Новый вариант цитозинпермеазы и способ получения L-триптофана с его применением Российский патент 2023 года по МПК C12N9/10 C12N15/70 C12P13/22 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к новому варианту цитозинпермеазы, штамму Escherichia coli, содержащему данный вариант, и к способу продуцирования L-триптофана с использованием данного штамма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проводятся разные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства L-аминокислот и других полезных веществ. Например, главным образом, используется специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивается экспрессия гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе L-триптофана, или при котором удаляются гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (US 8945907 В2).

Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию L-триптофана, так как возрастает спрос на L-триптофан.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения разработали новый вариант цитозинпермеазы для увеличения продуцирования L-триптофана, штамм Escherichia coli, содержащий данный вариант, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного штамма, посредством этого осуществляя настоящее раскрытие.

Техническое решение

Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта цитозинпермеазы, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой изолейцин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 401 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена треонином.

Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-триптофана.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа продуцирования L-триптофана, который включает культивирование в среде штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-триптофана.

Полезные эффекты

В случае культивирования штамма Escherichia coli, содержащего вариант цитозинпермеазы по настоящему раскрытию, возможно продуцировать L-триптофан с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.

Наилучший способ воплощения изобретения

Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение и содержание настоящего изобретения.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в котором изолейцин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 401 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменен треонином.

Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.

В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 401 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой треонин и может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включаются в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.

Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце и С-конце аминокислотной последовательности, и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.

Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может происходить на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.

В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед изменением посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или транс мембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть зрелого белка от N- и/или С-конца. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением изменения. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, в которой изолейцин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 401 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменен треонином.

Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.

В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может быть выражена в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто могут использоваться взаимозаменяемо.

Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотида с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.

Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, A dv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.

В качестве примера по настоящему раскрытию, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность цитозинпермеазы. Кроме того, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность таким образом, чтобы иметь повышенную способность к образованию L-триптофана по сравнению с полипептидом дикого типа, демонстрирующим активность цитозинпермеазы. Термин «цитозинпермеаза» в том виде, как он здесь используется, относится к полипептиду, который транспортирует цитозин в клетку. В частности, термин «цитозинпермеаза» по настоящему раскрытию можно использовать взаимозаменяемо с термином «фермент проникновения цитозина». В настоящем раскрытии последовательность цитозинпермеазы может быть получена из GenBank NCBI - известной базы данных. В частности, цитозинпермеаза может представлять собой полипептид, имеющий активность цитозинпермеазы, кодируемый геном codB, но не ограничивается им.

В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором он здесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.

Например, произвольная аминокислотная последовательность выравнивается с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем описании, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).

Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at, 2000, Trends Genet. 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.

Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотида, кодирующий данный вариант.

Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.

В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности кодонов или предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 401 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих треонин.

Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описываются в документах (см. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50 9.51, 11.7 11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.

Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении T_m 55°С и вышеописанных условиях. Значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и его могут подходящим образом корректировать специалисты в данной области согласно цели.

Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарности данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.

Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность оснований полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы с мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.

Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.

Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничивается им. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.

В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть вставлен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.

В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию L-триптофана.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, имеющий в природе цитозинпермеазу или способность к продуцированию L-триптофана, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не имеет цитозинпермеазы или способности к продуцированию L-триптофана, и/или в котором способность к продуцированию L-триптофана придается родительскому штамму, но не ограничивается им.

Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать L-триптофан. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-триптофан, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант цитозинпермеазы и иметь повышенную способность к продуцированию L-триптофана. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-аминокислоты, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом, не модифицированным цитозинпермеазой (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим цитозинпермеазу дикого типа (SEQ ID NO: 3), или микроорганизмом, который не экспрессирует модифицированный белок (SEQ ID NO: 1), но не ограничивается им. Например, штамм по настоящему раскрытию, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с Escherichia coli, которая содержит полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, но не ограничивается им. В качестве примера, микроорганизм, не модифицированный цитозинпермеазой, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию L-триптофана, может представлять собой штамм CJ600 (KCCM10812P, KR 10-0792095), но не ограничивается им.

Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-триптофана, повышенную примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 7% или больше, примерно на 10% или более, примерно на 12% или более, примерно на 15% или более, примерно на 17% или более, примерно на 19% или более, примерно на 20% или больше, примерно на 21% или больше, или примерно на 21,5% или больше (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее, примерно 35% или менее, примерно 30% или менее, примерно 25% или меньше, или примерно 22% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-триптофана родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но повышенное значение не ограничивается им, при условии, что способность к продуцированию имеет повышенное значение плюс значения по сравнению со способностью к продуцированию родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-триптофана, увеличенную примерно в 1,01 раза или более, примерно в 1,02 раза или более, примерно в 1,05 раза или больше, примерно в 1,07 раза или больше, примерно в 1,1 раза или больше, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,15 раза или более, примерно в 1,17 раза или более, примерно в 1,19 раза или более, примерно в 1,2 раза или больше, или примерно в 1,21 раза или больше (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, примерно в 2 раза или менее, или примерно в 1,5 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-триптофана родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но данный показатель увеличения не ограничивается ими. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант цитозинпермеазы, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм», «немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».

В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Escherichia coli.

В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.

Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которым исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.

Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2): 2773-2793, Sambrook et al., Molecular Cloning 2012, и тому подобные).

В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:

1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/присоединение одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);

4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);

5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;

8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1)-(8), но, в частности, не ограничивается ими.

Например:

1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, или замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.

2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.

5) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

3) и 4) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотной последовательностью, или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность данного полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять посредством введения изменения в последовательность полинуклеотида и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается ей.

6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986.

7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно, гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.

8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.

В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладает родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.

Данное усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или увеличения эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.

Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al., Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16; Sambrook et al., Molecular Cloning 2012; и тому подобные).

В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;

3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;

5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);

6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1)-(8), но конкретно не ограничиваясь ими.

Более конкретно:

1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно осуществлять введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.

2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или регуляторной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательностью, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.

Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор O2 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.

3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данную замену можно конкретно осуществлять посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничивается ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение можно осуществлять посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид и может увеличиваться его активность.

7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.

8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта могут осуществляться, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.

Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации, или уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого из полипептида, но не ограничивается ими.

В микроорганизме по настоящему раскрытию частичная или полная модификация полинуклеотида может индуцироваться (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или редактированием генома с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.

В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, L-триптофан и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-аминокислоты, который включает культивирование в среде штамма Escherichia coli, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может включать культивирование в среде штамма Escherichia coli, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию.

Кроме того, L-аминокислота по настоящему раскрытию может представлять собой L-трипофан.

В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию при условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности, культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Escherichia coli по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.

В частности, культуральную среду для штамма Escherichia coli можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).

В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные предобработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.

В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.

Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.

Во время культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликоле вый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.

При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.

L-аминокислота, продуцируемая посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения L-аминокислоты из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Escherichia coli. После стадии культивирования может быть дополнительно включена стадия выделения.

Выделение может служить для сбора интересующей L-аминокислоты посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их комбинацию. Интересующую L-аминокислоту можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.

В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования L-аминокислоты, которая содержит штамм Escherichia coli, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Escherichia coli; или комбинации двух или более чем двух из них.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, подлежащие обычному применению в композициях для продуцирования L-аминокислот.Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.

В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, L-аминокислота и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Способ осуществления изобретения

Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения ими объема настоящего раскрытия. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.

