СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ Российский патент 1996 года по МПК C12P19/04 C12M1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биополимеров, например, экзополисахаридов.

Известны способы получения экзополисахаридов с использованием различных штаммов: Acinetobacter sp. ВКПМ В-3243 (авт. св. N 1579059), Bacillus polymyxa ВКПМ В-3015 (авт. св. N 1698293), консорциум дрожжей Candida tropicalis ЦМПМ У-507 и штамм бактерий Acinetobacter species ЦМПМ В-3243 (авт.св. N 1311256).

Штаммы при росте на богатой органической среде в условиях аэрации при 28-30^oС в течение 72-96 часов продуцируют полисахарид, превращая культуральную жидкость в гель.

Можно осуществлять культивирование штамма Acinetobacter sp. на жидкой минеральной среде следующего состава: мас. KH₂PO₄ 0,55; NaHPO₄ 1,0; NH₄Cl 0,06; MgSO₄ 0,019; CaCl₂ 0,00075; FeSO₄ 0,0006, вода остальное.

В качестве источника углеродного питания используют сахарозу в концентрации 4% или глюкозу в концентрации 2% или этанол в количестве 1 об.

Посевную культуру B. polymyxa (10 об.) вносят в питательную среду, содержащую, об. гидролизованный кукурузный крахмал 3; БВК 0,5; KH₂PO₄ 0,05; K₂HPO₄ •3 H₂O 0,05; MgO₄•7 H₂O 0,04; CaCl ₂ 0,02.

Периодическое культивирование штаммов экзополисахаридов осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10л, рабочий объем 4л.

Общим недостатком известных способов получения экзополисахаридов является низкий выход целевого продукта, периодичность проведения процесса, длительность проведения процесса.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является непрерывный способ культивирования микроорганизмов, например, штаммов для получения экзополисахаридов, включающий выращивание продуцирующего его штамма в условиях аэрации в питательной среде с использованием каскада реакторов (авт. св. N 206491).

Использование в процессе культивирования штаммов каскада реакторов позволяет интенсифицировать процесс выращивания штаммов.

Недостатком прототипа является получение экзополисахаридов с изменяющимися свойствами, невозможность получения оптимальной совокупности полезных свойств, длительность процесса.

Для получения экзополисахаридов с устойчивыми свойствами предлагается в первом ферментаторе штамм выращивать в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего полученная биомасса поступает во второй ферментатор, предварительно заполненный питательной средой, в котором находится в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток во втором ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя. Затем содержимое второго ферментатора поступает поровну в третий и четвертый ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой, при этом в третьем ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего из третьего ферментотора биомасса поступает во второй и пятый ферментаторы в количестве, необходимом для получения готового продукта в рабочем объеме засеваемых ферментаторов, а из оставшейся биомассы в третьем ферментаторе и поступившей в четвертый ферментатор получают конечный продукт, после чего процесс повторяют с первого ферментатора.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Подготовка посевного материала.

Экзополисахарид получали с использованием двух видов штаммов. Жидкая питательная среда для выращивания культуры в колбах на качалках имеет следующий состав:
Для штамма Acinetobacter sp
KH₂PO₄ 0,55
NaHPO₄ 1,0
NH₄Cl 0,06
MgSO₄ 0,019
CaCl₂ 0,00075
FeSO₄ 0,0006
вода остальное.

Для штамма Bacillus polymyxa
гидролизованный кукурузный крахмал 3
БВК 0,5
KH₂PO₄ 0,05
K₂HPO₄•3 H₂O 0,05
MgO₄•7 H₂O 0,04
CaCl₂ 0,02
вода остальное.

Режим стерилизации питательной среды для колб 118^oC в течение 30 мин. Для получения посевного материала в колбах-накопителях жидкую питательную среду засевают суспензией культуры с одного косяка. Суспензию готовят, приливая на каждый косяк 10 мл стерильного физ. раствора. Выращивание культуры в колбахнакопителях осуществляют на качалке при 28^oC в течение 19-22 час. Число оборотов мешалки 220 об/мин.

2. Выращивание посевного материала осуществляют в инокуляторе вместимостью 0,1 м³. В аппарат загружают 35 л воды при работающей мешалке, затем остальные компоненты питательной среды. Заложенный посевной материал в количестве 1,2-1,5 л в асептических условиях внесен в аппарат через дозатор.

3. Ведение технологического процесса выращивания посевного материала в пяти ферментаторах.

1-ый ферментатор (объем 16 л) загружается питательной средой как описано выше. Затем готовый посевной материал передается из инокулятора в 1-ый ферментатор. Процесс ведется при 28^oC с работающей мешалкой, расход воздуха 1-0,8 V воздуха/ 1 V среды. Для контроля за стерильностью и развитием продуцента отбираются пробы на стерильность, микроскопию и pH не реже 1 раза в 4 часа. Кроме того, снимается кривая роста культуры в различных фазах. Концентрацию клеток (г/л) определяют по оптической плотности раствора (см. график).

