УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СПЕКТРОВ СОБСТВЕННОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ ОБРАЗЦОВ В ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ ПРИ ВЫСОКОМ ДАВЛЕНИИ Российский патент 2022 года по МПК G01J3/443 

Область техники

Изобретение относится к области биологии и биотехнологии, а именно к устройствам и способам для исследования жидких биологических образцов при высоком давлении при измерении их спектров собственного излучения в инфракрасном диапазоне и может быть использовано для анализа химического состава и молекулярной структуры жидких образцов без внешнего облучения.

Уровень техники

Известно, что высокое давление способно изменять межмолекулярную структуру веществ, влиять на фазовые переходы, активировать химические реакции, существенно изменять свойства биологических объектов, что важно как при изучении фундаментальных вопросов химии, физики, биологии, так и в прикладном плане для нужд биотехнологии и материаловедения.

Практический интерес представляют измерения различных физико-химических параметров жидкостей в зависимости от давления, например при проведении ИК спектроскопии биологических объектов в растворе.

Исследование растворов при высоких давлениях методом ИК спектроскопии позволяет определять характер их структурных изменений под действием высокого давления [С.A. Almodovar et.al High-pressure, high-temperature optical cell for mid-infrared spectroscopy. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer, Volume 231, July 2019, Pages 69-78].

Однако стандартные способы получения ИК спектров имеют ограничения при воздействии на исследуемые жидкие биологические образцы инфракрасного и лазерного облучения, которое за счет поглощения квантов может изменять структуру биологических макромолекул.

Для обеспечения возможности получения истинных спектров растворов биологических молекул известен способ ИК спектроскопии основанной на изучении спектров собственного излучения образцов. Учитывая высокую

чувствительность (10^-8-10^-10 Вт) и высокое отношение сигнал/шум, метод ИК эмиссионной спектроскопии может иметь существенные преимущества перед классическим методом ИК абсорбционной спектроскопии при анализе структурных характеристик биологических макромолекул. Эмиссионная спектроскопия также имеет неоспоримые преимущества, когда облучение исследуемого образца мощным ИК излучением может оказать деструктивное воздействие.

В уровне техники известен патент США [US5075552, McClelland et al. December 24, 1991], в котором описано устройство и метод для измерения спектров собственного излучения образцов.

Недостатком известного решения является необходимость нагрева образца и невозможность анализа жидкостей, что ограничивает круг подходящих для измерения образцов и условий проведения измерений.

Известен патент США [US7218396, Fichet Р et al. May 15, 2007], в котором описан способ измерения эмиссионных спектров жидкостей. Недостатком является необходимость воздействовать на образец мощным лазерным излучением, что может приводить к изменениям в образце на химическом уровне.

Наиболее близким к рассматриваемому изобретению является устройство для анализа химических и биологических материалов описанное в заявке США [US 20040259234, Chou М. et al. December 23, 2004]. В заявке описано устройство для измерения спектров собственного излучения химических и биологических образцов. Устройство содержит спектрометр, регистрирующий пассивное излучение от образца, телескоп или другое оптическое устройство, холодное устройство, расположенное в поле зрения спектрометра, зеркало. Образец расположен между спектрометром и холодным устройством на горизонтальной пластине, размещенной между холодным устройством и зеркалом.

Недостатками данного устройства являются: влияние внешней температуры на результат измерения, отсутствие возможности контроля толщины образца в процессе измерения. Конструкция устройства не позволяет проводить измерения спектров образцов под давлением.

Таким образом, в данной области техники существует потребность в новых устройствах и способах их применения, расширяющих возможности исследований и основанных на других технических решениях для выполнения недорогого и эффективного скрининга параметров биологических объектов в виде растворов, коллоидных систем, жидких кристаллов, гелей при серийно-поточных исследованиях.

Задачей изобретения является создание устройства и способа измерения методом ИК спектроскопии при регистрации собственного излучения жидких биологических образцов при высоком давлении и при заданных значениях температуры.

Технический результат состоит в том, что новая конструкция устройства и способ его применения разработаны таким образом, что позволяют проводить высокочувствительный спектральный анализ жидких биологических образцов (в виде растворов, коллоидных систем, гелей) при высоком давлении в инфракрасном диапазоне (от 4000 до 15 см^-1) без воздействия внешнего излучения, которое может приводить к изменениям в образце.

