СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Российский патент 2021 года по МПК C12N9/58 C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способам получения ферментных препаратов, в частности, коллагеназы, которая перспективна для использования в медицине, косметологии, дерматологии, пищевой и кожевенно-меховой промышленности.

Коллагеназа является уникальным ферментом, который способен избирательно гидролизовать коллаген, входящий в состав соединительной ткани живого организма. Расщепляя крайне устойчивые к действию других протеаз коллагеновые волокна, коллагеназа выполняет в организме человека и животных важнейшие функции, участвует в превращениях соединительной ткани при росте и морфогенезе, а также в устранении некоторых патологических процессов.

Исследование компании ИА Крединформ «Ферментные препараты на основе коллагеназы и их применение» [https://marketing.rbc.ru/articles/710/] показало, что в наше время ферментные препараты, в том числе на основе коллагеназы, широко используются в различных отраслях и сферах - от медицины до мясной промышленности и пивоварения.

В частности, известны медицинские препараты на основе коллагеназы, такие, например, как мазь Ируксол для лечения кожных покровов. В косметологии коллагеназа используется в косметических препаратах - кремах, сыворотках и пр., в БАД и при различных процедурах в частности, при электрофорезе для уменьшения и рассасывания рубцов, шрамов и т.п.

В настоящее время коллагеназы получают, как правило, переработкой биологического материала. Коллагеназы широко распространены у беспозвоночных животных, у которых в отличие от высших млекопитающих, используются в процессе пищеварения. Например, из морской звезды Pycnopodia helianthoides были выделены две протеиназы с коллагенолитическим действием. Одна из них отнесена к классу металлопротеиназ, а другая с меньшей молекулярной массой - химотрипсинового типа. Оба фермента разрушали меченый коллаген из шкуры гвинейской свиньи, но были практически неактивны по субстрату клостридиопептидазы PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg [М.Е. Alexander, M.N. Dresden, Comp. Biochem. Physiol. 1980, V. 67 В, p. 505-509]. Коллагеназы беспозвоночных обнаружены у пиявок, различных насекомых, у креветок, различных видов крабов. Однако далеко не все они являются перспективными источниками коллагеназ, применяемых в медицине и других отраслях, что, как правило, связано с ограниченным количеством исходного материала [RU 2236460, 2004].

Широкое применение нашли способы получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность, из измельченных панкреассодержащих наземных или водяных животных. В качестве сырья используют панкреассодержащие органы рыб: пилорические придатки терпуга, камбалы, трески, сельди, скумбрии, ставриды, мойвы, палтуса, сайры, анчоуса, лососей, гепатопанкреас краба, криля, кальмара, поджелудочную железу морских ластоногих и китообразных, а также крупного и мелкого рогатого скота, свиней, оленей, кур. [RU 2034028, 1995].

Наибольшее распространение получила технология выделения коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов крабов [RU 2008353, 1995; RU 2096456, 1997; RU 2112036, 1998; RU 2265052, 2005], в частности, из камчатского краба Paralithodes camtshatica, что связано с решением проблемы утилизации отходов краболовства. Кроме того, немаловажным преимуществом этой коллогеназы является относительная безвредность препаратов коллагеназ из краба для человека. Так, известен способ получения коллагенолитического препарата, предусматривающий гомогенизацию тканей гепатопанкреаса в буферном растворе с рН 6,0-9,5, содержащем неионный детергент и NaCl с последующей очисткой раствора микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, концентрированием ультрафильтрацией на мембране с диаметром пор 5 кДа и лиофильным высушиванием. Удельная протеолитическая активность не ниже 10000 ед/мг [ЕР 0402321, 1990].

Препараты, полученные из гепатопанкреаса, значительно различаются по степени чистоты и активности, а также по составу. К недостаткам данных способов также можно отнести длительность и многостадийность процесса выделения коллагеназы, что значительно снижает выход продукта.