Пример 1. Конструирование штамма, экспрессирующего вариант цитозинпермеазы

Для того чтобы сконструировать штамм Е. coli с фенотипом варианта codB (I401T; SEQ ID NO: 1), получали каждый из фрагментов для расположенной выше области и расположенной ниже области варианта I401T codB Е. coli посредством осуществления ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием гДНК W3110 Е. coli в качестве матрицы, наряду с парой праймеров SEQ ID NO: 5 и 6, и парой праймеров SEQ ID NO: 7 и 8. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: денатурация при 95°С в течение 2 минут; 27 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 1 минуты, полимеризация при 72°С в течение 1 минуты и полимеризация при 72°С в течение 5 минут.Для индукции гомологичной рекомбинации на хромосоме рекомбинантную плазмиду получали клонированием каждой из амплифицированных расположенной выше области и расположенной ниже области варианта I401T codB и плазмиды pSG76-C, которая представляет собой вектор для хромосомной трансформации, расщепленный рестрикционным ферментом SmaI (Journal Of Bacteriology, July 1997, p.4426-4428) с использованием Gibson Assembly, и называли pSG76-C-codB(I401Tdgt(D100N). Клонирование осуществляли посредством смешивания реактива Gibson Assembly и каждого из фрагментов гена при расчетном числе моль, с последующим хранением при 50°С в течение одного часа. Штамм CJ600 (KR 10-0792095) трансформировали плазмидой pSG76-C-codB(I401T), культивировали в среде LB-Cm (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 25 мкг/л хлорамфеникола), и затем отбирали колонии с устойчивостью к хлорамфениколу. Подтверждали то, что отобранный трансформант представляет собой штамм, в котором плазмида pSG76-C-codB(I401T) была вставлена в область гена codB в хромосоме с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 9 и 10. Штамм, для которого было сначала подтверждено, что в него был вставлен вариант codB(I401T), был трансформирован pST76-AsceP (Nucleic Acids Research, том 27, номер 22, 1 ноября 1999, страницы 4409-4415), и отбирали колонии, которые вырастали в твердой среде LB-Amp (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 100 мкг/л ампициллина) при 30°С.Отобранные колонии собирали в твердую среду LB, LB-Amp и LB-Cm, соответственно, и культивировали при 42°С в течение 16 часов. Подтвердили то, что плазмида pST76-AsceP сохранялась в колониях, которые росли на твердой среде LB, но не росли на твердой среде LB-Amp, LB-Cm. Наконец, в колониях, где было подтверждено сохранение плазмиды pST76-AsceP, ген codB амплифицировали с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, и штамм, в котором ген codB был заменен на codB(I401T), был отобран посредством секвенирования. Сконструированный таким образом штамм назвали CJ600_codB_I401T.

Пример 2. Оценка способности к продуцированию L-триптофана микроорганизма, экспрессирующего вариант цитозинпермеазы

Способности к продуцированию L-триптофана каждого из штаммов, полученных в Примере 1, и родительского штамма (контрольного штамма) анализировали посредством оценки титра ферментации данных штаммов в колбе.

Колонии контрольного родительского штамма CJ600 и рекомбинантного штамма CJ600_codB_I401T, полученные в Примере 1, культивировали в течение ночи в твердой среде LB с использованием инокуляционной петли. Каждый из выращенных штаммов инокулировали в 250 мл колбе с угловыми перегородками, содержащей 25 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 37°С при 200 об/мин в течение 48 часов. После завершения культивирования способности к продуцированию L-триптофана данных колоний измеряли посредством ВЭЖХ.

Продукционная среда (рН 7,0)

60 г глюкозы, 2,5 г дрожжевого экстракта, 20 г сульфата аммония [(NH₄)₂SO₄⋅7H₂O], 1 г сульфата магния (MgSO₄), 2 г дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 5 г цитрата натрия (Na-цитрат), 1 г хлорида натрия (NaCl), 0,1 г тирозина (L-тирозин), 0,15 г L-фенилаланина, 40 г карбоната кальция (СаСО₃) (на основе 1 литра дистиллированной воды).

Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения результатов анализа показаны в Таблице 1 ниже.

Как представлено в Таблице 1, штамм CJ600_codB_I401T демонстрировал повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с контрольной группой.

Штамм CJ600_codB_I401T был назван СА04-4589, депонирован в Корейский центр культуры микроорганизмов учреждение депонирования, работающее согласно Будапештскому соглашению, 2 декабря 2020 г., и ему был дан номер доступа KCCM12881P.

Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности и важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Новый вариант цитозинпермеазы и способ получения

L-триптофана с его применением

<130> OPA21159

<150> KR 10-2021-0010277

<151> 2021-01-25

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codB

<400> 1

Met Ser Gln Asp Asn Asn Phe Ser Gln Gly Pro Val Pro Gln Ser Ala

1 5 10 15

Arg Lys Gly Val Leu Ala Leu Thr Phe Val Met Leu Gly Leu Thr Phe

20 25 30

Phe Ser Ala Ser Met Trp Thr Gly Gly Thr Leu Gly Thr Gly Leu Ser

35 40 45

Tyr His Asp Phe Phe Leu Ala Val Leu Ile Gly Asn Leu Leu Leu Gly

50 55 60

Ile Tyr Thr Ser Phe Leu Gly Tyr Ile Gly Ala Lys Thr Gly Leu Thr

65 70 75 80

Thr His Leu Leu Ala Arg Phe Ser Phe Gly Val Lys Gly Ser Trp Leu

85 90 95

Pro Ser Leu Leu Leu Gly Gly Thr Gln Val Gly Trp Phe Gly Val Gly

100 105 110

Val Ala Met Phe Ala Ile Pro Val Gly Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ile

