еженедельной подкормке культуры. Для каждого биореактора используют строгальные клетки от индивидуальных доноров. Для 3D исследований и исследований на монослое культуры первичных стромальных клеток разделяют с помощью трипсинизации (0,25% трипсин и EDTA в Puck's Saline А; Beit Ha'Emek) каждые 10 дней, чтобы предоставить возможность для достаточного размножения стромальных клеток. Для LTC-IC и CAFC (см. ниже) стромальные клетки облучают (1500 cGy), с использованием источника ¹³⁷Cs, культуры поддерживают при 33°С в среде LTC.

Посев стромальных клеток: Конфлюэнтные культуры линий стромальных клеток или 5-недельные первичные стромальные клетки костного мозга трипсинизируют и клетки промывают 3 раза в HBSS, повторно суспендируют в среде биореактора (см. выше), подсчитывают и засевают при 10⁶ клеток/мл в 10 мл объемах с помощью пункта введения ([4], фигура 1) на 10 мл носителя в стеклянной колонке биореактора. Непосредственно после посева циркуляцию останавливают на 16 часов, чтобы дать возможность клеткам осесть на носителях. Рост стромальных клеток в биореакторе отслеживают путем удаления носителей и подсчета клеток по методу МТТ (56). Когда стромальные клетки сливаются, для продолжения исследований (приготовление SCM, посев стволовых клеток) среду заменяют средой LTC.

Приготовление кондиционированной среды стромальных клеток (SCM): При эквивалентных плотностях клеток стромальные клетки в монослое и в биореакторе заливают свежей культуральной средой LTC. SCM собирают после инкубации клеток в течение ночи. Для этой цели поток среды 3D в культурах останавливают на 16 часов и среду удаляют непосредственно из колонки перед возобновлением циркуляции. Для анализа воздействия клеток CD34+ на продуцирование стромальных клеток SRC циркуляцию останавливают на различные интервалы времени (2-7 дней) после посева CD34+ в 3D системе и среду отбирают из колонки, как описывается выше. SCM центрифугируют (1000×g, 10 минут), фильтруют и хранят при -20°С. Стромальные клетки для сбора SCM также выращивают в биореакторе, в среде, не содержащей сыворотки, тем самым исключая неопределенные параметры.

Выделение клеток CD34+: Образцы пуповинной крови, собранные в стерильных условиях во время родов, фракционируют в среде Фиколл-Пак и собирают верхнюю фракцию (плотность <1,077 г/см³) одноядерных клеток. Клетки индивидуальных образцов СВ собирают, инкубируют вместе с антителами CD34 и выделяют с помощью midi MACS (Miltenyl Biotech).

Культуры суспензий клеток CD34+: Клетки CD34+ СВ (5×10⁵/лунка) инкубируют в 24-луночных планшетах (ТРР, Switzerland), в 0,5 мл 0-100% SCM, минус или плюс 300 нг/мл каждого из лигандов FLT3, SCF или ТРО, вместе или по одному. Контроли содержат среду LTC, плюс или минус цитокины. Клетки инкубируют при 37°С, при 5% СO₂ на воздухе. Культуральную среду заменяют еженедельно. Перед посевом и в различные моменты времени (1-3 недели) клетки собирают, подсчитывают и анализируют на CD34+/38-/CXCR4+ с помощью проточной цитометрии. На выходе анализ также может включать в себя SRC, CAFC и LTC-IC.

Совместные культуры стромальных и стволовых клеток: Изолированные, собранные в пул клетки CD34+ СВ высевают в эквивалентных количествах (около 5×10⁵) на монослой или в биореактор, которые содержат эквивалентные плотности конфлюэнтных стромальных клеток. При добавлении в биореактор поток среды приостанавливают в течение 16 часов, чтобы сделать возможным контакт со стромальными клетками, и возобновляют со скоростью 0,1-1,0 мл в минуту. Посеянные клетки CD34+ -стромальные клетки на носителе удаляют для контрольных исследований в отсутствие замены среды. Совместные культуры поддерживают в среде LTC с цитокинами или без них. В различные моменты времени (вплоть до 4 недель) не прилипшие клетки собирают из супернатантов монослоя или из циркулирующей культуральной среды с помощью контейнера ([8], фигура 1). Прилипшие клетки собирают с помощью последующей трипсинизации и контакта с буфером для диссоциации на основе EDTA (GIBCO BRL), с последующим осторожным пипеттированием клеток. Чтобы исключить присутствие стромальных клеток в полученной в результате суспензии, клетки повторно суспендируют в HBSS+10% PCS и подвергают 60-минутной процедуре адгезии в пластиковых чашках для культур тканей (Corning), при 37°С. Циркулирующие и отделенные от носителей гемопоэтические клетки промывают, подсчитывают и исследуют отдельно на CD34+/38-/CXCR4+ с помощью проточной цитометрии. На выходе анализ также может включать в себя SRC, CAFC и LTC-IC.

