Новый вариант белка и способ получения L-лизина с его применением Российский патент 2023 года по МПК C12N15/77 C07K14/34 C12P13/08 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к новому варианту белка, штамму Corynebacterium glutamicum, содержащему данный вариант, и к способу продуцирования L-лизина с использованием данного штамма.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проводят различные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства L-аминокислот и других полезных веществ. Например, главным образом, используют специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивают экспрессию гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе L-лизина, или при котором удаляют гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (WO 2008-082181 А1).

Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию L-лизина, так как возрастает спрос на L-лизин.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта белка, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота (Asp или D), которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 676 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена тирозином (Tyr или Y).

Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-лизина.

Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа продуцирования L-лизина, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-лизина.

Наилучший способ воплощения изобретения

Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение, и содержание настоящего изобретения.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант белка, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота (Asp или D), которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 676 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена тирозином (Tyr или Y).

Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.

В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 676 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой тирозин, и данный вариант может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включают в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.

Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце, С-конце аминокислотной последовательности и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.

Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может существовать на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильно ста и/или амфипатической природе остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.

В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед модификацией посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть N- и/или С-конца от зрелого белка. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением вариации. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленной SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота (Asp или D), которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 676 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена тирозином (Туг или Y).

Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или постгрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.

В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может быть выражена в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто можно использовать взаимозаменяемо.

Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотида или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотида с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.

Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et at, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.

Вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность таким образом, что возможность продуцирования L-лизина возрастает, по сравнению с полипептидом дикого типа.

Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и/или вариант по настоящему изобретению может демонстрировать активность белка, кодируемого геном NCgl0752, но не ограничивается им.

В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором он здесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.

Например, произвольную аминокислотную последовательность выравнивают с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем описании, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).

Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mot Biol. 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at., 2000, Trends Genet. 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.

Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотида, кодирующий данный вариант.

Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.

В другом воплощении в полинуклеотиде по настоящему раскрытию основание, соответствующее положению 2026 на основе последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 в последовательности нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2, представляет собой Т, и данный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной SEQ ID NO: 2. Очевидно, что полинуклеотиды, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включены в объем настоящего раскрытия, при условии, что данные последовательности нуклеиновой кислоты имеют такую гомологию или идентичность и кодируют полипептид или белок, демонстрирующий эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.

В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 676 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих тирозин.

Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описаны в документах (см. J. Sambrook et at., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et at., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50 9.51, 11.7-11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.

Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении T_m 55°С и вышеописанных условиях. Значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и его могут подходящим образом корректировать специалисты в данной области согласно цели.

Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарности данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et at., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.

Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.

Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.

Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.

В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть вставлен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.

В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Corynebacterium glutamicum, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию L-лизина.

Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий белок дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 3 и/или обладающий способностью к продуцированию L-лизина, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не экспрессирует белок дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 3 или у которого нет способности к продуцированию L-лизина, и/или в котором способность к продуцированию L-лизина придается родительскому штамму, но не ограничивается им.

Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотид ом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать L-лизин. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-лизин, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант белка и иметь повышенную способность к продуцированию L-лизина. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-лизина, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом, не модифицированным белком (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим белок дикого типа), но не ограничивается им. В качестве примера, микроорганизм, не модифицированный белком, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию L-лизина, может представлять собой штамм АТСС13032 и/или штамм Corynebaterium glutamicum СА08-0072 CJ3P (US 9556463 В2; полное описание которого включено сюда посредством ссылки), но не ограничивается им.

Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина (или продуктивность), повышенную примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или более, примерно на 6% или более, примерно на 7% или более, примерно на 8% или более, примерно на 9% или более, примерно на 10% или более, примерно на 10,5% или более, примерно на 11% или более, примерно на 11,5% или более, примерно на 12% или более, примерно на 12,5% или более, примерно на 13% или более, примерно на 13,5% или более, примерно на 14% или более, примерно на 14,5% или более, примерно на 15% или более, примерно на 15,5% или более, примерно на 16% или более, примерно на 16,5% или более, примерно на 17% или более, примерно на 17,5% или более, примерно на 18% или более, примерно на 18,5% или более, примерно на 19% или более, примерно на 19,5% или более, примерно на 20% или более, примерно на 20,5% или более, примерно на 21% или более, примерно на 21,5% или более, примерно на 22% или более, примерно на 22,5% или более, примерно на 23% или более, примерно на 23,5% или более, примерно на 24% или более, примерно на 24,5% или более, примерно на 25% или более, примерно на 25,5% или более, примерно на 26% или более, примерно на 26,5% или более, примерно на 27% или более, примерно на 27,5% или более, примерно на 28% или более, примерно на 28,5% или более, примерно на 29% или более, примерно на 29,5% или более, примерно на 30% или более, примерно на 31% или более, примерно на 32% или более, примерно на 33% или более, примерно на 34% или более, или примерно на 35 или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее, или примерно 35% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина, увеличенную примерно в 1,1 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,13 раза или более, примерно в 1,15 раза или более, примерно в 1,16 раза или более, примерно в 1,17 раза или более, примерно в 1,18 раза или более, примерно в 1,19 раза или более, примерно в 1,2 раза или более, примерно в 1,21 раза или более, примерно в 1,25 раза или более, или примерно в 1,3 раза или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, или примерно в 2 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом.