Сущность изобретения

Для достижения вышеуказанных целей объектом изобретения является устройство и способ для измерения спектров собственного излучения жидких образцов в инфракрасном диапазоне при высоком давлении.

Одним из аспектов изобретения является устройство, которое состоит из ИК спектрометра, узла формирования холодного фона, зеркала, измерительной кюветы. Устройство дополнительно содержит жидкостной термостат, блок управления термостатом, узел формирования высокого давления, блок обработки сигналов спектрометра и контроллер, соединенные с компьютером. При этом спектрометр обеспечивает возможность Фурье - преобразования сигнала и содержит вакуумируемый корпус с входным окном и охлажденным детектором. Оптическая ось между детектором, зеркалом и узлом формирования холодного фона проходит через термостатируемую кювету, которая закреплена на внешней поверхности корпуса около входного окна спектрометра. Узел формирования холодного фона дополнительно содержит плоский термостат, соединенный с жидкостным термостатом и размещенный под нижней поверхностью черной пластины с возможностью термостатирования черной пластины в диапазоне от -20 до+100°С. Пластина выполнена с неотражающим в инфракрасном диапазоне покрытием. Термостатируемая кювета выполнена с возможностью обеспечения быстрой регулировки толщины рабочего слоя исследуемого жидкого образца в пределах от 5 мкм до 2 мм с помощью подвижных держателей оптических окон, при этом толщину рабочего слоя образца устанавливают по нониусу встроенного микрометра с шагом 5 мкм или с использованием прокладок с шагом 1 мкм.

Другой аспект изобретения связан с выбором параметров оптических окон измерительной кюветы, которые выполняют из материала входящего в группу, состоящую из: алмаза, фторида кальция, кремния, кварца, KRS-5, KRS-6, бромида калия, йодида цезия, хлорида натрия, полиэтилена высокого давления, селенида цинка.

Следующим аспектом изобретения является способ для измерения спектров собственного излучения жидких биологических образцов при высоком давлении в инфракрасном диапазоне с использованием черной пластины для формирования холодного фона. Способ содержит этапы, на которых:

- определяют спектральную область в диапазоне от 4000 до 15 см^-1, спектральное разрешение от 0,1 до 10 см^-1 и температуру жидкого биологического образца при измерении спектра в пределах диапазона от -20 до +100°С;

- измеряют спектр излучения фона черной пластины в определенной спектральной области и при значении температуры черной пластины, соответствующей температуре жидкого биологического образца, с возможностью термостатирования черной пластины в диапазоне от -20 до +100°С. При этом спектр излучения черной пластины измеряют не менее 10 раз для установления диапазона вариаций базовой линии спектров, где спектр наименьшей интенсивности запоминают в компьютере для последующего сравнения;

- отключают термостатирование черной пластины и заливают ее жидким азотом для охлаждения;

- устанавливают кювету в держатель, размещенный возле входного окна спектрометра, и подключают кювету к термостату для осуществления возможности термостатирования жидкого биологического образца при выбранной температуре в диапазоне от -20 до +100°С;

- открывают промывочный порт и заполняют кювету исследуемым образцом, закрывают промывочный порт и подают заданное давление в диапазоне до 150 атм через пневматический порт, при этом осуществляют возможность включения компрессора, формирующего заданное давление, путем подачи сигнала от контроллера, связанного с компьютером или использования баллона с газом под давлением, регулируемым редуктором;

- с учетом типа растворителя, используемого для формирования жидкого биологического образца, устанавливают длину оптического пути равную толщине рабочего слоя исследуемого жидкого образца в пределах от 5 мкм до 2 мм с помощью подвижных держателей оптических окон, при этом толщину рабочего слоя образца устанавливают по нониусу встроенного микрометра с шагом 5 мкм или с использованием прокладок с шагом 1 мкм, при этом тип растворителя входит в группу, состоящую из воды, хлороформа, углеводорода, ДМСО, CCl₄, где длину оптического пути при использовании разных типов растворителей устанавливают в пределах от 5 до 20 мкм для воды, в пределах от 5 до 30 мкм для хлороформа и ДМСО, в пределах от 10 до 200 мкм при использовании жидких углеводородов, в пределах от 50 до 2000 мкм при использовании CCl₄ и проводят измерение спектра;

