СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИБНЫХ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/716 C12N1/14 C12P19/04 

Область техники

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способам подготовки посевного мицелия базидиомицета, погруженного культивирования базидиомицета на крахмалсодержащих средах и получения некрахмальных полисахаридов из культуральной жидкости.

Известно, что базидиомицеты является продуцентом биологически активных веществ, среди которых наиболее известными считаются некрахмальные полисахариды. Согласно многочисленным исследованиям, данные метаболиты обладают противовоспалительными, противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами, что позволяет применять их в терапии многих заболеваний. Основными источниками некрахмальных полисахаридов являются плодовые тела базидиомицетов, мицелиальная биомасса и культуральная жидкость, полученная методом погруженного культивирования. Получение полисахаридов из мицелия подразумевает измельчение биомассы с последующей щелочной и кислотной экстракцией, что делает его трудоемким и дорогостоящим. Некрахмальные полисахариды из культуральной жидкости, также называемые экзополисахаридами, получают путем спиртового осаждения. Данный подход отличается простотой и эффективностью.

Уровень техники

В настоящее время большое внимание уделяется разработке технологии погруженного культивирования базидиомицетов с целью получения внеклеточных полисахаридов.

Известен способ получения внеклеточного полисахарида лентинана из культуральной жидкости путем погруженного культивирования мицелия базидиомицета Lentinus edodes на среде содержащей 3 г солодового экстракта, 20 г глюкозы, 3 г дрожжевого экстракта, 5 г пептона на 1 литр воды, а также соли магния, калия, кукурузный щелок и витамины (US 10471135 В2. 2019).

Предварительно готовят посевной материал, для чего мицелий Lentinus edodes сначала культивируют в предпочтительном диапазоне температур 23-32°С в течение 14-20 дней на агаризованной питательной среде, содержащей солодовый экстракт, глюкозу, дрожжевой экстракт и пептон. Затем, посевной материал переносят в жидкую среду и культивируют при 23-32°С в течение 12-18 дней. Полученным в два этапа посевным мицелием засевают питательную среду и культивируют при 28°С в течение 16 суток [1].

Недостатком описанного способа является длительный процесс подготовки посевного мицелия до 30 суток, длительный период погруженного культивирования, составляющий 16 суток, низкая конечная концентрация полисахарида в культуральной жидкости, составляющая 43 мг/л.

Известен способ получения внеклеточного полисахарида ганодерана из культуральной жидкости путем погруженного культивирования мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum IFO 4912 на среде следующего состава: крахмальный гидролизат 60 г, зародыши пшеницы 2 г, кукурузный сироп 3 г, аммония нитрат 1 г, калия гидроортофосфат 1 г, магния сульфат 7-водный 0.5 г, калия хлорид 0.5 г, магния сульфат 4-водный 0.001 г на 1 литр воды, рН среды 6.2 (US 4769363 A. 1988). Предварительно подготовленный посевной мицелий пересевали на питательную среду и культивировали при 30°С в течение 6 суток [2].

Недостатком описанного способа является сложность компонентного состава питательной среды, из-за чего конечный продукт ганодеран может содержать большое количество примесей.

Известен способ получения внеклеточного полисахарида из культуральной жидкости путем погруженного культивирования мицелия базидиомицета Schizophyllum commune на среде следующего состава: глюкоза 50 г, солодовый экстракт 5 г, дрожжевой экстракт 5 г, аммония сульфат 1 г, калия дигидроортофосфат 1 г, магния сульфат 0.5 г на 1 литр воды, рН среды 6.0. В стерильную питательную среду добавляли сорбент Amberlite XAD-7 в количестве 20 г на 1 литр воды (US 20090023681 A1. 2009). Предварительно подготовленный посевной мицелий пересевали на питательную среду и культивировали при 28°С в течение 5 суток [3].

Недостатком описанного способа является сложность компонентного состава питательной среды, из-за чего в питательную среду следует добавлять специальный синтетический адсорбент для удаления примесей.

Сущность изобретения

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является оптимизация компонентного состава питательной среды. Технический результат, достигаемый в результате использования предложенного изобретения, заключается в сокращении длительности процесса культивирования базидиомицета Ganoderma lucidum и повышение выхода полисахарида.