115 120 125

Asn Leu Leu Ile Ala Val Ser Gly Leu Leu Met Thr Val Thr Val Phe

130 135 140

Phe Gly Ile Ser Ala Leu Thr Val Leu Ser Val Ile Ala Val Pro Ala

145 150 155 160

Ile Ala Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Val Trp Leu Ala Val Asn Gly Met

165 170 175

Gly Gly Leu Asp Ala Leu Lys Ala Val Val Pro Ala Gln Pro Leu Asp

180 185 190

Phe Asn Val Ala Leu Ala Leu Val Val Gly Ser Phe Ile Ser Ala Gly

195 200 205

Thr Leu Thr Ala Asp Phe Val Arg Phe Gly Arg Asn Ala Lys Leu Ala

210 215 220

Val Leu Val Ala Met Val Ala Phe Phe Leu Gly Asn Ser Leu Met Phe

225 230 235 240

Ile Phe Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Gly Met Ala Asp Ile Ser

245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gln Gly Leu Leu Leu Pro Ala Ile Val Val Leu

260 265 270

Gly Leu Asn Ile Trp Thr Thr Asn Asp Asn Ala Leu Tyr Ala Ser Gly

275 280 285

Leu Gly Phe Ala Asn Ile Thr Gly Met Ser Ser Lys Thr Leu Ser Val

290 295 300

Ile Asn Gly Ile Ile Gly Thr Val Cys Ala Leu Trp Leu Tyr Asn Asn

305 310 315 320

Phe Val Gly Trp Leu Thr Phe Leu Ser Ala Ala Ile Pro Pro Val Gly

325 330 335

Gly Val Ile Ile Ala Asp Tyr Leu Met Asn Arg Arg Arg Tyr Glu His

340 345 350

Phe Ala Thr Thr Arg Met Met Ser Val Asn Trp Val Ala Ile Leu Ala

355 360 365

Val Ala Leu Gly Ile Ala Ala Gly His Trp Leu Pro Gly Ile Val Pro

370 375 380

Val Asn Ala Val Leu Gly Gly Ala Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Asn Pro