- проводят сравнение спектра излучения фона черной пластины и спектра жидкого биологического образца, где в случае меньшей интенсивности спектра жидкого образца во всей спектральной области по отношению интенсивности спектра черной пластины увеличивают длину оптического пути через рабочий слой исследуемого жидкого образца;

- проводят измерение спектра собственного излучения образца с достаточным количеством повторов от 1 до 50 и продолжительностью каждого повтора от 1 секунды до 1 часа, обеспечивающих требуемый уровень сигнал/шум, при этом данные спектров собственного излучения образца сохраняются в компьютере, при этом осуществляется возможность корректировки спектров излучения за счет учета частичного поглощения светового потока окнами кюветы и их собственного излучения.

Перечень фигур Фиг. 1 Структурная схема устройства Фиг. 2 Вид сечения измерительной кюветы.

Фиг. 3 Результат эксперимента по измерению спектра собственного излучения раствора АТФ без давления и под давлением СО₂ 30 атм.

Описание изобретения

При анализе спектров собственного излучения жидких образцов с использованием холодного фона было обнаружено, что часто спектры излучения либо обладают низким отношением сигнал/шум, либо наблюдается сильное искажение спектральных полос излучения. Причем наблюдаемые погрешности спектров зависят от типа образца, от температуры образца и от давления подаваемого на образец. В связи с этим возникла необходимость решения технической задачи, связанной с поиском оптимальных решений в конструкции устройства и технологии его применения для получения ИК спектров собственного излучения жидких биологических образцов при высоком давлении в заданных условиях.

С этой целью была проанализирована физическая сущность наблюдаемого явления собственного излучения образцов. Каждый образец, обладающий поглощением в инфракрасной области, способен излучать на тех же частотах. Дело в том, что поглощение обеспечивается наличием колебательных уровней соответствующей энергии, при переходе на которые с основного уровня происходит поглощение квантов с частотами, удовлетворяющими правилу частот Бора. Также при наличии ненулевой заселенности возбужденных уровней при изучаемых температурах происходят излучательные переходы на основной уровень, что и обеспечивает собственное излучение образца. Для образцов в конденсированном состоянии (жидком и твердом) полосы поглощения сильно уширены. Для широких полос наблюдается сдвиг максимума полос излучения в сторону меньших частот, по сравнению со спектром поглощения из-за уменьшения заселенности колебательных уровней с ростом энергии (частоты квантов излучения).

Было установлено, что при увеличении толщины образца, спектр излучения которого необходимо измерить, наблюдается некий максимальный уровень интенсивности излучения для каждой частоты. Согласно описанному теоретическому обоснованию наблюдаемого излучательного процесса можно установить, что этот спектр с максимально возможной интенсивностью излучения является спектром абсолютно черного тела при температуре излучающего образца. Это было подтверждено экспериментально. Очевидно, что при увеличении толщины образца до некоторого предельного значения холодный фон уже не будет выполнять роль экрана теплового излучения, поскольку образец сам по себе станет излучать как абсолютно черное тело. То есть необходимо подбирать толщину образца таким образом, чтобы этого не происходило.

В связи с этим часто невозможно качественно измерить спектр излучения образца, не обладая критериями, на основании которых можно осознанно выбрать условия измерения. Для оптимизации процесса измерения спектров собственного излучения в способ измерения были введены дополнительные этапы по сравнению с прототипом. К ним относится: этап измерения спектра абсолютно черного тела при заданной температуре, этап корректировки длины оптического пути через исследуемый жидкостной образец и этап корректировки измеренных спектров излучения для учета влияния окон кюветы, поскольку окна могут поглощать часть излучения образца, а также сами быть источником излучения. При этом этап корректировки длины оптического пути за счет изменения толщины исследуемого образца, связан с анализом соотношений между уровнем спектрального сигнала образца в сравнении со спектром излучения абсолютно черного тела.

Структурная схема устройства для измерения инфракрасных спектров собственного излучения жидких образцов при высоком давлении приведена на фиг. 1. Устройство, содержит вакуумный ИК спектрометр с Фурье-преобразованием (1) с высокочувствительным охлаждаемым детектором (2), кювету (8), в которую вводят исследуемый образец, зеркало (7), узел формирования холодного фона (14), жидкостный термостат (10), узел формирования высокого давления (16) с манометром, усилитель сигнала детектора (11), контроллер (12), компьютер (13).