Более конкретно, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-лизина (или продуктивность), повышенную примерно на 18,9% (или примерно в 1,19 раза) по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но показатель увеличения не ограничивается им. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант белка, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм», «немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».

В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Corynebactehum glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium effwiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens.

В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.

Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которым исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.

Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et at., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int JMol Sci. 2014; 15(2):2773-2793, Sambrook et at., Molecular Cloning 2012, и тому подобные).

В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:

1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/присоединение одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);

4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);

5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;

8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но, в частности, не ограничивается ими.

Например:

1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, или замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.

2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.

3) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

4) и 5) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотной последовательностью, или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность данного полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять посредством введения изменения в последовательность полинуклеотида и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается ей.

6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно, гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.

8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.

В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладает родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.

Данное усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или увеличения эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.

Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et al., Molecular Cloning 2012; и тому подобные).

В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;

3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;

5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);

6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или

9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1)-(8), но конкретно не ограничиваясь ими.

Более конкретно:

1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно осуществлять введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.

2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или регуляторной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательностью, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.

Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.

3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующуего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.

4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данную замену можно конкретно осуществлять посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничиваясь ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение можно осуществлять посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид и может увеличиваться его активность.

7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.

8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта можно осуществлять, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.

Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации, или уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого от полипептида, но не ограничивается ими.

В микроорганизме по настоящему раскрытию частичную или полную модификацию (например, модификация для кодирования варианта белка, как описано выше) полинуклеотида можно индуцировать (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или редактированием генома с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.

В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, L-лизин и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-аминокислоты, который включает культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может включать культивирование в среде штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию.

Кроме того, L-аминокислота по настоящему раскрытию может представлять собой L-лизин.

В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию при условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности, культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.

В частности, культуральную среду для штамма рода Corynebacterium можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).

В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные пред обработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.

В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.

Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.

Во время культивирования штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.

При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.

L-аминокислота, продуцируемая посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения L-аминокислоты из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Corynebacterium glutamicum. После стадии культивирования может быть дополнительно включена стадия выделения.

Выделение может служить для сбора интересующей L-аминокислоты посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их комбинацию. Интересующую L-аминокислоту можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.

Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.

В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования L-аминокислоты, которая содержит штамм Corynebacterium glutamicum, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Corynebacterium glutamicum; или комбинацию двух или более чем двух из них.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, которые обычно примененяют в композициях для продуцирования аминокислот. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.

В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, L-аминокислота и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.

Полезные эффекты

В случае культивирования штамма Corynebacterium glutamicum, содержащего вариант белка по настоящему раскрытию, возможна продукция L-лизина с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.

Способ осуществления изобретения

Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения ими объема настоящего раскрытия. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.

Пример 1. Конструирование вектора для экспрессии варианта белка в микроорганизме

Для того, чтобы подтвердить влияние варианта (D676Y; SEQ ID NO: 1), у которого аспарагиновая кислота (Asp) в положении 676 белка последовательности SEQ ID NO: 3, была заменена тирозином (Tyr), на продукцию L-лизина, конструировали вектор для конструирования штамма, экспрессирующего данный вариант, с использованием плазмиды pDCM2 (публикация Корейского патента №10-2020-0136813) для вставки и замены гена в геноме Corynebacterium, следующим образом.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) проводили с использованием гДНК (геномная ДНК) Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13032 в качестве матрицы, пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 6, и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 7 и 8. Вновь проводили ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием смеси двух фрагментов, полученных выше, в качестве матрицы и пары праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 5 и 8, с получением фрагмента. ПЦР проводили следующим образом: денатурация при 94°С в течение 5 минут; 30 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 1 минуты 30 секунд; и 72°С в течение 5 минут. Вектор pDCM2 обрабатывали smal, и ПЦР-продукт, полученный выше, клонировали в него посредством слияния. Клонирование посредством слияния проводили с использованием набора для клонирования In-Fusion® HD (Clontech). Полученный вектор называли pDCM2- NCgl0752(D676Y). Последовательности праймеров, используемых в данном примере, описаны в следующей Таблице 1:

Пример 2. Оценка способности к продуцированию L-лизина микроорганизма, экспрессирующего вариант белка

3-1. Конструирование штамма экспрессирующего вариант белка

Вектор, сконструированный в Примере 1, трансформировали в Corynebacterium glutamicum CJ3P US 9556463 В2).

Штамм, в который был введен данный вариант, был выбран из штаммов, в которых происходила гомологичная рекомбинация с использованием SEQ ID NO: 9 и 10. Выбранный штамм называли CJ3P_NCgl0752_D676Y. Последовательности праймеров, использованных в данном примере, описываются в следующей Таблице 2:

2-2. Сравнение способности к продуцированию L-лизина штаммов, экспрессирующих вариант белка

Способность к продуцированию L-лизина анализировали посредством оценки титра ферментации в колбе каждого штамма, сконструированного в Примере 2-1, и контрольного родительского штамма.