385 390 395 400

Thr Leu Asn Arg Lys Thr Thr Ala Ala Met Thr His Val Glu Ala Asn

405 410 415

Ser Val Glu

<210> 2

<211> 1260

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codB

<400> 2

gtgtcgcaag ataacaactt tagccagggg ccagtcccgc agtcggcgcg gaaaggggta

60

ttggcattga cgttcgtcat gctgggatta accttctttt ccgccagtat gtggaccggc

120

ggcactctcg gaaccggtct tagctatcat gatttcttcc tcgcagttct catcggtaat

180

cttctcctcg gtatttacac ttcatttctc ggttacattg gcgcaaaaac cggcctgacc

240

actcatcttc ttgctcgctt ctcgtttggt gttaaaggct catggctgcc ttcactgcta

300

ctgggcggaa ctcaggttgg ctggtttggc gtcggtgtgg cgatgtttgc cattccggtg

360

ggtaaggcaa ccgggctgga tattaatttg ctgattgccg tttccggttt actgatgacc

420

gtcaccgtct tttttggcat ttcggcgctg acggttcttt cggtgattgc ggttccggct

480

atcgcctgcc tgggcggtta ttccgtgtgg ctggctgtta acggcatggg cggcctggac

540

gcattaaaag cggtcgttcc cgcacaaccg ttagatttca atgtcgcgct ggcgctggtt

600

gtggggtcat ttatcagtgc gggtacgctc accgctgact ttgtccggtt tggtcgcaat

660

gccaaactgg cggtgctggt ggcgatggtg gcctttttcc tcggcaactc gttgatgttt

720

attttcggtg cagcgggcgc tgcggcactg ggcatggcgg atatctctga tgtgatgatt

780

gctcagggcc tgctgctgcc tgcgattgtg gtgctggggc tgaatatctg gaccaccaac

840

gataacgcac tctatgcgtc gggtttaggt ttcgccaaca ttaccgggat gtcgagcaaa

900

accctttcgg taatcaacgg tattatcggt acggtctgcg cattatggct gtataacaat

960

tttgtcggct ggttgacctt cctttcggca gctattcctc cagtgggtgg cgtgatcatc

1020

gccgactatc tgatgaaccg tcgccgctat gagcactttg cgaccacgcg tatgatgagt

1080

gtcaattggg tggcgattct ggcggtcgcc ttggggattg ctgcaggcca ctggttaccg

1140

ggaattgttc cggtcaacgc ggtattaggt ggcgcgctga gctatctgat ccttaacccg

1200

actttgaatc gtaaaacgac agcagcaatg acgcatgtgg aggctaacag tgtcgaataa

1260

1260

<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> codB

<400> 3

Met Ser Gln Asp Asn Asn Phe Ser Gln Gly Pro Val Pro Gln Ser Ala

1 5 10 15

Arg Lys Gly Val Leu Ala Leu Thr Phe Val Met Leu Gly Leu Thr Phe

20 25 30

Phe Ser Ala Ser Met Trp Thr Gly Gly Thr Leu Gly Thr Gly Leu Ser

35 40 45

Tyr His Asp Phe Phe Leu Ala Val Leu Ile Gly Asn Leu Leu Leu Gly

50 55 60

Ile Tyr Thr Ser Phe Leu Gly Tyr Ile Gly Ala Lys Thr Gly Leu Thr

65 70 75 80

Thr His Leu Leu Ala Arg Phe Ser Phe Gly Val Lys Gly Ser Trp Leu

85 90 95

Pro Ser Leu Leu Leu Gly Gly Thr Gln Val Gly Trp Phe Gly Val Gly

100 105 110

Val Ala Met Phe Ala Ile Pro Val Gly Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ile

115 120 125

Asn Leu Leu Ile Ala Val Ser Gly Leu Leu Met Thr Val Thr Val Phe

130 135 140

Phe Gly Ile Ser Ala Leu Thr Val Leu Ser Val Ile Ala Val Pro Ala

145 150 155 160

Ile Ala Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Val Trp Leu Ala Val Asn Gly Met

165 170 175

Gly Gly Leu Asp Ala Leu Lys Ala Val Val Pro Ala Gln Pro Leu Asp

180 185 190

Phe Asn Val Ala Leu Ala Leu Val Val Gly Ser Phe Ile Ser Ala Gly

195 200 205

Thr Leu Thr Ala Asp Phe Val Arg Phe Gly Arg Asn Ala Lys Leu Ala

210 215 220

Val Leu Val Ala Met Val Ala Phe Phe Leu Gly Asn Ser Leu Met Phe

225 230 235 240

Ile Phe Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Gly Met Ala Asp Ile Ser

245 250 255

Asp Val Met Ile Ala Gln Gly Leu Leu Leu Pro Ala Ile Val Val Leu

260 265 270

Gly Leu Asn Ile Trp Thr Thr Asn Asp Asn Ala Leu Tyr Ala Ser Gly

275 280 285

Leu Gly Phe Ala Asn Ile Thr Gly Met Ser Ser Lys Thr Leu Ser Val

290 295 300

Ile Asn Gly Ile Ile Gly Thr Val Cys Ala Leu Trp Leu Tyr Asn Asn

305 310 315 320

Phe Val Gly Trp Leu Thr Phe Leu Ser Ala Ala Ile Pro Pro Val Gly

325 330 335

Gly Val Ile Ile Ala Asp Tyr Leu Met Asn Arg Arg Arg Tyr Glu His

340 345 350

Phe Ala Thr Thr Arg Met Met Ser Val Asn Trp Val Ala Ile Leu Ala

355 360 365

Val Ala Leu Gly Ile Ala Ala Gly His Trp Leu Pro Gly Ile Val Pro

370 375 380

Val Asn Ala Val Leu Gly Gly Ala Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Asn Pro