Известен способ получения коллагеназы из головного отдела различных видов пиявок [RU 2160280, 2000; WO 87/00860, 1987]. Для этого замороженный головной отдел пиявки гомогенизируют в дистиллированной воде, суспензию неоднократно центрифугируют 10 мин и собирают супернатант. Фермент высаливают сульфатом и диализуют против дистиллированной воды. Коллагеназы пиявок не дают побочных эффектов и действуют прямо на один из основных стимуляторов аггрегации тромбоцитов. Кроме того, коллагеназы пиявок разрушают коллаген только по одной связи, что дает возможность применять этот фермент вместе с другими активными факторами в микрохирургии. Недостатком известного способа является длительность и трудоемкость такого способа получения коллагеназы.

В настоящее время широкое распространение получили коллагеназы микробного происхождения, среди которых наиболее изученными являются коллагеназы, синтезируемые бактерией Clostridium histolyticum, которые характеризуются высокой специфичностью действия на коллагеновые волокна. К настоящему времени уже разработан ряд фармацевтических композиций на основе коллагеназы [RU 2166950, 2001; RU 2174389, 2001; RU 2139044, 1999; RU 2149644, 2000 и др.]. Так, известен препарат «Ируксол» (Германия), который содержит коллагеназу в смеси с протеазами, выделенными из бактериальной культуры Clostridium histolyticum. «Ируксол» является комбинированным препаратом с протеолитическим и противомикробным действием для наружного применения, используется для энзиматического очищения ран, в том числе при варикозных язвах, пролежнях, при гангрене конечностей, в особенности у больных сахарным диабетом, а также при отморожениях, при длительно незаживающих послеоперационных ранах, после лучевой терапии, при подготовке к трансплантации кожи [Susagawara R., Harper Е. Publication and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum II Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 5175-5182].

Недостатком препаратов из данного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены, является необходимость тщательной очистки в специальных условиях, дороговизна и многостадийность, что приводит к снижению активности получаемого на выходе препарата и повышению его стоимости.

Известен также способ получения микробной коллагеназы из ультрафильтрата культуральной жидкости Streptomyces lavendulae ИНМИ-36-SV [RU 95104309, 1996]. Препарат получают из ультраконцентрата культуральной жидкости штамма Streptomyces lavendulae ИНМИ-36-SV с помощью ионнооб-менной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гельфильтрации на сефадексе G-100 и лиофилизации. Данный препарат имеет более высокую коллагеназную активность, чем препарат из Clostridium histolyticum, однако способ имеет ряд недостатков, в частности многостадийность и относительно невысокий выход.

Среди источников коллагеназы значительный интерес представляет использование грибов в связи с их меньшей токсичностью для человека и более простой технологией культивирования.

Известен способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков, содержащий коллагеназу, кератиназу и эластазу из предварительно активированной культуры штамма-продуцента из числа грибов-дерматофитов видов Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Microsporum canis и Microsporum gypseum [RU 2003118988, 2004]. После выделения, очистки и высушивания получают препарат, обладающий суммарной протеолитической активностью не менее 0,7 ПЕ/мг.

Недостатком препарата является наличие в его составе смеси ферментов и недостаточная активность.

Задачей, решаемой авторами изобретения, является расширение номенклатуры сырья, используемого для получения коллагеназы. Указанная задача решалась за счет использования для данных целей базидиальных грибов.

Базидиальные грибы (базидиомицеты), в большинстве своем сапротрофы, играют важную роль в минерализации органических соединений, в особенности трудно разрушаемых (целлюлоза, лигнин). Например, афиллофоровые базидиомицеты относятся к ксилотрофным грибам, вызывающим в природе разрушение древесины по типу белой или бурой гнили и способны расти на всевозможных древесных субстратах и их отходах. Наибольшее распространение базидиомицеты имеют в лесных почвах и подстилке.

В настоящее время предпринимаются активные исследования, направленные на создание технологии культивирования базидиомицетов, в частности, грибов, продуцирующих ценные биологически активные вещества (БАВ), в частности, белков, витаминов, незаменимых аминокислот, липидов, полисахаридов и др. Поэтому большое внимание уделяется разработке технологий искусственного выращивания (культивирования) базидиомицетов как в погруженных условиях (глубинное культивирование), так и на поверхности различных субстратов.