Сначала каждый штамм инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащей 25 мл затравочной среды, и подвергали культивированию со встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 72 часов. Затем затравочную культуральную среду инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащей 24 мл продукционной среды, и подвергали культивированию со встряхиванием при 200 об/мин при 30°С в течение 72 часов. После завершения культивирования продукцию L-лизина анализировали посредством ВЭЖХ. Концентрация L-лизина, а также повышение уровня концентрации в культуральной среде для каждого штамма показаны в Таблице 3 ниже.

Затравочная среда (рН 7,0)

20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 20 г агара, 1,5 г мочевины, 4 г KH₂PO₄, 8 г K₂HPO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 0,1 мг биотина, 1 мг тиамин-HCl, 2 мг пантотената кальция, 2 мг никотинамида (на основе 1 литра дистиллированной воды).

Продукционная среда (рН 7,0)

100 г глюкозы, 40 г (NH₄)₂SO₄, 2,5 г соевого белка, 5 г твердых веществ кукурузного экстракта, 3 г мочевины, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄⋅7H₂O, 100 мкг биотина, 1000 мкг хлорида тиамина, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г СаСО₃ (на основе 1 литра дистиллированной воды).

Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения результатов его анализа представлены в Таблице 3 ниже.

Как представлено в Таблице 3, штамм CJ3P_NCgl0752_D676Y демонстрировал повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению со способностью к продуцированию L-лизина контрольной группы.

Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности и важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPP20212332KR

<150> KR 10-2021-0047408

<151> 2021-04-12

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 985

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (D676Y)_NCgl0752_аминокислота

<400> 1

Met Ser Thr Gly Leu Thr Pro Pro Pro Gln Pro Ile Lys Arg Pro Pro

1 5 10 15

Lys Ala Val Thr Trp Ile Phe Ala Ile Ile Ala Leu Val Ile Leu Ile

20 25 30

Ala Pro Met Ser Val Gly Phe Tyr Thr Asp Trp Leu Trp Phe Gly Glu

35 40 45

Val Asp Phe Arg Gly Val Phe Ser Lys Val Ile Val Thr Arg Ile Val

50 55 60

Leu Phe Val Ile Phe Ala Leu Ile Ala Gly Phe Val Thr Trp Leu Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Val Thr Lys Leu Arg Pro Asp Glu Met Ser Ala Phe Asp

85 90 95

Thr Gln Ser Pro Val Tyr Gln Tyr Arg Gln Met Ile Glu Asn Ser Leu

100 105 110

Arg Arg Val Met Val Ile Ile Pro Ile Phe Val Ala Leu Leu Ala Gly

115 120 125

Leu Ile Gly Gln Arg Ser Trp Arg Thr Val Gln Met Trp Leu Asn Gly

130 135 140

Gln Asp Phe Gly Val Ser Asp Gln Gln Phe Gly Leu Asp Tyr Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Ala Phe Asp Leu Pro Met Leu Arg Leu Ile Ala Asp Ser Leu Ser

165 170 175

Met Met Leu Ile Val Ala Phe Leu Ile Ala Leu Val Gly His Tyr Leu

180 185 190

Met Gly Gly Ile Arg Ala Gly Asn Gln Met Thr Gly Gln Lys Ser Phe

195 200 205

Val Ser Arg Gly Ala Arg Thr Gln Leu Ala Val Thr Ala Gly Leu Trp

210 215 220

Met Leu Val Lys Val Ala Gly Tyr Trp Leu Asp Arg Tyr Asp Leu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Glu Asn Ser Thr Phe Thr Gly Ala Ser Tyr Thr Asp Ile Asn

245 250 255

Ala Gln Leu Pro Ala Lys Ile Ile Leu Leu Val Ile Ala Leu Phe Val

260 265 270

Ala Ile Ala Phe Phe Ser Ala Ile Phe Leu Lys Asp Leu Arg Ile Pro

275 280 285

Gly Leu Ala Val Val Leu Met Leu Leu Ser Ser Val Ile Ile Gly Ala

290 295 300

Ala Trp Pro Leu Met Leu Glu Arg Phe Ser Val Gln Pro Asn Arg Ala

305 310 315 320

Glu Lys Glu Ala Glu Tyr Ile Ser Arg Asn Ile Glu Ser Thr Arg Tyr

325 330 335

Ala Tyr Gly Ile Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Glu Glu Asn Trp Gly

340 345 350

Ala Gly Glu Thr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Asp Ser Ala Thr Ile

355 360 365

Ser Asn Ile Arg Leu Leu Asp Pro Gln Ile Leu Ser Pro Thr Phe Thr

370 375 380

Gln Gln Gln Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Gln Leu Ala

385 390 395 400

Met Asp Arg Phe Glu Val Asp Gly Lys Leu Arg Asp Phe Val Val Ala

405 410 415

Ala Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ala Leu Gln Gln Asn Gln Gln Asp Trp