385 390 395 400

Ile Leu Asn Arg Lys Thr Thr Ala Ala Met Thr His Val Glu Ala Asn

405 410 415

Ser Val Glu

<210> 4

<211> 1260

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> codB

<400> 4

gtgtcgcaag ataacaactt tagccagggg ccagtcccgc agtcggcgcg gaaaggggta

60

ttggcattga cgttcgtcat gctgggatta accttctttt ccgccagtat gtggaccggc

120

ggcactctcg gaaccggtct tagctatcat gatttcttcc tcgcagttct catcggtaat

180

cttctcctcg gtatttacac ttcatttctc ggttacattg gcgcaaaaac cggcctgacc

240

actcatcttc ttgctcgctt ctcgtttggt gttaaaggct catggctgcc ttcactgcta

300

ctgggcggaa ctcaggttgg ctggtttggc gtcggtgtgg cgatgtttgc cattccggtg

360

ggtaaggcaa ccgggctgga tattaatttg ctgattgccg tttccggttt actgatgacc

420

gtcaccgtct tttttggcat ttcggcgctg acggttcttt cggtgattgc ggttccggct

480

atcgcctgcc tgggcggtta ttccgtgtgg ctggctgtta acggcatggg cggcctggac

540

gcattaaaag cggtcgttcc cgcacaaccg ttagatttca atgtcgcgct ggcgctggtt

600

gtggggtcat ttatcagtgc gggtacgctc accgctgact ttgtccggtt tggtcgcaat

660

gccaaactgg cggtgctggt ggcgatggtg gcctttttcc tcggcaactc gttgatgttt

720

attttcggtg cagcgggcgc tgcggcactg ggcatggcgg atatctctga tgtgatgatt

780

gctcagggcc tgctgctgcc tgcgattgtg gtgctggggc tgaatatctg gaccaccaac

840

gataacgcac tctatgcgtc gggtttaggt ttcgccaaca ttaccgggat gtcgagcaaa

900

accctttcgg taatcaacgg tattatcggt acggtctgcg cattatggct gtataacaat

960

tttgtcggct ggttgacctt cctttcggca gctattcctc cagtgggtgg cgtgatcatc

1020

gccgactatc tgatgaaccg tcgccgctat gagcactttg cgaccacgcg tatgatgagt

1080

gtcaattggg tggcgattct ggcggtcgcc ttggggattg ctgcaggcca ctggttaccg

1140

ggaattgttc cggtcaacgc ggtattaggt ggcgcgctga gctatctgat ccttaacccg

1200

attttgaatc gtaaaacgac agcagcaatg acgcatgtgg aggctaacag tgtcgaataa

1260

1260

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>Прямойпраймер

<400> 5

ggaattcgag ctcggtaccc gctcagggcc tgctgctgcc

40

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>Обратныйпраймер

<400> 6

acgattcaaa gtcgggttaa g

21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>Прямойпраймер

<400> 7

cttaacccga ctttgaatcg t

21

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>Обратныйпраймер

<400> 8

gttatcccta gcggatcccc gcgcagttag cgttgcatcc

40

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>Прямойпраймер

<400> 9

cctcggcaac tcgttgatgt

20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 10

cttcctgctt cacttccagc

20

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена цитозинпермеаза, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой изолейцин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 401 в SEQ ID NO: 3, заменен треонином. Также предложены полинуклеотид, кодирующий указанную цитозинпермеазу, микроорганизм Escherichia coli, который продуцирует L-триптофан и содержит указанную цитозинпермеазу или полинуклеотид, кодирующий указанную цитозинпермеазу, и способ продуцирования L-триптофана. Изобретение позволяет увеличить выход L-триптофана. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Цитозинпермеаза, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой изолейцин, который представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 401 в SEQ ID NO: 3, заменен треонином.

2. Полинуклеотид, кодирующий цитозинпермеазу по п. 1.

3. Микроорганизм Escherichia coli, который продуцирует L-триптофан и содержит цитозинпермеазу по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий указанную цитозинпермеазу.

4. Микроорганизм по п. 3, который продуцирует увеличенное количество L-триптофана по сравнению с Escherichia coli, не содержащей цитозинпермеазу по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий указанную цитозинпермеазу.

5. Способ продуцирования L-триптофана, включающий культивирование в среде микроорганизма Escherichia coli, который продуцирует L-триптофан и содержит цитозинпермеазу по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий указанную цитозинпермеазу.