Описание изобретения

Поставленная задача изобретения решается за счет того, что в способе получения экзополисахаридов согласно изобретению приготовление посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum проводится в два этапа. На первом этапе осуществляется посев культуры базидиомицета на стерильную агаризованную питательную среду следующего состава: пшеничный крахмал 20-25 г, аммония хлорид 0.5-1 г, кальция хлорид 0.1-0.2 г, магния сульфат 0.5-1 г, калия дигидроортофосфат 1-1.5 г, калия гидроортофосфат 0.05-0.75 г, бактериологический агар-агар 20-25 г на 1 литр воды. Рекомендованный начальный рН приготовленных сред 5.0-5.5. Культивирование на первом этапе проводят при температуре 22-28°С в течение 7-9 суток. На втором этапе подготовки посевного материала мицелий, полученный на первом этапе, пересевают на жидкую среду следующего состава: глюкоза 10-15 г, дрожжевой экстракт 0.3-0.5 г, магния сульфат 0.5-1 г, калия дигидроортофосфат 1-1.5 г, калия гидроортофосфат 0.05-0.75 г на 1 литр воды. Рекомендованный начальный рН приготовленных сред 5.0-5.5. Культивирование на втором этапе осуществляют при температуре 26-29°С в течение 10-13 суток. Для активации роста базидиомицета в агаризованную и жидкую питательные среды целесообразно вводить тиамин в количествах 0.05-0.075 г на 1 литр воды. На этапе погруженного культивирования мицелия базидиомицета при приготовлении питательной среды в качестве источников углерода и азота используют пшеничный крахмал и аммония хлорид в количествах, соответственно равных 15-30 г и 0.3-1 г на 1 литр воды, а в качестве минеральных солей используют кальция хлорид, магния сульфат, калия дигидроортофосфат, калия гидроортофосфат и тиамин в количествах, соответственно равных 0-0.8 г, 0.4-0.6 г, 0.5-1 г, 0.05-0.075 г и 0.05-0.075 г на 1 литр воды. Рекомендованный начальный рН питательной среды 4.0-4.5. Погруженное культивирование мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum целесообразно осуществлять при 27-29°С в течение 7-9 суток. После культивирования культуральную жидкость отделяют от погруженной культуры центрифугированием при 6000-8000 об/мин. Полученный супернатант смешивают с 75-96% этанолом в пропорции 1: 2-4 и выдерживают при температуре 3-6°С в течение 12-24 часов. Полученный осадок экзополисахаридов отделяют от жидкой фракции центрифугированием и лиофильно высушивают. Экзополисахариды, полученные описанным способом, являются самостоятельным объектом изобретения.

Технический результат, достигаемый в результате использования предложенного изобретения, заключается в повышении выхода экзополисахаридов и сокращении длительности культивирования мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum за счет оптимизации компонентного состава питательных сред.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний заявителя, но и не ограничивают его.

Пример 1. Приготовление посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881.

Посев мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum проводили на агаризованную стерильную среду следующего состава: пшеничный крахмал 24 г, аммония хлорид 1 г, кальция хлорид 0.15 г, магния сульфат 0.55 г, калия дигидроортофосфат 1 г, калия гидроортофосфат 0.05 г, тиамин 0.05 г, бактериологический агар-агар 21.5 г на 1 литр воды, начальный рН 5.1. Культивирование проводили при температуре 28°С в течение 9 суток.

Для получения посевного материала готовили жидкую питательную среду следующего состава: глюкоза 10 г, дрожжевой экстракт 0.4 г, магния сульфат 1 г, калия дигидроортофосфат 1 г, калия гидроортофосфат 0.05 г, тиамин 0.05 г на 1 литр воды, начальный рН 5.1. Культивирование осуществляли при температуре 28°С в течение 11 суток. В результате был получен посевной мицелий с характерной биосинтетической активностью.

Пример 2. Погруженное культивирование базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 на крахмалсодержащей среде с количественным соотношением источников углерода и азота C:N 1:30.

Была приготовлена питательная среда следующего состава: пшеничный крахмал 30 г, аммония хлорид 1 г, кальция хлорид 0.5 г, магния сульфат 0.55 г, калия дигидроортофосфат 0.9 г, калия гидроортофосфат 0.05 г, тиамин 0.05 г на 1 литр воды, начальный рН питательной среды 4.1. Стерильную питательную среду засевали посевным материалом, подготовленным согласно способу, описанному в Примере 1. Погруженное культивирование Ganoderma lucidum проводили в колбах объемом 750 мл при 28°С на орбитальном шейкера при 100 об/мин в течение 9 суток. Выход экзополисахаридов по субстрату составил 0.011 г экзополисахаридов/г крахмала.