420 425 430

Ile Asn Arg His Thr Val Tyr Thr His Gly Asn Gly Phe Ile Ala Ala

435 440 445

Gln Ala Asn Gln Val Asp Glu Val Ala Arg Asp Val Gly Ser Thr Arg

450 455 460

Gly Gly Tyr Pro Val Tyr Thr Val Ser Asp Leu Gln Ser Asn Ala Arg

465 470 475 480

Ala Ala Glu Ser Glu Asp Ala Glu Glu Leu Gly Ile Lys Val Asp Glu

485 490 495

Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Pro Leu Ile Ala Ser Ala Thr Asp Gly Ala

500 505 510

Asp Tyr Ala Ile Val Gly Asp Thr Gly Asp Gly Pro Val Glu Tyr Asp

515 520 525

Thr Asp Thr Ser Ser Tyr Thr Tyr Glu Gly Ala Gly Gly Val Asp Ile

530 535 540

Gly Asn Met Val Asn Arg Ala Met Phe Ala Leu Arg Tyr Gln Glu Met

545 550 555 560

Asn Met Leu Leu Ser Asp Arg Val Gly Ser Glu Ser Lys Ile Leu Phe

565 570 575

Glu Arg Asp Pro Arg Ser Arg Val Glu Lys Val Ala Pro Trp Leu Thr

580 585 590

Thr Asp Ser Lys Thr Tyr Pro Thr Val Ile Asp Gly Arg Ile Lys Trp

595 600 605

Ile Val Asp Gly Tyr Thr Thr Leu Asp Ser Leu Pro Tyr Ser Thr Arg

610 615 620

Thr Ser Leu Thr Glu Ala Thr Gln Asp Ala Val Met Pro Asp Gly Thr

625 630 635 640

Pro Gln Pro Leu Ile Thr Asp Arg Val Gly Tyr Ile Arg Asn Ser Val

645 650 655

Lys Ala Val Val Asp Ala Tyr Asp Gly Thr Val Glu Leu Tyr Glu Phe

660 665 670

Asp Thr Glu Tyr Pro Val Leu Lys Ala Trp Arg Gly Val Phe Pro Asp

675 680 685

Thr Val Lys Asp Gly Ser Glu Ile Ser Asp Glu Leu Arg Ala His Leu

690 695 700

Arg Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Lys Val Gln Arg Asp Met Leu Ala Lys

705 710 715 720

Tyr Asn Val Asp Asp Ser Gly Thr Phe Phe Thr Asn Asp Ala Phe Trp

725 730 735

Ser Val Pro Gly Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Arg Gln Glu Leu Lys

740 745 750

Gln Pro Pro Tyr Tyr Val Val Ala Ala Asp Pro Glu Thr Gly Glu Ser

755 760 765

Ser Phe Gln Leu Ile Thr Pro Phe Arg Gly Leu Gln Arg Glu Tyr Leu

770 775 780

Ser Ala His Met Ser Ala Ser Ser Asp Pro Val Thr Tyr Gly Glu Ile

785 790 795 800

Thr Val Arg Val Leu Pro Thr Asp Ser Val Thr Gln Gly Pro Lys Gln

805 810 815

Ala Gln Asp Ala Met Met Ser Ser Asp Gln Val Ala Gln Asp Gln Thr

820 825 830

Leu Trp Arg Gly Ser Asn Asp Leu His Asn Gly Asn Leu Leu Thr Leu

835 840 845

Pro Val Gly Gly Gly Glu Ile Leu Tyr Val Glu Pro Ile Tyr Ser Gln

850 855 860

Arg Lys Asp Gln Ala Ser Ala Phe Pro Lys Leu Leu Arg Val Leu Val

865 870 875 880

Phe Tyr Lys Gly Gln Val Gly Tyr Ala Pro Thr Ile Ala Glu Ala Leu

885 890 895

Ser Gln Val Gly Ile Asp Pro Lys Glu Ala Gln Asp Ile Glu Glu Val

900 905 910

Asp Gly Thr Ala Thr Thr Pro Ser Thr Asp Glu Thr Asp Thr Asp Thr

915 920 925

Asp Gln Pro Ala Thr Glu Thr Pro Thr Ala Pro Val Ser Glu Ala Glu

930 935 940

Gly Ile Ala Ala Ile Asn Asp Ala Leu Ser Asn Leu Glu Ala Ala Arg

945 950 955 960

Asp Ser Ser Phe Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Leu Asp Ala Leu Asp Arg

965 970 975

Ala Val Asp Ser Tyr Gln Ser Ala Gln

980 985

<210> 2

<211> 2958

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (D676Y)_NCgl0752_нуклеиновая кислота