Узел (14) формирования холодного фона состоит из резервуара (3) выполненного из материала с низкой теплопроводностью, например, пенопласта, в который заливают жидкий азот (4). В нижней части резервуара (3) устанавливается пластина (5), покрытая черным материалом. Пластина (5) формирует холодный фон, минимизирующий попадание теплового излучения в спектрометр вместе с излучением от образца. Пластина (5) выполнена с неотражающим в ИК диапазоне черным покрытием, выполненным из мелкопористой резины или сажи. В состав узла (14) формирования холодного фона входит плоский термостат (6), представляющий собой плоскую полую емкость с двумя штуцерами для ввода и вывода прокачиваемой жидкости, подающейся из термостата (10). В качестве термостатирующей жидкости может выступать вода, спирт, силиконовое масло. Пластина (5) расположена на одной оптической оси (15) с зеркалом (7), кюветой (8), детектором спектрометра (2), а ее площадь такова, чтобы полностью перекрыть входную апертуру спектрометра. Световой поток попадает в ИК спектрометр (1) через входное окно (9), с высоким коэффициентом пропускания в необходимом интервале частот, принадлежащем диапазону от 4000 до 15 см^-1.

На фиг. 2 представлена структура измерительной кюветы. В состав кюветы (8) входит: пневматический порт (17), разделитель сред (18), резервуар с исследуемой жидкостью (19), тело кюветы (20), подвижные держатели оптических окон (21) и (27), первое (22) и второе (26) оптические окна, канал (24) для прохождения термостатирующей жидкости, промывочный порт (25) для заполнения и промывки рабочей зоны (23) кюветы.

Пневматический порт (17) и промывочный порт (25) для заполнения и промывки кюветы позволяют заполнять кювету (8) исследуемой жидкостью и осуществлять промывку. Над резервуаром с исследуемой жидкостью устанавливается разделитель сред (18), который может быть выполнен из резины, фторопласта, а также иных эластичных и герметичных материалов для воды и газа. Через пневматический порт (17) подают давление газа до 150 атм. Разделитель сред может не использоваться в тех случаях, когда целью является насыщение жидкости газом под давлением.

Узел формирования высокого давления (16) содержит либо заполненный газом баллон с редуктором или воздушный компрессор с манометром. Используют газ из баллона высокого давления, входящего в группу, состоящую из: азота, аргона, гелия, кислорода, криптона, ксенона, углекислого газа, гексафторида серы, метана, этана или их смесей. Выход узла высокого давления (16) подключают к входу пневматического порта (17). Включение компрессора, формирующего заданное давление, осуществляют подачей сигнала от контроллера (12), связанного с компьютером (13), на вход узла формирования высокого давления (16).

С помощью подвижных держателей (21) и (27) оптических окон (22) и (26) выбирают оптимальную длину оптического пути в рабочем объеме кюветы (8), равную толщине слоя исследуемого образца. Перемещение держателей (21) и (27) друг относительно друга обеспечивается за счет резьбового соединения держателей с телом кюветы (8). Для оптических окон (22) и (26) выбирают различные материалы для достижения наилучших спектральных характеристик в необходимом спектральном диапазоне и с учетом химической совместимости жидких образцов с материалом окон. Для достижения высокого пропускания излучения (желательно более 95%) в требуемом диапазоне частот оптические окна могут быть сделаны из следующих материалов, в зависимости от типа жидкости, входящих в группу, состоящую из: алмаза, фторида кальция, кремния, кварца, KRS-5, KRS-6, бромида калия, йодида цезия, хлорида натрия, полиэтилена высокого давления, селенида цинка. Толщина окон определяется нагрузкой, создаваемой рабочим давлением.