Образование базидиомицетами ценных стабильных биологически активных веществ зависит от вида используемых базидиомицетов и технологии культивирования.

В частности, предложено культивировать высшие базидиальные грибы на питательной среде на основе пивного сусла [Александрова Е.А., Завьялова Л.А., Терешина В.М., Гарибова Л.В., Феофилова Е.П. Получение плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing.; Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология, 1998. Т. 67. №5. С. 649-654; (http://selhozproduct.narod.ru / miselia.html]. Известен способ приготовления мицелия базидиомицетов путем их культивирования на стерильной питательной среде, содержащей 20% отвар картофеля, глюкозу или сахарозу и агар при 24°С в течение 14 дней [W0 2004/097007, 2004].

Недостатком этой технологии является небольшой выход биомассы мицелия высших базидиальных грибов из-за отсутствия в питательной среде достаточного количества минеральных веществ и энергетического субстрата (углеводов), длительность процесса приготовления посевного материала.

Известны способы получения мицелия при выращивании плодовых тел съедобного базидиального гриба Pleurotus ostreatus, заключающийся в инокуляции зернового субстрата мицелием, выращенным методом погруженного культивирования на жидких питательных средах, содержащих крахмал кукурузный, кукурузный или ячменно-солодовый экстракт и минеральные добавки [(UA 36655, 2001], или Pleurotus djamor на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода - глюкозу, сахарозу, растительное масло, источники азота - соевая мука, пептон, нитрат натрия, сульфат аммония, а также ди-гидрофосфат калия, сульфат магния и калия по [Краснопольская и др., Pleurotus djamor. способы культивирования и антимикробные свойства // Микология и фитопатология, 2001. Т. 35. Вып. 1. С. 62-67].

Недостатком этих способов является длительность процесса приготовления посевного мицелия - до 16 суток, а также узкие рамки его применения -только для одного вида рода Pleurotus. Кроме того в ходе их культивирования не отмечена возможность получения коллагеназы.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является ранее разработанная авторами технология получения коллагенолитических ферментов, путем глубинного культивирования базидиальных грибов с использованием в качестве источников углерода и азота глюкозы и пептона [RU 2018100382, 2018]. Культивирование проводят с использованием полусинтетической среды следующего состава, г/л: пептон - 1.08; глюкоза - 10; KH₂PO₄ - 0.6; K₂HPO₄ - 0.4; MgSO₄*7H₂O - 0.5; FeSO₄ - 0.005; ZnSO₄ - 0.001; CaCl ₂ - 0.05; NaCl - 0.5; экстракт дрожжевой сухой - 2.0. По достижении максимальной коллагенолитической активности мицелиальную биомассу отделяют от нативного раствора методом фильтрации под вакуумом, затем проводят концентрирование и очистку нативного раствора методом ультрафильтрации на полупроницаемой мембране марки «МИФИЛ ПА-20» с величиной номинального молекулярно-массового предела задерживания 20 Ша. Ультрафильтрат лиофильно высушивают.

Удельная коллагеназная активность ферментного препарата составляет от 2000 до 9000 Ед/мг белка в зависимости от используемого гриба.

Технической задачей, решаемой авторами, является создание технологии, позволяющей повысить ферментативную активность.

Было установлено, что для достижения максимального выхода коллагеназы при культивировании базидиальных грибов требуется оптимальная рецептура питательной среды.

Было установлено, что технический результат достигается тем, что в рамках технологии, включающей в себя культивирование базидиальных грибов методом глубинного культивирования макромицетов на жидкой питательной среде, отделения мицелиальной биомассы от нативного раствора и концентрирования методом ультрафильтрации с последующим высушиванием ультрафильтрата в качестве источника азота используют мочевину, а в качестве источника углерода - лактозосодержащие продукты при их содержании в питательной среде - мочевины 1,5-5,0 г/л и лактозы 6,0-10,0 г/л.

Использование мочевины и лактозы в меньших концентрациях приводит к падению выхода коллагеназы, а при больших концентрациях не приводит к повышению ее выхода и экономически нецелесообразно.

В качестве источника лактозы используют лактозу или продукты, ее содержащие, например, сухую молочную сыворотку (CMC).

Используемая жидкая питательная среда, как правило, содержит мочевину 1,5-5 г/л, лактозо-содержащий продукт 6-15 г/л, экстракт дрожжевой 2 г/л, минеральные добавки (KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄*7H₂O, FeSO₄, ZnSO₄, CaCl ₂, NaCl) - 2-2,5 г/л, вода-остальное.

Промышленная применимость иллюстрируется на примере культивирования культур высших грибов, которые были выделены из плодовых тел, собранных в северо-восточной пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга. Плодовые тела (базидиомы) собраны и индуцированы в чистую культуру на кафедре технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технического университета.

Пример 1. Мицелий гриба помещали питательную среду, содержащую источники углерода (пептон или мочевину), углеводы, (в частности CMC, содержащая 70% лактозы), минеральные добавки: KH₂PO₄ - 0.6; K₂HPO₄ - 0.4; MgSO₄*7H₂O - 0.5; FeSO₄ - 0.005; ZnSO₄ - 0.001; CaCl ₂ - 0.05; NaCl - 0.5; а также экстракт дрожжевой сухой - 2.0. рН среды до стерилизации 6.8-6.9. Стерилизацию среды проводили при 0.75⋅10⁵ Па в течение 30 минут. По достижении максимальной коллагенолитической активности мицелиальную биомассу отделяли от нативного раствора фильтрацией под вакуумом, после чего проводили концентрирование и очистку нативного раствора методом ультрафильтрации в ячейке непроточного типа марки «ФМ 02-200» объемом 200 мл на полупроницаемой мембране марки «МИФИЛ ПА-20» с величиной номинального молекулярно-массового предела задерживания 20 kDa. Ультрафильтрат подвергали лиофильной сушке на установке Него (Дания) при температуре замораживания материала -40°С, температуре конденсора -30°С и определяли коллагенолитическую активность сухого порошка. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Полученные результаты показали, что использование заявляемого изобретения по сравнению с аналогами, позволяет повысить выход коллагеназы в 1,4-1,7 раза.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения коллагенолитического фермента, включающий культивирование базидиальных грибов видов Correna unicolor, Ganoderma lucidum, Trametes ochracea, Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus, Hypsizygus ulmarius, Lentinus edodes, Funalia trogii, Fomes fomentarius или Coprinus lagopides на жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 6,0-10,0 г/л лактозы или 10-15 г/л сухой молочной сыворотки, содержащей 70% лактозы, а в качестве источника азота - 1,5-5,0 г/л мочевины, с последующим отделением мицелия фильтрацией, концентрирования нативного раствора с помощью ультрафильтрации, лиофильной сушки. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ получения коллагенолитического фермента путем культивирования базидиальных грибов видов Correna unicolor, Ganoderma lucidum, Trametes ochracea, Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus, Hypsizygus ulmarius, Lentinus edodes, Funalia trogii, Fomes fomentarius или Coprinus lagopides на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли с последующим отделением мицелия фильтрацией, концентрирования с помощью ультрафильтрации и лиофильной сушки, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют лактозу или сухую молочную сыворотку, содержащую 70% лактозы, а в качестве источника азота - мочевину при следующем их содержании в питательной среде:

мочевина 1,5-5,0 г/л лактоза 6,0-10,0 г/л или молочная сыворотка 10-15 г/л

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют мочевину 1,5-5,0 г/л, лактозу 6,0-10,0 г/л или молочную сыворотку 10-15 г/л, экстракт дрожжевой 2,0 г/л, минеральные соли 2,056 г/л, вода - остальное».