А начало экспоненциальной, конец логарифмической фазы. Равномерные мелкие клетки округлой формы, расположенные неправильными группами, реже поодиночке или короткими цепочками.

В экспоненциальная фаза роста, в группах молодые клетки, признак активного деления, максимальная скорость роста (точка перегиба кривой).

С начало стационарной фазы роста, мелкие однородные вегетативные клетки.

Д устойчивая стационарная фаза роста, популяция разнородная.

ВВ' момент пересева культуры из одного ферментатора в другой.

2-ой ферментатор (объем 100 л) загружается питательной средой. После чего из первого ферментатора поступает посевной материал, находящийся в фазе роста ВВ'. В аппарате (условия процесса см. в 1-м ферментаторе) происходит процесс выращивания посевного материала. Одновременно снимается кривая роста клеток. Дойдя до точки перегиба В (максимальная скорость роста клеток), процесс выращивания продолжают еще 2-4 часа, после чего содержимое подают в равных долях в 3-й и 4-й ферментаторы объемом по 250 л, предварительно заполненные питательной средой.

В 3-м ферментаторе процесс выращивания осуществляют аналогично 1-му и 2-му ферментатору. Также снимается кривая роста культуры. Доведя процесс до точки перегиба (В) для данного аппарата (максимальная скорость роста культуры), еще 2-4 часа продолжают вести процесс выращивания культуры. Затем из 3-го ферментатора дозатором часть биомассы переводится во 2-ой и 5-й ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой. Объем 5-го ферментатора 250 л.

В каждый из этих ферментаторов (2-ой и 5-ый) передали биомассу в количестве 5-20% от объема засеваемых аппаратов.

Из оставшейся биомассы в 3-ем ферментаторе готовят конечный продукт. В 4-ом ферментаторе процесс также ведут до полного получения конечного продукта.

После этого процесс повторяют с 1-ого ферментатора. Кривую роста культуры снимают только в пусковой период для определения времени максимальной скорости роста культуры для данного аппарата.

Готовый продукт должен иметь следующие показатели (см. табл.1).

Результаты опытов получения экзополисахаридов предложенным способом сведены в табл. 2.

Передача биомассы из 1-ого, 2-ого и 3-ого ферментаторов в фазе роста ВВ' (см. кривую) позволяет получить экзополисахарид с требуемыми реологическими характеристиками (кинематическая вязкость), необходимыми в условиях нефтяного промысла.

Содержание углеводов до 0,8% можно получить предлагаемым способом, в то время как по прототипу этот показатель получается не выше 0,2% В этой фазе отсутствуют признаки специфической бактериофагии культуры. Время процесса по заявляемому варианту составляет 40-44 часа.

При работе установки в режиме по прототипу, когда каскад реакторов используется только для увеличения рабочего объема процесса, составило 72-74 часа. ТТТ1 ТТТ2

Использование: относится к микробиологической промышленности и касается получения экзополисахаридов микробиологическим синтезом. Сущность изобретения: способ включает выращивание продуцирующего его штамма в условиях аэрации в питательной среде с использованием каскада ферментаторов. В первом ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя, после чего полученная биомасса поступает во второй ферментатор, предварительно заполненный питательной средой, в котором находится в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток во втором ферментаторе и 2-4 часов после достижения того показателя. Содержимое второго ферментатора поступает поровну в третий и четвертый ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой, при этом в третьем ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 часов после достижения этого показателя. После чего из третьего ферментатора биомасса поступает во второй и пятый ферментоторы в количестве, необходимом для получения готового продукта в рабочем объеме засеваемых ферментаторов, а из оставшейся биомассы в третьем ферментаторе и поступившей в четвертый ферментатор получают конечный продукт, после чего процесс повторяют с первого ферментатора. 1 ил, 2 табл.

Способ непрерывного получения экзополисахаридов, включающий выращивание продуцирующего его штамма в условиях аэрации в питательной среде с использованием каскада ферментаторов, отличающийся тем, что в первом ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 ч после достижения этого показателя, после чего полученную биомассу подают во второй ферментатор, предварительно заполненный питательной средой, в котором биомасса находится в течение времени, включающего время достижения максимальной скорости роста клеток во втором ферментаторе и 2-4 ч после достижения этого показателя, затем содержимое второго ферментатора подают поровну в третий и четвертый ферментаторы, предварительно заполненные питательной средой, а в третьем ферментаторе штамм выращивают в течение времени, состоящего из времени достижения максимальной скорости роста клеток в данном ферментаторе и 2-4 ч после достижения этого показателя, после чего из третьего ферментатора биомассу подают во второй и пятый ферментаторы в количестве, необходимом для получения готового продукта в рабочем объеме засеваемых ферментаторов, а из оставшейся биомассы в третьем ферментаторе и поступившей в четвертый ферментатор получают конечный продукт, после чего процесс повторяют, начиная с первого ферментатора.