В теле кюветы (8) выполнен канал (24) для прокачки термостатирующей жидкости (вода, водно-спиртовая смесь, этиленгликоль, силиконовое масло), поступающей из термостата (10) для термостатирования кюветы (8) в заданном диапазоне от -20 до +100°С. Управление термостатом (10) производят от контроллера (12), связанного с компьютером (13). Кювета (8) устанавливается в держатель (28) закрепленный с внешней стороны спектрометра (1). При этом рабочий объем кюветы (8) совпадает с оптической осью (15), которая проходит между детектором (2) спектрометра (1), зеркалом (7), и узлом (14) формирования холодного фона. Тело кюветы (8) может быть выполнено из стали, бронзы, латуни, дюралюминия.

Устройство работает следующим образом.

На первом этапе определяется спектральная область в диапазоне 4000 до 15 см^-1, спектральное разрешение от 0,1 до 10 см^-1 и температура образца от -20 до +100°С, исходя из специфики задачи и образца.

На втором этапе измеряется спектр излучения черной пластины (5) при задании выбранной температуры плоского термостата (6) в диапазоне от -20 до +100°С (спектр черной пластины), при которой планируется измерение спектров собственного излучения образцов. Полученный спектр черной пластины представляет собой спектр излучения абсолютно черного тела при заданной температуре, умноженный на аппаратную функцию спектральной установки. Азот в резервуар (3) узла формирования холодного фона (14) при этом не заливается. Спектр излучения теплой пластины является максимально возможным по интенсивности для всех частот при данной температуре. Спектр собственного излучения любого образца при этой температуре лежит не выше спектра теплой пластины. Поэтому в дальнейшем необходимо подбирать толщину излучающего слоя жидкости таким образом, чтобы спектр излучения был близок, но не доходил до уровня спектра теплой пластины. Так достигается наибольшая информативность измеряемых спектров излучения. Спектр излучения черной пластины измеряется не менее 10 раз для установления диапазона вариаций базовой линии спектров. Спектр наименьшей интенсивности запоминается программно для последующего сравнения.

На третьем этапе плоский термостат (6) отключают, в резервуар (3) узла формирования холодного фона заливают жидкий азот и полностью охлаждают черную пластину (5).

В держатель (28) устанавливается кювета (8). Открывают промывочный порт (25) и заполняют кювету исследуемым образцом. Закрывают промывочный порт и подают заданное давление с помощью узла формирования высокого давления (16) до 150 атм в кювету через пневматический порт (17). Узел формирования высокого давления (16) содержит либо заполненный газом баллон с редуктором или воздушный компрессор с манометром. Используют газ из баллона высокого давления, входящего в группу, состоящую из: азота, аргона, гелия, кислорода, криптона, ксенона, углекислого газа, гексафторида серы, метана, этана или их смесей. Выход узла высокого давления (16) подключают к входу пневматического порта (17). Включение компрессора, формирующего заданное давление, осуществляют подачей сигнала от контроллера (12), связанного с компьютером (13), на вход узла формирования высокого давления (16). В зависимости от задачи устанавливают или извлекают разделитель сред (18). Разделитель сред может быть выполнен из резины, фторопласта, а также иных эластичных, герметичных и химически инертных материалов для используемых жидкостей и газа. Его задача при подаче газового давления препятствовать насыщению раствора газом, а только быть проводником гидростатического давления. Если требуется провести измерение под гидростатическим давлением, то разделитель сред необходим. Если требуется насытить жидкий образец газами, то разделитель сред не используется. Выбирают температуру, при которой надо термостатировать образец от -20 до +100°С (при которой измерялся спектр черной пластины) в кювете (8) и поддерживают ее с помощью термостата (10). При этом необходимо выбирать температуру и давление, опираясь на справочные данные по фазовым диаграммам в координатах температура-давление исследуемых жидкостей во избежание закипания или кристаллизации.

На следующем этапе производят установку толщины образца. С помощью подвижных держателей (21) и (27) оптических окон (22) и (26) выбирают оптимальную длину оптического пути в рабочем объеме кюветы (8), равную толщине слоя исследуемого образца. Перемещение держателей (21) и (27) друг относительно друга обеспечивается за счет резьбового соединения держателей с телом кюветы (8). Толщину рабочего слоя образца равную длине оптического пути (23) выбирают в пределах от 5 мкм до 2 мм. В диапазоне 5-20 мкм зазор между оптическими окнами (22) и (26) выставляется с помощью прокладок с точностью 1 мкм, а в диапазоне 20-2000 мкм по нониусу встроенного микрометра с точностью 5 мкм.