Пример 3. Погруженное культивирование базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 на крахмалсодержащей среде с количественным соотношением источников углерода и азота C:N 1:40.

Была приготовлена питательная среда следующего состава: пшеничный крахмал 15 г, аммония хлорид 0.375 г, кальция хлорид 0.75 г, магния сульфат 0.55 г, калия дигидроортофосфат 0.9 г, калия гидроортофосфат 0.05 г, тиамин 0.05 г на 1 литр воды, начальный рН питательной среды 4.1. Стерильную питательную среду засевали посевным материалом, подготовленным согласно способу, описанному в Примере 1. Погруженное культивирование Ganoderma lucidum проводили в колбах объемом 750 мл при 28°С на орбитальном шейкера при 100 об/мин в течение 7 суток. Выход экзополисахаридов по субстрату составил 0.015 г экзополисахаридов/г крахмала.

Пример 4. Погруженное культивирование базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 на крахмалсодержащей среде с количественным соотношением источников углерода и азота C:N 1:40 в биореакторе.

Была приготовлена питательная среда следующего состава: пшеничный крахмал 15 г, аммония хлорид 0.375 г, кальция хлорид 0.75 г, магния сульфат 0.55 г, калия дигидроортофосфат 0.9 г, калия гидроортофосфат 0.05 г, тиамин 0.05 г на 1 литр воды, начальный рН питательной среды 4.1. Стерильную питательную среду засевали посевным материалом, подготовленным согласно способу, описанному в Примере 1. Погруженное культивирование Ganoderma lucidum проводили в отъемно-доливном режиме в колонном биореакторе объемом 0.3 л, заполненном твердыми носителями. Было проведено три цикла культивирования. Каждый цикл длился 7 суток, по окончании которых из биореактора выгружали 200 мл культуральной жидкости и доливали 200 мл свежей крахмалсодержащей питательной среды.

В таблице 1 представлены результаты погруженного культивирования базидиомицета Ganoderma lucidum в биореакторе.

Средний выход экзополисахаридов по субстрату составил 0.013±0.001 г экзополисахаридов/г крахмала.

Пример 5. Получение экзополисахаридов из культуральной жидкости.

Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 3, 4 центрифугировали при 8000 об/мин для отделения мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum. Полученную культуральную жидкость смешивали с 96% этанолом в соотношении 1:3 и выдерживали в течение 20 часов при температуре 4°С. Полученный осадок экзополисахаридов центрифугировали при 8000 об/мин и лиофильно высушивали. Параметры культуральной жидкости, используемой для получения экзополисахаридов, представлены в таблице 2.

Из приведенных материалов следует, что за счет оптимизации компонентного состава питательной среды сокращается длительность культивирования погруженной культуры базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 до 7-9 суток с одновременным повышением выхода экзополисахаридов.

Источники информации:

1. Kristiansen В. Production of fungal extracellular immune stimulating compounds: пат. US 10471135 B2. 2019.

2. Misaki A., Sone Y., Yoshida M, Takeuchi K. Beta-glucan: пат. US 4769363 A. 1988.

3. Kim M, Park Y.-D., LEE S.-R. Method of using beta-glucan from Schizophyllum commune: пат. US 20090023681 A1. 2009.

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности, а именно к способу получения водорастворимых экзополисахаридов из мицелия базидиомицета. Способ получения водорастворимых экзополисахаридов, включающий подготовку посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum, погруженное культивирование подготовленного посевного мицелия с последующим выделением экзополисахаридов из культуральной жидкости, при этом подготовка посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 осуществляется в два этапа, на первом из которых проводят засев культуры базидиомицета на стерильную агаризованную питательную среду, содержащую источник углерода, азота, минеральных солей и бактериологический агар-агар, а на втором проводят посев мицелия, полученного на первом этапе, на стерильную жидкую питательную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральных солей, приготовление питательной среды для погруженного культивирования, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, а погруженное культивирование мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 для получения экзополисахаридов проводится при 27-29°С в течение 7-9 суток на питательной среде, при приготовлении которой в качестве источника углерода и азота используют пшеничный крахмал и аммония хлорид в количествах, соответственно равных 15-30 г и 0.3-1 г на 1 литр воды, в качестве источников минеральных солей используют кальция хлорид, магния сульфат, калия дигидроортофосфат, калия гидроортофосфат в количествах, соответственно равных 0-0.8 г, 0.4-0.6 г, 0.5-1 г и 0.05-0.075 г на 1 литр воды, в качестве активатора роста мицелия используют тиамин в количестве 0.05-0.075 г на 1 литр воды, а начальный рН питательной среды составляет 4.0-4.5. Также предлагается порошкообразный продукт, полученный заявленным способом. Вышеописанный способ позволяет повысить выхода экзополисахаридов (конечного продукта) и сократить длительность культивирования мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum за счет оптимизации компонентного состава питательных сред. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