<400> 2

ttgtcgactg gtctcacacc tcctccccaa ccgatcaagc gacctcccaa ggcggtgaca 60

tggatcttcg ccattatcgc gttggtcatt ctcatcgccc caatgagtgt tggcttctat 120

accgactggc tttggttcgg tgaagtcgat ttccgaggcg ttttcagcaa ggttattgtc 180

actcgcattg ttctctttgt gatctttgcg ctaattgctg ggtttgtcac atggcttgct 240

ggttattttg tgacaaaact tcgacctgat gagatgtcgg cgtttgatac ccagtcgcct 300

gtgtatcagt accgtcagat gatcgaaaac agccttcgtc gcgttatggt gatcattcca 360

attttcgtcg cgttgctggc tggcctaatt ggtcagcgtt cgtggcgcac cgttcaaatg 420

tggctgaatg gccaggactt tggcgtttcg gatcagcagt tcggcttgga ttatggattc 480

tacgcgtttg atcttccgat gcttcgcctc atcgctgact cactgtcgat gatgttgatc 540

gttgctttcc tgatcgcact cgttggccat tacctcatgg gtggcattcg cgctggaaac 600

cagatgacgg gccagaagtc ctttgtatcc cgtggtgcgc gcactcagct tgcggtaact 660

gctggtctgt ggatgcttgt taaggtcgct ggctactggc tggatcgcta tgacctgctg 720

actaaggaaa actcaacctt cacaggtgca agctacaccg acatcaatgc acagctgcca 780

gcgaagatca tcctgctggt tatcgcattg ttcgtggcga tcgcgttctt ctctgcgatc 840

ttcctgaagg acctccgcat cccaggtctt gccgtagttc tgatgctgct gagctctgtg 900

atcattggtg ctgcttggcc tttgatgctg gagcgtttct ccgttcagcc aaaccgtgca 960

gaaaaagaag ccgagtacat ttctcgaaac attgaatcga ctcgctatgc ctatggcatc 1020

accgatgaag atgtcaccta cgaggaaaac tggggagcag gggagaccac caatgaagaa 1080

gtcgccgctg attctgcaac gatttctaac attcgtctgc tggatccaca gatcctgtca 1140

ccaaccttca cccagcaaca gcagctgcga aacttctacg gtttcccaga ccagctggcg 1200

atggaccgct ttgaagtaga tggcaaactc cgcgactttg ttgtggcagc acgtgagctc 1260

gatccaaacg ccctgcagca aaaccagcag gactggatta accgtcacac tgtttatacc 1320

cacggcaacg gcttcattgc agctcaagca aaccaggtgg atgaggtcgc ccgcgacgtc 1380

ggatccactc gtggtggtta ccctgtctac accgtctctg atttgcagtc gaatgctcgt 1440

gctgcagaaa gcgaagatgc tgaggagctt ggcatcaagg ttgatgagcc tcgtgtgtac 1500

tacggaccac tgattgcttc tgcgactgat ggtgctgact acgcaattgt cggtgacacc 1560

ggcgatggcc cagtcgagta cgacactgac acctccagct acacctacga aggtgctggc 1620

ggcgtggaca ttggaaacat ggtcaaccgt gcgatgtttg cattgcgcta ccaggaaatg 1680

aacatgctcc tgtctgatcg tgttggttcc gaatccaaga tcctatttga gcgcgatcct 1740

cgttcccgtg tggaaaaggt tgcaccttgg ttgaccactg actccaagac ctacccaact 1800

gtgattgatg gtcgcatcaa gtggatcgtc gatggctaca ccaccttgga tagtcttccg 1860

tactccacgc gcacctcact gacggaagcg actcaggatg ctgtcatgcc tgacggcacc 1920

ccacagccac tgatcacaga tagggtcggt tacatccgca actccgtgaa ggctgttgtt 1980

gatgcgtacg acggaactgt tgaactctac gaattcgaca ccgaatatcc tgttctgaag 2040

gcatggcgtg gcgtgttccc agacaccgtg aaggacgggt cggagatttc cgatgagctt 2100

cgcgcacacc tgcgttaccc agaagatttg ttcaaggtcc agcgtgacat gctggccaag 2160

tacaacgttg atgattctgg aacattcttc accaacgatg cgttctggtc tgtcccaggt 2220

gacccaactg cagcggaggg ccgccaggaa cttaagcagc ctccttacta cgtggtggca 2280

gcagacccag agaccggtga gtccagcttc cagctgatca ccccgttccg tggacttcag 2340

cgcgagtacc tctctgcaca catgtctgcg tcgtctgatc cagttaccta cggtgaaatc 2400

actgttcgtg tgctgcctac cgattctgtg acccagggtc caaagcaggc ccaggatgcg 2460

atgatgtcat ctgaccaggt tgctcaggac caaacactgt ggcgtggatc gaacgatctg 2520

cacaacggaa acctgttgac cttgccagtt ggtggcggag agatcctcta cgttgagccg 2580

atttactcgc agcgcaagga tcaggcatcg gccttcccga agcttctgcg cgtgctggtc 2640