Диапазоны толщин выбираются с учетом типа растворителя, входящего в группу, состоящую из воды, хлороформа, жидкого углеводорода, ДМСО, CCl₄, где толщина прокладки при использовании воды составляет от 5 до 20 мкм, для хлороформа и ДМСО от 5 до 30 мкм, для жидких углеводородов 10-200 мкм, для CCl₄ от 50 до 2000 мкм.

Измеряют спектр собственного излучения образца. При этом сигнал с выхода детектора (2) спектрометра поступает на блок усиления сигнала (11) и контроллер (12) связанный с компьютером (13). Анализируют полученные данные и, в случае необходимости, перед следующим измерением ИК спектра производят подбор толщины рабочего слоя образца (23) в кювете.

Толщина подбирается итерационным методом с учетом имеющегося набора толщин так, чтобы интенсивность полос излучения образца была максимально близка к спектру черной пластины, измеренному на втором этапе, но не достигала его ни в одной частоте исследуемого спектрального диапазона. Если измеренный спектр во всем рассматриваемом интервале частот по интенсивности ниже спектра черной пластины, то надо увеличивать толщину, если хотя бы в одной частоте измеренный спектр совпадает со спектром теплой пластины, то надо уменьшать толщину. Окончание итерационного подбора толщины определяется дискретностью имеющегося набора толщин прокладок или точностью установки толщины по микрометру. При этом обеспечивают дискретность толщин с шагом 1 мкм в диапазоне толщин от 5 до 10 мкм; с шагом 2 мкм в диапазоне от 10 до 20 мкм; с шагом 5 мкм в диапазоне от 20 до 50 мкм; с шагом 10 в диапазоне от 50 до 100 мкм, с шагом 50 мкм в диапазоне от 100 до 500 мкм, с шагом 100 мкм в диапазоне от 500 до 2000 мкм.

После заключительной установки оптимальной толщины измеряют спектр собственного излучения образца с достаточным количеством повторов от 1 до 50 и продолжительностью каждого повтора от 1 секунды до 1 часа, обеспечивающей требуемый уровень сигнал/шум. При этом данные спектров собственного излучения образца сохраняются в компьютере. Затем производится усреднение спектров. Обычно отношение сигнал/шум считается приемлемым, когда оно превышает 10, однако для низких концентраций для достижения такого уровня сигнала может потребоваться слишком долгое изменение, тогда для экономии времени можно считать приемлемым отношение сигнал/шум менее 10. Значения сигнал шум и продолжительность измерений определяются в каждом конкретном случае индивидуально на усмотрение исследователя.

На следующем этапе осуществляется возможность корректировки спектров излучения за счет учета частичного поглощения светового потока окнами кюветы и их собственного излучения. С учетом этого каждый измеренный спектр излучения корректируется следующим образом [N. Penkov, N. Penkova. "Analysis of Emission Infrared Spectra of Protein Solutions in Low Concentrations," Frontiers in Physics. 8, 624779 (2020). doi: 10.3389/fphy.2020.624779]:

I_s - скорректированный спектр излучения изучаемого раствора;

I_exp - измеренный спектр излучения образца в кювете на холодном фоне (нескорректированный);

I_w - спектр излучения окна кюветы на холодном фоне;

T_s - спектр пропускания образца;

T_w - спектр пропускания окна кюветы.

Член I_w * T_s * T_w формулы (1) позволяет вычесть из измеренного спектра излучения вклад излучения фона, прошедшего через первое окно (I_w), ослабленное прохождением через слой образца (I_w*T_s) и через второе окно (I_w*T_s*T_w). Знаменатель T_w в преобразовании (1) учитывает то, что излучение образца ослабляется, проходя через выходное окно кюветы.

Для реализации корректировки необходимо получать дополнительные спектры: I_w, T_s, T_w. При этом спектр I_w измеряется путем установки в держатель (28) одного спектрального окна, идентичного тому, которое используется в кювете (8), и измерению его спектра излучения с использованием холодного фона и с теми же параметрами (спектральный диапазон, разрешение, температура), как и спектры излучения. Спектры пропускания T_s, T_w измеряются на спектрометре в стандартном трансмиссионном режиме с теми же параметрами (спектральный диапазон, разрешение, температура), как и спектры излучения.