Проточная цитометрия: Клетки инкубируют при 4°С в течение 30 минут при насыщающих концентрациях моноклональных антител анти-СD34+PerСР (Beckton-Dickinson), анти-СХСR4-флюоресцеин изоцианат (FITC, R&D systems) и - ликоэритрин (РЕ, Beckton-Dickinson). Клетки промывают дважды в охлаждаемом льдом PBS, содержащем 5% термически активированного FCS, и повторно суспендируют для трехцветной проточной цитометрии на FACSscan (Beckton-Dickinson).

Анализы на LTC-IC и CAFC: Свежевыделенные клетки CD34+, клетки выделяют из совместных культур стромальных и стволовых клеток или из суспензионных культур, анализируют на LTC-IC и CAFC, как описано выше (16, 17). Конфлюэнтные первичные стромальные клетки костного мозга трипсинизируют, облучают (1500 cGy) и помещают при 0,1 мл в 96-луночные планшеты (Corning) при 1,5×10⁵/лунка. Создают 24 идентичных лунки/группа. Стромальные клетки заливают 0,1 мл среды LTC, содержащей серийные разведения клеток CD34+ (500-5 клеток/лунка), или серийные разведения клеток, собранных из различных анализов. Культуры инкубируют непосредственно при 33°С в течение 5 недель, при еженедельной замене половины среды. Планшеты центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, супернатанты культур удаляют и оставшиеся клетки покрывают метилцеллюлозными культурами и цитокинами для исследований миелоидных клеток-предшественников, как описано выше (57). Колонии подсчитывают в течение следующих 14 дней и частоту LTC-IC определяют в соответствии с обратной величиной концентрации исследуемых клеток, что дает 37% отрицательных культур (16). Исследование CAFC-анализом в основном производят, как описано выше, за исключением отсутствия заливки метилцеллюлозой и цитокинами. Процентное содержание лунок по меньшей мере с одним гемопоэтическим клоном в темной фазе по меньшей мере из пяти клеток ("булыжникообразная" область) под слоем строгальных клеток определяют на неделе 6 после высевания исследуемых суспензий клеток, при серийных разбавлениях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Система биореакторов, практически используемая в настоящем изобретении, изображена на фигуре 1. Она содержит четыре параллельных узла поршневого проточного биореактора [5]. Каждый узел биореактора содержит 1 грамм пористых носителей (4 мм в диаметре), изготовленных из матрикса из нетканого материала, состоящего из сложного полиэфира (58). Эти носители делают возможным размножение больших количеств клеток в относительно малом объеме. Структура и степень упаковки носителя оказывает главное влияние на транспорт кислорода и питание, а также на локальные концентрации и высвобождение продуктов стромальных клеток (например, белки ЕСМ, цитокины, 59). Биореактор содержат в инкубаторе при 37°С.

Поток в каждом биореакторе отслеживают [6] и регулируют с помощью клапана [6а]. Каждый биореактор содержит пункт подготовки образца и введения [4], который делает возможным последовательный посев стромальных и гемопоэтических клеток. Культуральную среду подают при рН 7,0 [13] из резервуара [1]. Резервуар снабжают фильтрованной [3] смесью газов, содержащей воздух/СO₂/O₂ [2] при различных пропорциях, в порядке поддержания 5-40% растворенного кислорода на выходе из колонки, в зависимости от плотности клеток в биореакторе. Доля О₂ соответствует уровню растворенного О₂ на выходе биореактора, что определяется с помощью датчика [12]. Газовую смесь подают в резервуар через силиконовые трубки. Культуральная среда проходит через разделительный контейнер [7], который делает возможным сбор циркулирующих, не прилипающих клеток. Циркуляцию среды получают посредством перистальтического насоса [9], работающего при скорости в 0,1-3 мл/минута. Узлы биореакторов снабжают дополнительным пунктом подготовки образца [10] и двумя контейнерами [8, 11] для непрерывной замены среды со скоростью 10-50 мл/день. Использование четырех параллельных узлов биореакторов делает возможным, периодическую разборку для таких целей, как удаление клеток, сканирующая электронная микроскопия, гистология, иммуногистохимия, извлечение РНК и тому подобное.