ttctacaagg gtcaggttgg ttacgcacca acgatcgctg aagccctatc gcaggtcggc 2700

attgatccga aggaagcgca ggacatcgaa gaggtagatg gcaccgctac gacgccatcg 2760

actgatgaga ctgacactga cactgatcag cctgcaaccg aaaccccaac tgcaccagtg 2820

agtgaggcgg aaggaatcgc ggccatcaac gatgcgttga gcaaccttga agctgctcgc 2880

gatagctctt tcgaagagta tggtcgtgca ctcgatgcgc ttgatcgtgc cgtcgatagc 2940

taccagtccg cacagtag 2958

<210> 3

<211> 985

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (WT)_NCgl0752_аминокислота

<400> 3

Met Ser Thr Gly Leu Thr Pro Pro Pro Gln Pro Ile Lys Arg Pro Pro

1 5 10 15

Lys Ala Val Thr Trp Ile Phe Ala Ile Ile Ala Leu Val Ile Leu Ile

20 25 30

Ala Pro Met Ser Val Gly Phe Tyr Thr Asp Trp Leu Trp Phe Gly Glu

35 40 45

Val Asp Phe Arg Gly Val Phe Ser Lys Val Ile Val Thr Arg Ile Val

50 55 60

Leu Phe Val Ile Phe Ala Leu Ile Ala Gly Phe Val Thr Trp Leu Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Val Thr Lys Leu Arg Pro Asp Glu Met Ser Ala Phe Asp

85 90 95

Thr Gln Ser Pro Val Tyr Gln Tyr Arg Gln Met Ile Glu Asn Ser Leu

100 105 110

Arg Arg Val Met Val Ile Ile Pro Ile Phe Val Ala Leu Leu Ala Gly

115 120 125

Leu Ile Gly Gln Arg Ser Trp Arg Thr Val Gln Met Trp Leu Asn Gly

130 135 140

Gln Asp Phe Gly Val Ser Asp Gln Gln Phe Gly Leu Asp Tyr Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Ala Phe Asp Leu Pro Met Leu Arg Leu Ile Ala Asp Ser Leu Ser

165 170 175

Met Met Leu Ile Val Ala Phe Leu Ile Ala Leu Val Gly His Tyr Leu

180 185 190

Met Gly Gly Ile Arg Ala Gly Asn Gln Met Thr Gly Gln Lys Ser Phe

195 200 205

Val Ser Arg Gly Ala Arg Thr Gln Leu Ala Val Thr Ala Gly Leu Trp

210 215 220

Met Leu Val Lys Val Ala Gly Tyr Trp Leu Asp Arg Tyr Asp Leu Leu

225 230 235 240

Thr Lys Glu Asn Ser Thr Phe Thr Gly Ala Ser Tyr Thr Asp Ile Asn

245 250 255

Ala Gln Leu Pro Ala Lys Ile Ile Leu Leu Val Ile Ala Leu Phe Val

260 265 270

Ala Ile Ala Phe Phe Ser Ala Ile Phe Leu Lys Asp Leu Arg Ile Pro

275 280 285

Gly Leu Ala Val Val Leu Met Leu Leu Ser Ser Val Ile Ile Gly Ala

290 295 300

Ala Trp Pro Leu Met Leu Glu Arg Phe Ser Val Gln Pro Asn Arg Ala

305 310 315 320

Glu Lys Glu Ala Glu Tyr Ile Ser Arg Asn Ile Glu Ser Thr Arg Tyr

325 330 335

Ala Tyr Gly Ile Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Glu Glu Asn Trp Gly

340 345 350

Ala Gly Glu Thr Thr Asn Glu Glu Val Ala Ala Asp Ser Ala Thr Ile

355 360 365

Ser Asn Ile Arg Leu Leu Asp Pro Gln Ile Leu Ser Pro Thr Phe Thr

370 375 380

Gln Gln Gln Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Gln Leu Ala

385 390 395 400

Met Asp Arg Phe Glu Val Asp Gly Lys Leu Arg Asp Phe Val Val Ala

405 410 415

Ala Arg Glu Leu Asp Pro Asn Ala Leu Gln Gln Asn Gln Gln Asp Trp

420 425 430

Ile Asn Arg His Thr Val Tyr Thr His Gly Asn Gly Phe Ile Ala Ala

435 440 445

Gln Ala Asn Gln Val Asp Glu Val Ala Arg Asp Val Gly Ser Thr Arg

450 455 460

Gly Gly Tyr Pro Val Tyr Thr Val Ser Asp Leu Gln Ser Asn Ala Arg

465 470 475 480

Ala Ala Glu Ser Glu Asp Ala Glu Glu Leu Gly Ile Lys Val Asp Glu

485 490 495

Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Pro Leu Ile Ala Ser Ala Thr Asp Gly Ala