1. Способ получения водорастворимых экзополисахаридов, включающий подготовку посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum, погруженное культивирование подготовленного посевного мицелия с последующим выделением экзополисахаридов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что подготовка посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 осуществляется в два этапа, на первом из которых проводят засев культуры базидиомицета на стерильную агаризованную питательную среду, содержащую источник углерода, азота, минеральных солей и бактериологический агар-агар, а на втором проводят посев мицелия, полученного на первом этапе, на стерильную жидкую питательную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральных солей, приготовление питательной среды для погруженного культивирования, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, а погруженное культивирование мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 для получения экзополисахаридов проводится при 27-29°С в течение 7-9 суток на питательной среде, при приготовлении которой в качестве источника углерода и азота используют пшеничный крахмал и аммония хлорид в количествах, соответственно равных 15-30 г и 0.3-1 г на 1 литр воды, в качестве источников минеральных солей используют кальция хлорид, магния сульфат, калия дигидроортофосфат, калия гидроортофосфат в количествах, соответственно равных 0-0.8 г, 0.4-0.6 г, 0.5-1 г и 0.05-0.075 г на 1 литр воды, в качестве активатора роста мицелия используют тиамин в количестве 0.05-0.075 г на 1 литр воды, а начальный рН питательной среды составляет 4.0-4.5.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получение посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 проводится в два этапа, на первом из которых осуществляется культивирование мицелия при температуре 22-28°С в течение 7-9 суток на агаризованной питательной среде, при приготовлении которой в качестве основы плотной питательной среды используют бактериологический агар-агар в количестве 20-25 г на 1 литр воды, в качестве источника углерода и азота используют пшеничный крахмал и аммония хлорид в количествах, соответственно равных 20-25 г и 0.5-1 г на 1 литр воды, в качестве источников минеральных солей используют кальция хлорид, магния сульфат, калия дигидроортофосфат, калия гидроортофосфат в количествах, соответственно равных 0.1-0.2 г, 0.5-1 г, 1-1.5 г и 0.05-0.075 г на 1 литр воды, в качестве активатора роста мицелия используют тиамин в количестве 0.05-0.075 г на 1 литр воды и начальный рН питательной среды составляет 5.0-5.5, а на втором этапе подготовки посевного мицелия базидиомицета культивирование Ganoderma lucidum (Curtis 1781) P. Karsten 1881 проводится при температуре 26-29°С в течение 10-13 суток на жидкой питательной среде, при приготовлении которой в качестве источника углерода и азота используют глюкозу и дрожжевой экстракт в количествах, соответственно равных 10-15 г и 0.3-0.5 г на 1 литр воды, в качестве источников минеральных солей используют магния сульфат, калия дигидроортофосфат, калия гидроортофосфат в количествах, соответственно равных 0,5-1 г, 1-1.5 г и 0.05-0.075 г на 1 литр воды, в качестве активатора роста мицелия используют тиамин в количестве 0.05-0.075 г на 1 литр воды и начальный рН питательной среды составляет 5.0-5.5.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после погруженного культивирования из культуральной жидкости удаляют биомассу мицелия центрифугированием при 6000-8000 об/мин, полученный супернатант смешивают с 96% этанолом в соотношении 1:2-4 и выдерживают при температуре 3-6°С в течение 12-24 часов, после чего осадок, содержащий экзополисахариды, отделяют центрифугированием при 6000-8000 об/мин и лиофильно высушивают.

4. Порошкообразный продукт, полученный по способу по пп. 1-3, характеризующийся тем, что содержит водорастворимые экзополисахариды грибного происхождения.