В одном из экспериментов создают систему биореакторов, содержащих линию стромальных 14F1.1-клеток мыши (24, 60, 61), которые, как показано ранее, поддерживают рост коммитированных миелоидных клеток-предшественников человека (24). Данная линия клеток может в такой же степени поддерживать CAFC (фигура 2), LTC-IC (фигура 3) и клетки CD34+38- (фигура 4) СВ человека, а также первичные стромальные клетки костного мозга человека. Результаты, представленные на указанных фигурах, также показывают, что добавление лиганда FLT3+ТРО к данным культурам не оказывает влияния на LTC-IC, в то время как цитокины значительно увеличивают выход клеток CAFC и CD34+38-. Наоборот, SCF индуцирует уменьшение, как LTC-IC, так и CAFC. Когда их высевают в биореактор при 1,5×10⁶ клеток/10 мл объема культуры, 14F1.1-клетки растут и размножаются на носителях (фигура 5). На день 40 после посева носители содержат 100-кратно увеличенную плотность клеток, то есть примерно 1,5×10⁶ клеток/носитель, 1,5×10⁷ клеток/мл (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1Кинетика роста 14F1.1 и первичной стромальной ткани костного мозга человека на носителяхВремя стромальных клеток на носителе (дни)1014203040 14F1.1стромальная ткань человека14F1.114F1.114F1.1Верхняя часть1.5×10³1.5×10³1×10⁵3.5×10⁵1.3×10⁶Средняя часть1×10³1.2×10³1.3×10⁵2.0×10⁵1.3×10⁶Нижняя часть1×10³1×10³7×10⁴2.0×10⁵1.5×10⁶

Анализ МТТ включает в себя 5 носителей/определение. Среднее значение из 2 независимых экспериментов.

Плотность клеток на носителях на различных уровнях колонки является одинаковой, что указывает на гомогенный транспорт кислорода и питательных веществ к клеткам. Для этих целей оптимизируют условия культивирования: культуральная среда (среда Дульбекко с высоким содержанием глюкозы + 10% фетальной сыворотки теленка), скорость потока (1 мл/мин), частота замены среды (раз в неделю), начальная плотность посева (как указано выше). При покрытии носителя коллагеном или поли-L-лизином не обнаружено никакого полезного воздействия на скорость роста и конечную плотность 14F1.1-клеток. Предварительные данные для первичных стромальных клеток костного мозга человека (таблица 1) указывают на примерно одинаковую плотность 14F1.1-клеток и первичных стромальных клеток в дни 10 и 14 после посева соответственно.

В порядке анализа функциональной активности стромальных клеток в биореакторе определяют воздействие кондиционированной среды стромальных клеток (SCM), полученной из колонки биореактора (3D SCM), на размножение клеток CD34+38- в культурах суспензии, засеянных клетками CD34+СВ человека. Активность сравнивают с SCM, полученной из монослоев культур (2D SCM), содержащих такую же концентрацию стромальных клеток. Как показано на фигуре 6, SCM из 14F1.1-клеток, как обнаружено, является в той же степени или более способной к поддержанию жизнедеятельности клеток CD34+38- СВ человека, чем SCM из первичных стромальных клеток костного мозга. Максимальное воздействие SCM 14F1.1 четко наблюдается при концентрации, более низкой, чем для SCM первичных стромальных клеток костного мозга. Далее, 3D SCM, как обнаружено, превосходит 2D SCM обоих типов клеток при поддержании размножения клеток CD34+38- СВ человека. Различие активностей между 2D и 3D SCM становится более выраженным с увеличением продолжительности культивирования (сравните дни 14 и 21). Добавление 3D SCM 14F1.1 к культуре суспензии клеток CD34+ СВ человека также приводит к поддержанию жизнедеятельности клеток CD34+38-CXCR4+ (таблица 2) по сравнению с контрольными культурами, содержащими одну только среду.

ТАБЛИЦА 2Воздействие 3D SCM 4F1.1 на выход CD34+38-/CD34+38-CXCR4+Фенотип клеточной поверхностиСреда LTCSCM 14F1.1 (50%)CD34+38-3701296CD34+38-CXCR4+038

Клетки CD34+ СВ человека (8×10⁴/точка) высевают в культуры суспензий, содержащие среду LTC или 50% 3D SCM 14F1.1. Культуры собирают через 7 дней и клетки анализируют с помощью FACS. Выходы CD34+38- и CD34+38-CXCR4+ составляют 2800 и 112 соответственно.

Таблица 3 демонстрирует воздействие цитокинов на культуры CD34+, содержащие 2D и 3D SCM. Результаты четко демонстрируют, что 3D SCM превосходит 2D SCM при поддержании жизнедеятельности как CD34+38-, так и, что более важно, субпопуляции CD34+38-CXCR4+ (SRC).

ТАБЛИЦА 3Воздействие цитокинов на размножение клеток CD34+38-/CD34+38-CXCR4+ в 3D 14F1.1 SCMФенотип клеточной поверхности2D14F1.1SCM(50%)3D14F1.1 SCM (50%)  сама по себелиганд FLT3+ТРОSCFсама по себелиганд FLT3+ТРОSCFCD34+38-1820140027204080130CD34+38-CXCR4460700620930оCD34+370001780003610001700025000210000

Клетки CD34+ СВ человека (2,6×10⁵/точка) 50% 2D и 3D SCM 14F1.1, в отсутствие или в присутствии лиганда FLT3 (300 нг/мл), ТРО (300 нг/мл) или SCF (50 нг/мл). Культуры собирают через 7 дней и клетки анализируют с помощью FACS. Выходы CD34+38- и CD34+38-CXCR4+ составляют 7900 и 360 соответственно.

Это может быть связано с более сильным воздействием 2D SCM на дифференцировку клеток, что определяется по выходу клеток CD34+. ТРО+ лиганд FLT3 уменьшают выход CD34+38-/CD34+38-CXCR4+ в присутствии 2D SCM, но увеличивают их выход в культурах, содержащих 3D SCM. Опять же, это может быть приписано меньшей степени дифференцировки в 3D системе, что определяется с помощью поверхностного маркера CD34+. Как в 2D, так и в 3D культурах SCM, SCF индуцирует заметное уменьшение дифференцировки клеток и заметное уменьшение выхода клеток CD34+38-/CD34+38-CXCR4+.

В порядке анализа взаимодействий между стромальными и стволовыми клетками в предлагаемом биореакторе сначала оценивают поддержание жизнедеятельности/размножение клеток CD34+38- на носителях, покрытых стромальными клетками (14F1.1). Последние удаляют из биореактора в покрытые силиконом 96-луночные планшеты, с последующим добавлением клеток CD34+. Контроли содержат одни только носители и эквивалентные носителю количества 14F1.1-клеток в монослоях. Как показано на фигуре 7, выживаемость клеток CD34+38-увеличивается в присутствии одного только носителя, что подтверждает выгодное воздействие 3D структуры на выживаемость/поддержание жизнедеятельности примитивных клеток-предшественников (36). Носители, покрытые стромальными клетками, превосходят носители сами по себе или монослои клеток 14F1.1 в стимулировании 7-дневной выживаемости/ поддержания жизнедеятельности клеток CD34+38-. Долговременное культивирование (день 14) приводит к увеличению количеств CD34+38- как в культурах монослоев 14F1.1, так и носителя, покрытого 14F1.1.

В следующем далее эксперименте, 6×10⁶ собранных в пул клеток CD34+ СВ (3×105 CD34+38-) высевают в биореактор, содержащий 4 колонки с необлученными, покрытыми 14F1.1 носителями, в 350 мл циркулирующей культуральной среды. Поток среды останавливают на 16 часов, а затем возобновляют при нормальной скорости (1 мл/мин). Через 4 дня совместного культивирования, циркулирующая среда содержит 10% собранных жизнеспособных клеток от изначально высеянных клеток CD34+38-, что определяется с помощью FACS-анализа. Через 18 дней культивирования циркулирующая среда содержит 0,4% клеток CD34+38-, в то время как прилипшие к носителю клетки составляют 3% от изначально посеянной популяции CD34+38-.

Хотя настоящее изобретение описано совместно с его конкретными воплощениями, очевидно, что множество альтернатив, модификаций и вариантов будут очевидны для специалиста в данной области. Соответственно предполагается охват всех таких альтернатив, модификаций и вариантов, которые находятся в пределах сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, цитируемые в данном описании, включены в виде ссылок во всей своей полноте. Цитирование или определение любой ссылки в настоящей заявке может рассматриваться как признание того, что такая ссылка является доступной в качестве предшествующего уровня техники настоящего изобретения.

ссылки

1. Turhan, A.G., Humphries, R.K., Phillips, G.L., Eaves, A.C. & Eaves, CJ. N.Engl. J. Med. 320:1655,1989.

2. Morrison, S.J., Uchida, N. & Weissman I.L. Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35,1995.

3. Ogawa, M. Blood 11:2844, 1993.

4. Lord BI, Testa NG, Hendry JH. Blood 45:65, 1995.

5. Trentin JJ. in Gordon A (ed): Regulation of Hematopoiesis Vol I. New York, N.Y., Appleton-Century-Crafts, p161, 1970.

6. Wolf NS. Clin. Hematol. 8:469, 1979.

7. Dorshkind К, Ann. Rev. Imrnunol. 8:11,1990.

8. Allen TD, Dexter TM. Exp. Hematol. 12:517, 1984.

9. Gupta P, McCarthy JB, Verfaillie CM. Blood 87:3229, 1996.

10. Liesveld JL, Winslow JM, Kempshi MC, Ryan DH, Brennan JK, Abboud CN. Exp. Hematol. 19:63, 1991.

11. Long MW, Briddel R, Walter AW, Bruno E, Hoffman R.J. Clin. Invest. 90:251, 1992.

12. Eaves CJ, Cashman JD, Kay RJ, Daugherty GJ, Otsuka T, Gabury LA, Hogge DE, Landsdorp PM, Eaves AC, Humphries RK. Blood 78:110,1991.

13. Moore KA, Pytowski B, Witte L, Hicklin D, Lemischka I. Proc. Nat. Acad. Sci. 94:4011,1997.

14. Li L, Milner LA, Deng Y, Iwata M, Banta A, Graf L, Marcovina S, Friedman C, Trask BJ, Hood L, Torok-Storb B. Immunity 8:43, 1998.

15. Alien TD, Dexter TM. Exp. Hematol. 12;517, 1984.

16. Sutherland H, Landsdorp PM, Henkelman D, Eaves AC, Eaves CJ. Proc. Nat. Acad. Sci. 87:3584, 1990.

17. Breems DA, Blokland EAW, Nben S, Ploemacher RE. Leukemia 8:1095, 1994.

18. Verfaillie С, Blakolmer К, McGlare P. J. Exp.. Med. 172:509, 1990.

19. Burroughs J, Gupta P, Blazar B, Verfaillie C. Exp. Hematol, 22:1095, 1994.

20. Roecklein BA, Torok-Storb В. Blood. 85: 997, 1995.

21. Thiemann FT, Moore KA, Smogorzewska ЕМ, Lemischka IR, Crooks GM. Exp. Hematol. 26:612, 1998.

22. Breems DA, Blokland EAW, Siebel KE, Mayen AEM, Engels LJA, Ploemacher RE. Blood 91:111, 1998.

23. Aiuti A, Friedrich С, Sieff CA, Gutierrez-Ramos JC. Exp. Hematol. 26:143, 1998.

24. Otsuka Т, Satoh H, Ogo Т, Bairy O, Gluck U, Zipori D, Nakano T, Okamura Y, Niho Y. Int. J. Cell Cloning 10:153, 1992.

25. Larochelle A, Vormoor J, Hahenberg H, Wang JCY, Bhatia M, Lapidot T, Moritz T, Murdoch B, Xiao LX, Kato I, Willimas DA & DickJE. Nat. Med. 2:1329, 1996.

26. Gan OI, Murdoch B, Larochelle A, Dick JE. Blood 90:641,1997.

27. Shultz LD, Schweitzer A, Christianson. SW, Gott B, Shweitzer IB, Tennent B, McKenna S, Mobraaten L, Rajan TV, Greiner DL, Leiter EH. J. Immunol. 154:180, 1995.

28. Larochelle A., Vormoor J, Lapidot Т, Sher G, Furukawa T, :I Q, Shultz L, Oliveri NF, Stamatoyannoppoulus G & Dick JE. Hum. Моль. Genet. 4:163, 1995.

29. Larochelle A, Vormoor J, Hahenberg H, Wang JCY, Bhatia M, Lapidot T, Moritz T, Murdoch B, Xiao LX, Kato I, Willimas DA & Dick JE. Nat. Med. 2:1329, 1996.

30. Dick JE. Sem. Immunol. 8:197, 1996.

31. Bhatia M, Wang JCY, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5320, 1997.

32. Wang JCY, Doedens M, Dick JE. Blood 89: 3919, 1997.

33. Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Nagler A, Ben-Hur H, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T. Science 283:845-8, 1999.

34. Bleul CC, Farzan M, Choe H, Parolin C, Clark-Lewis I, Legler DF, Loetscher M, Baggiolini M. Moser B. Nature 382:833, 1966.

35. Mizuno S, Wang J, Greenberger J, Glowacki J. Blood 88:189a (abs), 1996.

36. Rozenzweig M, Pykett M, Marks DF, Johnson RP. Gene Therapy 4:928, 1997.

37. Arakawa-Hoyt, Thiemann FT, Dao MA, Barsky L, Crooks GM, Nolta JA. Blood 92:581a, 1998 (Abst).

38. Moore KA, Pytowski B, Witte L, Hicklin D, Lemischka I. Proc. Nat. Acad. Sci. 94:4011, 1997.

39. Varnum-Finney B, Purton LE, Yu M, Brashem-Stein C, Flowers D, Staats S, Moore KA, Le Roux I, Mann R, Gray G, Artavanis-Tsakonas S, Bernstein. ID. Blood 91:4084, 1998.

40. Verfaillie CM. Blood 79:2821, 1992.

41. Verfaillie CM. Blood 82:2045, 1993.

42. Bhatia R, McGlave PB, Miller JS, Wissink S, Lin WN, Verfaillie CM. Exp. Hematol. 25:980, 1997.

43. Breems DA, Blokland EAW, Ploemacher RE. Leukemia 11:142, 1997.

44. Herman PH, Ferrant A, De Bruyere M, Straetmans N. Leukemia 12:735, 1998.

45. Breems DA, Van Driel EM, Hawley RG, Siebel KE, Ploemacher RE. Leukemia 12:951, 1998.

46. Aiuti A, Ficara F, Dando J, ZE, Bordignon C. Blood 92:145a, 1998 (Abs).

47. Kusadasi N, van Soest PL, Ploemacher RE. Exp. Hematol. 25:699, 1998 (Abst).

48. Dorrell С, Gan OI, Pereira DS, Dick JE. Exp. Hematol. 25:688, 1998 (Abst).

49. Bhatia M, Bonnet D, Kapp U, Wang JCY, Murdoch B, Dick JE. J, Exp. Med. 186:619, 1997.

50. Kollet O, Moore J, Fajerman I, Ben-Hur H, Hagay Z, Nagler A, Feldman M, Lapidot T. Blood 90:365a, 1997 (Abs).

51. Bertolini F, Battaglia M, Lanza A, Palermo B, Soligo D, Robustelli della Cuna G. Blood 90:365a, 1997 (Abs).

52. Luens KM, Travis MA, Chen BP, Hill BL, Scollay R, Murray LJ. Blood 91:1206, 1998.

53. Piacibello W, Sanavio F, Severino A, Dane A, Gammaitoni L, Fagioli F, Perissinotto E, Aglietta M. Blood. 93: 3736-49, 1999.

54. Kadouri A. Colloid and Surface B:Biointerface, 2:265, 1994.

55. Kadouri A, Kompier R, Honigwachs-Sha'anani J, Toledo J, Brosh N, Sternberg D, Levy A, Tzehoval E, Zipori D. Int. J. Cell Cloning 10:299, 1992.

56. Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. J Immunol Methods 119:203, 1989.

57. Merchav S., Wagemaker G., Souza L. and Tatarsky I. Leukemia 5:344, 1991.

58. Kadouri A. Colloid and Surface B:Biointerface 2:265, 1994.

59. Kadouri A, Kompier R, Honigwachs-Sha'anani J, Toledo J, Brosh N, Sternberg D, Levy A, Tzehoval E, Zipori D. Int. J. Cell Cloning 10:299, 1992.

60. Zipori, D., Toledo, J. & von der Mark, K. Blood 66:447, 1985.

61. Otsuka Т, Ogo Т, Nakano t, Niiro H, Kuga S, Satoh H, Furukawa Y, Zipori D, Niho Y. Stem Cells 12:409, 1994.

62. Piacibello W, Sanavio F, Garetto L, Severino A, Bergandi D, Ferrario J, Fagioli F, Berger M, Aglietta M. Blood 89:2644, 1997.

63. Carlo-Stella С, Mangoni L, Piovani G, Garau D, Almici C, Rizzoli V. Blood 83:1373, 1994.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Оно предусматривает приготовление кондиционированной среды стромальных клеток, размножение/поддержание недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников и трансплантацию недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников реципиенту путем осуществления следующих действий. Трехмерную культуру стромальных клеток культивируют в поршневом проточном биореакторе. Причем указанная культура размещена в волокнистом матриксе, содержащемся в субстрате, который в виде пласта помещается в контейнер, входящий в состав поршня биореактора. Стромальные клетки растят до достижения плотности 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр субстрата, после чего недифференцированные гемопоэтические клетки либо высевают непосредственно в проточный поршневой биореактор, либо культивируют в кондиционированной среде стромальных клеток, полученной сбором среды из указанного проточного биореактора. Недифференцированные гемопоэтические клетки, полученные культивированием в присутствии трехмерной культуры стромальных клеток или их кондиционированной среды, трансплантируют реципиенту. Применение изобретения позволяет осуществить размножение больших количеств стромальных клеток в относительно небольшом объеме и обеспечить более долговременное поддержание жизнедеятельности/размножения недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников. 5 с. и 76 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.

1. Способ размножения/поддержания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, подразумевающий следующие стадии:

(a) культивирование трехмерной культуры стромальных клеток в условиях потока среды в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя поршень биореактора, причем указанный поршень биореактора содержит контейнер, имеющий вход и выход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем указанный субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, где указанную трехмерную культуру стромальных клеток выращивают до плотности по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр указанного субстрата; и

(b) высевание недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в указанном поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя указанную трехмерную культуру стромальных клеток со стадии (а), в то время, когда поток в указанном биореакторе перекрывают на предопределенное время.

(а) культивирование трехмерной культуры стромальных клеток в условиях потока среды в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя поршень биореактора, причем указанный поршень биореактора содержит контейнер, имеющий вход и выход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем указанный субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, где указанную трехмерную культуру стромальных клеток выращивают до плотности по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр указанного субстрата; и

(b) культивирование недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в среде, содержащей кондиционированную среду стромальных клеток, причем указанную кондиционированную среду стромальных клеток получают из указанного поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, включающего в себя указанную трехмерную культуру стромальных клеток со стадии (а).

(a) культивирование трехмерной культуры стромальных клеток в условиях потока среды в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя поршень биореактора, причем указанный поршень биореактора содержит контейнер, имеющий вход и выход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем указанный субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, где указанную трехмерную культуру стромальных клеток выращивают до плотности по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр указанного субстрата; и

(b) сбор среды из указанного поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, с получением тем самым кондиционированной среды стромальных клеток, пригодной для размножения/поддержания жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников.

(а) размножение/поддержание жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников путем

(i) культивирования трехмерной культуры стромальных клеток в условиях потока среды в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя поршень биореактора, причем указанный поршень биореактора содержит контейнер, имеющий вход и выход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем указанный субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, где указанную трехмерную культуру стромальных клеток выращивают до плотности по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр указанного субстрата; и

(ii) высевания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в указанном поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя указанную трехмерную культуру стромальных клеток со стадии (i), в то время, когда поток в указанном биореакторе перекрывают на предопределенное время; и

(b) трансплантация указанных недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, полученных на стадии (а), реципиенту.

(а) размножение/поддержание жизнедеятельности недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников путем

(i) культивирования трехмерной культуры стромальных клеток в условиях потока среды в поршневом проточном биореакторе со стационарной фазой, включающем в себя поршень биореактора, причем указанный поршень биореактора содержит контейнер, имеющий вход и выход и содержащий внутри субстрат в виде пласта, причем указанный субстрат включает в себя волокнистый матрикс из нетканого материала, образующий физиологически приемлемую трехмерную сетку из волокон, где указанную трехмерную культуру стромальных клеток выращивают до плотности по меньшей мере 5×10⁶ клеток на кубический сантиметр указанного субстрата; и

(ii) культивирования недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников в среде, содержащей кондиционированную среду стромальных клеток, причем указанную кондиционированную среду стромальных клеток получают из указанного поршневого проточного биореактора со стационарной фазой, включающего в себя указанную трехмерную культуру стромальных клеток на стадии (i);

(b) трансплантация указанных недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, полученных на стадии (а), реципиенту.