500 505 510

Asp Tyr Ala Ile Val Gly Asp Thr Gly Asp Gly Pro Val Glu Tyr Asp

515 520 525

Thr Asp Thr Ser Ser Tyr Thr Tyr Glu Gly Ala Gly Gly Val Asp Ile

530 535 540

Gly Asn Met Val Asn Arg Ala Met Phe Ala Leu Arg Tyr Gln Glu Met

545 550 555 560

Asn Met Leu Leu Ser Asp Arg Val Gly Ser Glu Ser Lys Ile Leu Phe

565 570 575

Glu Arg Asp Pro Arg Ser Arg Val Glu Lys Val Ala Pro Trp Leu Thr

580 585 590

Thr Asp Ser Lys Thr Tyr Pro Thr Val Ile Asp Gly Arg Ile Lys Trp

595 600 605

Ile Val Asp Gly Tyr Thr Thr Leu Asp Ser Leu Pro Tyr Ser Thr Arg

610 615 620

Thr Ser Leu Thr Glu Ala Thr Gln Asp Ala Val Met Pro Asp Gly Thr

625 630 635 640

Pro Gln Pro Leu Ile Thr Asp Arg Val Gly Tyr Ile Arg Asn Ser Val

645 650 655

Lys Ala Val Val Asp Ala Tyr Asp Gly Thr Val Glu Leu Tyr Glu Phe

660 665 670

Asp Thr Glu Asp Pro Val Leu Lys Ala Trp Arg Gly Val Phe Pro Asp

675 680 685

Thr Val Lys Asp Gly Ser Glu Ile Ser Asp Glu Leu Arg Ala His Leu

690 695 700

Arg Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Lys Val Gln Arg Asp Met Leu Ala Lys

705 710 715 720

Tyr Asn Val Asp Asp Ser Gly Thr Phe Phe Thr Asn Asp Ala Phe Trp

725 730 735

Ser Val Pro Gly Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Arg Gln Glu Leu Lys

740 745 750

Gln Pro Pro Tyr Tyr Val Val Ala Ala Asp Pro Glu Thr Gly Glu Ser

755 760 765

Ser Phe Gln Leu Ile Thr Pro Phe Arg Gly Leu Gln Arg Glu Tyr Leu

770 775 780

Ser Ala His Met Ser Ala Ser Ser Asp Pro Val Thr Tyr Gly Glu Ile

785 790 795 800

Thr Val Arg Val Leu Pro Thr Asp Ser Val Thr Gln Gly Pro Lys Gln

805 810 815

Ala Gln Asp Ala Met Met Ser Ser Asp Gln Val Ala Gln Asp Gln Thr

820 825 830

Leu Trp Arg Gly Ser Asn Asp Leu His Asn Gly Asn Leu Leu Thr Leu

835 840 845

Pro Val Gly Gly Gly Glu Ile Leu Tyr Val Glu Pro Ile Tyr Ser Gln

850 855 860

Arg Lys Asp Gln Ala Ser Ala Phe Pro Lys Leu Leu Arg Val Leu Val

865 870 875 880

Phe Tyr Lys Gly Gln Val Gly Tyr Ala Pro Thr Ile Ala Glu Ala Leu

885 890 895

Ser Gln Val Gly Ile Asp Pro Lys Glu Ala Gln Asp Ile Glu Glu Val

900 905 910

Asp Gly Thr Ala Thr Thr Pro Ser Thr Asp Glu Thr Asp Thr Asp Thr

915 920 925

Asp Gln Pro Ala Thr Glu Thr Pro Thr Ala Pro Val Ser Glu Ala Glu

930 935 940

Gly Ile Ala Ala Ile Asn Asp Ala Leu Ser Asn Leu Glu Ala Ala Arg

945 950 955 960

Asp Ser Ser Phe Glu Glu Tyr Gly Arg Ala Leu Asp Ala Leu Asp Arg

965 970 975

Ala Val Asp Ser Tyr Gln Ser Ala Gln

980 985

<210> 4

<211> 2958

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (WT)_NCgl0752_нуклеиновая кислота