На заключительном этапе проводят статистический анализ данных, полученных в нескольких экспериментах, и с использованием программного обеспечения рассчитывают средние спектры, разброс и необходимые статистические параметры. Накопление большого количества повторов и увеличение времени измерения каждого спектра позволяет в результате усреднения снижать влияние шума на спектр и выделять слабые полосы излучения.

Пример №1 Измерение спектра собственного излучения раствора АТФ без давления и под давлением СО₂ 30 атм.

Использовали раствор тринатриевой соли АТФ (Thermo Fisher Scientific, USA), разведенной водой до концентрации 40 мМ. Раствором заполняли кювету с использованием окон из CaF₂ толщиной 20 мм и диаметром 12 мм. Разделитель сред не использовали, поскольку ставилась цель за счет газового давления насытить раствор СО₂. Расстояние между окнами устанавливали 40 мкм. Измерение спектра проводили при температуре кюветы 25°С без давления, а также под давлением газа СО₂ 30 атм. Данные эксперимента приведены на фиг. 3 в виде разностных спектров излучения раствора АТФ и воды. Из фиг. 3 видно, что подача давления СО₂ приводит к изменению спектральных полос колебаний фосфатных групп.

Промышленная применимость К преимуществам эмиссионной ИК спектроскопии с холодным фоном также можно отнести отсутствие воздействия инфракрасного и лазерного излучения на образец. Для измерения собственного излучения жидкого биологического образца также нет необходимости его нагревать, что может нарушить структуру исследуемого образца (например, привести к фазовым переходам в липидах или денатурации белка, либо изменению степени диссоциации в растворах или растворимости в коллоидных системах). Температура измерительной кюветы выбирается с учетом свойств образца и целей исследования.

Устройство и способ рассчитаны на подбор оптимальных условий для наиболее информативного анализа практически любых жидких биологических образцов, таких как растворы, суспензии, эмульсии, взвеси, гели, растворы химических веществ, биологических молекул в объемах 0,2 - 1000 мкл в диапазоне давлений до 150 атм для дальнейшего использования в серийно-поточной спектроскопии.

Учитывая высокую чувствительность (10^-8-10^-10 Вт) и высокое отношение сигнал/шум, метод ИК эмиссионной спектроскопии может иметь существенные преимущества перед классическим методом ИК абсорбционной спектроскопии при анализе молекулярных структур.

Изобретение относится к области спектроскопии и касается устройства и способа для исследования жидких биологических образцов при высоком давлении. Устройство включает в себя спектрометр, который обеспечивает возможность Фурье-преобразования сигнала, узел формирования холодного фона, зеркало. Устройство дополнительно содержит жидкостный термостат, узел формирования высокого давления, контроллер и блок обработки сигналов спектрометра, соединенные с компьютером. Узел формирования холодного фона содержит плоский термостат, который размещен под нижней поверхностью черной пластины с возможностью установки температуры черной пластины в диапазоне от -20 до +100°С. Термостатируемая кювета обеспечивает возможность быстрой регулировки толщины слоя исследуемого жидкого образца за счет изменения расстояния между оптическими окнами. Технический результат заключается в обеспечении возможности проводить высокочувствительный спектральный анализ жидких биологических образцов при высоком давлении без воздействия внешнего излучения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Устройство для измерения спектров собственного излучения в инфракрасном диапазоне жидких образцов при высоком давлении с использованием черной пластины для формирования холодного фона, состоящее из ИК спектрометра, узла формирования холодного фона, зеркала, измерительной кюветы, отличающееся тем, что дополнительно содержит жидкостный термостат, блок управления термостатом, узел формирования высокого давления, блок обработки сигналов спектрометра и контроллер, соединенные с компьютером, при этом спектрометр обеспечивает возможность Фурье-преобразования сигнала и содержит вакуумированный корпус с входным окном, с размещенным в корпусе охлажденным детектором, при этом оптическая ось между детектором, зеркалом и узлом формирования холодного фона проходит через термостатируемую измерительную кювету, которая закреплена на внешней поверхности корпуса вблизи входного окна спектрометра, где узел формирования холодного фона дополнительно содержит плоский термостат, который размещен под нижней поверхностью черной пластины с возможностью термостабилизации черной пластины в диапазоне от -20 до +100°С, где плоский термостат соединен с жидкостным термостатом, черная пластина выполнена с неотражающим в инфракрасном диапазоне покрытием, где термостатируемая кювета выполнена с возможностью обеспечения быстрой регулировки толщины рабочего слоя исследуемого жидкого образца за счет смены расстояния в измерительной кювете между первым и вторым спектральными окнами, при этом кювета снабжена промывочным портом и пневматическим портом с возможностью ввода образца и повышения давления до 150 атм в рабочем объеме кюветы.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что черная пластина установлена на плоский термостат.

3. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что измерения спектров жидких образцов проводят в инфракрасном диапазоне от 4000 до 15 см^-1.

4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что оптические окна измерительной кюветы выполняют из материала, входящего в группу, состоящую из: алмаза, фторида кальция, кремния, кварца, KRS-5, KRS-6, бромида калия, йодида цезия, хлорида натрия, полиэтилена высокого давления, селенида цинка.

5. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что термостатирование измерительной кюветы осуществляют в диапазоне от -20 до +100°С.

6. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что давление в рабочем объеме кюветы обеспечивают за счет газового или гидростатического давления.

7. Способ измерения спектров собственного излучения в инфракрасном диапазоне жидкого биологического образца при высоком давлении с использованием черной пластины для формирования холодного фона, содержащий этапы, на которых:

- определяют спектральную область в диапазоне от 4000 до 15 см^-1 и температуру жидкого биологического образца при измерении спектра в пределах диапазона от -20 до +100°С;

- измеряют спектр излучения фона черной пластины в определенной спектральной области и при значении температуры черной пластины, соответствующей температуре жидкого биологического образца, с возможностью термостатирования черной пластины в диапазоне от -20 до +100°С, при этом спектр излучения черной пластины измеряют не менее 10 раз для установления диапазона вариаций базовой линии спектров, где спектр наименьшей интенсивности запоминают в компьютере для последующего сравнения;

- отключают термостатирование черной пластины и заливают ее жидким азотом для охлаждения;

- устанавливают кювету в держатель, размещенный возле входного окна спектрометра, и подключают кювету к термостату для осуществления возможности термостатирования жидкого биологического образца при выбранной температуре в диапазоне от -20 до +100°С;

- открывают промывочный порт и заполняют кювету исследуемым образцом, закрывают промывочный порт и подают заданное давление в диапазоне до 150 атм через пневматический порт, при этом осуществляют возможность включения компрессора, формирующего заданное давление, путем подачи сигнала от контроллера, связанного с компьютером, или использования баллона с газом под давлением, регулируемым редуктором;

- с учетом типа растворителя, используемого для формирования жидкого биологического образца, устанавливают длину оптического пути, равную толщине рабочего слоя исследуемого жидкого образца в пределах от 5 мкм до 2 мм, с помощью подвижных держателей оптических окон, при этом толщину рабочего слоя образца устанавливают по нониусу встроенного микрометра с шагом 5 мкм или с использованием прокладок с шагом 1 мкм, при этом тип растворителя входит в группу, состоящую из воды, хлороформа, углеводорода, ДМСО, CCl₄, где длину оптического пути при использовании разных типов растворителей устанавливают в пределах от 5 до 20 мкм для воды, в пределах от 5 до 30 мкм для хлороформа и ДМСО, в пределах от 10 до 200 мкм при использовании жидких углеводородов, в пределах от 50 до 2000 мкм при использовании CCl₄ и проводят измерение спектра;

- проводят сравнение спектра излучения фона черной пластины и спектра жидкого биологического образца, где в случае меньшей интенсивности спектра жидкого образца во всей спектральной области по отношению интенсивности спектра черной пластины увеличивают длину оптического пути через рабочий слой исследуемого жидкого образца;

- проводят измерение спектра собственного излучения образца с достаточным количеством повторов от 1 до 50 и продолжительностью каждого повтора от 1 секунды до 1 часа, обеспечивающих требуемый уровень сигнал/шум, при этом данные спектров собственного излучения образца сохраняются в компьютере, при этом осуществляется возможность корректировки спектров излучения за счет учета частичного поглощения светового потока окнами кюветы и их собственного излучения.