<400> 4

ttgtcgactg gtctcacacc tcctccccaa ccgatcaagc gacctcccaa ggcggtgaca 60

tggatcttcg ccattatcgc gttggtcatt ctcatcgccc caatgagtgt tggcttctat 120

accgactggc tttggttcgg tgaagtcgat ttccgaggcg ttttcagcaa ggttattgtc 180

actcgcattg ttctctttgt gatctttgcg ctaattgctg ggtttgtcac atggcttgct 240

ggttattttg tgacaaaact tcgacctgat gagatgtcgg cgtttgatac ccagtcgcct 300

gtgtatcagt accgtcagat gatcgaaaac agccttcgtc gcgttatggt gatcattcca 360

attttcgtcg cgttgctggc tggcctaatt ggtcagcgtt cgtggcgcac cgttcaaatg 420

tggctgaatg gccaggactt tggcgtttcg gatcagcagt tcggcttgga ttatggattc 480

tacgcgtttg atcttccgat gcttcgcctc atcgctgact cactgtcgat gatgttgatc 540

gttgctttcc tgatcgcact cgttggccat tacctcatgg gtggcattcg cgctggaaac 600

cagatgacgg gccagaagtc ctttgtatcc cgtggtgcgc gcactcagct tgcggtaact 660

gctggtctgt ggatgcttgt taaggtcgct ggctactggc tggatcgcta tgacctgctg 720

actaaggaaa actcaacctt cacaggtgca agctacaccg acatcaatgc acagctgcca 780

gcgaagatca tcctgctggt tatcgcattg ttcgtggcga tcgcgttctt ctctgcgatc 840

ttcctgaagg acctccgcat cccaggtctt gccgtagttc tgatgctgct gagctctgtg 900

atcattggtg ctgcttggcc tttgatgctg gagcgtttct ccgttcagcc aaaccgtgca 960

gaaaaagaag ccgagtacat ttctcgaaac attgaatcga ctcgctatgc ctatggcatc 1020

accgatgaag atgtcaccta cgaggaaaac tggggagcag gggagaccac caatgaagaa 1080

gtcgccgctg attctgcaac gatttctaac attcgtctgc tggatccaca gatcctgtca 1140

ccaaccttca cccagcaaca gcagctgcga aacttctacg gtttcccaga ccagctggcg 1200

atggaccgct ttgaagtaga tggcaaactc cgcgactttg ttgtggcagc acgtgagctc 1260

gatccaaacg ccctgcagca aaaccagcag gactggatta accgtcacac tgtttatacc 1320

cacggcaacg gcttcattgc agctcaagca aaccaggtgg atgaggtcgc ccgcgacgtc 1380

ggatccactc gtggtggtta ccctgtctac accgtctctg atttgcagtc gaatgctcgt 1440

gctgcagaaa gcgaagatgc tgaggagctt ggcatcaagg ttgatgagcc tcgtgtgtac 1500

tacggaccac tgattgcttc tgcgactgat ggtgctgact acgcaattgt cggtgacacc 1560

ggcgatggcc cagtcgagta cgacactgac acctccagct acacctacga aggtgctggc 1620

ggcgtggaca ttggaaacat ggtcaaccgt gcgatgtttg cattgcgcta ccaggaaatg 1680

aacatgctcc tgtctgatcg tgttggttcc gaatccaaga tcctatttga gcgcgatcct 1740

cgttcccgtg tggaaaaggt tgcaccttgg ttgaccactg actccaagac ctacccaact 1800

gtgattgatg gtcgcatcaa gtggatcgtc gatggctaca ccaccttgga tagtcttccg 1860

tactccacgc gcacctcact gacggaagcg actcaggatg ctgtcatgcc tgacggcacc 1920

ccacagccac tgatcacaga tagggtcggt tacatccgca actccgtgaa ggctgttgtt 1980

gatgcgtacg acggaactgt tgaactctac gaattcgaca ccgaagatcc tgttctgaag 2040

gcatggcgtg gcgtgttccc agacaccgtg aaggacgggt cggagatttc cgatgagctt 2100

cgcgcacacc tgcgttaccc agaagatttg ttcaaggtcc agcgtgacat gctggccaag 2160

tacaacgttg atgattctgg aacattcttc accaacgatg cgttctggtc tgtcccaggt 2220

gacccaactg cagcggaggg ccgccaggaa cttaagcagc ctccttacta cgtggtggca 2280

gcagacccag agaccggtga gtccagcttc cagctgatca ccccgttccg tggacttcag 2340

cgcgagtacc tctctgcaca catgtctgcg tcgtctgatc cagttaccta cggtgaaatc 2400

actgttcgtg tgctgcctac cgattctgtg acccagggtc caaagcaggc ccaggatgcg 2460

atgatgtcat ctgaccaggt tgctcaggac caaacactgt ggcgtggatc gaacgatctg 2520

cacaacggaa acctgttgac cttgccagtt ggtggcggag agatcctcta cgttgagccg 2580

atttactcgc agcgcaagga tcaggcatcg gccttcccga agcttctgcg cgtgctggtc 2640

ttctacaagg gtcaggttgg ttacgcacca acgatcgctg aagccctatc gcaggtcggc 2700

attgatccga aggaagcgca ggacatcgaa gaggtagatg gcaccgctac gacgccatcg 2760

actgatgaga ctgacactga cactgatcag cctgcaaccg aaaccccaac tgcaccagtg 2820

agtgaggcgg aaggaatcgc ggccatcaac gatgcgttga gcaaccttga agctgctcgc 2880

gatagctctt tcgaagagta tggtcgtgca ctcgatgcgc ttgatcgtgc cgtcgatagc 2940

taccagtccg cacagtag 2958

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_1F

<400> 5

tgaattcgag ctcggtaccc gctgaggagc ttggcatc 38

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_2R

<400> 6

gccttcagaa caggatattc ggtgtcgaat tcg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_3F

<400> 7

cgaattcgac accgaatatc ctgttctgaa ggc 33

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_4R

<400> 8

gtcgactcta gaggatcccc cgatcctctc gggctg 36

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_5F

<400> 9

ggatccactc gtggtgg 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCgl0752_6R

<400> 10

gatgcggtgt ctctaggc 18

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новому полипептиду, участвующему в производстве L-лизина, штамму Corynebacterium glutamicum, содержащему данный полипептид, и к способу продуцирования L-лизина с использованием данного штамма. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой степенью эффективности. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Полипептид, участвующий в продуцировании L-лизина, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 676 в SEQ ID NO: 3, заменена тирозином.

2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 1.

3. Микроорганизм Corynebacterium glutamicum для продуцирования L-лизина, содержащий полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

4. Микроорганизм по п. 3, который имеет повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению с Corynebacterium glutamicum, содержащим полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.

5. Способ продуцирования L-лизина, включающий культивирование в среде микроорганизма Corynebacterium glutamicum, содержащего полипептид по п. 1 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид.