ИММУНОГЕННЫЕ ПОЛИСАХАРИД-БЕЛКОВЫЕ КОНЬЮГАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИСАХАРИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ B (GBS) Российский патент 2023 года по МПК A61K39/09 A61P31/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим капсульный полисахарид (CP) из Streptococcus agalactiae, обычно называемого стрептококком группы B (GBS), конъюгированный с белком-носителем, и необязательно, содержащим адъювант на основе алюминия. Изобретение также относится к способам индукции иммунного ответа против GBS у пациентов и/или облегчения или предотвращения инвазивного заболевания, вызываемого GBS, у пациентов с использованием композиций, раскрытых в настоящем описании. Полученные антитела могут быть использованы для лечения или предотвращения инфекции, вызываемой GBS, путем пассивной иммунотерапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Streptococcus agalactiae представляют собой грамположительные, инкапсулированные в полисахарид микроорганизмы, которые также известны как стрептококки группы B (GBS). Они являются обычными комменсалами в желудочно-кишечном тракте и половых путях человека, и также вызывают серьезное заболевание у младенцев и пожилых людей (Baker, C.J., Vaccine, 31(Suppl. 4):D3-D6 (2013)). Основным фактором риска для инфекции, вызываемой GBS, у младенцев является колонизация у матери (Dillon, H.C., et al., J. Pediatr., 110(1):31-36 (1987)). По статистике у одной из четырех женщин ректо-вагинально присутствуют GBS, которые могут инфицировать амниотическую жидкость или младенца до, или в процессе, родов, вызывая сепсис, пневмонию и менингит (Baker 2013; Heath, P.T., et al., BMJ Clin. Evid. (Online), pii:0323 (2014)). Двадцать пять процентов младенцев, выживших после вызванного GBS менингита, страдают от неврологических нарушений, у 19% имеет место задержка когнитивных функций, церебральный паралич, слепота и потеря слуха (Libster, R., et al., Pediatrics, 130(1):e8-152012 (2012)). GBS также могут вызывать невынашивание беременности и преждевременные роды, и установлена их связь со случаями мертворождения (McDonald, H.M., et al., Infect. Dis. Obstetr. Gynecol., 8(5-6):220-227 (2000); Randis, T.M., et al., J. Infect. Dis., 210(2):265-273 (2014): Kessous, R., et al., J. Matern. Fetal Neonatal Med., 25(10):1983-1986 (2012)). Младенцы с очень низкой массой тела при рождении имеют намного более высокий риск инфекции, из них вплоть до 3% являются инфицированными, и смертность достигает уровня 30% даже при немедленном лечении антибиотиками (Heath 2014).

Введение в практику в конце 1990-х годов скрининга на GBS и интранатальной антибиотикопрофилактики (ИАП) в США привело к снижению степени неонатальной заболеваемости в первую неделю жизни (ранее начало заболевания [РНЗ]), но не оказало заметного влияния на показатели позднего начала заболевания (ПНЗ), которое возникает позже, в пределах первых 3 месяцев жизни. В настоящее время частота случаев РНЗ и ПНЗ в США составляет 0,25 и 0,27 на 1000 родов, соответственно (Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Active Bacterial Core (ABC) Surveillance Report (2013) available at http://www.cdc.gov/abcs/reports-findings/survreports/gbs13.pdf). После введения в практику использования пневмококковых конъюгированных вакцин для предотвращения инвазивного вызываемого пневмококками заболевания, включая бактериемию и менингит, и несмотря на ИАП для предотвращения вызываемого GBS заболевания, GBS стали единственной наиболее распространенной причиной неонатального сепсиса (РНЗ) и менингита (<2 месяцев) у младенцев в США (Verani, J.R., et al., MMWR, 59(RR10):1-32 (2010); Thigpen, M.C., et al., N. Engl. J. Med., 364(21):2016-2025 (2011)). В отличие от США, введение в практику мер по профилактике инвазивного заболевания, вызываемого GBS, и ИАП не привело к уменьшению частоты случаев РНЗ в Нидерландах или в Соединенном Королевстве (Bekker, V., et al., The Lancet Infectious Dis., 14(11):1083-1089 (2014); Lamagni, T.L., et al., Clin. Infect. Dis., 57(5):682-688 (2013)). Это отсутствие эффекта может быть следствием недостатка повсеместного скрининга и ограничения ИАП для матерей в группе наивысшего риска (например, лихорадка, длительный разрыв оболочек). Показатели РНЗ значительно выше в странах, в которых не применяют ИАП, с сообщаемой средней частотой случаев, составляющей 0,75 на 1000 живорожденных детей (95% ДИ 0,58-0,89) (Edmond, K.M, et al., Lancet, 379(9815):547-556 (2012)).

Другой популяцией людей, имеющих риск вызываемого GBS заболевания, являются пожилые. Факторы риска включают хронические медицинские проблемы, такие как сахарный диабет, рак, сердечная недостаточность, неврологические и урологические нарушения. По данным CDC ABC в США ежегодная частота случаев инвазии GBS в 2013 г. составила 0,28/1000 взрослых людей или 12400 случаев/год у взрослых людей в возрасте ≥65 лет. Этот показатель приближается к частоте случаев инвазивного пневмококкового заболевания у пожилых (против 0,30/1000 для людей старше 65 лет). Ожидается, что эти показатели будут продолжать расти как в США, так и в Европе (CDC 2013; Lamagni 2013).

Одним из подходов для профилактики вызываемого GBS заболевания у младенцев и пожилых людей является применение полисахаридной вакцины. Профилактическое вакцинирование матерей от GBS обладает потенциалом для предотвращения вызываемого GBS заболевания у младенцев в США, независимо от применения ИАП. Хотя полисахариды могут быть иммуногенными сами по себе, конъюгация полисахаридов с белковыми носителями была использована для повышения иммуногенности, особенно у детей и пожилых. Полисахарид-белковые конъюгированные вакцины получают с использованием полисахаридов, как правило, из поверхностной оболочки бактерий, связанных с белковыми носителями. Полисахарид-белковый конъюгат индуцирует иммунный ответ против бактерий, на поверхности которых экспонирован полисахарид, содержащийся в вакцине, таким образом предотвращая заболевание. Соответственно, вакцинация с использованием конъюгатов полисахаридов из патогенных бактерий является потенциальной стратегией для стимуляции иммунитета хозяина.

Полисахариды, покрывающие бактерии, сильно различаются даже среди бактерий одного вида. Например, у GBS имеется десять разных серотипов из-за вариаций в полисахаридной капсуле бактерий. Вследствие этого, желательно, чтобы полисахаридные вакцины содержали панель полисахаридов для гарантии широты покрытия против разных циркулирующих серотипов.

Белок-носитель может представлять собой либо соответствующий белковый антиген из целевого патогена, стимулирующий специфический иммунный ответ на данный патоген, либо обычный иммуногенный белок, который служит больше в качестве адъюванта или общего стимулятора иммунного ответа.

Отдельные одновалентные полисахарид-белковые конъюгаты для серотипов Ia, Ib, II, III и V GBS были оценены в клинических испытаниях фазы 1 и 2 с участием не беременных взрослых людей (Brigtsen, A.K., et al., J. Infect. Dis., 185(9):1277-1284 (2002); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 188(1):66-73 (2003); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 189(6):1103-1112 (2004); Baker, C.J., et al., Vaccine, 25(1):55-63 (2007)). Двухвалентные гликоконъюгатные вакцины II-TT и III-TT и трехвалентная вакцина, содержащая гликоконъюгаты Ia-CRM₁₉₇, Ib-CRM₁₉₇ и III-CRM₁₉₇, также были изучены (Baker 2003; Clicaltrials.gov NCT01193920, NCT01412801 и NCT01446289). Однако вакцины против GBS еще не получили одобрение для применения.

Кроме того, хотя трехвалентная вакцина покрывает >90% инвазивных штаммов, вызывающих неонатальное заболевание в Южной Африке (Madzivhandila, M., et al., PloS One, 6(3):e17861 (2011)), эти самые серотипы представляют лишь 62% и 66% инвазивных изолятов в Северной Америке и Европе, соответственно, на основании результатов обзора последних неонатальных изолятов из глобальной коллекции из 901 образца, собранной в 2004-2013 годы в клиническом испытании по оценке и контролю применения тайгециклина (T.E.S.T., http://www.testsurveillance.com/).

Анализ штаммов, полученных из образов, собранных в T.E.S.T., показал, что 95% собранных штаммов принадлежали к одному из пяти зарегистрированных основных серотипов (Ia, Ib, II, III и V) и еще 3% имели серотип IV. В серии публикаций также было подтверждено появление серотипа IV в течение последнего десятилетия в странах Америки и в Европе (Diedrick, M.J., et al., J. Clin. Microbiol., 48(9):3100-3104 (2010); Teatero (2014); Meehan, M. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 33(7):1155-1162 (2014); Florindo, C., et al., Euro Surveillance: Bulletin European sur les Maladies Transmissibles (European Communicable Disease Bulletin), 19(23) (2014); Palmiero, J.K., et al., J. Clin. Microbiol., 48(12):4397-4403 (2010)). В исследовании, посвященном изучению ректо-вагинального носительства у взрослых людей, что является фактором риска передачи GBS младенцам, также было установлено, что 97% изолятов принадлежали к одному из этих шести серотипов, причем серотип IV встречался с частотой ~4%. Исследование было предназначено для мониторинга носительства бета-гемолитических стрептококков (которые включают GBS), Clostridium difficile и Staphylococcus aureus у здорового взрослого населения США (смотри Matson, M.A., et al., ICAAC, Abstract I-306 (Washington, DC, Sep. 5-9, 2014)).

Аналогично, анализ образцов из T.E.S.T. показал, что 98% изолятов из крови проживающих в США пожилых людей в возрасте ≥65 лет принадлежат к тем же шести преобладающим серогруппам. Наиболее примечательным различием между изолятами от пожилых людей и других популяций является распределение серогрупп. В изолятах от пожилых пациентов штаммы серотипа V составляют самую большую группу (34% против 18% у новорожденных или 18% у взрослых носителей штаммов).

В других исследованиях было обнаружено, что существуют географические вариации распространенности серотипов. Например, показано, что изоляты серотипов VI и VIII являются преобладающими колонизирующими микроорганизмами у здоровых беременных женщин в Японии (Lachenauer, C.S., et al., J. Infect. Dis.,179(4):1030-1033 (1999).

Соответственно, существует потребность в полисахарид-белковых конъюгатных вакцинах или моноклональных антителах для создания пассивного иммунитета в качестве средства для предотвращения или лечения заболеваний, вызываемых GBS, включая те, которые вызывает новый серотип IV, у широких слоев населения во всем мире. Кроме того, необходимо, чтобы такие вакцины или иммуногенные композиции были стабильными и легко ресуспендируемыми в любом контейнере, известном в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым иммуногенным композициям, содержащим GBS полисахарид-белковые конъюгаты и, необязательно, содержащим адъювант. Следующие пункты описывают некоторые аспекты и варианты осуществления изобретения.

В одном аспекте изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей капсульный полисахарид из стрептококка группы B (GBS), конъюгированный с белком-носителем, и необязательно, адъювант на основе алюминия. В одном варианте осуществления адъювант на основе алюминия выбирают из группы, состоящей из фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия и гидроксида алюминия. В одном таком варианте осуществления адъювант на основе алюминия находится в концентрации от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид выбирают из группы, состоящей из полисахаридов серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой шестивалентную конъюгатную композицию GBS. В одном таком варианте осуществления иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды из GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V.

В другом варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B (GBS), выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX; и дополнительно содержащей один или более из фармацевтически приемлемого эксципиента, буфера, стабилизатора, адъюванта, криопротектора, соли, двухвалентного катиона, неионного детергента, ингибитора вызываемого свободными радикалами окисления, носителя, или их смесь.

В другом варианте осуществления изобретение относится к иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании, в которой капсульные полисахариды индивидуально конъюгированы с одним и тем же белком-носителем.

В другом аспекте изобретения иммуногенная композиция помещена в шприц. В одном варианте осуществления шприц является стеклянным. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция помещена в шприц со свободным пространством над продуктом, составляющим от приблизительно 1 мм до приблизительно 15 мм.

В следующем аспекте изобретения иммуногенную композицию ресуспендируют посредством приблизительно 50 или менее встряхиваний.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит фосфат. В одном таком варианте осуществления фосфат находится в концентрации от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ.

В другом варианте осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит хлорид натрия. В одном таком варианте осуществления хлорид натрия находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ.

В следующем варианте осуществления иммуногенная композиция содержит общую дозу конъюгата от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл.

В дополнительном варианте осуществления иммуногенная композиция имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл фосфата алюминия, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 265 мМ хлорида натрия и общую дозу конъюгата от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, причем иммуногенная композиция имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

В другом аспекте изобретения иммуногенная композиция содержит от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл гидроксида алюминия, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 170 мМ хлорида натрия и общую дозу конъюгата от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, причем иммуногенная композиция имеет pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

Другой аспект изобретения относится к способу индукции иммунного ответа против GBS, включающему введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу профилактики, или облегчения, заболевания или состояния, связанного с GBS, у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной. В одном таком варианте осуществления беременная женщина находится во второй половине беременности, например, на сроке беременности по меньшей мере 20 недель или по меньшей мере 27 недель. В предпочтительном варианте осуществления беременная женщина находится на сроке беременности от 27 недель до 36 недель. В другом варианте осуществления пациент является пожилым человеком, например, в возрасте 50 лет или старше, 65 лет или старше и 85 лет или старше. В следующем варианте осуществления пациент имеет иммунную недостаточность. В одном аспекте пациент может иметь медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени. В предпочтительном варианте осуществления стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.

В дополнительном аспекте изобретение относится к антителам, которые связывают капсульный полисахарид в иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитела получают путем введения иммуногенной композиции пациенту. В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей антитела по настоящему изобретению.

Следующий аспект изобретения относится к способу создания пассивного иммунитета у пациента, включающему стадии (a) получения препарата антител с использованием иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании; и (b) введения препарата антител пациенту для создания пассивного иммунитета.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1: Сравнение опсонической активности сыворотки и выделенных IgG от мышей, иммунизированных одновалентными вакцинами GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇.

ФИГ. 2: Стабильность GBS Ia-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 3: Стабильность GBS Ib-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 4: Стабильность GBS II-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 5: Стабильность GBS III-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 6: Стабильность GBS IV-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 7: Стабильность GBS V-CRM₁₉₇ (представленная в виде % изменения молекулярной массы, определенной методом SEC-MALLS) после хранения в условиях ускоренного старения (4 недели) при 50°C.

ФИГ. 8: Стабильность GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ и GBS IV-CRM₁₉₇ (представленная наличием свободной сиаловой кислоты) после хранения при 37°C.

ФИГ. 9: Стабильность pH в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) при использовании сукцината в качестве буфера.

ФИГ. 10: Стабильность pH в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) при использовании гистидина в качестве буфера.

ФИГ. 11: Эффект концентрации гистидинового буфера в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на связывание конъюгатов GBS с алюминием в дозе 10 мкг/мл.

ФИГ. 12: Эффект концентрации гистидинового буфера в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на связывание конъюгатов GBS с алюминием в дозе 40 мкг/мл.

ФИГ. 13: Эффект концентрации полисорбата-80 в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на потерю, в процентах, общей антигенности при стрессе, создаваемым встряхиванием.

ФИГ. 14: Эффект концентрации алюминия в шестивалентной вакцине против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на связывание конъюгатов GBS с алюминием.

ФИГ. 15: Эффект 5,5% (масс./об.) сахарозы в дозе 10 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 16: Эффект 7,0% (масс./об.) сахарозы в дозе 10 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 17: Эффект 8,5% (масс./об.) сахарозы в дозе 10 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 18: Эффект 5,5% (масс./об.) сахарозы в дозе 50 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 19: Эффект 7,0% (масс./об.) сахарозы в дозе 50 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 20: Эффект 8,5% (масс./об.) сахарозы в дозе 50 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 21: Эффект 7,0% (масс./об.) сахарозы в дозе 40 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 22: Эффект 2,0% (масс./об.) сахарозы и 4,0% (масс./об.) маннита в дозе 40 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 23: Эффект 3,0% (масс./об.) сахарозы и 3,0% (масс./об.) маннита в дозе 40 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 24: Эффект 2,0% (масс./об.) сахарозы и 4,0% (масс./об.) глицина в дозе 40 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 25: Эффект 3,0% (масс./об.) сахарозы и 3,0% (масс./об.) глицина в дозе 40 мкг/мл лиофилизированной шестивалентной вакцины против GBS (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) на восстановление антигенности для каждого серотипа.

ФИГ. 26: Сравнение восстановленной суспензии GBS6 и одновалентных препаратов в высоких и низких дозах, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз, во временных точках 0, 2 недели и 3 месяца.

ФИГ. 27: Сравнение восстановленной суспензии GBS6 и одновалентных препаратов в высоких и низких дозах, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз и в горизонтальном положении.

ФИГ. 28: Дзета-потенциал AlPO₄ в зависимости от pH.

ФИГ. 29: Дзета-потенциал конъюгатов GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V в зависимости от pH.

ФИГ. 30: Сравнение скоростей седиментации разных GBS6 и одновалентных препаратов в высоких и низких дозах, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз, во временных точках 0, 2 недели и 3 месяца.

ФИГ. 31: Скорость седиментации препаратов GBS6 в зависимости от уровней дозы (концентрация для каждого серотипа).

ФИГ. 32: Скорость седиментации препаратов GBS6 в зависимости от pH при низкой дозе (60 мкг/мл) и высокой дозе (240 мкг/мл).

ФИГ. 33: Эффект дозы и концентрации NaCl на скорость седиментации.

ФИГ. 34: Сравнение особенностей оседания разных препаратов антигена через 45 минут.

ФИГ. 35A: Подробное распределение частиц по размерам в разных препаратах антигена.

ФИГ. 35B: Распределение частиц по размерам в разных препаратах антигена, с категоризацией на ≥10 мкм или ≥25 мкм.

ФИГ. 36: Препараты GBS6 в PFS с различным свободным пространством над продуктом.

ФИГ. 37: Число встряхиваний, необходимое для ресуспендирования препаратов GBS6 в высокой дозе с различными концентрациями AlPO₄ через 2 недели хранения в горизонтальном положении.

ФИГ. 38: Связывание конъюгатов GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V с AlPO₄ в разных концентрациях через 2 недели хранения в горизонтальном положении.

ФИГ. 39: Эффект разных флокулянтов и солей алюминия на ресуспендирование.

ФИГ. 40: Эффект разных флокулянтов и солей алюминия на скорость оседания.

ФИГ. 41: Эффект концентраций NaCl на время ресуспендирования препаратов GBS6 в высокой дозе.

ФИГ. 42: Эффект сочетания NaCl и фосфат-ионов на время ресуспендирования.

ФИГ. 43A: Эффект концентраций NaCl и фосфата калия на оседание через 2 часа.

ФИГ. 43B: Эффект концентраций NaCl и фосфата калия на оседание через 30 минут.

ФИГ. 44: Связанная антигенность, в процентах, препарата GBS6, содержащего 20 мМ фосфат и 240 мМ NaCl, в сравнении с контрольным препаратом GBS6.

ФИГ. 45: Рекомендации системы профилирования для предсказания оптимальных и надежных условий для препарата, способствующих более легкому ресуспендированию (≤10 встряхиваний).

ФИГ. 46: Связанная антигенность, в процентах, препаратов GBS6 на основании рекомендаций системы профилирования для предсказаний.

ФИГ. 47: Связывание GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V с Al(OH)₃ в различных концентрациях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит лишь целям описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, могут быть использованы при практическом применении или тестировании изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены посредством ссылки в полном объеме

Термины, используемые в настоящем описании, имеют те значения, которые признаны и известны специалистам в данной области, однако для удобства и полноты описания конкретные термины и их значения приведены ниже и во всем тексте спецификации.

При использовании в настоящей спецификации и прилагаемой формуле изобретения термины в единственном числе включают соответствующие термины во множественном числе, если из контекста явно не следует иначе. Таким образом, например, термин «способ» включает один или более способов, и/или этапов, таких, как описанные в настоящем описании, и/или которые станут понятными специалистам в данной области после прочтения настоящего описания, и так далее.

Термин «приблизительно», или «приблизительно», означает «в пределах статистически значимого диапазона значений». Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, как правило, в пределах 20%, более конкретно в пределах 10%, и еще более конкретно в пределах 5% от указанного значения или диапазона. Допустимые вариации, охваченные термином «приблизительно», или «приблизительно», зависят от конкретной изучаемой системы, и могут быть с легкостью определены специалистами в данной области. Если в тексте настоящей заявки указан диапазон, каждое целое число в пределах данного диапазона также предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В настоящем описании такие термины, как «содержит», «содержащийся», «содержащий», «заключает в себе», «заключающий в себе», и тому подобное, могут иметь значение, которое им придается в патентном законе США; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное. Такие термины означают включение конкретных ингредиентов или набора ингредиентов, без исключения любых других ингредиентов. Такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, которое им придается в патентном законе США, например, они допускают включение других ингредиентов или этапов, которые не преуменьшают новые или базовые характеристики изобретения, то есть, они исключают дополнительные не перечисленные ингредиенты или стадии, которые преуменьшают новые или базовые характеристики изобретения, и они исключают ингредиенты или стадии предшествующего уровня техники, такие как документы, относящиеся к данной области, которые цитированы в настоящем описании или включены в настоящий документ посредством ссылки, в частности, поскольку целью настоящего документа является определение вариантов осуществления, являющихся патентоспособными, например, новыми, неочевидными, обладающими признаками изобретения относительно предшествующего уровня техники, например, относительно документов, которые цитированы в настоящем описании или включены в настоящий документ посредством ссылки. Также термины «состоит из» и «состоящий из» имеют значение, которое им придается в патентном законе США; а именно, что эти термины являются закрытыми. Соответственно, данные термины означают включение конкретного ингредиента или набора ингредиентов и исключение всех других ингредиентов.

Термин «антиген», в целом, означает биологическую молекулу, как правило, белок, пептид, полисахарид, липид или конъюгат, содержащую по меньшей мере один эпитоп, с которым узнающее его антитело может избирательно связываться; или в некоторых случаях, иммуногенное вещество, которое способно стимулировать продуцирование антител или T-клеточные ответы, либо и то, и другое, у животного, включая композиции, которые вводят инъекцией животному или поглощаются животным. Иммунный ответ может быть индуцирован на целую молекулу, или на одну или более разных частей молекулы (например, эпитоп или гаптен). Термин может быть использован применительно к отдельной молекуле, либо к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген узнается антителами, T-клеточными рецепторами или другими элементами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин «антиген» включает все соответствующие антигенные эпитопы. Эпитопы конкретного антигена могут быть идентифицированы с использованием различных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, NJ). Например, линейные эпитопы можно определять, например, одновременно синтезируя на твердых подложках большое количество пептидов, соответствующих фрагментам белковой молекулы, и проводя реакцию пептидов с антителами, когда пептиды все еще связаны с подложками. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 4708871; Geysen, H.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984); Geysen, H.M., et al., Molec. Immunol., 23(7):709-715 (1986), содержание всех из которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Аналогично, конформационные эпитопы могут быть идентифицированы путем определения пространственной конформации аминокислот, например, методами рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (смотри, например, Epitope Mapping Protocols, выше). Кроме того, для целей настоящего изобретения термин «антиген» также может быть использован применительно к белку, который имеет модификации, такие как делеции, добавления и замены (как правило, консервативные по характеру, однако они могут быть не консервативными), в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Такие модификации могут быть намеренными, например, в результате сайт-направленного мутагенеза, или вследствие использования конкретного метода синтеза или генно-инженерного подхода, либо могут быть случайными, например, вследствие мутаций в организме хозяев, которые продуцируют антигены. Кроме того, антиген может быть произведен, получен или выделен из микроорганизма, например, бактерии, или может представлять собой целый микроорганизм. Аналогично, олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген, например, в протоколах иммунизации нуклеиновой кислотой, также охвачен данным определением. Синтетические антигены также включены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или полученные методом синтеза антигены (Bergmann, C., et al., Eur. J. Immunol., 23(11):2777-2781(1993); Bergmann, C.C., et al., J. Immunol., 157(8):3242-3249(1996); Suhrbier, A., Immunol. and Cell Biol., 75(4):402-408 (1997)).

Термины «вакцина» или «вакцинная композиция», которые используются взаимозаменяемо, означают фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ в организме животного.

Капсульные полисахариды

Используемый в настоящем описании термин «сахарид» означает одиночный сахарный фрагмент или моносахаридную единицу, а также сочетание двух или более одиночных сахарных фрагментов или моносахаридных единиц, ковалентно связанных, с образованием дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов. Термин «сахарид» можно использовать взаимозаменяемо с термином «углевод». Полисахарид может быть линейным или разветвленным.

Используемый в настоящем описании термин «моносахарид» означает один сахарный остаток в олигосахариде. Используемый в настоящем описании термин «дисахарид» означает полисахарид, состоящий из двух моносахаридных единиц, или фрагментов, связанных вместе гликозидной связью.

В одном варианте осуществления полисахарид представляет собой олигосахарид (OS). Используемый в настоящем описании термин «олигосахарид» означает соединение, содержащее две или более моносахаридных единиц, или фрагментов. В контексте олигосахарида отдельная мономерная единица, или фрагмент, представляет собой моносахарид, который связан, или может быть связан, через гидроксильную группу с другой моносахаридной единицей, или фрагментом. Олигосахариды могут быть получены либо путем химического синтеза из имеющих защитную группу одиночных сахарных остатков, либо путем химической деградации биологически полученных полисахаридов. Альтернативно, олигосахариды могут быть получены in vitro ферментативными методами.

В предпочтительном варианте осуществления полисахарид PS представляет собой линейный или разветвленный полимер из по меньшей мере 5 моносахаридных единиц, или фрагментов. Для ясности, полимер с большим числом повторяющихся единиц, где n больше 5, например, больше приблизительно 10, в настоящем описании называют полисахаридом.

В одном варианте осуществления полисахарид представляет собой полисахарид клеточной поверхности. Термин «полисахарид клеточной поверхности» означает полисахарид, по меньшей мере часть которого расположена на самой внешней мембране бактериальной клетки, или поверхности бактериальной клетки, включая пептидогликановый слой, клеточную стенку и капсулу. Как правило, полисахарид клеточной поверхности связан с индукцией иммунного ответа in vivo. Полисахарид клеточной поверхности может представлять собой «полисахарид клеточной стенки» или «капсульный полисахарид». Полисахарид клеточной стенки, как правило, образует прерывистый слой на поверхности бактерий.

В одном варианте осуществления полисахарид представляет собой капсульный полисахарид. Капсульный полисахарид представляет собой гликополимер, содержащий повторяющиеся единицы одного или более моносахаридов, связанные гликозидными связями. Капсульный полисахарид, как правило, образует капсулоподобный слой вокруг бактериальной клетки. «Капсульный полисахарид» или «полисахарид капсулы» означает полисахаридную капсулу, которая является внешней по отношению к клеточной стенке в большинстве изолятов стрептококков. Например, капсульные полисахариды всех GBS имеют разветвленную повторяющуюся структуру с концевой α2-3-связанной сиаловой кислотой, которая необходима для вирулентности бактерий. Связанная с капсулой сиаловая кислота (количество которой определяют методом ВЭЖХ) была обнаружена в >94% инвазивных неонатальных изолятов из исследования T.E.S.T., культивируемых in vitro.

Авторы настоящего изобретения установили, что уровень сиаловой кислоты в капсульных полисахаридах GBS является важным фактором для вызывания иммунного ответа. В предыдущих заявках была лишь предоставлена противоречивая информация относительно уровней сиаловой кислоты для серотипа V, заключение, что десиалированный серотип V являлся предпочтительным (публикация международной патентной заявки № WO 2012/035519), и что может быть использовано содержание сиаловой кислоты >50% для серотипа V (публикация международной патентной заявки № WO 2014/053612). Однако ничто в этих документах на указывает на важность уровней сиаловой кислоты для иммуногенности по меньшей мере большинства полисахаридов GBS. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в капсульных полисахаридах GBS должно содержаться приблизительно 60% или более сиаловой кислоты перед конъюгацией для обеспечения иммунного ответа, сопоставимого с ответом на такие полисахариды, имеющие естественные уровни сиаловой кислоты (то есть 100% или более приблизительно 95%). Даже уровни сиаловой кислоты 58%, что находится в пределах диапазонов, описанных ранее для серотипа V, отрицательно влияют на иммуногенность.

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения капсульные полисахариды имеют их естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%).

Следует отметить, что 100% уровень сиаловой кислоты соответствует содержанию приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида. Таким образом, капсульные полисахариды могут иметь приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

Концевые сиалиловые остатки капсульных полисахаридов (CP) некоторых серотипов являются частично O-ацетилированными (OAc) (Lewis, A.L., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 101(30):11123-8 (2004)). Полисахариды серотипов Ib, III, IV, V, VI и IX имеют частичное O-ацетилирование (до ~40%), а серотипов Ia, II и VII имеют небольшое, или совсем не имеют, O-ацетилирование (менее приблизительно 5%) (Lewis 2004). В одном варианте осуществления изобретения капсульные полисахариды имеют их естественный уровень O-ацетилирования (от приблизительно 0% до приблизительно 40%). В другом варианте осуществления капсульные полисахариды могут быть де-O-ацетилированными (уровень менее приблизительно 5%). Степень O-ацетилирования полисахарида или олигосахарида можно определять любым методом, известным в данной области, например, методом протонного ЯМР (Lemercinier, X., et al., Carbohydrate Research, 296:83-96 (1996); Jones, C., et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30:1233-1247 (2002); публикации международных патентных заявок №№ WO 2005/033148 и WO 00/56357). Другим обычно используемым методом является метод, описанный в Hestrin, S., J. Biol. Chem., 180:249-261 (1949).

Кроме того, 100% уровень O-ацетата соответствует содержанию приблизительно 1,0 мМ O-ацетата на мМ повторяющейся сахаридной единицы. Соответственно, частично O-ацетилированные полисахариды содержат по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,35 или приблизительно 0,4 мМ O-ацетата на мМ повторяющейся сахаридной единицы. Де-O-ацетилированный полисахарид содержит менее приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 или 0,05 мМ O-ацетата на мМ повторяющейся сахаридной единицы.

Стрептококковые микроорганизмы, способные вызывать инвазивное заболевание, как правило, также способны продуцировать CP, который инкапсулирует бактерию и повышает ее сопротивляемость удалению врожденной иммунной системой хозяина. CP укрывает бактериальную клетку защитной капсулой, придающей бактерии устойчивость к фагоцитозу и внутриклеточному уничтожению. Бактерии, лишенные капсулы, более подвержены фагоцитозу. Капсульные полисахариды часто являются важным фактором вирулентности для многих бактериальных патогенов, включая Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Staphylococcus aureus.

Капсульный полисахарид можно использовать для серотипирования конкретных видов бактерий. Типирование, как правило, выполняют путем проведения реакции со специфической антисывороткой или моноклональными антителами, полученными против конкретной структуры или уникального эпитопа, характерного для капсульного полисахарида. Существуют десять серотипов GBS: Ia, Ib и II-IX (Ferrieri, P., et al., Emerg. Infect. Dis. [интернет], 19(4) (2013), доступно по сетевому адресу http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/19/4/12-1572_article.

В одном варианте осуществления изобретения полисахарид выделяют из Streptococcus agalactiae. Полисахарид может быть выделен из любого инкапсулированного штамма S. agalactiae, такого как 090, A909 (регистрационный № ATCC BAA-1138), 515 (регистрационный № ATCC BAA-1177), B523, CJB524, MB 4052 (регистрационный № ATCC 31574), H36B (регистрационный № ATCC 12401), S40, S42, MB 4053 (регистрационный № ATCC 31575), M709, 133, 7357, PFEGBST0267, MB 4055 (регистрационный № ATCC 31576), 18RS21 (регистрационный № ATCC BAA-1175), S16, S20, V8 (регистрационный № ATCC 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, PFEGBST0708, MB 4082 (регистрационный № ATCC 31577), M132, 110, M781 (регистрационный № ATCC BAA-22), D136C(3) (регистрационный № ATCC 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; регистрационный № ATCC 31475), M132, K79, COH1 (регистрационный № ATCC BAA-1176), PFEGBST0563, 3139 (регистрационный № ATCC 49446), CZ-NI-016, PFEGBST0961, 1169-NT1, CJB111 (регистрационный № ATCC BAA-23), CJB112, 2603 V/R (регистрационный № ATCC BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, PFEGBST0837, 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, CZ-PW-119, 7271, CZ-PW-045, JM9130013, JM9130672, IT-NI-016, IT-PW-62 и IT-PW-64.

Полисахариды, описанные в настоящем описании, могут быть выделены способами, известными в данной области, включая, например, способы, описанные в настоящем описании. Используемый в настоящем описании термин «выделенные» означает полученные из, и отделенные от, конкретного источника. Термин «выделенные» также означает не находящиеся в соответствующей природной форме, состоянии и/или окружении. Например, «выделенное из стрептококка» означает вещество, которое было получено из, и отделено от, клетки стрептококка. Выделенный полисахарид не является естественным. Термин «выделенный» означает, что материал удален из его естественного окружения (например, естественного окружения, если он является природным, или из организма-хозяина, если он представляет собой рекомбинантную молекулу) или перенесен из одного окружения в другое окружение. Например, «выделенный» капсульный полисахарид, белок или пептид является в основном свободным от клеточного материала или других примесных белков клеточного или тканевого источника, из которого белок получен, или в основном свободным от химических предшественников или других реактивов, если он химически синтезирован или иным образом присутствует в смеси в виде компонента химической реакции. В настоящем изобретении белки или полисахариды могут быть выделенными из бактериальной клетки или из клеточного детрита с целью получения их в форме, полезной для производства иммуногенной композиции. Термин «выделенный» или «выделение» может охватывать очистку, или очищение, включая способы очистки выделенного полисахарида, известные в данной области, и/или способы, описанные в настоящем описании. Выражение «в основном свободные от клеточного материала» относится к препаратам полипептида/белка, в которых полипептид/белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или в которых рекомбинантно продуцирован. Таким образом, капсульный полисахарид, белок или пептид, который в основном свободен от клеточного материала, включает препараты капсульного полисахарида, белка или пептида, содержащие менее приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% (в расчете на сухую массу) примесного белка или полисахарида, или другого клеточного материала. Если полипептид/белок рекомбинантно продуцирован, он также предпочтительно является в основном свободным от культуральной среды, то есть, культуральная среда составляет менее приблизительно 20%, 10% или 5% от объема белкового препарата. Если полипептид/белок или полисахарид получен методом химического синтеза, он предпочтительно является в основном свободным от химических предшественников или других реактивов, то есть, он отделен от химических предшественников или других реактивов, которые используют в синтезе белка или полисахарида. Соответственно, такие препараты полипептида/белка или полисахарида содержат менее приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (в расчете на сухую массу) химических предшественников или соединений, отличных от интересующего фрагмента полипептида/белка или полисахарида.

В одном варианте осуществления изобретения полисахарид выделен из бактерии. В другом варианте осуществления изобретения полисахарид получен рекомбинантными методами. В следующем варианте осуществления полисахарид является синтетическим или химически синтезированным общепринятыми методами. В другом варианте осуществления изобретения полисахарид получен путем экспрессии в суррогатном хозяине после клонирования и экспрессии пути биосинтеза для получения полисахарида. В одном варианте осуществления полисахарид является иммуногенным. Например, авторы изобретения установили, что каждый полисахарид, описанный в настоящем описании, способен индуцировать, или вызывать, иммунный ответ. Термин «иммуногенный» означает наличие способности инициировать, запускать, вызывать, усиливать, улучшать и/или повышать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ у млекопитающего. В одном варианте осуществления млекопитающее является человеком, приматом, кроликом, свиньей, мышью и так далее.

Молекулярная масса капсульного полисахарида является фактором, который следует учитывать при использовании его в иммуногенных композициях. Высокомолекулярные капсульные полисахариды способны индуцировать определенные иммунные ответы в виде продукции антител вследствие более высокой валентности эпитопов, присутствующих на поверхности антигена. Выделение и очистку высокомолекулярных капсульных полисахаридов предполагается использовать в получении конъюгатов, композиций, а также в способах по настоящему изобретению.

Однако в одном варианте осуществления полисахарид может иметь размер в диапазоне молекулярной массы (ММ), который ниже, чем молекулярная масса природного капсульного полисахарида до конъюгации с белком-носителем. Размер очищенного капсульного полисахарида уменьшают для получения конъюгатов с более подходящими характеристиками фильтруемости и/или выхода.

В одном таком варианте осуществления размер очищенного капсульного полисахарида уменьшают путем гомогенизации под высоким давлением. При гомогенизации под высоким давлением достигается высокая скорость сдвига за счет прокачки технологического потока через проточный канал с достаточно небольшими размерами. Скорость сдвига увеличивается при использовании высокого приложенного давления гомогенизации, и время экспозиции может быть увеличено за счет рециркуляции потока сырья через гомогенизатор.

В одном варианте осуществления полисахарид, описанный в настоящем описании, способен индуцировать опсоническую активность. В другом варианте осуществления полисахарид, описанный в настоящем описании, способен индуцировать опсоническую и фагоцитарную активность (например, опсонофагоцитарную активность).

Термин «опсоническая активность», или «опсонизация», означает процесс, при котором опсонин (например, антитело или фактор комплемента) связывается с антигеном (например, выделенным полисахаридом, описанным в настоящем описании), что облегчает прикрепление антигена к фагоциту, или фагоцитарной клетке (например, макрофагу, дендритной клетке и полиморфноядерному лейкоциту (ПМЯЛ). Некоторые бактерии, такие как, например, инкапсулированные бактерии, которые, как правило, не подвергаются фагоцитозу из-за наличия капсулы, с большей вероятностью узнаются фагоцитами, если они покрыты опсоническим антителом. В одном варианте осуществления полисахарид индуцирует иммунный ответ, такой как, например, выработка антитела, которое является опсоническим. В одном варианте осуществления опсоническая активность направлена против грамположительных кокков, предпочтительно против вида Streptococcus, более предпочтительно против по меньшей мере одного штамма S. agalactiae.

В другом варианте осуществления полисахарид, описанный в настоящем описании, способен индуцировать бактерицидный иммунный ответ. В одном варианте осуществления бактерицидная активность направлена против грамположительных кокков, предпочтительно против вида Streptococcus, более предпочтительно против по меньшей мере одного штамма S. agalactiae.

Способы количественного определения опсонизации, фагоцитоза и/или бактерицидной активности известны в данной области, например, такие способы, как измерение уменьшения бактериальной нагрузки in vivo (например, путем измерения уровней бактериемии у млекопитающих, которым ввели бактерии вида Streptococcus) и/или измерение уничтожения бактериальных клеток in vitro (например, in vitro анализ опсонофагоцитарной активности). В одном варианте осуществления полисахарид способен индуцировать опсоническую, фагоцитарную и/или бактерицидную активность, в сравнении с соответствующим контролем, например, в сравнении с антисывороткой, полученной против убитых нагреванием грамположительных кокков.

Серотип Ia

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа Ia GBS. Структура полисахарида серотипа Ia может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа Ia до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа. В другом предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В конкретном варианте осуществления процесс гомогенизации под высоким давлением используют для уменьшения размера природного капсульного полисахарида серотипа Ia GBS, сохраняя при этом структурные особенности полисахарида, такие как сиаловая кислота.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа Ia имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа Ia имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа Ia имеют уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%. Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа Ia по изобретению, включают 090, A909 (регистрационный № ATCC BAA-1138), 515 (регистрационный № ATCC BAA-1177), B523, CJB524 и MB 4052 (регистрационный № ATCC 31574).

Серотип Ib

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа Ib GBS. Структура полисахарида серотипа Ib может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа Ib до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа Ib имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа Ib имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа Ib имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа Ib по изобретению, включают H36B (регистрационный № ATCC 12401), S40, S42, MB 4053 (регистрационный № ATCC 31575), M709, 133, 7357 и PFEGBST0267.

Серотип II

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа II GBS. Структура полисахарида серотипа II может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа II до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа II имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа II имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа II имеют уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%. Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа II по изобретению, включают MB 4055 (регистрационный № ATCC 31576), 18RS21 (регистрационный № ATCC BAA-1175), S16, S20, V8 (регистрационный № ATCC 12973), DK21, DK23, UAB, 5401 и PFEGBST0708.

Серотип III

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа III GBS. Структура полисахарида серотипа III может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа III до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа. В другом предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В конкретном варианте осуществления процесс гомогенизации под высоким давлением используют для уменьшения размера природного капсульного полисахарида серотипа III GBS, сохраняя при этом структурные особенности полисахарида, такие как сиаловая кислота.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа III имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа III имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа III имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа III по изобретению, включают MB 4082 (регистрационный № ATCC 31577), M132, 110, M781 (регистрационный № ATCC BAA-22), D136C(3) (регистрационный № ATCC 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; регистрационный № ATCC 31475), M132, K79, COH1 (регистрационный № ATCC BAA-1176) и PFEGBST0563.

Серотип IV

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа IV GBS. Структура полисахарида серотипа IV может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа IV до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа IV имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа IV имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа IV имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа IV по изобретению, включают 3139 (регистрационный № ATCC 49446), CZ-NI-016 и PFEGBST0961.

Серотип V

Один вариант осуществления относится к капсульному полисахариду серотипа V GBS. Структура полисахарида серотипа V может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа V до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. В одном предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса капсульного полисахарида до конъюгации составляет от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа V имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа V имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа V имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа V по изобретению, включают 1169-NT1, CJB111 (регистрационный № ATCC BAA-23), CJB112, 2603 V/R (регистрационный № ATCC BAA-611), NCTC 10/81, CJ11 и PFEGBST0837.

Серотип VI

Капсульные полисахариды серотипа VI GBS описаны в публикации von Hunolstein, C., et al., Infection and Immunity, 6194):1272-1280 (1993), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Структура полисахарида серотипа VI может быть представлена следующим образом:

a)

или

b)

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа VI до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа VI имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа VI имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа VI имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа VI по изобретению, включают 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214 и CZ-PW-119.

Серотип VII

Капсульные полисахариды серотипа VII GBS описаны в публикации Kogan, G., et al., Carbohydrate Research, 277(1):1-9 (1995), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Повторяющаяся единица серотипа VII является следующей:

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа VII до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа VII имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа VII имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа VII имеют уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%. Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа VII по изобретению, включают 7271 и CZ-PW-045.

Серотип VIII

Капсульные полисахариды серотипа VIII GBS описаны в публикации Kogan, G., et al., The Journal of Biological Chemistry, 271(15):8786-8790 (1996), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Повторяющаяся единица серотипа VIII является следующей:

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа VIII до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа VIII имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа VIII имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа VIII имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа VIII по изобретению, включают JM9130013 и JM9130672.

Серотип IX

Капсульные полисахариды серотипа IX GBS описаны в публикации Berti, F., et al., The Journal of Biological Chemistry, 289(34):23437-2348 (2014), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Структура полисахарида серотипа IX может быть представлена следующим образом:

Молекулярная масса капсульных полисахаридов серотипа IX до конъюгации составляет от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения капсульный полисахарид серотипа IX имеет его естественный уровень сиаловой кислоты, например, приблизительно 100% или более приблизительно 95%. В другом варианте осуществления десиалирование капсульных полисахаридов может достигать уровня до приблизительно 40% (уровень сиалирования выше приблизительно 60%), например, до приблизительно 35% (уровень сиалирования выше приблизительно 65%), до приблизительно 30% (уровень сиалирования выше приблизительно 70%), до приблизительно 25% (уровень сиалирования выше приблизительно 75%), до приблизительно 20% (уровень сиалирования выше приблизительно 80%), до приблизительно 15% (уровень сиалирования выше приблизительно 85%), до приблизительно 10% (уровень сиалирования выше приблизительно 90%) и до приблизительно 5% (уровень сиалирования выше приблизительно 95%) до конъюгации.

В другом варианте осуществления капсульный полисахарид серотипа IX имеет приблизительно 1,0 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации. В следующем варианте осуществления капсульный полисахарид может иметь по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, например, по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида, по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида или по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида до конъюгации.

Капсульные полисахариды серотипа IX имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%. В одном варианте осуществления изобретения полисахарид является де-O-ацетилированным (то есть, уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%). Некоторые иллюстративные штаммы, имеющие капсульные полисахариды серотипа IX по изобретению, включают IT-NI-016, IT-PW-62 и IT-PW-64.

Полисахарид-белковые конъюгаты

Используемый в настоящем описании термин «конъюгаты» охватывает капсульный полисахарид, как правило, с молекулярной массой в нужном диапазоне, и белок-носитель, причем капсульный полисахарид конъюгирован с белком-носителем. Конъюгаты могут содержать, или не содержать, некоторое количество свободного капсульного полисахарида. Используемый в настоящем описании термин «свободный капсульный полисахарид» означает капсульный полисахарид, который нековалентно связан с (то есть нековалентно соединен с, адсорбирован на, либо заключен в, или совместно с) конъюгатом капсульный полисахарид-белок-носитель. Термины «свободный капсульный полисахарид», «свободный полисахарид» и «свободный сахарид» могут быть использованы взаимозаменяемо и должны иметь одно и то же значение. Независимо от природы молекулы носителя, она может быть конъюгирована с капсульным полисахаридом либо непосредственно, либо через линкер. Используемые в настоящем описании термины «конъюгировать», «конъюгированный» и «конъюгация» относятся к процессу, посредством которого бактериальный капсульный полисахарид ковалентно присоединяют к молекуле носителя. Конъюгация приводит к увеличению иммуногенности бактериального капсульного полисахарида. Конъюгацию можно выполнять способами, описанными ниже, или способами, известными в данной области.

Используемый в настоящем описании термин «конъюгатная иммуногенная композиция» означает иммуногенную композицию, в которой иммуногенный материал включает антигенный полисахарид, ковалентно связанный с белком-носителем, в результате чего образуется полисахарид-белковый конъюгат. В одном варианте осуществления полисахарид-белковый конъюгат по изобретению может быть сформулирован в виде поливалентной иммуногенной композиции.

Используемый в настоящем описании термин «молекулярная масса» полисахарида или конъюгата белок-носитель-полисахарид означает молекулярную массу, определяемую методом эксклюзионной хроматографии (SEC) в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (MALLS).

Используемый в настоящем описании термин «полисахарид-белковый конъюгат» относится к молекуле полисахарида, конъюгированной с молекулой белка-носителя за счет одной или более ковалентных связей. Может быть желательно конъюгировать полисахарид с белком от другого биологического вида, известным своей иммуногенностью в организме целевого хозяина. Соответственно, в одном варианте осуществления молекула носителя представляет собой белок-носитель. В настоящем описании такой чужеродный белок называют «белок-носитель». Белки-носители служат для усиления антигенности и иммуногенности полисахарида. Используемый в настоящем описании термин «эффект носителя» относится к явлению, когда антигенность и иммуногенность слабо иммуногенной или не иммуногенной молекулы усиливается за счет присоединения к более иммуногенной молекуле, используемой в качестве носителя (например, к гетерологичному белку). В этом случае полисахарид в комбинированном полисахарид-белковом конъюгате становится более иммуногенным, чем в свободном состоянии. Белки-носители содержат T-клеточные эпитопы для стимуляции помощи T-клеток в вызывании иммунных ответов в виде продуцирования антител.

Используемый в настоящем описании термин «белок-носитель», или «белковый носитель», означает любую белковую молекулу, которая может быть конъюгирована с антигеном (таким как капсульные полисахариды), против которого желателен иммунный ответ. Конъюгация антигена, такого как полисахарид, с белком-носителем может придавать антигену иммуногенность. Белки-носители предпочтительно представляют собой белки, которые являются нетоксичными, не реакционноспособными, и которые можно получать в достаточном количестве и достаточно чистом состоянии. Примерами белков-носителей являются токсины, токсоиды или любой мутантный перекрестно реагирующий материал (CRM₁₉₇) токсина столбняка, дифтерии, коклюша, токсина из вида Pseudomonas, E. coli, вида Staphylococcus и вида Streptococcus. Белки-носители должны поддаваться стандартным процедурам конъюгации. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве белка-носителя используют CRM₁₉₇.

Перекрестно реагирующие материалы, или CRM, являются особенно полезными в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения. Могут быть получены генетически измененные белки, которые по антигенности аналогичны некоторым бактериальным токсинам, однако не являются токсичными. Их называют «перекрестно реагирующими материалами», или CRM. Следует упомянуть CRM₁₉₇ (Wyeth/Pfizer Inc., Sanford, NC), поскольку он имеет одну измененную аминокислоту в сравнении с природным дифтерийным токсином и иммунологически не отличим от него. Смотри Pappenheimer, A.M., et al., Immunochem., 9(9):891-906 (1972); патент США № 5614382, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичный вариант (то есть, токсоид) дифтерийного токсина, выделенный из культур Corynebacterium diphtheriae штамма C7 (β197), растущих в среде на основе кас аминокислот и дрожжевого экстракта. CRM₁₉₇ очищают методами ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. Культура C. diphtheriae штамма C7 (β197), продуцирующего белок CRM₁₉₇, была депонирована в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Maryland, и ей был присвоен регистрационный номер ATCC 53281. Другие дифтерийные токсоиды также подходят для использования в качестве белков-носителей. CRM3201 представляет собой генетически модифицированный вариант токсина коклюша. Смотри публикацию Black, W.J., et al., Science, 240(4852):656-659 (1988), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

Помимо дифтерийного токсоида (DT), CRM₁₉₇ и токсоида коклюша, дополнительные примеры белков-носителей включают токсоид столбняка (TT), холерный токсоид (например, описанный в публикации международной патентной заявки № WO 2004/083251), термолабильный токсоид (LT) E. coli, термостабильный токсоид (ST) E. coli, пневмолизин из S. pneumonia (дикого типа или мутант с пониженной токсичностью), пневмококковый поверхностный белок A (PspA), пневмококковый адгезин белок A (PsaA), C5a пептидазу из Streptococcus, гемолизин из Staphylococcal aureus, белки нетипируемого штамма Haemophilus influenzae (NTHi), белок D Haemophilus influenzae, экзотоксины/токсоиды Clostridium perfringens, поверхностный антиген вируса гепатита B, коровый антиген вируса гепатита B, белок VP7 ротавируса и белки F и G респираторно-синцитиального вируса, овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA), очищенный белок, производный от туберкулина (PPD), а также экзотоксин Pseudomonas или его производные, включая рекомбинантно продуцируемый нетоксичный мутантный экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa. Также могут быть использованы белки наружной мембраны бактерий, такие как белковый комплекс c наружной мембраны (OMPC), порины, трансферрин-связывающие белки или энтеротоксин (токсин A) и цитотоксин (токсин B) C. difficile. Другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенный белок, производный от туберкулина (PPD), также могут быть использованы в качестве белков-носителей. В предпочтительном варианте осуществления белок-носитель представляет собой дифтерийный токсоид. Более предпочтительно, белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇. В другом варианте осуществления изобретения белок-носитель представляет собой токсоид столбняка.

Для создания поливалентной конъюгатной иммуногенной композиции полисахарид-белковые конъюгаты можно получать путем конъюгации смеси полисахаридов, очищенных из бактерий двух разных видов, с белком-носителем. Альтернативно, поливалентную конъюгатную иммуногенную композицию можно получать путем объединения полисахаридов, очищенных из бактерий двух или более разных серотипов одного и того же вида бактерий, и конъюгации их в виде смеси с белком-носителем. Альтернативно, можно смешивать полисахарид-белковые конъюгаты, полученные в результате отдельных реакций полисахаридов нескольких видов с белком-носителем. Таким образом, поливалентная иммуногенная композиция может содержать белок-носитель, несущий гомогенную или гетерогенную популяцию связанных полисахаридов.

После конъюгации капсульного полисахарида с белком-носителем полисахарид-белковые конъюгаты очищают (обогащают в отношении количества полисахарид-белкового конъюгата) различными методами. Эти методы включают, например, процедуры концентрации/диафильтрации, осаждения/элюции, хроматографии на колонке и глубинной фильтрации.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим капсульные полисахариды GBS, конъюгированные с белками-носителями. Один вариант осуществления изобретения относится к конъюгатам, содержащим капсульный полисахарид серотипа IV GBS, конъюгированный с белком-носителем, и по меньшей мере одному дополнительному конъюгату, содержащему капсульный полисахарид серотипа Ia GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа Ib GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа II GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа III GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа V GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа VI GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа VII GBS, конъюгированный с белком-носителем, капсульный полисахарид серотипа VIII GBS, конъюгированный с белком-носителем, или капсульный полисахарид серотипа IX GBS, конъюгированный с белком-носителем. В одном аспекте изобретения полисахариды имеют молекулярную массу от приблизительно 5 кДа до 1000 кДа; конъюгаты имеют молекулярную массу от приблизительно 300 кДа до приблизительно 20000 кДа, и конъюгаты содержат менее приблизительно 40% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида. В одном варианте осуществления конъюгаты содержат менее приблизительно 30%, менее приблизительно 25%, менее приблизительно 20%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 10% или менее приблизительно 5% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида.

В одном варианте осуществления полисахарид серотипа Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и/или IX имеет молекулярную массу до конъюгации от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 250 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 350 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа и 750 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 750 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 550 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 450 кДа, от приблизительно 250 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа и 750 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 650 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 600 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 550 кДа или от приблизительно 300 кДа до приблизительно 500 кДа. Любое целое число в любом из вышеуказанных диапазонов предусмотрено в качестве варианта осуществления изобретения.

В одном варианте осуществления конъюгат имеет молекулярную массу от приблизительно 300 кДа до приблизительно 20000 кДа, например, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 5000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 4000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 3000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 2000 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 1000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 5000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 4000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 3000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 2000 кДа, от приблизительно 500 кДа до приблизительно 1000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 5000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 1500 кДа до приблизительно 5000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 7000 кДа, от приблизительно 2500 кДа до приблизительно 6000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 20000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 15000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 10000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 9000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 8000 кДа, от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 7000 кДа или от приблизительно 3000 кДа до приблизительно 6000 кДа.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IV GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ia GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ib GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа II GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа III GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа V GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VI GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VII GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VIII GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IX GBS имеет молекулярную массу в любом из приведенных выше диапазонов.

В одном варианте осуществления конъюгаты по изобретению имеют по меньшей мере приблизительно 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 0,97 или 0,98 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида. В предпочтительном варианте осуществления конъюгаты имеют по меньшей мере приблизительно 0,9 или 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IV GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ia GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ib GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа II GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа III GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа V GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VI GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VII GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VIII GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IX GBS имеет содержание сиаловой кислоты, соответствующее по меньшей мере любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат по изобретению содержит менее приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 или 0,05 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы. В другом варианте осуществления конъюгат содержит по меньшей мере приблизительно 0,1, 0,2, 0,3, 0,35 или приблизительно 0,4 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IV GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ia GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа Ib GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа II GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа III GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа V GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VI GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VII GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа VIII GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В одном из вариантов осуществления конъюгат капсульного полисахарида серотипа IX GBS имеет содержание O-ацетата, соответствующее любому из вышеприведенных значений.

В следующем варианте осуществления иммуногенный конъюгат содержит менее приблизительно 40%, менее приблизительно 35%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 25%, менее приблизительно 20%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 10% или менее приблизительно 5% свободного капсульного полисахарида GBS в сравнении с общим количеством капсульного полисахарида GBS. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенный конъюгат содержит менее приблизительно 5% непрореагировавшего свободного сахарида в сравнении с общим количеством капсульного полисахарида GBS.

В другом варианте осуществления соотношение (по массе) капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0. В одном аспекте соотношение капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0, от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,5 или от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0. В предпочтительном варианте осуществления соотношение капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,0.

В другом варианте осуществления степень конъюгации конъюгата составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном варианте осуществления степень конъюгации конъюгата составляет от 2 до 5.

Конъюгация

Конъюгация может быть непосредственной, когда атомы полисахарида ковалентно связаны с атомами поверхности белка. Альтернативно, конъюгация может происходить через молекулу линкера, которая реагирует как с полисахаридом, так и с белком, и соединяет их, связывая углевод с белком.

При конъюгации (то есть ковалентном связывании) носителя и одного или более антигенов, таких как полисахарид, конъюгацию можно выполнять любым химическим методом, способом или генетическим методом, известным в данной области. Например, полипептид носителя и один или более антигенов, выбранных из группы, включающей углевод, олигосахарид, липид, липоолигосахарид, полисахарид, олигосахарид-белковый конъюгат, полисахарид-белковый конъюгат, пептид-белковый конъюгат, олигосахарид-пептидный конъюгат, полисахарид-пептидный конъюгат, белок-белковый конъюгат, липоолигосахарид-белковый конъюгат, полисахарид-белковый конъюгат, или любое их сочетание, могут быть конъюгированы методами, включая, но без ограничения: (1) прямое связывание через функциональные группы белка (например, тиол-тиоловая связь, амин-карбоксильная связь, амин-альдегидная связь; ферментативное прямое связывание); (2) гомобифункциональное связывание аминов (например, с использованием бис-альдегидов); (3) гомобифункциональное связывание тиолов (например, с использованием бис-малеинимидов); (4) гомобифункциональное связывание при помощи фотоактивируемых реагентов; (5) гетеробифункциональное связывание аминов с тиолами (например, с использованием малеинимидов); (6) гетеробифункциональное связывание при помощи фотоактивируемых реагентов (например, семейства β-карбонилдиазо); (7) введение амино-реактивных групп в поли- или олигосахарид путем активации цианогенбромидом или карбоксиметилирования; (8) введение тиол-реактивных групп в поли- или олигосахарид при помощи гетеробифункционального соединения, такого как малеимидо-гидразид; (9) белок-липидную конъюгацию за счет введения гидрофобной группы в белок и (10) белок-липидную конъюгацию за счет введения реакционноспособной группы в липид. Кроме того, также предусмотрены методы гетеробифункционального «нековалентного связывания», например, за счет взаимодействия биотин-авидин. Другие хорошо известные в данной области способы осуществления конъюгации олигосахаридов и полисахаридов с иммуногенными белками-носителями также входят в объем некоторых вариантов осуществления изобретения.

В одном из вариантов осуществления GBS капсульный полисахарид-белковые конъюгаты получают путем активации полисахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP), с получением сложного эфира цианата. Активированный полисахарид может быть связан непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин, или цистеамин, с получением тиолированного полисахарида, который может быть связан с носителем тиоэфирной связью, образовавшейся после реакции с активированным малеимидом белком-носителем (например, с использованием GMBS) или галогенацетилированным белком-носителем (например, с использованием иодацетимида, SIB, SIAB, сульфо-SIAB, SIA или SBAP).

В одном аспекте сложный эфир цианат (необязательно, полученный с использованием CDAP химии) связывают с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC или EDC) химии через карбоксильную группу на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны, например, в публикациях международных патентных заявок №№ WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/29094.

В других подходящих методах используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S--NHS, EDC и TSTU. Многие из них описаны в публикации международной патентной заявки № WO 98/42721. При конъюгации может быть использован карбонильный линкер, который может быть образован в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с 1,1-карбонилдиимидазолом (CDI) или 1,1-карбонилди-1,2,4-триазолом (CDT) (смотри Bethell, et al., J. Biol. Chem., 254:2572-2574 (1979); Hearn, et al., J. Chromatogr., 218:509-518 (1981)), с последующей реакцией с белком для образования карбаматной связи. Это может включать восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, необязательно, защиту/снятие защиты для первичной гидроксильной группы, реакцию первичной гидроксильной группы с CDI/CDT, с образованием CDI/CDT карбаматного промежуточного соединения, и связывание CDI/CDT карбаматного промежуточного соединения с аминогруппой на белке.

В предпочтительных вариантах осуществления GBS капсульный полисахарид-белковые конъюгаты по изобретению получают с использованием восстановительного аминирования. Восстановительное аминирование включает два этапа: (1) окисление полисахарида, с получением альдегидных функциональных групп из присоединенных к соседним атомам диолов в отдельной гексасахаридной единице и (2) восстановление активированного полисахарида и белка-носителя, с образованием конъюгата.

В одном из вариантов осуществления капсульный полисахарид GBS активируют (окисляют) методом, включающим стадии:

(a) проведения реакции выделенного капсульного полисахарида GBS с окислителем; и

(b) гашения реакции окисления путем добавления гасителя, с получением активированного капсульного полисахарида GBS.

В одном из аспектов изобретения концентрация выделенного капсульного полисахарида составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10,0 мг/мл, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 5,0 мг/мл, от приблизительно 1,0 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл или приблизительно 2,0 мг/мл.

В конкретном варианте осуществления окислитель представляет собой периодат. Периодат окисляет присоединенные к соседним атомам гидроксильные группы, с образованием карбонильных или альдегидных групп, и вызывает расщепление C-C связи. Термин «периодат» включает как периодат, так и йодную кислоту. Этот термин также включает как метапериодат (IO₄^-), так и ортопериодат (IO₆^5-). Термин «периодат» также включает различные периодатные соли, в том числе периодат натрия и периодат калия. В предпочтительном варианте осуществления окислитель представляет собой периодат натрия. В предпочтительном варианте осуществления периодат, используемый для окисления капсульных полисахаридов GBS, представляет собой метапериодат. В предпочтительном варианте осуществления периодат, используемый для окисления капсульного полисахарида серотипа, представляет собой метапериодат натрия.

В другом варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с 0,01-10,0, 0,05-5,0, 0,1-1,0, 0,5-1,0, 0,7-0,8, 0,05-0,5 или 0,1-0,3 молярными эквивалентами окислителя. В конкретном варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,05, приблизительно 0,1, приблизительно 0,15, приблизительно 0,2, приблизительно 0,25, приблизительно 0,3, приблизительно 0,35, приблизительно 0,4, приблизительно 0,45, приблизительно 0,5, приблизительно 0,55, приблизительно 0,6, приблизительно 0,65, приблизительно 0,7, приблизительно 0,75, приблизительно 0,8, приблизительно 0,85, приблизительно 0,9 или приблизительно 0,95 молярными эквивалентами окислителя. В следующем варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,1 молярными эквивалентами окислителя. В следующем варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,15 молярными эквивалентами окислителя. В дополнительном варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,25 молярными эквивалентами окислителя. В другом варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,5 молярными эквивалентами окислителя. В альтернативном варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,6 молярными эквивалентами окислителя. В следующем варианте осуществления полисахарид вступает в реакцию с приблизительно 0,7 молярными эквивалентами окислителя.

В одном аспекте изобретения продолжительность реакции окисления составляет от приблизительно 1 часа до приблизительно 50 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 30 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 20 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 17 часов или приблизительно 16 часов.

В другом аспекте изобретения температуру реакции окисления поддерживают на уровне от приблизительно 2°C до приблизительно 25°C, от приблизительно 2°C до приблизительно 8°C или от приблизительно 20°C до приблизительно 25°C. В одном предпочтительном варианте осуществления температуру реакции окисления поддерживают на уровне приблизительно 23°C. В другом предпочтительном варианте осуществления температуру реакции окисления поддерживают на уровне приблизительно 5°C.

В следующем аспекте реакцию окисления проводят в буфере, выбранном из группы, состоящей из фосфата натрия, фосфата калия, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и Bis-Tris. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой фосфат калия.

В дополнительном аспекте буфер имеет концентрацию от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 300 мМ или от приблизительно 50 мМ до приблизительно 200 мМ. В предпочтительном варианте осуществления буфер имеет концентрацию приблизительно 100 мМ.

В одном аспекте реакцию окисления проводят при значении pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5. В предпочтительном варианте осуществления значение pH составляет приблизительно 6,0.

В одном варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS получают путем проведения реакции выделенного капсульного полисахарида в концентрации от приблизительно 0,5 мг/л до приблизительно 5,0 мг/мл с приблизительно 0,05-0,3 молярными эквивалентами периодата при температуре от приблизительно 20°C до 25°C.

В другом варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS получают путем проведения реакции выделенного капсульного полисахарида в концентрации от приблизительно 0,5 мг/л до приблизительно 5,0 мг/мл с приблизительно 0,05-0,3 молярными эквивалентами периодата при температуре от приблизительно 2°C до приблизительно 8°C.

В другом варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS очищают методами, известными специалисту в данной области, такими как гель-проникающая хроматография (GPC), диализ или ультрафильтрация/диафильтрация. Например, активированный капсульный полисахарид очищают путем концентрирования и диафильтрации с использованием устройства для ультрафильтрации.

В одном варианте осуществления степень окисления активированного капсульного полисахарида GBS составляет от 5 до 25, например, от 5 до 15, от 5 до 10, от 10 до 25, от 10 до 20, от 10 до 15. В предпочтительном варианте осуществления степень окисления активированного капсульного полисахарида GBS составляет от 10 до 20, от 11 до 19, от 12 до 18, от 13 до 17, или от 14 до 16.

В другом варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS имеет молекулярную массу от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа, например, от приблизительно 50 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 75 кДа до приблизительно 200 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 700 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 500 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 100 кДа до приблизительно 300 кДа, от приблизительно 200 кДа до приблизительно 400 кДа, от приблизительно 300 кДа до приблизительно 700 кДа. В предпочтительном варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS имеет молекулярную массу от приблизительно 75 кДа до приблизительно 400 кДа.

В одном из вариантов осуществления активированный капсульный полисахарид GBS является лиофилизированным, необязательно, в присутствии сахарида. В предпочтительном варианте осуществления сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления сахарид представляет собой сахарозу. Лиофилизированный активированный капсульный полисахарид затем может быть объединен с раствором, содержащим белок-носитель.

В другом варианте осуществления активированный капсульный полисахарид GBS объединяют с белком-носителем и лиофилизируют, необязательно, в присутствии сахарида. В одном аспекте сахарид выбирают из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита. В предпочтительном варианте осуществления сахарид представляет собой сахарозу. Совместно лиофилизированные полисахарид и белок-носитель затем могут быть ресуспендированы в растворе и вступать в реакцию с восстановителем.

Активированный капсульный полисахарид GBS можно конъюгировать с белком-носителем методом, включающим стадии:

(a) объединения активированного капсульного полисахарида GBS с белком-носителем, и

(b) проведения реакции объединенных активированного капсульного полисахарида GBS и белка-носителя с восстановителем для получения конъюгата GBS капсульный полисахарид-белок-носитель.

Конъюгация активированного капсульного полисахарида GBS с белковым носителем путем восстановительного аминирования в полярном апротонном растворителе является подходящей для поддержания низких уровней свободного полисахарида, в сравнении, например, с восстановительным аминированием в водном растворе, когда уровень непрореагировавшего (свободного) полисахарида значительно повышен. В предпочтительном варианте осуществления этап (a) и этап (b) выполняют в полярном апротонном растворителе.

В одном варианте осуществления этап (a) включает растворение лиофилизированного капсульного полисахарида GBS в растворе, содержащем белок-носитель и полярный апротонный растворитель. В другом варианте осуществления этап (a) включает растворение совместно лиофилизированных капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в полярном апротонном растворителе.

В одном варианте осуществления полярный апротонный растворитель выбирают из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), сульфолана, диметилформамида (DMF) и гексаметилфосфорамида (HMPA). В предпочтительном варианте осуществления полярный апротонный растворитель представляет собой DMSO.

Если стадии (a) и (b) выполняют в водном растворе, стадии (a) и (b) выполняют в буфере в водной среде, предпочтительно выбранном из PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES, MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, бицина или HEPB со значением pH от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0 или от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой PBS. В предпочтительном варианте осуществления значение pH составляет приблизительно 7,3.

В одном варианте осуществления концентрация активированного капсульного полисахарида GBS на стадии (b) составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10,0 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 5,0 мг/мл или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 2,0 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления концентрация активированного капсульного полисахарида серотипа GBS на стадии (b) составляет приблизительно 0,1 мг/мл, приблизительно 0,2 мг/мл, приблизительно 0,3 мг/мл, приблизительно 0,4 мг/мл, приблизительно 0,5 мг/мл, приблизительно 0,6 мг/мл, приблизительно 0,7 мг/мл, приблизительно 0,8 мг/мл, приблизительно 0,9 мг/мл, приблизительно 1,0 мг/мл, приблизительно 1,1 мг/мл, приблизительно 1,2 мг/мл, приблизительно 1,3 мг/мл, приблизительно 1,4 мг/мл, приблизительно 1,5 мг/мл, приблизительно 1,6 мг/мл, приблизительно 1,7 мг/мл, приблизительно 1,8 мг/мл, приблизительно 1,9 мг/мл, приблизительно 2,0 мг/мл, приблизительно 2,1 мг/мл, приблизительно 2,2, приблизительно 2,3 мг/мл, приблизительно 2,4 мг/мл, приблизительно 2,5 мг/мл, приблизительно 2,6 мг/мл, приблизительно 2,7 мг/мл, приблизительно 2,8 мг/мл, приблизительно 2,9 мг/мл или приблизительно 3,0 мг/мл.

В предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение (по массе) активированного капсульного полисахарида серотипа GBS и белка-носителя составляет от 5:1 до 0,1:1, от 2:1 до 0,1:1, от 2:1 до 1:1, от 1,5:1 до 1:1, от 0,1:1 до 1:1, от 0,3:1 до 1:1, от 0,6:1 до 1:1. В предпочтительном варианте осуществления начальное соотношение активированного капсульного полисахарида серотипа GBS и белка-носителя составляет приблизительно 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, 2:1.

В одном из вариантов осуществления восстановитель представляет собой цианоборгидрид натрия, триацетоксиборгидрид натрия, боргидрид натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, амин-бораны, такие как пиридин-боран, 2-пиколин-боран, 2,6-диборан-метанол, диметиламин-боран, трет-BuMeⁱPrN-BH₃, бензиламин-BH₃ или 5-этил-2-метилпиридин-боран (PEMB). В предпочтительном варианте осуществления восстановитель представляет собой цианоборгидрид натрия.

В другом варианте осуществления количество восстановителя, используемого на стадии (b), составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0 молярных эквивалентов, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0 молярных эквивалентов или от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления количество восстановителя, используемого на стадии (b), составляет приблизительно 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 молярных эквивалента.

В предпочтительном варианте осуществления продолжительность этапа (b) составляет от 1 часа до 60 часов, от 10 часов до 50 часов, от 40 часов до 50 часов или от 42 часов до 46 часов. В предпочтительном варианте осуществления продолжительность этапа (b) составляет приблизительно 44 часа.

В следующем варианте осуществления температуру реакции на стадии (b) поддерживают на уровне от 10°C до 40°C, от 15°C до 30°C или от 20°C до 26°C. В предпочтительном варианте осуществления температуру реакции на стадии (b) поддерживают на уровне приблизительно 23°C.

В дополнительном варианте осуществления способ получения иммуногенного конъюгата, содержащего капсульный полисахарид GBS, ковалентно связанный с белком-носителем, дополнительно включает этап (этап (c)) кэппирования непрореагировавших альдегидов (гашения) путем добавления боргидрида.

В одном варианте осуществления кэппирующий реагент представляет собой боргидрид, выбранный из группы, состоящей из боргидрида натрия (NaBH₄), цианоборгидрида натрия, боргидрида лития, боргидрида калия, боргидрида тетрабутиламмония, боргидрида кальция и боргидрида магния. В предпочтительном варианте осуществления кэппирующий реагент представляет собой боргидрид натрия.

В другом варианте осуществления количество боргидрида, используемого на стадии (c), составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0 молярных эквивалентов, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0 молярных эквивалентов или от приблизительно 1,0 до 3,0 молярных эквивалентов. В предпочтительном варианте осуществления количество боргидрида, используемого на стадии (c), составляет приблизительно 2,0 молярных эквивалента.

В одном предпочтительном варианте осуществления боргидрид, используемый на стадии (c), представляет собой NaBH₄ в концентрации приблизительно 2,0 молярных эквивалента.

В одном варианте осуществления продолжительность этапа (c) составляет от 0,1 часа до 10 часов, от 0,5 часа до 5 часов, от 2 часов до 4 часов. В предпочтительном варианте осуществления продолжительность этапа (c) составляет приблизительно 3 часа.

В другом варианте осуществления температуру реакции на стадии (c) поддерживают на уровне от приблизительно 15°C до приблизительно 45°C, от приблизительно 15°C до приблизительно 30°C или от приблизительно 20°C до приблизительно 26°C. В предпочтительном варианте осуществления температуру реакции на стадии (c) поддерживают на уровне приблизительно 23°C.

После конъюгации капсульного полисахарида GBS с белком-носителем и кэппирования полисахарид-белковый конъюгат может быть очищен (обогащен в отношении количества полисахарид-белкового конъюгата) различными методами, известными квалифицированному специалисту. Эти методы включают диализ, процедуры концентрирования/диафильтрации, проточную фильтрацию вдоль потока, осаждение/элюцию, хроматографию на колонке (хроматографию на DEAE или хроматографию гидрофобного взаимодействия) и глубинную фильтрацию.

В следующем варианте осуществления иммуногенный конъюгат содержит менее приблизительно 40%, менее приблизительно 35%, менее приблизительно 30%, менее приблизительно 25%, менее приблизительно 20%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 10% или менее приблизительно 5% свободного капсульного полисахарида GBS в сравнении с общим количеством капсульного полисахарида GBS. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенный конъюгат содержит менее приблизительно 5% непрореагировавшего свободного сахарида в сравнении с общим количеством капсульного полисахарида GBS.

В предпочтительном варианте осуществления GBS полисахарид-белковый конъюгат имеет молекулярную массу от приблизительно 300 кДа до приблизительно 20000 кДа, например, от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 15000 кДа или от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 10000 кДа.

В другом варианте осуществления соотношение (по массе) капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0. В одном аспекте соотношение капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,5, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0, от приблизительно 1,0 до приблизительно 1,5 или от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0. В предпочтительном варианте осуществления соотношение капсульного полисахарида GBS и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,0.

В другом варианте осуществления степень конъюгации конъюгата составляет от 2 до 15, от 2 до 13, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4, от 3 до 15, от 3 до 13, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5, от 3 до 4, от 5 до 15, от 5 до 10, от 8 до 15, от 8 до 12, от 10 до 15 или от 10 до 12. В предпочтительном варианте осуществления степень конъюгации конъюгата составляет от 2 до 5.

В одном аспекте изобретения GBS капсульный полисахарид-белковые конъюгаты получают методом восстановительного аминирования, описанным выше. Например, в одном аспекте настоящее изобретение относится к GBS капсульный полисахарид-белковому конъюгату, содержащему полисахарид, конъюгированный с белком-носителем, который получен, или может быть получен, способом, включающим стадии:

(a) проведения реакции выделенного капсульного полисахарида GBS с окислителем;

(b) гашения реакции окисления путем добавления гасителя, с получением активированного капсульного полисахарида GBS;

(c) объединения активированного капсульного полисахарида GBS с белком-носителем,

(d) проведения реакции объединенных активированного капсульного полисахарида GBS и белка-носителя с восстановителем, с получением конъюгата капсульного полисахарида GBS и белка-носителя и, необязательно,

(e) кэппирования непрореагировавшего альдегида путем добавления боргидрида натрия (NaBH₄).

В предпочтительном варианте осуществления стадии (c) и (d) выполняют в DMSO.

В другом аспекте изобретения GBS капсульный полисахарид-белковые конъюгаты по изобретению получают методом восстановительного аминирования, описанным выше, но со свободным радикалом 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в качестве coокислителя на стадии активации/окисления. Смотри публикацию международной патентной заявки № WO 2014/097099, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В таком варианте осуществления гликоконъюгаты из капсульных полисахаридов GBS получают с использованием свободного радикала TEMPO для окисления первичных спиртов сахарида до альдегидов с использованием NCS в качестве coокислителя (далее в настоящем описании «TEMPO/NCS окисление»), например, как описано в примере 7 и в публикации международной патентной заявки № WO 2014/097099. Таким образом, в одном аспекте конъюгаты капсульных полисахаридов GBS можно получать способом, включающим стадии: a) проведения реакции капсульного полисахарида GBS с TEMPO и NCS в растворителе, с получением активированного сахарида; и b) проведения реакции активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогрупп (далее в настоящем описании «TEMPO/NCS-восстановительное аминирование»). В одном варианте осуществления растворитель может представлять собой водный растворитель или DMSO.

В одном аспекте GBS капсульный полисахарид-белковые конъюгаты можно получать указанным способом. Например, в одном аспекте настоящее изобретение относится к GBS капсульный полисахарид-белковому конъюгату, содержащему полисахарид, конъюгированный с белком-носителем, который получен, или может быть получен, способом, включающим стадии: a) проведения реакции сахарида с 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (TEMPO) и N-хлорсукцинимидом (NCS) в растворителе, с получением активированного сахарида; и b) проведения реакции активированного сахарида с белком-носителем, содержащим одну или более аминогрупп. В одном варианте осуществления растворитель может представлять собой водный растворитель или DMSO.

Иммуногенные композиции

После очистки отдельных конъюгатов их можно комбинировать для формулирования иммуногенной композиции по настоящему изобретению, которую можно использовать, например, в вакцине. Формулирование иммуногенной композиции по настоящему изобретению можно выполнять с использованием признанных в данной области способов.

«Иммунный ответ» на иммуногенную композицию представляет собой развитие у пациента гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в интересующей композиции (например, антиген, такой как белок или полисахарид). Для целей настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» представляет собой иммунный ответ, опосредованный антителами, и включает выработку антител с аффинностью для антигенов, присутствующих в иммуногенных композициях по изобретению, в то время как «клеточный иммунный ответ» представляет собой иммунный ответ, опосредованный T-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови. «Клеточный иммунный ответ» инициируется в результате представления антигенных эпитопов в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II. Это приводит к активации антиген-специфических CD4+ T-хелперов или CD8+ цитотоксических T-лимфоцитов (CTL). CTL обладают специфичностью для пептидных или липидных антигенов, которые представлены в ассоциации с белками, закодированными MHC или CD1, и экспрессированными на поверхности клеток. CTL способствуют индукции и стимуляции внутриклеточного уничтожения внутриклеточных микробов, или лизиса клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ T-хелперов. T-хелперы способствуют стимуляции функции, и направлению активности, неспецифических эффекторных клеток против клеток, на поверхности которых экспонированы пептидные антигены в ассоциации с классическими или не классическими молекулами MHC. «Клеточный иммунный ответ» также означает продуцирование цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными T-клетками и/или другими белыми клетками крови, включая те, которые продуцируют CD4+ и CD8+ T-клетки. Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточный иммунный ответ можно определять в ряде анализов, например, в анализах лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализах с цитотоксическими клетками CTL, анализах T-лимфоцитов, специфических для антигена, у сенсибилизированного пациента, или путем измерения продуцирования цитокинов T-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие анализы хорошо известны в данной области. Смотри, например, Erickson, A.L., et al., J. Immunol., 151(8):4189-4199 (1993); Doe, B., et al., Eur. J. Immunol. 24(10):2369-2376 (1994).

Термин «иммуногенные» означает способность антигена или вакцины вызывать иммунный ответ, или гуморальный, или клеточный, либо и тот, и другой.

Термины «иммуногенное количество» или «иммунологически эффективное количество», или «доза», которые в настоящем описании используют взаимозаменяемо, как правило, означают количество антигена или иммуногенной композиции, достаточное для вызывания иммунного ответа, или клеточного (T-клеточного), или гуморального (B-клеточного или продуцирования антител) ответа, либо и того, и другого, при измерении в стандартных анализах, известных специалисту в данной области.

Используемый в настоящем описании термин «иммунная интерференция» или «значительная иммунная интерференция» означает статистически значимое уменьшение иммунного ответа на отдельный антиген в поливалентной или многокомпонентной вакцине, в сравнении с иммунным ответом на тот же антиген в случае введения в одновалентной вакцине.

«Защитный иммунный ответ» означает способность иммуногенной композиции вызывать иммунный ответ, или гуморальный, или клеточный, который защищает пациента от инфекции. Обеспечиваемая защита не обязательно должна быть абсолютной, то есть, инфекция не обязательно должна быть полностью предотвращена или устранена, если имеет место статистически значимое улучшение в сравнении с контрольной популяцией пациентов, например, инфицированных животных, которым не вводили вакцину или иммуногенную композицию. Защита может быть ограничена уменьшением степени тяжести или скорости развития симптомов инфекции. Несколько анализов известно в данной области для определения того, является ли иммунный ответ «защитным иммунным ответом». Например, увеличение уровней антител можно определять в анализе связывания, таком как клеточный анализ ELISA, описанный ниже. Другие анализы включают измерение ответов в виде продуцирования функциональных антител, например, способствующих уничтожению бактерий, что можно тестировать в анализе опсонофагоцитоза (OPA), описанном ниже. В конкретных ситуациях «защитный иммунный ответ» может включать индукцию двукратного увеличения уровней антител или четырехкратного увеличения уровней антител, специфических для конкретного антигена, у по меньшей мере 50% пациентов. В другой ситуации «защитный иммунный ответ» может включать уменьшение количества бактерий на по меньшей мере 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более.

Количество конкретного конъюгата в композиции, как правило, рассчитывают на основании общего количества полисахарида, конъюгированного и не конъюгированного, для данного конъюгата. Например, конъюгат капсульного полисахарида GBS с 20% свободного полисахарида будет содержать приблизительно 80 мкг/мл конъюгированного капсульного полисахарида GBS и приблизительно 20 мкг/мл не конъюгированного капсульного полисахарида GBS в дозе 100 мкг/мл капсульного полисахарида GBS. Вклад белкового носителя в конъюгат, как правило, не учитывают при расчете дозы конъюгата. Количество конъюгата может варьироваться в зависимости от серотипа стрептококков. Как правило, каждая доза будет содержать от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 100 мкг/мл каждого полисахарида, в частности, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 70 мкг/мл, и более конкретно, от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. «Иммуногенное количество» разных полисахаридных компонентов в иммуногенной композиции может отличаться, и в каждом случае может составлять приблизительно 0,01 мкг/мл, приблизительно 0,1 мкг/мл, приблизительно 0,25 мкг/мл, приблизительно 0,5 мкг/мл, приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 7 мкг/мл, приблизительно 8 мкг/мл, приблизительно 9 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 15 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 25 мкг/мл, приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 70 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 90 мкг/мл или приблизительно 100 мкг/мл конкретного полисахаридного антигена. Доза, или иммуногенное количество, поливалентной иммуногенной композиции будет показателем дозы каждого полисахарида, если нет иных указаний. Например, доза 10 мкг/мл для шестивалентной иммуногенной композиции будет включать 10 мкг/мл каждого из шести полисахаридов, общую дозу 60 мкг/мл антигена или конъюгата.

В одном аспекте изобретения общая доза конъюгата составляет по меньшей мере приблизительно 60 мкг/мл, например, по меньшей мере приблизительно 120 мкг/мл или по меньшей мере приблизительно 240 мкг/мл. В одном варианте осуществления общая доза конъюгата составляет от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 600 мкг/мл, например, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 540 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 480 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 420 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 300 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 240 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 180 мкг/мл, от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 120 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 600 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 540 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 480 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 420 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 300 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 240 мкг/мл, от приблизительно 120 мкг/мл до приблизительно 180 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 600 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 540 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 480 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 420 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 300 мкг/мл, от приблизительно 180 мкг/мл до приблизительно 240 мкг/мл, от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 600 мкг/мл, от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 540 мкг/мл, от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 480 мкг/мл, от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 420 мкг/мл, от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл или от приблизительно 240 мкг/мл до приблизительно 300 мкг/мл. В предпочтительном варианте осуществления общая доза конъюгата составляет от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, и наиболее предпочтительно от приблизительно 120 мг/мл до приблизительно 240 мкг/мл.

Эффективность антигена в качестве иммуногена можно определять, измеряя уровни B-клеточной активности путем измерения уровней циркулирующих антител, специфических для антигена, в сыворотке с использованием иммунологических анализов, анализов иммунопреципитации, анализов на функциональные антитела, таких как in vitro анализ опсонической активности, и используя множество других анализов, известных в данной области. Другой показатель эффективности антигена в качестве T-клеточного иммуногена можно определять в анализах пролиферации, в анализах цитолитической активности, таких как анализы с высвобождением хрома, для измерения способности T-клеток лизировать их специфические клетки-мишени. Кроме того, в настоящем изобретении «иммуногенное количество» также можно определять путем измерения сывороточных уровней специфических для антигена антител, индуцированных после введения антигена, или путем измерения способности индуцированных таким образом антител усиливать опсонофагоцитарную активность конкретных белых клеток крови, как описано в настоящем описании. Уровень защиты в результате иммунного ответа можно определять путем провокационного введения иммунизированному хозяину антигена, который был ему инъецирован. Например, если антиген, на который желателен иммунный ответ, представляет собой бактерию, уровень защиты, индуцированный «иммуногенным количеством» антигена, можно измерять путем определения выживаемости, в процентах, или смертности, в процентах, после провокационного введения животным бактериальных клеток. В одном варианте осуществления степень защиты можно определять путем количественного определения по меньшей мере одного симптома, связанного с бактериальной инфекцией, например, лихорадки, связанной с инфекцией. Количество каждого из антигенов в полиантигенной или многокомпонентной вакцине, или иммуногенных композициях, будет варьироваться относительно каждого из других компонентов и может быть определено способами, известными квалифицированному специалисту. Такие способы будут включать, например, измерение иммуногенности и/или in vivo эффективности.

Термин «иммуногенная композиция» означает любую фармацевтическую композицию, содержащую антиген, например, микроорганизм, или его компонент, которую можно использовать для вызывания иммунного ответа у пациента. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения человека, восприимчивого к инфекции, вызываемой GBS, путем введения иммуногенных композиций системным, чрескожным или мукозальным путем введения. Такие способы введения могут включать внутримышечную (в/м), внутрибрюшинную (в/б), внутрикожную (в/к) или подкожную инъекцию; нанесение с помощью пластыря или другого устройства для чрескожной доставки; или мукозальное введение в ротовую полость/пищеварительную систему, дыхательные или мочеполовые пути. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция может быть использована для производства вакцины или индукции поликлональных, или моноклональных, антител, которые могут быть использованы для пассивной защиты или лечения животного.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим эффективное количество по меньшей мере одного полисахарида, олигосахарида, полисахарид-белкового конъюгата или их биологического эквивалента, описанных в настоящем описании. Например, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем капсульный полисахарид выбирают из группы, состоящей из капсульных полисахаридов стрептококков группы B серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX, и при этом капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%. В другом примере иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа выбранного из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипа IV и по меньшей мере двух дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипа IV и по меньшей мере трех дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В следующем варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипа IV и по меньшей мере четырех дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипов Ia, Ib, II, III и V. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипов Ia, Ib, II, III и IV. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококков группы B серотипа IV и по меньшей мере пяти дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В одном таком варианте осуществления иммуногенная композиция содержит шесть полисахарид-белковых конъюгатов, причем конъюгаты содержат капсульный полисахарид из стрептококков группы B серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V.

В одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция по изобретению содержит полисахариды 2-10 разных серотипов S. agalactiae. Таким образом, в одном из вариантов осуществления иммуногенная композиция по изобретению представляет собой 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10-валентную конъюгатную композицию GBS. В одном таком варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 5-валентную конъюгатную композицию GBS. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 6-валентную конъюгатную композицию GBS. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 7-валентную конъюгатную композицию GBS. В следующем варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой 8-валентную конъюгатную композицию GBS.

Несмотря на результаты, полученные ранее с использованием менее шести, менее пяти или менее четырех антигенов GBS в композиции (смотри публикации международных патентных заявок США №№ WO 2006/082527 и WO 2006/082530), которые свидетельствовали о иммунной интерференции, в частности, в связи с использованием серотипа V в поливалентных композициях (смотри публикацию международной патентной заявки № WO 2012/035519), настоящее изобретение не связано с какой-либо значительной иммунной интерференцией при использовании четырех или более антигенов GBS, или при использовании серотипа V в поливалентной композиции. Соответственно, настоящее изобретение относится к поливалентным иммуногенным композициям, содержащим полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие капсульные полисахариды по меньшей мере четырех серотипов GBS, например, капсульные полисахариды по меньшей мере пяти серотипов GBS, капсульные полисахариды по меньшей мере шести серотипов GBS, капсульные полисахариды по меньшей мере семи серотипов GBS, капсульные полисахариды по меньшей мере восьми серотипов GBS или капсульные полисахариды по меньшей мере девяти серотипов GBS, причем в композиции отсутствует значительная иммунная интерференция. В конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит капсульный полисахарид серотипа V GBS.

Полисахарид-белковые конъюгаты могут содержать одинаковые или разные белковые носители. В одном варианте осуществления конъюгаты содержат один и тот же белковый носитель, и сахариды конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (с молекулами носителя конъюгированы 2 или более разных полисахаридов) [смотри, например, публикацию международной патентной заявки № WO 2004/083251]. В другом варианте осуществления все полисахариды индивидуально конъюгированы с разными молекулами белкового носителя (с каждой молекулой белкового носителя конъюгирован полисахарид только одного типа). В указанном варианте осуществления говорят, что капсульные сахариды индивидуально конъюгированы с белком-носителем.

Оптимальные количества компонентов для конкретной иммуногенной композиции может быть установлено с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у пациентов. После начальной вакцинации пациенты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные интервалы времени.

Иммуногенные композиции по изобретению могут дополнительно содержать один или более консервантов, помимо нескольких конъюгатов капсульного полисахарида с белком. В соответствии с требованиями FDA биологические препараты в многодозовых (мультидозовых) флаконах содержат консервант, лишь с несколькими исключениями. По настоящему изобретению предусмотрено использование таких многодозовых флаконов. Вакцинные препараты, содержащие консерванты, включают вакцины, содержащие бензэтония хлорид (сибирская язва), 2-феноксиэтанол (КДС, гепатит A, болезнь Лайма, полиомиелит (парентеральная)) и фенол (пневмококковая инфекция, тиф (парентеральная)). Консерванты, одобренные для применения в инъекционных лекарственных препаратах, включают, например, хлорбутанол, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, бензэтония хлорид, бензалкония хлорид, бензойную кислоту, бензиловый спирт, фенол и нитрат фенилртути.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один из любых полисахаридов, описанных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый эксципиент, буфер, стабилизатор, адъювант, криопротектор, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, ингибитор вызываемого свободными радикалами окисления, разбавитель или носитель, либо их смесь.

Иммуногенная композиция может, необязательно, содержать один или более физиологически приемлемых буферов, выбранных из, но без ограничения, HEPES, PIPES, MES, Tris (триметамин), фосфата, ацетата, бората, цитрата, глицина, гистидина и сукцината. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой гистидин или фосфат.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит буфер в концентрации от приблизительно 5 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 35 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 15 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 35 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ или от приблизительно 15 мМ до приблизительно 20 мМ. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит буфер в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ, например, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ, и наиболее предпочтительно приблизительно 20 мМ.

В одном предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит гистидин в концентрации приблизительно 20 мМ. В другом предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит фосфат в концентрации приблизительно 20 мМ.

В конкретных вариантах осуществления значение pH буфера препарата находится в пределах диапазона от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,5, например, от приблизительно 5,3 до приблизительно 7,5, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 5,3 до приблизительно 7,1, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,5, от приблизительно 6,3 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0. В другом варианте осуществления значение pH буфера препарата составляет приблизительно 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5. В предпочтительном варианте осуществления значение pH буфера препарата находится в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, например, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, и наиболее предпочтительно составляет приблизительно 6,5 или приблизительно 7,0.

Иммуногенная композиция может, необязательно, содержать один или более неионных сурфактантов, включая, но без ограничения, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, полисорбат-80 (TWEEN 80), полисорбат-60 (TWEEN 60), полисорбат-40 (TWEEN 40), полисорбат-20 (TWEEN 20) и полиоксиэтиленалкиловые эфиры, включая, но без ограничения, BRIJ 58, BRIJ 35, а также другие, такие как TRITON X-100; TRITON X-114, NP40, SPAN 85 и неионные сурфактанты серии плюроник (например, плюроник 121). В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисорбат-80 или полисорбат-40, предпочтительно полисорбат-80 (PS80).

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит сурфактант в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (об/масс), от приблизительно 0,001% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,005%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,04%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 0,04%, от приблизительно 0,015% до приблизительно 0,03%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,04%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,03%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,25%. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит сурфактант в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03%, и наиболее предпочтительно приблизительно 0,02%.

В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисорбат-80 в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (при этом, предпочтительно до приблизительно 0,25%) или полисорбат-40 в концентрации от приблизительно 0,001% до 1% (при этом, предпочтительно до приблизительно 0,5%).

В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит PS80 в концентрации приблизительно 0,02%.

Фармацевтически приемлемые носители не следует путать с «белками-носителями», которые используют для присоединения углевода по изобретению к белку и модификации иммунного ответа на данный углевод. Во избежание путаницы с белковыми носителями, описанными в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемый разбавитель» будет более предпочтительным, чем «фармацевтически приемлемые носители», однако эти термины могут иногда использоваться взаимозаменяемо. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает носитель, одобренный регулирующим органом федерального правительства, правительства штата или другим регулирующим органом, или перечисленный в Фармакопее США или других признанных фармакопеях, к использованию для животных, включая людей, а также не являющихся людьми млекопитающих. Термин «носитель» означает разбавитель, адъювант, эксципиент, или среду, с которыми вводят фармацевтическую композицию. Подходящие фармацевтически приемлемые разбавители включают любые, и все, общепринятые растворители, дисперсионные среды, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства, и тому подобное. Такие фармацевтически приемлемые разбавители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая нефтепродукты, масла животного, растительного или синтетического происхождения. В качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов, можно использовать воду, воду для инъекций (WFI), стерильные изотонические солевые растворы, фосфатно-солевой буфер, суспензии адъюванта, водные растворы декстрозы и глицерина, а также их сочетание. Фармацевтически приемлемые разбавители также могут содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие средства или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые способствуют увеличению срока хранения или эффективности в организме. Получение и использование фармацевтически приемлемых разбавителей хорошо известно в данной области. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» под редакцией E. W. Martin. В одном варианте осуществления разбавитель представляет собой воду, воду для инъекций (WFI), суспензию адъюванта или солевой раствор. В конкретном варианте осуществления разбавитель представляет собой суспензию любого адъюванта, описанного в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления разбавитель представляет собой суспензию адъюванта на основе алюминия, например, суспензию фосфата алюминия.

Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, рафинозу, стахиозу, мелизитозу, декстран, маннит, лактит, палатинит, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, глицин, аргинин, лизин, хлорид натрия (NaCl), сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и томе подобное. В предпочтительном варианте осуществления эксципиент представляет собой NaCl.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит эксципиент в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 470 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 420 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 370 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 320 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 270 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 220 мМ, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 170 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 465 мМ, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 425 мМ, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 365 мМ, от приблизительно о 225 мМ до приблизительно 325 мМ, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 265 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 400 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 400 мМ до приблизительно 450 мМ или от приблизительно 450 мМ до приблизительно 500 мМ. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит эксципиент в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ, например, от приблизительно 130 мМ до приблизительно 170 мМ и от приблизительно 225 мМ до приблизительно 265 мМ, и наиболее предпочтительно приблизительно 150 мМ или приблизительно 245 мМ.

В одном предпочтительном варианте осуществления эксципиент представляет собой NaCl в концентрации приблизительно 150 мМ. В другом предпочтительном варианте осуществления эксципиент представляет собой NaCl в концентрации приблизительно 245 мМ.

Композиция, при необходимости, также может содержать незначительные количества смачивающих средств, объемообразующих средств, эмульгаторов или регуляторов pH. Такие композиции можно принимать в форме растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизированного порошка или лепешки, и тому подобного. Препарат должен соответствовать способу введения. За исключением случаев, когда какие-либо из общепринятых сред или средств являются несовместимыми с активным ингредиентом, подразумевается их использование в иммуногенных композициях по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления иммуногенную композицию лиофилизируют, необязательно, в присутствии по меньшей мере одного эксципиента. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один эксципиент выбирают из группы, состоящей из крахмала, глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита, палатинита, желатина, солода, риса, муки, мела, силикагеля, стеарата натрия, глицерин моностеарата, талька, глицина, аргинина, лизина, хлорида натрия (NaCl), сухого снятого молока, глицерина, пропиленгликоля, воды и этанола. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один эксципиент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, маннита и глицина. В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один эксципиент представляет собой сахарозу. В другом варианте осуществления лиофилизированная композиция содержит дополнительный эксципиент. В одном таком варианте осуществления дополнительный эксципиент представляет собой маннит или глицин.

В другом варианте осуществления лиофилизированная композиция содержит от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) по меньшей мере одного сахарида, например, приблизительно 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10,0%. В предпочтительном варианте осуществления лиофилизированная композиция содержит более приблизительно 5,5% (масс./об.) по меньшей мере одного эксципиента, например, более приблизительно 7,0% (масс./об.). В следующем варианте осуществления лиофилизированная композиция содержит от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) дополнительного эксципиента, например, приблизительно 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% или 10,0%. В предпочтительном варианте осуществления лиофилизированная композиция содержит от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) по меньшей мере одного эксципиента и от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) дополнительного эксципиента.

В другом варианте осуществления лиофилизированную композицию восстанавливают водой, водой для инъекций (WFI), суспензией адъюванта или солевым раствором. В предпочтительном варианте осуществления разбавитель представляет собой суспензию адъюванта на основе алюминия, например, суспензию фосфата алюминия.

В одном варианте осуществления композиция содержит выделенный полисахарид, описанный в настоящем описании, и молекулу носителя. Подходящие молекулы носителя могут включать белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и инактивированные вирусные частицы. Примеры носителей в виде частиц включают те, которые получены из полиметилметакрилатных полимеров, а также микрочастицы, полученные из поли(лактидов) и поли(лактид-со-гликолидов), известных как PLG.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению также могут содержать один или более дополнительных «иммуномодуляторов», которые представляют собой средства, вызывающие нарушения или изменения в иммунной системе, вследствие чего наблюдается либо стимуляция, либо подавление, гуморального и/или клеточного иммунитета. В одном конкретном варианте осуществления предпочтительной является стимуляция гуморального и/или клеточного звеньев иммунной системы. Примеры конкретных иммуномодуляторов включают, например, адъювант или цитокин, или ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанный в патенте США № 5254339, в числе прочих. Термин «адъювант» означает соединение, или смесь, которое вызывает усиление иммунного ответа на антиген, как далее описано в настоящем описании.

Неограничивающие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в композиции по настоящему изобретению, включают адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.); минеральные гели, такие как гель гидроксида алюминия; эмульсии типа вода-в-масле, такие как полный и неполный адъюванты Фрейнда; блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.); SAF-M (Chiron, Emeryville, Calif.); адъювант AMPHIGEN^®; сапонин; Quil A или другую фракцию сапонина; монофосфориллипид A и липид-аминный адъювант авридин. Неограничивающие примеры эмульсий типа масло-в-воде, полезных в качестве адъюванта в вакцине по изобретению, включают MF59 (патент США № 6299884) (содержащий 5% сквалена, 0,5% полисорбата-80 и 0,5% Span 85 (необязательно, содержащий разные количества MTP-PE), сформулированный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA)), и SAF (содержащий 10% сквалена, 0,4% полисорбата-80, 5% плюроник-блокполимера L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вортексе для образования эмульсии с частицами более крупного размера); модифицированный SEAM62 (содержащий 5% (по объему) сквалена (Sigma), 1% (по объему) детергента SPAN^® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (по объему) детергента полисорбата-80 (ICI Surfactants), 2,5% (по объему) этанола, 200 мкг/мл Quil A, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (по объему) лецитина); и модифицированный SEAM 1/2 (содержащий 5% (по объему) сквалена, 1% (по объему) детергента SPAN^® 85, 0,7% (по объему) детергента полисорбата-80, 2,5% (по объему) этанола, 100 мкг/мл Quil A и 50 мкг/мл холестерина).

Подходящие адъюванты, используемые для усиления иммунного ответа, дополнительно включают, без ограничения, MPL™ (3-O-деацилированный монофосфориллипид A, Corixa, Hamilton, MT), который описан в патенте США № 4912094. Также подходят для использования в качестве адъювантов синтетические аналоги липида A или соединения аминоалкилглюкозаминфосфата (AGP), или их производные или аналоги, которые доступны от компании Corixa (Hamilton, MT) и которые описаны в патенте США № 6113918. Одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, который также известен как 529 (прежнее название RC529). Этот адъювант 529 сформулирован в водной форме (AF) или в виде стабильной эмульсии (SE).

Другие адъюванты включают производное циклодекстрина (патент США № 6165995); полианионный полимер (патент США № 6610310); мурамилпептиды, такие как N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP) и N-ацетилнормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE); амфиген; авридин; L121/сквален; D-лактид-полилактид/гликозид; плюроники полиолы; убитые Bordetella; сапонины, такие как Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), описанный в патенте США № 5057540; Mycobacterium tuberculosis; бактериальные липополисахариды; синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG (например, патент США № 6207646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), описанный в Европейских патентах №№ 1296713 и 1326634; коклюшный токсин (PT) или его мутант, холерный токсин или его мутант (например, патенты США № 7285281, 7332174, 7361355 и 7384640); или термолабильный токсин E. coli (LT) или его мутант, в частности, LT-K63, LT-R72 (например, патенты США № 6149919, 7115730 и 7291588).

Другие «иммуномодуляторы», которые можно включать в вакцину, включают, например, один или более из интерлейкинов 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (смотри, например, патент США № 5723127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы); интерфероны-α, β и γ; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (смотри, например, патент США № 5078996 и регистрационный номер ATCC 39900); макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); или факторы некроза опухоли α и β. Другие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенных композициях, описанных в настоящем описании, включают хемокины, в том числе, без ограничения, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β и RANTES; молекулы адгезии, такие как селектин, например, L-селектин, P-селектин и E-селектин; муциноподобные молекулы, например, CD34, GlyCAM-1 и MadCAM-1; представителей семейства интегринов, таких как LFA-1, VLA-1, Mac-1 и p150.95; представителей суперсемейства иммуноглобулинов, таких как PECAM, ICAM, например, ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3, CD2 и LFA-3; костимулирующие молекулы, такие как B7-1, B7-2, CD40 и CD40L; факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, PDGF, BL-1 и фактор роста эндотелия сосудов; рецепторные молекулы, включая Fas, TNF-рецептор, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6; и каспазу (ICE).

Следует понимать, что решение об использовании иммуномодулятора и/или адъюванта, или выбор используемого иммуномодулятора и/или адъюванта, будет зависеть от пациента, которому будет введена вакцина или иммуногенная композиция, от пути введения инъекцией и числа инъекций. Например, если пациент естественным образом подвергся воздействию патогена, адъювант может не потребоваться, поскольку антигены вакцины могут эффективно вызывать ответ клеток памяти. В конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция будет содержать один или более адъювантов. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит адъювант на основе алюминия. В одном таком варианте осуществления адъювант на основе алюминия представляет собой гидроксид алюминия, фосфат алюминия или гидроксифосфат алюминия. В конкретном варианте осуществления адъювант представляет собой фосфат алюминия. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит QS-21 в качестве адъюванта.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,9 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,7 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,6 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,4 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,3 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 0,2 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,95 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,85 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,65 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,55 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,45 мг/мл, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,35 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,9 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,8 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,7 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,65 мг/мл, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 0,6 мг/мл, от приблизительно 0,75 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл, от приблизительно 0,75 мг/мл до приблизительно 0,95 мг/мл, от приблизительно 0,75 мг/мл до приблизительно 0,9 мг/мл и от приблизительно 0,75 мг/мл до приблизительно 0,85 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит адъювант в концентрации от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл, и наиболее предпочтительно приблизительно 0,5 мг/мл.

В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия в концентрации приблизительно 0,5 мг/мл. В одном таком варианте осуществления адъювант на основе алюминия представляет собой фосфат алюминия или гидроксифосфат алюминия. В другом варианте осуществления адъювант на основе алюминия представляет собой гидроксид алюминия.

Следует отметить, что иммуногенные композиции, содержащие адъювант на основе алюминия, имеют тенденцию к разделению фаз с течением времени; частицы алюминия отделяются от жидкости, выпадая в виде осадка при хранении. Для гарантии успешного введения иммуногенная композиция должна быть визуально однородной и ресуспендированной перед введением. Соответственно, важно, чтобы композицию можно было с легкостью ресуспендировать до однородного состояния. В одном аспекте изобретения иммуногенную композицию ресуспендируют, используя приблизительно 50 или менее встряхиваний, например, приблизительно 40 или менее встряхиваний, приблизительно 30 или менее встряхиваний, приблизительно 25 или менее встряхиваний, приблизительно 20 или менее встряхиваний, приблизительно 15 или менее встряхиваний, приблизительно 10 или менее встряхиваний, или приблизительно 5 или менее встряхиваний. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенную композицию ресуспендируют, используя приблизительно 10 или менее встряхиваний. В другом аспекте изобретения иммуногенную композицию ресуспендируют, используя от приблизительно 1 до приблизительно 50 встряхиваний, например, от приблизительно 1 до приблизительно 40 встряхиваний, от приблизительно 1 до приблизительно 30 встряхиваний, от приблизительно 1 до приблизительно 25 встряхиваний, от приблизительно 1 до приблизительно 20 встряхиваний, от приблизительно 1 до приблизительно 15 встряхиваний, от приблизительно 1 до приблизительно 10 встряхиваний или от приблизительно 1 до приблизительно 5 встряхиваний. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенную композицию ресуспендируют, используя от приблизительно 1 до приблизительно 10 встряхиваний.

В одном аспекте изобретения иммуногенная композиция помещена в контейнер. В одном варианте осуществления контейнер выбирают из группы, состоящей из ампулы, флакона, мешка и шприца. В одном варианте осуществления контейнер выполнен из стекла, металла (например, стали, нержавеющей стали и алюминия) и полимеров (например, термопластов, эластомеров, термопластичных эластомеров). В одном варианте осуществления контейнер является силиконизированным. В предпочтительном варианте осуществления контейнер представляет собой шприц, и наиболее предпочтительно стеклянный шприц.

В одном конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция помещена в шприц со свободным пространством над продуктом, составляющим от приблизительно 1 мм до приблизительно 15 мм, например, от приблизительно 1 мм до приблизительно 11 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 9 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 7 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 6 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 4 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 3 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 11 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 9 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 7 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 6 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 2 мм до приблизительно 4 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 11 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 9 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 7 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 6 мм, от приблизительно 3 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 11 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 9 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 8 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 7 мм, от приблизительно 4 мм до приблизительно 6 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 15 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 11 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 9 мм, от приблизительно 5 мм до приблизительно 8 мм или от приблизительно 5 мм до приблизительно 7 мм. В предпочтительном варианте осуществления свободное пространство над продуктом составляет от приблизительно 2 мм до приблизительно 6 мм, и наиболее предпочтительно приблизительно 4 мм.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковый конъюгат, описанный в настоящем описании, буфер, сурфактант, эксципиент и, необязательно, адъювант, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5.

В одном таком варианте осуществления иммуногенная композиция содержит GBS полисахарид-белковый конъюгат, буфер, сурфактант, эксципиент и, необязательно, адъювант, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, и при этом капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит GBS полисахарид-белковый конъюгат, гистидин, полисорбат-80, хлорид натрия и, необязательно, фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0.

В одном конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит GBS полисахарид-белковый конъюгат, гистидин, полисорбат-80, хлорид натрия и, необязательно, фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, и при этом капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл GBS полисахарид-белкового конъюгата, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ гистидина, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (об/масс) полисорбата-80, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ хлорида натрия и, необязательно, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, причем капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

В другом варианте осуществления иммуногенная композиция содержит GBS полисахарид-белковый конъюгат, фосфат, полисорбат-80, хлорид натрия и фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5.

В дополнительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит GBS полисахарид-белковый конъюгат, фосфат, полисорбат-80, хлорид натрия и фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, и при этом капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл GBS полисахарид-белкового конъюгата, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (об./масс.) полисорбата-80, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ хлорида натрия и от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, причем капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

В одном таком варианте осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере два GBS полисахарид-белковых конъюгата, буфер, сурфактант, эксципиент и, необязательно, адъювант, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, и при этом конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

В одном конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере два GBS полисахарид-белковых конъюгата, гистидин, полисорбат-80, хлорид натрия и, необязательно, фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, и при этом конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл каждого из по меньшей мере двух GBS полисахарид-белковых конъюгатов, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ гистидина, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (об./масс.) полисорбата-80, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ хлорида натрия и, необязательно, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

В другом конкретном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере два GBS полисахарид-белковых конъюгата, фосфат, полисорбат-80, хлорид натрия и фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, и при этом конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

В одном предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл каждого из по меньшей мере двух GBS полисахарид-белковых конъюгатов, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (об./масс.) полисорбата-80, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ хлорида натрия и от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, причем конъюгаты содержат капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

Оценка иммуногенных композиций

Для оценки иммуногенности иммуногенных композиций по изобретению используют различные in vitro тесты. Например, проводят in vitro анализ опсонической активности путем совместной инкубации смеси стрептококковых клеток, инактивированной нагреванием сыворотки, содержащей специфические антитела к интересующим антигенам, и комплемента из экзогенного источника. Онсонофагоцитоз происходит в процессе инкубации свежевыделенных полиморфноядерных клеток (PMN) или дифференцированных эффекторных клеток, таких как HL60, и смеси антител/комплемента/стрептококковых клеток. Бактериальные клетки, которые покрыты антителом и комплементом, уничтожаются в результате опсонофагоцитоза. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) выживших при опсонофагоцитозе бактерий определяют путем высева аналитической смеси. Титры определяют, как величину, обратную наибольшему разбавлению, при котором имеет место уничтожение 50% бактерий, что определяют при сравнении с аналитическими контролями.

Для in vitro оценки иммуногенности и поверхностного экспонирования антигена также можно использовать клеточный анализ ELISA, в котором клетки интересующего бактериального штамма (S. agalactiae) вносят в лунки планшета, например, 96-луночного планшета, и тестируемая сыворотка от иммунизированного животного вступает в реакцию с бактериальными клетками. Если антитело, специфическое для тестируемого антигена, реагирует с экспонированным на поверхности эпитопом антигена, это может быть обнаружено стандартными методами, известными специалисту в данной области. Альтернативно, можно использовать метод проточной цитометрии для измерения экспонирования на поверхности антигенов капсульного полисахарида и специфичности антител, включая моноклональные антитела.

Антиген, демонстрирующий нужную активность in vitro, затем можно тестировать в животной модели заражения in vivo. В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции используют для иммунизации животного (например, мыши) с использованием методов и путей иммунизации, известных специалистам в данной области (например, интраназального, парентерального, перорального, ректального, вагинального, чрескожного, внутрибрюшинного, внутривенного, подкожного и так далее). После иммунизации животного иммуногенной композицией GBS животному вводят клетки штамма Streptococcus agalactiae и анализируют на устойчивость к стрептококковой инфекции.

В одном варианте осуществления свободных от патогенов мышей иммунизируют и заражают S. agalactiae. Например, мышей иммунизируют одной или более дозами нужного антигена в иммуногенной композиции. Затем мышей заражают S. agalactiae и контролируют выживаемость с течением времени после заражения.

Способы применения

Используемый в настоящем описании термин «имеющий иммунную недостаточность» относится к пациенту, страдающему от недостаточности клеточного и/или гуморального звена (звеньев) иммунной системы. Соответственно, подразумевают степень недостаточности иммунной функции, варьирующую от легкого нарушения иммунных процессов до полной иммуносупрессии.

Термин «пациент» относится к млекопитающему, птице, рыбе, рептилии или любому другому животному. Термин «пациент» также охватывает людей. Термин «пациент» также охватывает домашних любимцев. Неограничивающие примеры домашних любимцев включают: собак, кошек, свиней, кроликов, крыс, мышей, песчанок, хомяков, морских свинок, хорьков, птиц, змей, ящериц, рыб, черепах и лягушек. Термин «пациент» также охватывает домашних животных. Неограничивающие примеры домашних животных включают: альпака, бизонов, верблюдов, крупный рогатый скот, оленей, свиней, лошадей, лам, мулов, ослов, овец, коз, кроликов, северных оленей, яков, кур, гусей и индеек.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» (включая его варианты, например, «лечить» или «леченный») относится к любому одному или более из перечисленного: (i) предотвращение инфекции или повторной инфекции, как в случае традиционной вакцины, (ii) уменьшение степени тяжести или устранение симптомов и (iii) существенная или полная элиминация конкретного патогена или заболевания. Таким образом, лечение можно применять профилактически (до инфицирования) или терапевтически (после инфицирования). В соответствии с настоящим изобретением можно использовать профилактическое или терапевтическое лечение. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения предложены композиции и способы, которые лечат, в том числе, за счет профилактической и/или терапевтической иммунизации, животное-хозяина от инфекции, вызываемой микробами (например, бактерией, такой как S. agalactiae). Способы по настоящему изобретению полезны для профилактического и/или терапевтического создания иммунитета у пациента. Способы по настоящему изобретению также могут быть применены к пациентам с целью биомедицинских исследований.

В другом аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против GBS у пациента путем введения пациенту эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу предотвращения, или облегчения, заболевания или состояния, связанного со стрептококком группы B, у пациента путем введения пациенту эффективного количества иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании. В одном из аспектов изобретение относится к иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании, для использования в качестве лекарственного средства. В одном из аспектов изобретение относится к иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании, для использования в способе индукции иммунного ответа против GBS у пациента. В конкретном варианте осуществления пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной. В одном таком варианте осуществления беременная женщина находится во второй половине беременности, например, на сроке беременности по меньшей мере 20 недель или по меньшей мере 27 недель. В предпочтительном варианте осуществления беременная женщина находится на сроке беременности от 27 недель до 36 недель. В другом варианте осуществления пациент является пожилым человеком, например, в возрасте 50 лет или старше, 65 лет или старше и 85 лет или старше. В следующем варианте осуществления пациент имеет иммунную недостаточность. В одном аспекте пациент может иметь медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени. В предпочтительном варианте осуществления стрептококк группы B представляет собой S. agalactiae.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие полисахарид GBS серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В другом варианте осуществления конъюгаты содержат полисахарид GBS серотипа IV и по меньшей мере двух дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В дополнительном варианте осуществления конъюгаты содержат полисахарид GBS серотипа IV и по меньшей мере трех дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В другом варианте осуществления конъюгаты содержат полисахарид GBS серотипа IV и по меньшей мере четырех дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В конкретном варианте осуществления конъюгаты содержат полисахариды GBS серотипов Ia, Ib, II, III и IV. В следующем варианте осуществления конъюгаты содержат полисахарид GBS серотипа IV и по меньшей мере пяти дополнительных серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX. В следующем варианте осуществления композиция содержит полисахарид GBS серотипа V. В конкретном варианте осуществления конъюгаты содержат полисахариды GBS серотипов Ia, Ib, II, III и V. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит шесть полисахарид-белковых конъюгатов из GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V. Один аспект изобретения относится к иммуногенной композиции, в которой отсутствует иммунная интерференция.

Иммуногенное, или эффективное, количество иммуногенной композиции можно определять в исследовании зависимого от дозы ответа, в котором пациентов иммунизируют постепенно возрастающими количествами иммуногенной композиции и анализируют иммунный ответ для определения оптимальной дозы. Исходные дозы в исследовании могут быть определены на основании данных по иммунизации в животных моделях. Количество дозы может варьироваться в зависимости от конкретных условий для индивидуума. Количество можно определять в обычных испытаниях способами, известными специалистам в данной области.

Иммунологически эффективное количество иммуногенной композиции в соответствующем количестве доз вводят пациенту для инициирования иммунного ответа. Количество дозы может варьироваться в зависимости от конкретных условий для индивидуума, таких как возраст и масса тела. Это количество можно определять в обычных испытаниях способами, известными специалистам в данной области.

В одном варианте осуществления у пациентов, которым вводят иммуногенные композиции по изобретению, наблюдается уменьшение степени носительства S. agalactiae. Такое уменьшение носительства, или более длительный интервал времени, проведенного без носительства, после введения иммуногенной композиции важны с точки зрения медицинской необходимости. Например, уменьшение общей степени носительства S. agalactiae у носителей можно оценивать после введения одной дозы иммуногенной композиции по изобретению. Например, за 1 день до введения иммуногенной композиции можно проводить скрининг группы взрослых людей в возрасте 18-50 лет на носительство путем получения носовых, горловых, подмышечных, ректальных, промежностных и вагинальных мазков, с последующим культивированием для определения их состояния носительства. Затем группе людей можно вводить иммуногенную композицию по изобретению, причем другая группа будет получать контроль. Носовые, горловые, подмышечные, ректальные, промежностные и вагинальные мазки собирают еженедельно в течение 12-недельного периода, и ежемесячно вплоть до 6 месяцев после введения иммуногенной композиции, и сравнивают с результатами для плацебо. Одним основным критерием эффективности являются результаты сравнения степеней носительства у пациентов после введения иммуногенной композиции и плацебо с 3-месячными интервалами после иммунизации.

Антитела

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связывать мишень, такую как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и так далее, через по меньшей мере один сайт узнавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. При использовании в настоящем описании, если из контекста не следует иное, термин должен охватывать не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также рекомбинантные антитела (например, химерные, гуманизированные и/или дериватизированные для изменения эффекторных функций, стабильности и других видов биологической активности) и фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела, включая антитела акул и верблюдовых), а также слитые белки, содержащие фрагмент антитела, мультивалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, при условии, что они обладают желательной биологической активностью), и фрагменты антител, описанные в настоящем описании, а также любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт узнавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, например, IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело не обязательно должно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 у человека. Константные домены тяжелых цепей, которые определяют принадлежность иммуноглобулинов к разным классам, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичная структура и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов разных классов хорошо известны.

«Фрагменты антитела» содержат лишь часть интактного антитела, причем часть предпочтительно сохраняет по меньшей мере одну, предпочтительно большинство или все, из функций, обычно связанных с данной частью, когда она находится в составе интактного антитела.

Используемые в настоящем описании термины «функциональная активность» антитела или «функциональное антитело» относятся к антителу, которое, как минимум, способно специфически связывать антиген. Дополнительные функции известны в данной области и могут включать дополнительные компоненты иммунной системы, которые осуществляют клиренс или уничтожение патогена, например, посредством опсонизации, ADCC или комплемент-опосредованной цитотоксичности. После связывания антигена любые последующие функции антитела могут быть опосредованы Fc-областью антитела. Анализ на опосредованный антителами опсонофагоцитоз (OPA) представляет собой in vitro анализ, разработанный для in vitro измерения опосредованного Ig и системой комплемента уничтожения бактерий эффекторными клетками (белыми клетками крови), таким образом, имитирующий биологический процесс. Связывание антитела также может непосредственно ингибировать биологическую функцию антигена, который оно связывает. В некоторых вариантах осуществления термин «функциональное антитело» означает антитело, которое является функциональным при измерении уничтожения бактерий в животной модели эффективности или в анализе опсонофагоцитарного уничтожения, показывающем, что антитела уничтожают бактерии.

В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу, или его фрагменту, которое специфически связывает полисахарид, описанный в настоящем описании. Используемый в настоящем описании термин «выделенное» антитело означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонентов его естественного окружения. Примесные компоненты его естественного окружения представляют собой материалы, которые препятствовали бы диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В иллюстративных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до содержания более 95% по массе антитела при определении методом Лоури, и наиболее предпочтительно, содержания более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для определения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при использовании секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности по результатам SDS-ПААГ в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях при окрашивании Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

Антитело, которое «специфически связывает» или является «специфическим для» конкретного полисахарида или эпитопа на конкретном полисахариде, представляет собой антитело, которое связывает конкретный полисахарид или эпитоп на конкретном полисахариде без существенного связывания с любым другим полисахаридом или эпитопом полисахарида.

Используемый в настоящем описании термин «метка» означает детектируемое соединение, или композицию, непосредственно или опосредованно конъюгированное с антителом, с целью получения «меченого» антитела. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоактивные изотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое может быть обнаружено.

Изобретение также относится к антителам и композициям антител, которые специфически и избирательно связывают один или более антигенов иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитела получают после введения пациенту иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены очищенные или выделенные антитела, направленные против одного или более антигенов иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению являются функциональными при измерении уничтожения бактерий либо в животной модели эффективности, либо в анализе опсонофагоцитарного уничтожения. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению создают пассивный иммунитет у пациента. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидным молекулам, кодирующим антитело или фрагмент антитела по изобретению, а также к клетке или линии клеток (например, клеткам гибридомы или другим линиям генетически модифицированных клеток для рекомбинантного продуцирования антител) и трансгенному животному, продуцирующему антитело или композицию антител по изобретению с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области.

Антитела или композиции антител по изобретению могут быть использованы в способе лечения или предотвращения стрептококковой инфекции, заболевания или состояния, связанного с S. agalactiae, у пациента, включающем получение препарата поликлональных или моноклональных антител и использование указанных антител или композиции антител для создания пассивного иммунитета у пациента. Антитела по изобретению также могут быть полезны для методов диагностики, например, для обнаружения присутствия или количественного определения уровней одного или более антигенов иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Продуцирование антител на повторяющиеся структуры, такие как полисахарид по настоящему изобретению, может обладать некоторыми уникальными особенностями. Например, регулярность повторяющихся единиц может означать, что молекулы антигена, сильно отличающиеся по молекулярной массе, могут связываться с антителами, специфическими для полисахарида. Во-вторых, повторяющиеся структуры более длинных полисахаридов способны индуцировать независимое от T-клеток продуцирование антител. Вследствие этого, при использовании полисахаридов, конъюгированных с белковыми носителями, имеющими эпитопы для T-хелперов, может быть стимулировано как независимое от T-клеток, так и зависимое от T-клеток, продуцирование антител. Таким образом, иммунный ответ можно модифицировать за счет соответствующего выбора размера полисахарида, а также за счет того, используют или не используют белок-носитель.

Поликлональные антитела

В конкретных вариантах осуществления антитело против полисахарида представляет собой поликлональное антитело. Используемый в настоящем описании термин «поликлональные антитела» означает смесь антител с разной специфичностью, полученных из препарата сыворотки и происходящих из разных B-клеточных клонов. Методы получения и характеризации поликлональных антител известны в данной области.

Поликлональные антитела вырабатываются у пациента, например, у млекопитающего, при введении одной или более инъекциями иммуногена или иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании, и, при необходимости, адъюванта, буфера и/или разбавителя. Животных разных видов можно использовать для получения специфической антисыворотки. Как правило, животное, используемое для получения поликлональной антисыворотки против сахарида, является отличным от человека приматом, козой, овцой, кроликом, мышью, крысой, хомяком или морской свинкой. Как правило, иммуноген или иммуногенную композицию с адъювантом, или без него, вводят млекопитающему несколькими инъекциями. Иммуногенный материал может включать полисахарид, олигосахарид, полисахарид, полисахарид-белковый конъюгат, описанный в настоящем описании, или большую совокупность иммуногенов. Как правило, начиная с 2-6 недель после первой иммунизации, у иммунизированного животного берут кровь, оставляют ее для сворачивания и собирают сыворотку. Сыворотка содержит поликлональные антитела против сахарида от иммунизированного животного, и ее часто называют антисывороткой.

Моноклональные антитела

Моноклональное антитело против сахарида можно получать известным методом гибридом. Как правило, получение моноклональных антител включает первую иммунизацию соответствующего целевого животного-хозяина выбранным иммуногеном, включающим полисахарид, олигосахарид, полисахарид или полисахарид-белковый конъюгат по настоящему изобретению. При необходимости можно включать адъювант, буфер и/или разбавители. Иммунизацию выполняют таким образом, чтобы стимулировать B-лимфоциты к продуцированию или экспрессии антител, которые специфически связывают полисахарид или его конъюгат. Альтернативно, лимфоциты иммунизируют in vitro.

Затем проводят слияние лимфоцитов с иммортализованными линейными клетками, используя подходящее средство, вызывающее слияние клеток, такое как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы. Источник лимфоцитов определяет, будут ли моноклональные антитела иметь человеческое или животное происхождение. Как правило, используют лимфоциты периферической крови («ЛПК») если нужны антитела и клетки человека, и используют клетки селезенки или лимфатических узлов, если в качестве источника нужны млекопитающие, отличные от человека.

Иммортализованные линейные клетки, как правило, представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности, клетки миеломы грызунов, крупного рогатого скота и человека. Как правило, используют линии клеток крысиной или мышиной миеломы. Клетки гибридомы культивируют в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание не слитых иммортализованных клеток. Например, если в родительских клетках отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом, как правило, будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин («среда HAT»), вещества, которые предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.

Иммортализованные линейные клетки выбирают из практических соображений, таких как исходный биологический вид, характеристики слияния и роста. Например, подходящими иммортализованными линейными клетками являются такие, которые эффективно участвуют в слиянии, поддерживают стабильно высокие уровни экспрессии антитела выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Примеры линий иммортализованных клеток включают линии клеток мышиной миеломы. Линии клеток человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы также были описаны для продуцирования человеческих моноклональных антител.

Моноклональное антитело секретируется в культуральную среду клетками гибридомы. Затем культуральную среду анализируют на наличие моноклональных антител, которые узнают и связывают полисахарид. Специфичность связывания в отношении полисахарида конкретных моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют одним из многочисленных методов, которые хорошо известны в данной области. Например, специфичность связывания антитела можно определять методом иммунопреципитации, радиоиммунного анализа (RIA), вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа (ELISA) или поверхностного плазмонного резонанса (например, Biacore). Конкретный эпитоп, узнаваемый моноклональным антителом, определяют путем картирования эпитопов. Такие методы и анализы хорошо известны в данной области.

После идентификации клеток гибридомы, продуцирующих антитела с нужной специфичностью, клоны субклонируют методом серийных разведений и культивируют стандартными методами. Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. Альтернативно, клетки гибридомы растут in vivo в виде асцитов у млекопитающего. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, выделяют или очищают из культуральной среды, или асцитной жидкости, общепринятыми методами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на протеин A-сефарозе, гидроксилапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография.

Альтернативно, антитела, обладающие нужной специфичностью и полученные от животных нужных видов, можно получать с использованием библиотек фагового дисплея. Кроме того, примеры способов и реагентов, особенно подходящих для получения и скрининга дисплейной библиотеки антител, можно найти в соответствующей литературе.

Применение антител

В одном аспекте изобретение относится к применению иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании, для получения анти-GBS антитела и/или фрагмента антитела. Полисахарид-белковые конъюгаты, описанные в настоящем описании, и/или антитела, полученные с их использованием, могут найти применение в различных иммунологических диагностическим методах, известных специалистам в данной области, включая технологии с использованием ELISA и микрочипов. Кроме того, эти реагенты могут быть использованы для оценки продуцирования антител, включая сывороточные уровни антител, например, против иммуногенных полисахаридных конъюгатов. Аналитические методы по изобретению могут включать использование меток, таких как флуоресцентные, хемилюминесцентные, радиоактивные, ферментативные метки или молекулы красителя, и/или вторичных иммунологических реагентов для непосредственного или опосредованного обнаружения комплекса между антигеном, или антителом, в биологическом образце и соответствующим антителом, или антигеном, связанным с твердой подложкой.

Полученное антитело, или фрагмент антитела, также может быть полезным для пассивной иммунотерапии или для профилактики стрептококковой инфекции.

Способ получения полисахарида

В другом аспекте изобретение относится к способу получения полисахаридов, описанных в настоящем описании. Способ включает культивирование GBS и сбор полисахаридов, продуцируемых бактерией. В одном варианте осуществления GBS включает S. agalactiae. Бактерия может относиться к любому штамму S. agalactiae. В предпочтительном варианте осуществления бактерия относится к штамму инкапсулированной бактерии S. agalactiae. Штаммы S. agalactiae для использования по настоящему изобретению включают 090, A909 (регистрационный № ATCC BAA-1138), 515 (регистрационный № ATCC BAA-1177), B523, CJB524, MB 4052 (регистрационный № ATCC 31574), H36B (регистрационный № ATCC 12401), S40, S42, MB 4053 (регистрационный № ATCC 31575), M709, 133, 7357, PFEGBST0267, MB 4055 (регистрационный № ATCC 31576), 18RS21 (регистрационный № ATCC BAA-1175), S16, S20, V8 (регистрационный № ATCC 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, PFEGBST0708, MB 4082 (регистрационный № ATCC 31577), M132, 110, M781 (регистрационный № ATCC BAA-22), D136C(3) (регистрационный № ATCC 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; регистрационный № ATCC 31475), M132, K79, COH1 (регистрационный № ATCC BAA-1176), PFEGBST0563, 3139 (регистрационный № ATCC 49446), CZ-NI-016, PFEGBST0961, 1169-NT1, CJB111 (регистрационный № ATCC BAA-23), CJB112, 2603 V/R (регистрационный № ATCC BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, PFEGBST0837, 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, CZ-PW-119, 7271, CZ-PW-045, JM9130013, JM9130672, IT-NI-016, IT-PW-62 и IT-PW-64.

Полисахарид, описанный в настоящем описании, можно получать путем культивирования GBS в соответствующей среде. Соответствующая среда может включать колумбийский бульон. Среда может включать декстрозу, гемин и/или глюкозу. Предпочтительно, среда включает колумбийский бульон и декстрозу. Если S. agalactiae культивируют с использованием колумбийского бульона и декстрозы, предпочтительно, температура при культивировании составляет 20-40°C, предпочтительно 37°C. В предпочтительном варианте осуществления бактерию культивируют в аэробных условиях. В другом предпочтительном варианте осуществления бактерию культивируют в течение 12-60 часов.

Полисахарид можно собирать из полученной культуры известным в данной области методом сбора целевого вещества из культуры, таким как, например, нагревание, обработка ферментами, центрифугирование, осаждение, обработка активированным углем и/или фильтрование. (Смотри, например, публикации патентных заявок США №№ 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 и 2008/0102498; публикацию международной патентной заявки № WO 2008/118752). В одном варианте осуществления культуру, содержащую бактерию и полисахарид, центрифугируют и обрабатывают ферментом, таким как, например, лизоцим, РНКаза, ДНКаза, проназа, мутанолизин, а также их сочетанием. Например, в одном варианте осуществления соответствующий органический растворитель добавляют в полученный супернатант для осаждения белков, и осадок удаляют центрифугированием. Затем можно осаждать полисахарид путем добавления соответствующего органического растворителя в супернатант, и полисахарид можно собирать центрифугированием. Более конкретно, полисахарид, описанный в настоящем описании, можно получать путем добавления этанола в конечной концентрации приблизительно 25 объемных % в супернатант, из которого были удалены бактерии, удаления осадка, содержащего белок, центрифугирования, последующего добавления в супернатант этанола до конечной концентрации приблизительно 75 объемных %, с последующим сбором осадка центрифугированием. Полученный осадок можно высушивать азотом. Полученный осадок можно ресуспендировать в Tris с 0,05% азида Na.

Следующий аспект изобретения относится к новому способу выделения в основном интактных высокомолекулярных CP, сохраняющих N- и O- ацетильные группы, с использованием органических реагентов, таких как дериватизированные соединения гидроксиламина. Поскольку данный способ не приводит к лизису клеток, CP, выделенные методом центрифугирования, имеют минимальные примеси внутриклеточных компонентов и их общий выход может быть более высоким. Кроме того, эти реагенты расщепляют примесь антигена группы B до очень мелких фрагментов из-за множественных фосфодиэфирных связей, и фрагменты могут быть с легкостью удалены диафильтрацией.

В одном варианте осуществления CP выделяют путем проведения реакции гидроксиламина с клеточной пастой, содержащей бактерию, продуцирующую капсульный полисахарид. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает этап центрифугирования. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает этап фильтрования. В другом варианте осуществления бактерию, продуцирующую капсульный полисахарид, выбирают из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis.

В одном из аспектов изобретения гидроксиламин может быть одним из тех, которые перечислены в Таблице 2 примера 2. В предпочтительном варианте осуществления гидроксиламин выбирают из группы, состоящей из дибензилгидроксиламина; диэтилгидроксиламина; гидроксиламина; этилендиамина; триэтилентетрамина; 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина и 2,6,10-триметил-2,6,10-триазаундекана.

В одном аспекте изобретения концентрация гидроксиламина составляет от приблизительно 5 мМ до приблизительно 200 мМ, например, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ, например, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ и от приблизительно 50 мМ до приблизительно 75 мМ.

В другом аспекте значение pH реакционной смеси поддерживают на уровне от приблизительно 5,5 до приблизительно 9,5, например, от приблизительно 5,5 до приблизительно 9,0, от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 9,5, от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,5, от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,5 и от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0.

В следующем аспекте изобретения реакция протекает при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 85°C, например, от приблизительно 20°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 20°C до приблизительно 50°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 25°C до приблизительно 50°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 30°C до приблизительно 50°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 35°C до приблизительно 55°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, от приблизительно 50°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 50°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 50°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 50°C до приблизительно 70°C, от приблизительно 55°C до приблизительно 85°C, от приблизительно 55°C до приблизительно 80°C, от приблизительно 55°C до приблизительно 75°C, от приблизительно 60°C до приблизительно 85°C и от приблизительно 65°C до приблизительно 85°C.

В другом аспекте продолжительность реакции составляет от приблизительно 10 часов до приблизительно 90 часов, например, от приблизительно 10 часов до приблизительно 85 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 80 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 75 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 70 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 50 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 40 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 30 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 25 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 20 часов, от приблизительно 10 часов до приблизительно 15 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 90 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 85 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 80 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 75 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 70 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 50 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 40 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 30 часов, от приблизительно 15 часов до приблизительно 20 часов, например, от приблизительно 20 часов до приблизительно 90 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 85 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 80 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 75 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 70 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 50 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 40 часов, от приблизительно 20 часов до приблизительно 30 часов и от приблизительно 20 часов до приблизительно 25 часов.

Альтернативно, в другом варианте осуществления изобретения полисахарид синтезируют химическими методами. Полисахарид может быть синтезирован общепринятыми химическими методами.

В другом варианте осуществления изобретения полисахарид получают путем экспрессии в суррогатном хозяине после клонирования и экспрессии пути биосинтеза для получения полисахарида. Например, клетка-хозяин может быть модифицирована для продуцирования полисахарида, обладающего структурным сходством с полисахаридом, описанным в настоящем описании, причем повторяющаяся единица полисахарида, продуцируемого в клетке-хозяине, частично идентична повторяющейся единице полисахарида, описанного в настоящем описании. Полисахарид обладает структурным сходством с полисахаридом, описанным в настоящем описании, если, например, повторяющаяся единица полисахарида лишена ветви, отличается по размеру и/или отличается по расположению ветвей от повторяющейся единицы полисахарида, описанного в настоящем описании. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку-хозяина.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстрации и не претендуют на полную определенность в отношении условий и объема настоящего изобретения. Следует понимать, что, если приведены типичные условия реакции (например, температура, продолжительность реакции и так далее), то условия, отличающие в меньшую или в большую сторону от указанных диапазонов, также можно использовать, хотя и с меньшим удобством. Все части и величины в процентах, указанные в настоящем описании, приведены по массе, и все значения температуры приведены в градусах Цельсия, если не указано иначе.

Кроме того, в следующих далее примерах были использованы стандартные методы, которые хорошо известны и являются рутинными для специалистов в данной области, за исключением случаев, которые описаны подробно. Как отмечено выше, следующие примеры приведены с целью иллюстрации, и не должны быть восприняты, как каким-либо образом ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение полисахарид-белковых конъюгатов с де-O-ацетилированными полисахаридами

Проводили ферментацию штаммов S. agalactiae для соответствующих серотипов в затопленной культуре с контролем pH в указанной среде. Используемые методики и среды были оптимизированы в процессе экспериментирования и являются модификациями базовых методов, описанных ранее в публикации von Hunolstein, C. et al., Appl. Micro. Biotech. 38(4):458-462 (1993). Капсульный полисахарид удаляли из клеток обработкой NaOH. После этапов осветления, серии УФ/ДФ, осаждения и фильтрования через угольный фильтр, получали очищенный полисахарид. Смотри, например, патент США № 8652480. Использовали химию восстановительного аминирования для конъюгации активированного полисахарида с CRM₁₉₇. Смотри, например, патент США № 5360897.

Пример 2. Выделение O-ацетилированных полисахаридов

Пасту клеток GBS с капсульным полисахаридом (CP) серотипа Ia, полученную после уничтожения нагреванием и центрифугирования ферментационного бульона (1,2 л), ресуспендировали в 175 мл 25 мМ калий-фосфатного буфера (25 мМ, pH 6,9). Суспензию смешивали с водным раствором гидроксиламин-O-сульфоновой кислоты в конечной концентрации 10 мМ. Значение pH суспензии при определении составляло приблизительно 5,8. Суспензию перемешивали при 55°C в течение 72 часов. Затем суспензию центрифугировали при приблизительно 10000 об/мин, и супернатант собирали. Супернатант, содержащий сырые расщепленные CP, анализировали на значение молекулярной массы и выход. Оставшуюся часть очищали диафильтрацией с использованием мембраны с 30 кДа НОММ, используя воду для инъекций (WFI). Проводили дополнительный анализ молекулярной массы очищенного полисахарида методом эксклюзионной хроматографии в сочетании с детектором многоуглового рассеяния лазерного излучения (SEC-MALS) (Таблица 1).

Таблица 1. Очистка полисахарида GBS серотипа Ia методом диафильтрации

Образец ММ (кДа) Полидисперсность (PD) Сырой 340 1,2 Очищенный полисахарид 320 1,3

Проводили скрининг нескольких гидроксиламинов, как азот-, так и кислород-замещенных соединений, на их активность с использованием способа, описанного выше. Выход рассчитывали с применением метода гель-проникающей хроматографии в сочетании с детекцией многоуглового рассеяния лазерного излучения (GPC-MALS) сырых супернатантов с использованием отклика показателя преломления (RI) и квадрата удельного значения приращения показателя преломления (dn/dc) 0,135. Выход зависел от типа гидроксиламинов и оптимизации условий, таких как концентрация, температура и продолжительность реакции (смотри Таблицу 2). Как правило, увеличение концентрации гидроксиламина, повышение температуры и увеличение продолжительности реакции приводили к более высокому выходу.

Таблица 2. Скрининг различных гидроксиламинов и оптимизация условий для капсульного полисахарида GBS серотипа Ia

Экс.
№ Реагент Конц. (мМ) Темп. (°C) Время (час) Выход/1л ферментационного бульона ММ полисахарида (кДа) Полидисперсность (PD) 1
O-бензилгидроксиламин гидрохлорид 10 55 72 42 2240 1,2 2
бензальдегид оксим 10 55 72 68 1400 1,2 3
N,N-дибензилгидроксиламин 10 55 72 101 980 1,3 4
N,N-дибензилгидроксиламин 50 55 17 320 590 1,3 5
O-фенилгидроксиламин гидрохлорид 10 55 72 109 850 1,3 6
4-(диметиламино)бензальдегид оксим 10 55 72 90 1400 1,2 7
бензилгидроксилкарбамат 10 55 84 323 1835 1,5 8
O-(тетрагидро-2H-пиран-2-ил)гидроксиламин 10 55 84 304 1270 1,4 9
O-((перфторфенил)метил)гидроксиламин 10 55 84 185 1330 1,6 10
O-тритилгидроксиламин 10 55 84 371 1275 1,7 11
O-(4-нитробензил)гидроксиламин гидрохлорид 10 55 84 190 3500 1,3 12
2-(аминоокси)уксусной кислоты гидрохлорид 10 55 84 252 2600 1,2 13
(аминоокси)сульфоновая кислота 10 55 84 463 490 1,4 14
(аминоокси)сульфоновая кислота 50 55 17 460 270 1,2 15
(аминоокси)сульфоновая кислота 100 23 21 240 500 1,2 16
N,N-диоктадецилгидроксиламин 10 55 84 380 4700 1,7

Было установлено, что замещенные и незамещенные гидроксиламины являются очень эффективными в высвобождении капсульного полисахарида GBS из клеточной стенки. Данный подход приводит к выделению высокомолекулярного полисахарида GBS с сохраненными N- и O-ацетильными группами. Установлено, что из нескольких подвергнутых скринингу соединений дибензилгидроксиламин является наиболее эффективным. Данные приведены в Таблице 3 ([дибензилгидроксиламин] -50 мМ; pH - 7-8; температура - 50°C; время - 24 часа).

Таблица 3. Данные по высвобождению CP GBS при использовании дибензилгидроксиламина

Тип GBS Ia Ib III Выход при высвобождении полисахарида 86% 81% 46% Общий выход при очистке 63% 54% 30% Молекулярная масса (ММ) 330 кДа 212 кДа 171 кДа O-ацетилирование (ЯМР) н/а 31% 37% N-ацетилирование (ЯМР) 106% 104% 87%

н/а - полисахарид серотипа Ia является не O-ацетилированным.

Поскольку дибензилгидроксиламин плохо растворим в воде, необходимо альтернативное производное гидроксиламина, которое легко растворимо в воде и обладает сходной или более высокой активностью, чем дибензилгидроксиламин. После скрининга нескольких соединений было установлено, что диэтилгидроксиламин является хорошей альтернативой. Данные приведены в Таблице 4 ([диэтилгидроксиламин] -100 мМ;, pH - 7-8; температура - 60°C; время - 19 часов).

Таблица 4. Данные по высвобождению CP GBS при использовании диэтилгидроксиламина

Тип GBS Ia Ib III Выход, %, при высвобождении полисахарида 100 94 59 Молекулярная масса (ММ) 890 кДа 560 кДа 309 кДа

Установлено, что гидроксиламин (NH₂-OH) также эффективен в отщеплении полисахарида CPS от клеточной стенки. Данные приведены в Таблице 5 ([гидроксиламин] -100 мМ; pH - 7-7,5; температура - 65°C; время - 17 часов). Для серотипа III выход составил 54% через 17 часов; однако выход возрастал до 70% через три с половиной дня.

Таблица 5. Данные по высвобождению CP GBS при использовании гидроксиламина

Тип GBS Ia III Выход, %, при высвобождении полисахарида 100 54 Молекулярная масса (ММ) 1160 кДа 500 кДа

Скрининг олигоаминов для высвобождения капсульного полисахарида GBS из клеток

Было установлено, что гидроксиламин и его замещенные соединения являются очень эффективными в отщеплении капсульных полисахаридов от клеточной стенки GBS. Однако было обнаружено, что они менее эффективны в случае серотипов II и V. Таким образом, были протестированы олигоамины из-за предположения, что они могут быть более активными вследствие содержания множества функциональных аминогрупп.

Было обнаружено, что этилендиамин эффективен в высвобождении капсульных полисахаридов всех серотипов. Данные приведены в Таблице 6 ([этилендиамин] -50 или 100 мМ; pH 8,0; 16 час; 80°C; 25 мМ EDTA).

Таблица 6: Данные по высвобождению CP GBS при использовании этилендиамина

Серотип GBS Извлечение (%) ММ (кДа) Ia 96% 242 Ib 83% 225 II 30% 76 III 68% 94 V 30% 235

Другие репрезентативные олигоамины были протестированы на их активность с использованием пасты клеток серотипов Ia и V, однако продемонстрировали меньшую эффективность в отношении серотипа V. Данные приведены в Таблицах 7 ([триэтилентетрамин] -100 мМ; pH - 8,9; температура - 60°C; время - 15 час), 8 ([1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамин] - 10 мМ; pH - 6,3; температура - 60°C; время - 20 час) и 9 ([2,6,10-триметил-2,6,10-триазаундекан] -10 мМ; pH - 7-8; температура - 60°C; время - 19 час).

Таблица 7. Данные по высвобождению CP GBS при использовании триэтилентетрамина

Тип GBS Ia V Выход, %, при высвобождении полисахарида 100 ~10 через 2,5 дня Молекулярная масса (ММ) 1280 н/о

н/о - не определено.

Таблица 8. Данные по высвобождению CP GBS при использовании 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина

Тип GBS Ia V Выход, %, при высвобождении полисахарида 100 ~1% Молекулярная масса (ММ) 980 н/о

н/о - не определено.

Таблица 9. Данные по высвобождению CP GBS при использовании 2,6,10-триметил-2,6,10-триазаундекана

Тип GBS Ia V Выход, %, при высвобождении полисахарида 100 ~1% Молекулярная масса (ММ) 1100 н/о

н/о - не определено.

Пример 3. Конъюгация капсульных полисахаридов GBS методом восстановительного аминирования

Активация полисахарида

Окисление полисахаридов выполняли в 100 мМ калий-фосфатном буфере (pH 6,0±0,5) путем последовательного добавления рассчитанного количества 500 мМ калий-фосфатного буфера (pH 6,0) и воды для инъекций (WFI) до достижения конечной концентрации полисахарида 2,0 г/л. При необходимости, значение pH реакционной смеси доводили до приблизительно pH 6,0. После доведения pH температуру реакционной смеси доводили до 23°C. Окисление начинали путем добавления приблизительно 0,25 молярных эквивалентов периодата натрия. Реакцию окисления проводили при 5±3°C в течение приблизительно 16 часов.

Концентрирование и диафильтрацию активированного полисахарида проводили с использованием кассет для ультрафильтрации с 5K НОММ. Диафильтрацию проводили против 20-кратного диаобъема WFI. Затем очищенный активированный полисахарид хранили при 5±3°C. Очищенный активированный сахарид характеризовали, в частности, путем определения (i) концентрации сахарида колориметрическим методом; (ii) концентрации альдегида колориметрическим методом; (iii) степени окисления и (iv) молекулярной массы методом SEC-MALLS.

Степень окисления (СО=моли сахарной повторяющейся единицы /моли альдегида) активированного полисахарида определяли следующим образом.

Моли сахарной повторяющейся единицы определяли различными колориметрическими методами, например, методом с использованием антрона. В методе с использованием антрона полисахарид сначала расщепляют до моносахаридов при помощи серной кислоты и нагревания. Реагент антрон взаимодействует с гексозами, с образованием окрашенного в желто-зеленый цвет комплекса, поглощение которого определяют спектрофотометрически при 625 нм. В пределах чувствительности метода поглощение прямо пропорционально присутствующему количеству гексозы.

Одновременно также определяют моли альдегида колориметрическим методом с использованием MBTH. Анализ с использованием MBTH включает образование соединения азина в результате реакции альдегидных групп (из конкретного образца) с 3-метил-2-бензотиазолонгидразоном (аналитический реагент MBTH). Избыток 3-метил-2-бензотиазолонгидразона окисляется, с образованием реакционноспособного катиона. Реакционноспособный катион и азин взаимодействуют, с образованием синего хромофора. Затем образовавшийся хромофор определяют спектрофотометрически при 650 нм.

Объединение активированного полисахарида с сахарозным эксципиентом и лиофилизация

Активированный полисахарид объединяли с сахарозой в соотношении 25 граммов сахарозы на грамм активированного полисахарида. Затем находящуюся во флаконе смесь лиофилизировали. После лиофилизации флаконы, содержащие лиофилизированный активированный полисахарид, хранили при -20±5°C. Рассчитанное количество белка CRM₁₉₇ замораживали в емкости и лиофилизировали отдельно. Лиофилизированный CRM₁₉₇ хранили при -20±5°C.

Восстановление лиофилизированного активированного полисахарида и белка-носителя

Лиофилизированный активированный полисахарид восстанавливали в безводном диметилсульфоксиде (DMSO). После полного растворения полисахарида добавляли равное количество безводного DMSO к лиофилизированному CRM₁₉₇ для восстановления.

Конъюгация и кэппирование

Восстановленный активированный полисахарид объединяли с восстановленным CRM₁₉₇ в реакционном сосуде, затем тщательно перемешивали, получая прозрачный раствор, до проведения конъюгации с использованием цианоборгидрида натрия. Конечная концентрация полисахарида в реакционном растворе составляла приблизительно 1 г/л. Конъюгацию начинали путем добавления 1,0-1,5 мЭкв цианоборгидрида натрия в реакционную смесь и инкубации при 23 ± 2°C в течение 20-48 часов. Реакцию конъюгации останавливали добавлением 2 мЭкв боргидрида натрия (NaBH₄) для кэппирования непрореагировавших альдегидов. Эта реакция кэппирования продолжалась при 23±2°C в течение 3±1 час.

Очистка конъюгата

Раствор конъюгата разбавляли 1:10 охлажденной смесью 5 мМ сукцината -0,9% солевого раствора (pH 6,0) в качестве подготовки к очистке методом проточной фильтрации вдоль потока с использованием мембран с 100-300K НОММ.

Разбавленный раствор конъюгата пропускали через 5-мкм фильтр и проводили диафильтрацию с использованием в качестве среды смеси 5 мМ сукцината/0,9% солевого раствора (pH 6,0). После завершения диафильтрации концентрат конъюгата пропускали через 0,22-мкм фильтр. Конъюгат дополнительно разбавляли смесью 5 мМ сукцината/0,9% солевого раствора (pH 6) для доведения концентрации сахарида до приблизительно 0,5 мг/мл. Альтернативно, конъюгат очищали с использованием смеси 20 мМ гистидина/0,9% солевого раствора (pH 6,5) методом проточной фильтрации вдоль потока с использованием мембран с 100-300K НОММ. Выполняли конечный этап фильтрования через 0,22-мкм фильтр, с получением иммуногенного конъюгата.

Пример 4: Эффект различных условий конъюгации на конъюгаты GBS полисахарид-CRM₁₉₇

Конъюгаты полисахаридов GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V получали, намеренно варьируя условия химических реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования (ПО/ВА), включая растворитель для реагента (водная среда против DMSO), варьируя уровни сиаловой кислоты в исходном полисахариде и степень окисления/модификации сахаридного эпитопа. Установлено, что, как правило, конъюгаты, полученные с использованием DMSO в качестве растворителя, имеют более низкие уровни непрореагировавшего (свободного) полисахарида, более высокую молекулярную массу конъюгата и более высокие соотношения сахарид/белок, чем конъюгаты, полученные с использованием водной среды.

Способ конъюгации, который приводит к получению конъюгатов с более низкими уровнями непрореагировавшего (свободного) полисахарида, обладает преимуществами и является предпочтительным. Хорошо известно, что высокие уровни непрореагировавшего (свободного) полисахарида могут вызывать независимый от T-клеток иммунный ответ, который потенциально способен «разбавлять» зависимый от T-клеток ответ, вызываемый полисахарид-белковым конъюгатом, таким образом уменьшая иммунный ответ, вызываемый конъюгатом.

Выбранные полисахариды GBS химически десиалировали методами, известными в данной области (смотри Chaffin, D.O., et al., J Bacteriol 187(13):4615-4626 (2005)), получая варианты конъюгата для определения влияния % десиалирования на иммуногенность. Десиалирование на уровне более приблизительно 40% (то есть уровни сиаловой кислоты менее приблизительно 60%) отрицательно влияет на иммуногенность.

Аналогично, в большинстве случаев степень окисления менее приблизительно 5 или модификации сахаридного эпитопа более приблизительно 20% отрицательно влияют на иммуногенность. Поскольку окисление происходит через сиаловую кислоту на капсульном полисахариде, результаты, очевидно, указывают на то, что модификация сахаридного эпитопа на уровне более приблизительно 20% приводит к уменьшению содержания сиаловой кислоты, что ведет к уменьшению иммуногенности.

Напротив, конъюгаты, имеющие разные соотношения сахарид/белок или молекулярную массу полисахарида, вызывали иммунный ответ у мышей, указывая на относительно широкий диапазон приемлемых критериев для этих показателей.

Также были получены дополнительные варианты конъюгатов с использованием альтернативных химических путей. Один альтернативный химический путь включал получение конъюгатов путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT) и проведения реакции конъюгации в DMSO. В другом альтернативном химическом пути конъюгаты получали путем окисления полисахарида при помощи реагента TEMPO [(2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил] (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией за счет реакции восстановительного аминирования (TEMPO/ВА) в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Показано, что все конъюгаты, полученные с использованием этих альтернативных химических реакций, были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных химических путей помимо ПО/ВА. Однако некоторые варианты реакций конъюгации для одних серотипов были более эффективными, чем для других.

Анализ OPA выполняли в соответствии с публикацией Nanra, J.S., et al., Hum. Vaccin. Immunother., 9(3):480-487 (2013), с заменой изолятами стрептококков группы B изолятов Staphylococcus aureus и пропуском этапа предопсонизации. После дозы 3 (PD3) титры в OPA представляли в виде среднего геометрического для группы из 10-20 мышей, иммунизированных соответствующим конюгатом в дозе 1 мкг/мл.

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ia-CRM₁₉₇

Показано, что конъюгаты, полученные методом ПО/ВА, и активированные полисахариды, имеющие СО 16-17 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 6%), являлись иммуногенными (конъюгаты 1 и 3). Однако использование активированных полисахаридов с СО 5,4 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 19%) отрицательно влияло на иммуногенность (конъюгат 2). Аналогично, при уровне сиаловой кислоты 50% иммунный ответ почти полностью отсутствовал (конъюгат 4). Результаты приведены в Таблице 10.

Таблица 10. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ia-CRM₁₉₇

Конъюгат 1 2 3 4 Растворитель DMSO DMSO Водный DMSO ММ полисахарида (кДа) 190 190 190 190 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 50 % Модификации 6 19 6 6 Степень окисления (СО) 16,8 5,4 16,2 16,4 Соотношение сахарид/белок 0,8 0,8 2,0 1,1 % Свободного сахарида <5 <5 26 <5 ММ конъюгата методом SEC-MALLS, кДа 6040 15390 806 3763 Титр в анализе OPA 300 172 406 68

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов (результаты приведены в Таблице 11). Конъюгат 5 был получен в результате реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Конъюгат 6 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Конъюгат 7 был получен методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгата с высоким соотношением сахарид/белок (С/Б). Конъюгат 8 был получен методом ПО/ВА с использованием полисахарида с низкой ММ (40 кДа). Было показано, что все эти конъюгаты были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как соотношение С/Б и низкая ММ исходного полисахарида.

Таблица 11. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ia-CRM₁₉₇

Конъюгат 5 6 7 8 Реакция конъюгации CDT TEMПО/ВА ПО/ВА ПО/ВА ММ полисахарида (кДа) 383 220 383 40 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 >95 % Модификации н/а 11 6 8 Степень окисления (СО) н/а 9,2 17,5 12 Соотношение сахарид/белок 1,2 0,9 2,5 1 % Свободного сахарида 12,5 11,2 13,3 24,3 ММ методом SEC-MALLS, кДа 7128 1678 4347 2000 Титр в анализе OPA 1028 371 303 1484

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ib-CRM₁₉₇

Конъюгаты, полученные с использованием метода ПО/ВА и активированных полисахаридов с СО 15,8 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 6%) в DMSO, были иммуногенными у мышей (конъюгаты 9 и 11). Конъюгаты, полученные методом ПО/ВА в DMSO, были немного более иммуногенными, чем конъюгат, полученный методом ПО/ВА в водной среде, при том, что все остальные молекулярные показатели конъюгатов были аналогичными (конъюгаты 9 и 11, соответственно). Однако использование активированных полисахаридов с СО 4,7 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 21%) отрицательно влияло на иммуногенность (конъюгат 10). Иммуногенность почти полностью отсутствовала, с очень небольшим числом ответов, в случае конъюгата, полученного с использованием метода ПО/ВА и на 95% десиалированного (уровень сиаловой кислоты 5%) полисахарида (конъюгат 12). Результаты приведены в Таблице 12.

Таблица 12. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ib-CRM₁₉₇

Конъюгат 9 10 11 12 Растворитель DMSO DMSO Водный DMSO ММ полисахарида (кДа) 120 120 120 120 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 5 % Модификации 6 21 6 9 Степень окисления (СО) 15,8 4,7 15,8 11,7 Соотношение сахарид/белок 1,1 1 2 1,1 % Свободного сахарида 11 <5 33 7 ММ методом SEC-MALLS, кДа 2608 7302 381 8418 Титр в анализе OPA 417 159 278 62

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов (результаты приведены в Таблице 13). Конъюгат 13 был получен методом ПО/ВА с использованием полисахарида, исходно имеющего низкий уровень сиалирования (65%). Конъюгат 14 был получен методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгата с высоким соотношением сахарид/белок (С/Б). Конъюгат 15 был получен путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Конъюгат 16 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Было показано, что все эти конъюгаты были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как соотношение С/Б и низкая ММ исходного полисахарида.

Таблица 13. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа Ib-CRM₁₉₇

Конъюгат 13 14 15 16 Реакция конъюгации ПО/ВА ПО/ВА CDT TEMПО/ВА ММ полисахарида (кДа) 141 141 141 150 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде 65 >95 >95 >95 % Модификации 8 7 н/а 13 Степень окисления (СО) 12 14,7 н/а 7,8 Соотношение сахарид/белок 1,06 2,1 1,29 0,85 % Свободного сахарида <5% 16% 21 7 ММ методом SEC-MALLS, кДа 5345 1594 2760 1400 Титр в анализе OPA 246 118 287 548

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа II-CRM₁₉₇

Конъюгаты, полученные с использованием метода ПО/ВА и активированных полисахаридов с СО 4-15 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 7-23%) были иммуногенными у мышей (конъюгаты 17-20). Конъюгат, полученный с использованием метода ПО/ВА и полисахарида с уровнем сиалирования 74% (уровень десиалирования 26%), также был иммуногенным (конъюгат 20). Результаты приведены в Таблице 14.

Таблица 14. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа II-CRM₁₉₇

Конъюгат 17 18 19 20 Растворитель DMSO DMSO Водный DMSO ММ полисахарида (кДа) 95 95 109 109 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 74 % Модификации 8 23 10 7 Степень окисления (СО) 12,6 4,3 9,8 15,2 Соотношение сахарид/белок 0,84 0,90 1,13 0,63 % Свободного сахарида 16 <5 6 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 3600 4650 1611 6140 Титр в анализе OPA 610 967 2149 684

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов (результаты приведены в Таблице 15). Конъюгаты 21 и 22 были получены методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгатов с низким и высоким соотношением сахарид/белок (С/Б), соответственно. Конъюгат 23 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Конъюгат 24 был получен путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Было показано, что все эти конъюгаты были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как соотношение С/Б.

Таблица 15. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа II-CRM₁₉₇

Конъюгат 21 22 23 24 Реакция конъюгации ПО/ВА ПО/ВА TEMПО/ВА CDT ММ полисахарида (кДа) 109 109 109 109 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 >95 % Модификации 10 10 11 н/а Степень окисления (СО) 10 10 8,8 н/а Соотношение сахарид/белок 0,61 2,03 0,66 0,87 % Свободного сахарида <5 25 <5% 12 ММ методом SEC-MALLS, кДа 8850 1480 5270 603 Титр в анализе OPA 3117 891 2167 631

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа III-CRM₁₉₇

Конъюгаты, полученные с использованием метода ПО/ВА и активированных полисахаридов с СО 10-17 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 6-10%) в DMSO, были иммуногенными у мышей (конъюгаты 25 и 30). Конъюгаты с СО 2,9 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 34%) или с высоким соотношением сахарид/белок (2,1) (конъюгаты 26 и 27, соответственно) были относительно менее иммуногенными. Конъюгат, полученный с использованием метода ПО/ВА и полисахарида с уровнем сиалирования 81% (уровень десиалирования 19%), был иммуногенным (конъюгат 30). Однако конъюгат, полученный с использованием полисахарида с уровнем сиалирования 58% (уровень десиалирования 42%), был слабоиммуногенным (конъюгат 29). Конъюгат, полученный методом ПО/ВА в DMSO, был немного более иммуногенным, чем конъюгат, полученный методом ПО/ВА в водной среде, при том, что все остальные молекулярные показатели конъюгатов были аналогичными (конъюгаты 25 и 28, соответственно). Результаты приведены в Таблице 16.

Таблица 16. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа III-CRM₁₉₇

Конъюгат 25 26 27 28 29 30 Растворитель DMSO DMSO DMSO Водный DMSO DMSO ММ полисахарида (кДа) 263 358 358 358 355 358 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 >95 58 81 % Модификации 10 34 6 8 6 6 Степень окисления (СО) 10 2,9 17 13 16 17 Соотношение сахарид/белок 1,1 1,2 2,1 1,7 1,15 1,19 % Свободного сахарида 10 7 24 19 <5 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 2396 14340 3066 1885 5110 4643 Титр в анализе OPA 701 57 252 248 137 505

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов (результаты приведены в Таблице 17). Конъюгаты 31-35 были получены методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгатов с различными значениями ММ. Конъюгат 36 был получен путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Конъюгат 37 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Было показано, что все эти конъюгаты были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как ММ. Конъюгаты, полученные с СО всего 5 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 20%) все еще были иммуногенными у мышей (конъюгат 32 в Таблице 17), в сравнении с конъюгатами, полученными с СО 2,9 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 34%) (конъюгат 26 в Таблице 16 выше).

Таблица 17. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа III-CRM₁₉₇

Конъюгат 31 32 33 34 35 36 37 Реакция конъюгации ПО/ВА ПО/ВА ПО/ВА ПО/ВА ПО/ВА CDT TEMПО/ВА ММ полисахарида (кДа) 353 350 355 50 349 355 355 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 >95 >95 >95 >95 % Модификации 6 5 6 8 20 н/а 10 Степень окисления (СО) 17 19 17 12 5 н/а 10 Соотношение сахарид/белок 0,8 1,1 1,2 0,9 1,0 1,16 0,96 % Свободного сахарида <5 <5 <5 20 <5 <5 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 9278 5291 4982 1201 8024 10740 3415 Титр в анализе OPA 646 204 176 441 1116 448 336

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа IV-CRM₁₉₇

Конъюгаты, полученные с использованием метода ПО/ВА и активированных полисахаридов с СО 6,9-14,2 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 7-14%), были иммуногенными у мышей (конъюгаты 38-41). Конъюгат, полученный с использованием метода ПО/ВА и полисахарида с уровнем сиалирования 60% (уровень десиалирования 40%), также был иммуногенным (конъюгат 41). Результаты приведены в Таблице 18.

Таблица 18. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа IV-CRM₁₉₇

Конъюгат 38 39 40 41 Растворитель DMSO DMSO Водный DMSO ММ полисахарида (кДа) 143 143 133 121 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 60 % Модификации 7 14 7 8 Степень окисления (СО) 14,2 6,9 13,6 13,2 Соотношение сахарид/белок 0,80 0,91 1,92 1,0 % Свободного сахарида <5 <5 33,4 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 8268 10210 657 5691 Титр в анализе OPA 3140 2379 3080 6708

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов. Результаты приведены в Таблице 19. Конъюгаты 42 и 45 были получены методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгатов с высоким СО (более низким уровнем окисления) и высоким соотношением С/Б, соответственно. Конъюгат 43 был получен путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Конъюгат 44 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Все конъюгаты полисахарида серотипа IV были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как соотношение С/Б. Конъюгаты, полученные с СО (более низким уровнем окисления) до по меньшей мере 20 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 5%) все-еще были иммуногенными у мышей.

Таблица 19. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа IV-CRM₁₉₇

Конъюгат 42 43 44 45 Реакция конъюгации ПО/ВА CDT TEMPO ПО/ВА ММ полисахарида (кДа) 143 133 133 140 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95 >95 >95 >95 % Модификации 5 н/а 7 7 Степень окисления (СО) 20 н/а 13,7 14,6 Соотношение сахарид/белок 1,0 0,9 0,52 1,96 % Свободного сахарида <5 <5 6 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 3580 12390 4580 2710 Титр в анализе OPA 8614 1989 7567 3695

Конъюгаты полисахарид GBS серотипа V-CRM₁₉₇

Конъюгаты, полученные с использованием метода ПО/ВА и активированных полисахаридов с СО 4,4-14,6 (модификация сахаридного эпитопа приблизительно 7-23%), были иммуногенными у мышей (конъюгаты 46 и 47). Десиалированный (уровень сиалирования 5%) конъюгат не был иммуногенным (конъюгат 49), и конъюгат, полученный с использованием метода ПО/ВА и водного растворителя, вызывал слабый иммунный ответ (конъюгат 48). Результаты приведены в Таблице 20.

Таблица 20. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования на конъюгаты полисахарид GBS серотипа V-CRM₁₉₇

Конъюгат 46 47 48 49 Растворитель DMSO DMSO Водный DMSO ММ полисахарида (кДа) 132 132 132 132 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >95% >95% >95% 5% % Модификации 7 23 8 6 Степень окисления (СО) 14,6 4,4 12,1 18 Соотношение сахарид/белок 1,32 1,43 1,27 0,94 % Свободного сахарида 11 <5 25,4 <5 ММ методом SEC-MALLS, кДа 4304 14510 573 4847 Титр в анализе OPA 335 181 93 60

Дополнительные варианты конъюгатов получали с использованием альтернативных методов конъюгации и молекулярных показателей конъюгатов. Результаты приведены в Таблице 21. Конъюгаты 50 и 53 были получены методом ПО/ВА с намеренным варьированием параметров конъюгации для получения конъюгатов с более низким уровнем сиалирования (уровень сиалирования 81%) и низкой ММ, соответственно. Конъюгат 51 был получен путем реакции полисахарида с карбонилдитриазолом (CDT), и реакцию конъюгации проводили в DMSO. Конъюгат 52 был получен путем окисления полисахарида с использованием реагента TEMPO (вместо периодата натрия), с последующей конъюгацией методом восстановительного аминирования в DMSO, как подробно описано выше в примере 3. Все конъюгаты полисахарида серотипа V, за исключением конъюгата, полученного с использованием CDT, были иммуногенными у мышей, свидетельствуя о возможности использования альтернативных методов конъюгации, помимо реакций периодатного окисления/восстановительного аминирования, а также альтернативных показателей конъюгатов, таких как ММ. Конъюгат, полученный с использованием CDT, был значительно менее иммуногенным в сравнении с другими конъюгатами, полученными методом ВА. Конъюгат с уровнем сиалирования 81% (конъюгат 50) вызывал более слабый иммунный ответ в сравнении с конъюгатом, имеющим уровень сиалирования >95% (конъюгат 53), однако более сильный, чем в случае конъюгата с уровнем сиалирования 5% (конъюгат 49 в Таблице 20, выше).

Таблица 21. Влияние различных условий метода периодатного окисления/восстановительного аминирования и альтернативных химических методов на конъюгаты полисахарид GBS серотипа V-CRM₁₉₇

Конъюгат 50 51 52 53 Реакция конъюгации ПО/ВА CDT TEMPO ПО/ВА ММ полисахарида (кДа) 159 193 193 37 % Сиаловой кислоты в исходном полисахариде >81% >95% >95% >95% % Модификации 7 н/а 5 10 Степень окисления (СО) 13,5 н/а 18,2 10,3 Соотношение сахарид/белок 1,2 1,14 0,71 0,53 % Свободного сахарида <5 <5 22,3 7,3 ММ методом SEC-MALLS, кДа 3037 4756 3501 3044 Титр в анализе OPA 160,3 101 320 279

Пример 5: Одновалентные конъюгатные вакцины GBS III-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇ вызывали OPA ответ у мышей

Самок мышей CD-1 иммунизировали 1 мкг, 0,1 мкг или 0,01 мкг полисахарида стрептококка группы B (GBS) серотипа III, конъюгированного с CRM₁₉₇ (GBS III-CRM₁₉₇), или GBS серотипа V, конъюгированного с CRM₁₉₇ (GBS V-CRM₁₉₇), три раза подкожно в недели 0, 3 и 6. После третьей дозы (PD3) сыворотку оценивали в анализе опсонофагоцитоза (OPA). Анализы OPA выполняли, как описано в примере 4. Оба конъюгата индуцировали OPA ответы у мышей (Таблица 22). Образцам без поддающегося обнаружению OPA ответа приписывали значение 50.

Таблица 22: Конъюгаты GBS III и GBS V индуцируют OPA ответы у мышей

Тип конъюгата Доза (мкг) Среднее геометрическое значение титра в анализе OPA III 1 701 0,1 103 0,01 50 V 1 378 0,1 204

Пример 6: Одновалентные конъюгатные вакцины GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇ вызывали OPA ответ у мышей

Шесть групп самок мышей CD-1 иммунизировали три раза подкожно вакциной, содержащей 1 мкг отдельного капсульного полисахарида (CP) GBS, конъюгированного с CRM₁₉₇, в недели 0, 3 и 6. Начальные исследования показали, что мыши предварительно не имели титр в анализе OPA ни к одному из шести протестированных серотипов. Сыворотки, полученные в PD3, анализировали в анализе OPA против полисахарида GBS соответствующего серотипа, содержащегося в вакцине. Анализы OPA выполняли, как описано в примере 4. Результаты приведены в Таблицах 23 и 24, ниже.

Таблица 23: Среднее геометрическое значение титра в анализах OPA у мышей после иммунизации отдельными конъюгатами GBS CP-CRM₁₉₇

Серотип Среднее геометрическое значение титра в анализе OPA Ia 300 Ib 417 II 610 III 188 IV 3140 V 378

Таблица 24: Кратность возрастания титра в анализах OPA у мышей после иммунизации отдельными конъюгатами GBS CP-CRM₁₉₇

Серотип Среднее геометрическое значение титра в анализе OPA Ia 6 Ib 8 II 12 III 4 IV 63 V 8

Примечание: Кратность возрастания рассчитывали, считая, что у мышей предварительно отсутствовал титр.

Пример 7: Опсоническая активность сыворотки в сравнении с выделенными IgG от мышей, иммунизированных одновалентными конъюгатными вакцинами GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇

Самок мышей CD-1 или BALB/c иммунизировали 1 мкг отдельного GBS CP, конъюгированного с CRM₁₉₇, три раза подкожно в недели 0, 3 и 6. В качестве адъюванта использовали либо AlPO₄, либо QS-21. Сыворотку, полученную в PD3, тестировали в специфическом для серотипа анализе OPA, а затем выделяли фракцию иммуноглобулинов G и тестировали на OPA активность. OPA активность очищенных IgG была нормирована на 5 мг/мл (в диапазоне количества IgG в нормальной мышиной сыворотке). Все шесть конъюгатов GBS CP вызывали продуцирование IgG антител с опсонической активностью (Фигура 1).

Пример 8: Одновалентные конъюгатные вакцины GBS Ia-TT, GBS Ib-TT, GBS II-TT, GBS III-TT, GBS IV-TT и GBS V-TT индуцировали OPA ответы у кроликов

Кроликов иммунизировали три раза по 50 мкг/мл полисахарида GBS серотипа Ia, конъюгированного с токсоидом столбняка, 10 мкг/мл полисахарида GBS серотипа Ib, конъюгированного с токсоидом столбняка, 50 мкг/мл полисахарида GBS серотипа II, конъюгированного с токсоидом столбняка, 50 мкг/мл полисахарида GBS серотипа III, конъюгированного с токсоидом столбняка, 50 мкг/мл полисахарида GBS серотипа IV, конъюгированного с токсоидом столбняка, или 50 мкг/мл полисахарида GBS серотипа V, конъюгированного с токсоидом столбняка, используя в качестве адъюванта полный адъювант Фрейнда в первой дозе и неполный адъювант Фрейнда во второй и третьей дозах. Конъюгаты были получены с использованием полисахаридов, имеющих уровень сиаловой кислоты >95%, и химической реакции с CDAP (1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборат). Иммунные ответы в день PD3 определяли в анализе OPA, как описано в примере 4. Титры сыворотки приведены в Таблице 25, а титры очищенных IgG приведены в Таблице 26, ниже. Полисахариды GBS серотипа Ia, Ib, II, III, IV и V, конъюгированные с TT, проявляли высокую иммуногенность у кроликов.

Таблица 25: Среднее геометрическое значение титра в анализах OPA сыворотки кроликов после иммунизации отдельными конъюгатами GBS CP-TT

Серотип GBS Среднее геометрическое значение титра в анализе OPA Ib 11550 II 36753 IV 34345

Таблица 26: Среднее геометрическое значение титра в анализах OPA очищенных кроличьих IgG после иммунизации отдельными конъюгатами GBS CP-TT

Серотип GBS Среднее геометрическое значение титра в анализе OPA (1 мг/мл оч. Ат) Ia 7190 Ib 2817 II 41870 III 40146 IV 15565 V 12124

Пример 9: Шестивалентная конъюгатная вакцина GBS индуцировала OPA ответ у приматов

Три группы макак-резусов иммунизировали шестивалентной вакциной против стрептококка группы B (GBS6) внутримышечно три раза в недели 0, 4 и 8. Вакцина GBS6 содержала GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇. Для животных в двух группах использовали фосфат алюминия (AlPO₄) в качестве адъюванта и дозы либо 5 мкг каждого конъюгата, либо 50 мкг каждого конъюгата. Животным в третьей группе вводили 5 мкг каждого конъюгата без адъюванта. В Таблице 27, ниже, приведена схема иммунизации.

Таблица 27: Схема иммунизации макак-резусов

Группа Кол-во приматов Доза вакцины
(каждого конъюгата) Квасцы в виде AlPO4
(мг/мл) Объем вводимой вакцины Доставка Расписание иммунизации (недели) 1 10 5 мкг 0,5 1,0 мл в/м 0, 4, 8 2 10 50 мкг 0,5 1,0 мл в/м 0, 4, 8 3 10 5 мкг нет 1,0 мл в/м 0, 4, 8

Преиммунную сыворотку и сыворотку, полученную в день PD3, анализировали в анализе OPA для полисахаридов всех шести серотипов GBS, содержащихся в вакцине. Анализы OPA выполняли, как описано в примере 4. Результаты приведены в Таблицах 28 и 29, ниже. В случае всех шести серотипов препараты с адъювантом AlPO₄ вызывали поддающийся обнаружению OPA ответ (увеличение титров от состояния до иммунизации до дня PD3, или кратность увеличения пре/PD3 >1). Доза 5 мкг конъюгата без адъюванта вызывала поддающиеся обнаружению OPA ответы в случае пяти из шести серотипов.

Таблица 28: Среднее геометрическое значение титра в анализах OPA у макак-резусов до и после иммунизации GBS6

5 мкг+AlPO₄ 50 мкг+AlPO₄ 5 мкг без адъюванта Серотип Пре PD3 Пре PD3 Пре PD3 Ia 97 2907 118 8106 166 69 Ib 53 3821 53 2957 50 313 II 54 980 62 764 61 362 III 105 7759 204 8448 762 4515 IV 78 2350 89 3331 309 899 V 233 5556 442 16476 6192 4226

Таблица 29: Кратность возрастания титра в анализах OPA у макак-резусов после иммунизации GBS6

Серотип 5 мкг+AlPO₄ 50 мкг+AlPO₄ 5 мкг без адъюванта Ia 30 69 4 Ib 72 56 6 II 18 12 6 III 74 41 6 IV 30 37 3 V 24 37 1

Пример 10: Шестивалентная конъюгатная вакцина GBS индуцировала OPA ответ у крыс

Самок крыс Sprague-Dawley иммунизировали дважды подкожно дозой 5 мкг/мл каждого конъюгата в полисахаридной конъюгатной вакцине GBS6, как описано в примере 9, сформулированной либо с фосфатом алюминия (AlPO₄), либо без него. Две сыворотки, преиммунную (исходную) и после введения дозы, оценивали на титры в анализе OPA против полисахаридов всех шести соответствующих серотипов GBS. Титры в анализе OPA измеряли для каждого серотипа GBS в формате 384-луночного анализа и рассчитывали кратность возрастания титра. Крысы, которым вводили вакцину GBS6, имели сильный иммунный ответ в виде продуцирования функциональных антител против полисахарида каждого серотипа после введения второй дозы; в отсутствие AlPO₄ наблюдали возрастание титров от 7 до 205 раз в случае разных серотипов, причем в присутствии адъюванта это возрастание составляло от 11 до 294 раз (Таблица 30).

Таблица 30. Кратность возрастания после дозы 2 (PD2) титров в анализе опсонофагоцитарной активности (OPA) у крыс, иммунизированных шестивалентной конъюгатной вакциной GBS

Кратность возрастания среднего геометрического значения титра от преиммунной до PD2 сыворотки в анализе OPA Серотип GBS Без AlPO₄ С AlPO₄ Ia 36 11 Ib 7 39 II 205 294 III 107 141 IV 45 33 V 185 195

Пример 11: Иммунизация беременных самок одновалентной или шестивалентной гликоконъюгатной вакциной GBS продемонстрировала защитный эффект от инфекции GBS III или V у их потомства после рождения

Самок мышей CD-1 иммунизировали три раза подкожно вакциной GBS6, как описано в примере 9, содержащей 5 мкг/мл каждого конъюгата и 100 мкг/мл AlPO₄, одновалентной гликоконъюгатной вакциной GBS III или V (каждая из которых содержала 10 мкг/мл конъюгата и 100 мкг/мл AlPO₄) или только контрольным растворителем. Мышам давали возможность спариваться до проведения третьей иммунизации. Потомству иммунизированных мышей вводили летальную дозу бактерий какого-либо из серотипов: GBS серотипа III или GBS серотипа V в соответствии с полученной ими вакциной, и выживаемость контролировали в течение 90 часов. Иммунизация самок GBS6+AlPO₄ или GBS III-CRM₁₉₇+AlPO₄ приводила к значительной степени защиты (p<0,0001) их потомства от летальной введенной дозы бактерий GBS серотипа III. Аналогично, иммунизация самок GBS V-CRM₁₉₇+AlPO₄ приводила к значительной степени защиты (p<0,0001) их потомства от летальной введенной дозы бактерий GBS серотипа V. Результаты приведены в Таблице 31.

Таблица 31: Иммунизация одновалентной и шестивалентной вакциной против GBS приводила к увеличению выживаемости потомства

Количество выжившего потомства/всего потомства (% выживаемости) Серотип, используемый для заражения Потомство иммунизированных GBS6 самок Потомство иммунизированных соответствующей одновалентной вакциной самок Потомство иммунизированных растворителем самок III 20/22 (91%) 28/28 (100%) 9/29 (31%) V 35/40 (85%) 3/27 (11%)

Пример 12: Пассивная иммунизация анти-GBS III моноклональными антителами новорожденных крыс продемонстрировала защитный эффект

Моноклональные антитела (мАт) против стрептококка группы B серотипа III (GBS III) получали путем иммунизации мышей пятивалентной вакциной, содержащей полисахариды серотипов Ia, Ib, II, III и V. Клоны специфичных для GBS III мАт отбирали, и мАт, узнающие CP GBS III, получали с использованием стандартных методов. мАт против GBS серотипа III пассивно вводили новорожденным крысам (n=10 на группу; показаны результаты 2 независимых экспериментов) за 16 часов до заражения клиническим изолятом GBS III. Через четыре часа после заражения кровь собирали, и подсчитывали КОЕ остаточных бактерий. Введение анти-GBS III мАт приводило к уменьшению КОЕ для остаточных бактерий у новорожденных крыс на 4 log или более (Таблица 32).

Таблица 32: Анти-GBS III мАт приводили к уменьшению КОЕ остаточных бактерий у новорожденных крыс

Воздействие КОЕ остаточных бактерий (log) Эксперимент 1 Анти-GBS III мАт 1,8 Контроль 7,5 Эксперимент 2 Анти-GBS III мАт 2,4 Контроль 6,4

Пример 13: Пассивная иммунизация моноклональными антителами против GBS Ib, III и V беременных мышей продемонстрировала защитный эффект для их потомства после рождения

Моноклональные антитела (мАт) получали от мышей, иммунизированных пятивалентной вакциной (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇), с использованием стандартных методов. Были идентифицированы мАт, специфически узнающие капсульные полисахариды каждого из пяти серотипов. Дозы 500 мкг/мл мАт против GBS серотипа Ib (GBS Ib), мАт против GBS серотипа III (GBS III), мАт против GBS серотипа V (GBS V) или контрольных по изотипу мАт пассивно вводили беременным мышам приблизительно за 24-48 часов до родов. Через 24-48 часов после рождения потомство иммунизированных самок мышей заражали летальной дозой бактерий GBS Ib, GBS III или GBS V. Выживаемость контролировали в течение 96 часов. Значительно более высокая степень выживаемости была отмечена у потомства, рожденного от самок, иммунизированных анти-GBS Ib мАт, анти-GBS III мАт или анти-GBS V мАт, в сравнении с контрольными мАт, после заражения GBS (Таблица 33).

Таблица 33: Анти-GBS III и V мАт приводили к увеличению выживаемости потомства

% Выживаемости потомства, рожденного от самок, пассивно иммунизированных: Серотип GBS при заражении Соответствующим мАт Контрольным мАт Ib 80 0 III 93 0 V 100 12

Пример 14: Стабильность конъюгатов GBS

GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇ отдельно формулировали в 10 мМ сукцинат-фосфатном буфере с 155 мМ NaCl при разных значениях pH для тестирования стабильности конъюгатов в условиях ускоренного старения препаратов. Изменение, в процентах, молекулярной массы, определяемой методом SEC-MALLS, определяли после 4 недель хранения при 50°C. Результаты представлены на Фигурах 2-7.

Конъюгаты GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇ и GBS IV-CRM₁₉₇ тестировали на стабильность сиалирования в различных условиях буфера, приведенных в Таблице 34. Содержание свободной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты; NANA) измеряли методом ВЭЖХ после 1 месяца хранения при 37°C. Результаты представлены на Фигуре 8.

Оба исследования показали, что конъюгаты лучше сохранялись при pH выше 6,0 и, не обязательно, при pH приблизительно 6,5.

Таблица 34. Условия буфера для тестирования стабильности сиалирования

pH Соль Концентрация соли (мМ) Буфер Концентрация буфера (мМ) 5,8 Нет 0 Сукцинат 10 6,2 Нет 0 Сукцинат 10 6,6 Нет 0 Сукцинат 10 6,9 Нет 0 Сукцинат 10 5,8 NaCl 150 Сукцинат 10 6,3 NaCl 150 Сукцинат 10 6,6 NaCl 150 Сукцинат 10 6,9 NaCl 150 Сукцинат 10 6,1 Нет 0 Гистидин 10 6,5 Нет 0 Гистидин 10 6,9 Нет 0 Гистидин 10 6,1 NaCl 150 Гистидин 10 6,5 NaCl 150 Гистидин 10 6,9 NaCl 150 Гистидин 10

Пример 15: Препарат GBS6

Для определения предпочтительного буфера GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇ (GBS6) формулировали с использованием условий буфера, указанных в Таблице 33, выше. Фактическое значение pH препаратов определяли в следующих временных точках: 0 (в момент создания препарата), через 1 месяц при 5°C, через 1 месяц при 25°C и через 1 месяц при 37°C. Смещение pH было отмечено в препаратах в случае использования сукцината в качестве буфера, в то время как смещение отсутствовало в препаратах, полученных с использованием гистидина в качестве буфера. Результаты представлены на Фигурах 9-10.

Также тестировали эффект концентрации гистидинового буфера на связывание конъюгатов GBS с алюминием. Препарат, содержащий 150 мМ NaCl, 0,01% полисорбата-80 при pH 6,5 и 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO4, тестировали с конъюгатами в двух разных концентрациях (10 мкг/мл и 40 мг/мл каждого серотипа) и гистидином в нескольких разных концентрациях. Процентную долю конъюгатов, связанных с алюминием, определяли путем измерения общего количества каждого из конъюгатов в вакцине и количества каждого из конъюгатов, связанных с алюминием. Количество связанных конъюгатов определяли путем центрифугирования вакцинного препарата, ресуспендирования осадка алюминия, солюбилизации алюминия и количественного определения связанных конъюгатов методом нефелометрии со специфическими для серотипа поликлональными антителами против каждого из серотипов. Результаты представлены на Фигурах 11-12. Было установлено, что концентрация гистидинового буфера влияла на количество, в процентах, конъюгата каждого серотипа, связанного с алюминием, и влияние было более выраженным при более низкой дозе, чем при более высокой дозе.

Проводили исследования со встряхиванием для определения предпочтительного количества полисорбата-80 (PS80). Препараты GBS6, содержащие 20 мМ гистидина, 150 мМ NaCl, 0,5 мг/мл AlPO₄ (при наличии) и либо не содержащие PS80, либо содержащие 0,01% PS80, 0,02% PS80 или 0,03% PS80 при pH 6,5, тестировали на потерю, в процентах, общей антигенности, при стрессе, вызываемом встряхиванием. Шприцы, предварительно заполненные препаратами, встряхивали при 500 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. Контрольные образцы (без встряхивания) хранили при комнатной температуре в течение 72 часов. Результаты представлены на Фигуре 13.

Также тестировали концентрацию алюминия в препаратах GBS6 для определения ее влияния на связывание конъюгатов GBS с алюминием. Препараты GBS6, содержащие 10 мМ гистидина, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и фосфат алюминия (AlPO₄) в концентрации или 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,75 мг/мл, или 1,0 мг/мл алюминия при pH 6,5, тестировали на количество, в процентах, конъюгата, связанного с алюминием. Выраженное в процентах связывание с AlPO₄ увеличивалось с увеличением концентрации AlPO₄. Результаты представлены на Фигуре 14.

Пример 16: Лиофилизированный препарат GBS6

Различные лиофилизированные препараты GBS6 (GBS Ia-CRM₁₉₇, GBS Ib-CRM₁₉₇, GBS II-CRM₁₉₇, GBS III-CRM₁₉₇, GBS IV-CRM₁₉₇ и GBS V-CRM₁₉₇) тестировали на стабильность. Препараты в низкой (10 мкг/мл) и высокой (50 мкг/мл) дозе, содержащие 20 мМ гистидина при pH 6,5, 0,02% PS80, приблизительно 28 мМ NaCl и либо 5,5%, 7,0%, либо 8,5% (масс./об.) сахарозы, лиофилизировали. Стабильность лиофилизированных препаратов тестировали путем измерения pH и содержания влаги через 4 месяца при 5°C, 4 месяца при 37°C и 1 месяц при 50°C. Все препараты были стабильны в отношении значения pH и содержания влаги (данные не представлены). Кроме того, восстановление антигенности, в процентах, для каждого серотипа тестировали для всех препаратов через 1, 4 и 9 месяцев как при 5°C, так и при 37°C, а также через 1, 2 и 4 недели при 50°C. Результаты представлены на Фигурах 15-20.

Следующие вариации в эксципиентах также использовали и оценивали для дозы 40 мкг/мл препарата GBS6: 1) 7% (масс./об.) сахарозы, 2) 2% (масс./об.) сахарозы и 4% (масс./об.) маннита, 3) 3% (масс./об.) сахарозы и 3% (масс./об.) маннита, 4) 2% (масс./об.) сахарозы и 4% (масс./об.) глицина или 5) 3% (масс./об.) сахарозы и 3% (масс./об.) глицина. Значение pH и содержание влаги во всех пяти препаратах были стабильны через 3 месяца при 5°C, 3 месяца при 25°C, 3 месяца при 37°C и 1 месяц при 50°C (данные не представлены). Кроме того, восстановленную антигенность, в процентах, для каждого серотипа тестировали для всех препаратов после хранения в течение 1, 3 и 7 месяцев при 2-8°C, 25°C и 37°C, а также через 1, 2 и 4 недели при 50°C. Результаты представлены на Фигурах 21-25.

Количество, в процентах, антигена, связанного с адъювантом фосфатом алюминия в вакцине GBS6, в случае восстановленного лиофилизированного препарата и жидкого препарата, тестировали методом нефелометрии. Как лиофилизированный, так и жидкий, препараты, содержащие 20 мМ гистидина, 0,02% PS80, 7,0% (масс./об.) сахарозы и 500 мкг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, готовили в низкой (10 мкг/мл) и высокой (50 мкг/мл) дозах. Также тестировали разные концентрации хлорида натрия (NaCl) для определения их влияния на связывание антигена. Результаты для лиофилизированных препаратов и жидких препаратов приведены в Таблицах 35 и 36, соответственно. Как лиофилизированные, так и жидкие, препараты в низкой дозе демонстрировали сопоставимые результаты при использовании концентраций NaCl приблизительно 150 мМ и выше.

Таблица 35. Связывание, в процентах, антигена с фосфатом алюминия в восстановленных лиофилизированных препаратах с разными уровнями NaCl

NaCl (мМ) Ia (%) Ib (%) II (%) III (%) IV (%) V (%) 10 мкг/мл каждого конъюгата с/7,0% сахарозы ~23 40 36 31 34 38 39 ~80 46 45 37 40 44 44 ~150 78 69 63 62 82 84 ~300 77 64 63 60 79 86 50 мкг/мл каждого конъюгата с/7,0% сахарозы ~23 21 23 24 18 27 24 ~34 24 23 23 21 27 40 ~150 66 58 52 46 65 67 ~300 65 56 50 48 66 64

Таблица 36. Связывание, в процентах, антигена с фосфатом алюминия в жидких препаратах с разными уровнями NaCl

NaCl (мМ) Ia (%) Ib (%) II (%) III (%) IV (%) V (%) 10 мкг/мл каждого конъюгата 40 78,4 72,4 62,9 73,3 70,9 70,8 100 61,0 63,3 52,3 51,9 49,8 53,9 150 72,7 77,0 68,1 67,1 64,0 71,0 200 67,7 73,0 58,6 52,3 51,9 60,1 300 78,3 79,2 71,1 57,1 58,0 74,1 50 мкг/мл каждого конъюгата 100 50,5 38,3 49,0 52,8 51,7 37,9 150 49,8 37,6 49,0 50,8 50,9 38,7 200 40,1 35,9 45,3 47,4 44,0 34,7 300 40,3 41,9 50,9 42,2 43,5 37,5

Пример 17: Особенности ресуспендирования препаратов GBS6

Готовили препараты GBS6, содержащие 240 мкг/мл (высокую) или 60 мкг/мл (низкую) общую дозу полисахарид-белковых конъюгатов, 20 мМ гистидина, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5. Аналогичные одновалентные препараты для каждого серотипа также готовили в дозах 240 мкг/мл (высокой) или 60 мкг/мл (низкой). Образцы помещали либо в 1) 2-мл стеклянные флаконы с объемом наполнения 0,73 мл на флакон, либо в 2) BD HYPAK SCF™ PRTC (Becton, Dickinson и Company) 1-мл короткие стеклянные предварительно заполненные шприцы (PFS) с объемом наполнения 0,58 мл, укупоренные 4432/50 пробками (West Pharmaceutical Services, Inc.), сохраняя свободное пространство над продуктом приблизительно 5±1 мм. Препараты во флаконах хранили в вертикальном положении, а препараты в PFS хранили в двух разных положениях, а именно, кончиком вниз и горизонтально, при 5°C.

Ресуспендирование характеризовали по количеству встряхиваний, необходимых для полного ресуспендирования препаратов после 2 недель и 3 месяцев хранения. Потребовалось менее 5 встряхиваний для ресуспендирования всех препаратов, помещенных во флаконы, после 2 недель и 3 месяцев хранения. При горизонтальном хранении для препарата GBS6 в низкой дозе в PFS потребовалось лишь 3 встряхивания после 3 месяцев хранения. Однако для препаратов в низкой дозе потребовалось приблизительно 15 встряхиваний для ресуспендирования при хранении в PFS в положении кончиком вниз, как через 2 недели, так и через 3 месяца хранения. Для сравнения, препараты в высокой дозе, хранившиеся в PFS, было трудно ресуспендировать независимо от положения при хранении. Для препарата GBS6 в высокой дозе потребовалось более 50 встряхиваний даже при хранении в горизонтальном положении. Кроме того, число встряхиваний, необходимых для ресуспендирования препарата в высокой дозе, возрастало с течением времени. Приблизительно 100 встряхиваний потребовалось для полного ресуспендирования препаратов GBS6 в высокой дозе, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз в течение вплоть до 16 часов после наполнения (T0), и это число возрастало до более 200 встряхиваний в случае хранения в течение 3 месяцев. И наконец, некоторые одновалентные препараты, полученные с использованием полисахаридных конъюгатов для серотипов Ia, III, IV и V, было трудно ресуспендировать после хранения в PFS в обоих положениях, и требовалось больше встряхиваний для ресуспендирования с течением времени, свидетельствуя о том, что особенности ресуспендирования одновалентных препаратов зависели от серотипа. Результаты сравнения ресуспендирования GBS6 и одновалентных препаратов в высокой и низкой дозах, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз, в моменты времени T0, 2 недели и 3 месяца представлены на Фигуре 26. Результаты сравнения ресуспендирования GBS6 и одновалентных препаратов в высокой и низкой дозах, хранившихся в PFS в положении кончиком вниз и горизонтально, представлены на Фигуре 27.

Препараты GBS6 в высокой и низкой дозах также тестировали для определения того, будет ли влиять на ресуспендирование длительное хранение во флаконах, PFS в положении кончиком вниз и PFS в горизонтальном положении. Кроме того, препарат в средней дозе (общая доза полисахарид-белковых конъюгатов 120 мкг/мл) также тестировали для сравнения с препаратами в низкой и высокой дозах. Было обнаружено, что препарат в низкой дозе становилось труднее ресуспендировать через 6 месяцев хранения в PFS в положении кончиком вниз, для этого требовалось более 50 встряхиваний. Препарат в средней дозе было трудно ресуспендировать после лишь 1 месяца хранения в PFS в положении кончиком вниз, и потребовалось 30 встряхиваний для его ресуспендирования после 1 месяца хранения в PFS в горизонтальном положении. Результаты приведены в Таблице 37.

Таблица 37. Сравнение особенностей ресуспендирования препаратов GBS6 в трех разных дозах, хранившихся во флаконах и предварительно заполненных шприцах

Контейнер Время хранения при 2-8°C (месяцы) Число встряхиваний для ресуспендирования Низкая доза Средняя доза Высокая доза PFS (кончиком вниз) 6 >50 >50* >50 PFS (горизонтально) 6 <10 30* >50 Флакон 11 <10 н/т <10

*время хранения 1 месяц;

н/т - не тестировали.

В данных исследованиях было определено, что трудности, связанные с ресуспендированием, могут быть уменьшены за счет хранения препаратов, содержащих 20 мМ гистидина, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг /мл AlPO4 при pH 6,5, во флаконах или PFS в горизонтальном положении. Однако ресуспендирование может происходить в приемлемых границах (то есть с использованием менее 10 встряхиваний) только для препаратов, хранившихся в PFS в горизонтальном положении, которые содержат общую дозу полисахарид-белковых конъюгатов 60 мкг/мл или менее.

Проводили дополнительные исследования для тестирования эффекта трех физических свойств на ресуспендирование: (1) поверхностного заряда или дзета-потенциала с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd.); (2) размера частиц с использованием лазерного дифракционного анализатора размера частиц Mastersizer 3000 (Malvern Instruments Ltd.); и (3) скорости седиментации, или осаждения, с использованием дисперсионного анализатора LUMISIZER^® (L.U.M. GmbH). Значения дзета-потенциала AlPO₄ и конъюгатов GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V в зависимости от pH представлены на Фигурах 28 и 29, соответственно. Дзета-потенциал и размеры частиц различных препаратов GBS6 и одновалентных препаратов GBS приведены в Таблице 38. Значения дзета-потенциала 15 препаратов составляли приблизительно от -7 до -10 мВ. Отсутствовала корреляция между поверхностным зарядом и ресуспендированием для этих образцов. С другой стороны, на ресуспендирование влиял размер частиц. Размер частиц в препаратах с низкой дозой был выше, чем в препаратах с высокой дозой, в случае GBS6 и одновалентных препаратов, и в целом, чем меньше был размер частиц, тем труднее было однородно ресуспендировать препарат.

Таблица 38. Сравнение дзета-потенциала и размера частиц GBS6 и одновалентных препаратов в высокой и низкой дозах

Препарат Конц. (мкг/мл) Дзета-потенциал (мВ) Размер частиц Кол-во встряхиваний в T0 D10 (мкм) D50 (мкм) D90 (мкм) 1 GBS Шестивалентная 60 -7,1 6,3 11,6 24,5 17 2 240 -8,5 4,2 7,1 12,6 96 3 Одновалентная типа Ia 60 -8,8 6,1 11,8 25,1 16 4 240 -10,0 4,3 7,2 14,3 33 5 Одновалентная типа Ib 60 -8,7 6,7 12,4 23,1 21 6 240 -10,2 4,0 7,2 14,1 27 7 Одновалентная типа II 60 -8,0 6,7 12,9 25,5 16 8 240 -7,1 3,9 7 15 29 9 Одновалентная типа III 60 -9,6 11 20,8 37,3 16 10 240 -9,6 4,8 9,1 32,6 34 11 Одновалентная типа IV 60 -9,0 5,4 9,1 16,4 17 12 240 -7,1 3,8 7,7 22,9 95 13 Одновалентная типа V 60 -7,7 5,3 9,1 17,0 15 14 240 -8,3 4,1 7,2 13,0 62 15 AlPO₄ плацебо 500 -9,1 4,4 7,1 11,6 11

Измеряли скорость седиментации алюминиевых частиц в препаратах во временных точках 0, 2 недели и 3 месяца. Препараты в высокой дозе демонстрировали меньшую скорость седиментации, чем препараты в низкой дозе. Скорость седиментации не изменялась после трех месяцев хранения при 5°C. Наблюдали прямую корреляцию между ресуспендированием и скоростью седиментации: при более высокой скорости седиментации было легче ресуспендировать препарат. Кроме того, препараты в низкой дозе, в которых частицы были большего размера, чем в препаратах в высокой дозе, отличались более высокой скоростью седиментации и более легким ресуспендированием. Данные представлены на Фигуре 30.

Пример 18: Эффект факторов препарата GBS6 на скорость седиментации

Изучали влияние факторов препарата, таких как концентрация антигена, pH и концентрация соли, на характеристики ресуспендирования. Во-первых, исследовали препараты GBS6 с разными концентрациями антигена в гистидиновых буферах с pH 6,5. Результаты данного исследования показали, что более высокая концентрация антигена приводит к более низкой скорости оседания (смотри Фигуру 31; дозы показаны для каждого серотипа), что вызвало бы трудности при ресуспендировании. При низких концентрациях частицы могли свободно осаждаться, не мешая друг другу за счет столкновений и/или броуновского движения.

Во-вторых, исследовали особенности осаждения препаратов GBS6 при общих концентрациях антигена 60 мкг/мл и 300 мкг/мл в гистидиновых буферах с pH 6,0, 6,5 и 7,0. Результаты изучения особенностей осаждения препаратов GBS6 с концентрацией 60 мкг/мл показали, что pH оказывает существенное влияние на скорость седиментации. Однако pH не оказывал существенное влияние на скорость седиментации препарата GBS6 с концентрацией 300 мкг/мл. Данные представлены на Фигуре 32. Поверхностный заряд AlPO₄ уменьшался от -10,3 мВ до -7,9 мВ, когда значение pH уменьшалось от 7,0 до 6,0 (данные не представлены). Как правило, высокий дзета-потенциал свидетельствовал бы о том, что частицы полностью диспергированы в среде из-за доминирующих сил отталкивания, которые существуют между частицами. В этом случае частицы находятся в суспензии в виде отдельных единиц, и скорость седиментации часто является низкой из-за широкого распределения частиц по размерам, вследствие чего частицы осаждаются с разными скоростями.

И наконец, также изучали влияние ионной силы на физико-химические свойства AlPO₄ и его последующее влияние на свойства суспензии. Готовили препараты GBS6 с тремя разными уровнями доз (общая концентрация антигена 60 мкг/мл, 150 мкг/мл и 20 мкг/мл) и двумя разными концентрациями NaCl (22 мМ и 150 мМ). Значения дзета-потенциала становятся более отрицательными при низких концентрациях соли. Препараты GBS6 во всех трех дозах с минимальной концентрацией соли (22 мМ) были заряжены отрицательно. Значения дзета-потенциала составляли от приблизительно -16 до приблизительно -17 мВ. Для сравнения, препараты GBS6 в высокой и низкой дозе с 150 мМ NaCl имели дзета-потенциал приблизительно -8 мВ. Более высокая концентрация соли приводила к уменьшению поверхностного заряда и увеличению скорости оседания, что могло бы приводить к большей легкости ресуспендирования. Данные представлены на Фигуре 33 и в Таблице 39.

Таблица 39. Сравнение дзета-потенциала и размера частиц препаратов GBS6 в разных дозах и с разными концентрациями NaCl

Препарат Дзета-потенциал
(мВ) Размер частиц D10 (мкм) D50 (мкм) D90 (мкм) 1 GBS6, низкая доза и низкая концентрация соли (общая доза антигена 60 мкг/мл с/22 мМ NaCl) -15,9 5,4 10,0 20,2 2 GBS6, средняя доза и низкая концентрация соли (общая доза антигена 150 мкг/мл с/22 мМ NaCl) -17,0 3,8 7,8 19,7 3 GBS6, высокая доза и низкая концентрация соли (общая доза антигена 240 мкг/мл с/22 мМ NaCl) -17,0 3,9 7,0 14,3 4 GBS6, низкая доза и высокая концентрация соли (общая доза антигена 60 мкг/мл с/150 мМ NaCl) -7,1 6,3 11,6 24,5 5 GBS6, высокая доза и высокая концентрация соли (общая доза антигена 240 мкг/мл с/150 мМ NaCl) -8,5 4,2 7,1 12,6

Пример 19: Особенности ресуспендирования разных антигенов и солей алюминия

Проводили исследование для дальнейшего изучения того, является ли корреляция между концентрацией антигена и трудностью ресуспендирования препарата характерной для GBS или общей особенностью и для других антигенов, таких как белки, полисахариды и не GBS полисахарид-белковые конъюгаты. Препараты, содержащие CRM₁₉₇; сочетание полисахаридов из GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V; BSA или сочетание 20 пневмококковых полисахарид-белковых конъюгатов (20vPnC) формулировали в той же высокой дозе (общая доза антигена 240 мкг/мл), в той же буферной матрице и с содержанием 0,5 мг/мл адъюванта AlPO₄, что и препараты GBS, протестированные в примерах 17 и 18. Препарат GBS6, сформулированный с алгидрогелем^® 85 (Brenntag Biosector A/S), также включали в качестве компаратора. Образцы тестировали на следующие характеристики: 1) время ресуспендирования (время, необходимое для ресуспендирования осадка в 1,5-мл центрифужных пробирках в шейкере с ручным приводом после 30-45 минут центрифугирования при 200 об/мин), 2) оседание в цилиндрах под визуальным наблюдением (высота осадочного слоя через разные интервалы времени), 3) размер частиц, 4) поверхностный заряд и 5) распределение частиц по размерам с использованием микроскопа MICRO-FLOW IMAGING^® (MFI) Flow DPA 4200 (Brightwell Technologies Inc.).

Разные антигены продемонстрировали различные особенности оседания и ресуспендирования (данные представлены на Фигуре 34 и в Таблице 40, соответственно). Как было отмечено ранее, препараты, которые осаждались быстрее, было легче ресуспендировать. Отсутствовала корреляция между ресуспендированием и средним размером частиц или распределением частиц по размерам. Данные по распределению частиц по размерам представлены на Фигурах 35A и 35B. Однако препараты GBS6, содержащие алгидрогель^® 85, было легче всего ресуспендировать, и они отличались значительно более крупным размером частиц, более высокой скоростью оседания и низким поверхностным зарядом, свидетельствуя о том, что размер частиц и поверхностный заряд коррелируют с легкостью ресуспендирования. Следует отметить, что гидроксид алюминия заряжен положительно при pH 6,5, в то время как конъюгаты заряжены отрицательно, что приводит к более сильному электростатическому взаимодействию и более высокой нейтрализации заряда. Напротив, AlPO₄ заряжен отрицательно при pH 6,5.

Таблица 40. Сравнение размера частиц, времени ресуспендирования и дзета-потенциала разных антигенных препаратов

Антиген Размер частиц Время ресуспендирования (сек) Дзета-потенциал(мВ) D10 D50 D90 GBS6 4,5 7,4 12,6 75 -8,1 CRM₁₉₇ 5,1 7,4 11,1 20 -6,4 Полисахариды GBS 4,8 6,9 9,7 10 -7,1 BSA 4,8 6,9 10,1 15 -6,6 20vPnC 7,7 14,8 28,9 25 -6,9 GBS6+алгидрогель^® 85 15,0 26,8 46,9 15 -5

Пример 20: Модификация конфигурации устройства

Результаты исследований указывали на то, что препараты было легко ресуспендировать во флаконе, но не в PFS, оба контейнера были выполнены из стекла 1 типа и для них использовали резиновые пробки. Однако ключевым различием между двумя системами является наличие свободного пространства над продуктом, которое позволяет свободно перемешивать препарат и приводит к получению более однородного ресуспендированного препарата. Вследствие этого, исследовали эффект свободного пространства над продуктом в качестве фактора, влияющего на ресуспендирование в PFS, для понимания того, приведет ли большее свободное пространство над продуктом в PFS к лучшему перемешиванию. Шприцы заполняли препаратами GBS6 в высокой дозе (с AlPO₄), укупоривали с разным свободным пространством над продуктом (2 мм, 6 мм и 10 мм; показано на Фигуре 36) и хранили в горизонтальном положении при 2-8°C. Особенности ресуспендирования (количество встряхиваний) тестировали через 2 недели хранения. Данные свидетельствовали о том, что увеличение свободного пространства над продуктом приводило к уменьшению количества встряхиваний, необходимых для ресуспендирования. Данные приведены в Таблице 41. Легкость ресуспендирования была связана с повышенной турбулентностью из-за большего свободного пространства над продуктом, что делало перемешивание более легким. Такие особенности были очевидны и во флаконах, в случае которых не возникало каких-либо проблем с перемешиванием (вследствие большего свободного пространства над продуктом).

Таблица 41. Влияние увеличения свободного пространства над продуктом на характеристики ресуспендирования препаратов GBS6

Свободное пространство над продуктом (± 1 мм) Количество встряхиваний* 2 >50 6 17 10 10

Время хранения: 2 недели при 2-8°C;

*Среднее значение для 3 образцов.

Пример 21: Влияние концентрации алюминия

Проводили исследование для определения влияния концентрации алюминия на возможность ресуспендирования препарата. Для этого проводили оценку препаратов GBS6 с уменьшающимися концентрациями AlPO₄. Готовили препараты GBS6 в высокой дозе (общая доза антигена 240 мкг/мл) в той же буферной матрице с уровнями концентраций алюминия в диапазоне 0,5-0,05 мг/мл. Образцы помещали в BD HYPAK SCF^TM PRTC (Becton, Dickinson and Company) 1-мл короткие стеклянные PFS с объемом наполнения 0,58 мл; укупоривали 4432/50 пробками (West Pharmaceutical Services, Inc.), сохраняя свободное пространство над продуктом приблизительно ~0,4 мм, и хранили в горизонтальном положении. Ресуспендирование тестировали через 0, 1, 2 и 4 недели хранения при 5°C. Общую и связанную антигенность для каждого из серотипов в индивидуальных препаратах анализировали методом нефелометрии со специфическими для серотипа поликлональными антителами.

Хотя уменьшение уровней алюминия оказывало положительный эффект на ресуспендирование, для препаратов с концентрацией алюминия 0,3 мг/мл все-еще требовалось более 20 встряхиваний в момент времени T0 и более 50 встряхиваний через 2 недели. Для препаратов, содержащих 0,05 мг/мл алюминия, требовалось приблизительно 20 встряхиваний через 2 недели хранения в горизонтальном положении. Данные представлены на Фигуре 37.

Также наблюдали уменьшение количества антигена, связанного с алюминием. Данные представлены на Фигуре 38.

Пример 22: Скрининг разных флокулянтов

Суспензия с очень мелкими частицами имеет низкую скорость оседания и результатом будет очень плотный осадок с малым объемом, который будет трудно или невозможно ресуспендировать. Характеристики ресуспендирования можно контролировать за счет фармацевтических манипуляций, таких как добавление флокулянтов для нейтрализации поверхностного заряда на суспендированных частицах, что делает возможным образование более крупных хлопьев, или кластеров, из частиц, тем самым приводя к увеличению скорости седиментации и облегчению ресуспендирования. Различия характеристик седиментации между не флокулированными и флокулированными суспензиями приведены в Таблице 42.

Таблица 42. Сравнение не флокулированных и флокулированных суспензий

Не флокулированные Флокулированные 1 Твердые вещества присутствуют в виде отдельных частиц, низкий уровень агрегации Твердые вещества присутствуют в виде агрегатов 2 У частиц проявляются силы отталкивания У частиц проявляются силы притяжения или слабые силы отталкивания 3 Скорость седиментации низкая и размеры частиц небольшие Скорость седиментации высокая, частицы образуют рыхлые агрегаты 4 Частицы оседают в виде плотного осадка Частицы оседают в виде хлопьев

Включение флокулянтов в препараты GBS6 использовали в качестве попытки улучшения характеристик ресуспендирования. Следующие флокулянты и алюминиевые соли оценивали в отношении их влияния на скорость седиментации и ресуспендирования препарата GBS6 в высокой дозе:

Флокулянты:

1. GBS6 контроль (GBS6, содержащий 20 мМ His буфера, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO4 при pH 6,5)

2. Сульфат аммония (0,25 мг/мл)

3. Сульфат аммония и KCl (0,25 мг/мл и 20 мМ)

4. CaCl₂ (0,25 мг/мл)

5. SDS (1%)

6. Фосфат калия (50 мМ)

7. NaCl (1M)

Алюминиевые соли:

1. Алгидрогель^® 85 (Brenntag Biosector A/S) [Al(OH)₃; 0,25 мг/мл]

2. Адъюфос^® (Brenntag Biosector A/S) (0,5 мг/мл)

3. AlPO₄ и Al(OH)₃ (1:1 смесь, по 0,25 мг/мл каждого).

Готовили препараты GBS6 в высокой дозе (240 мкг/мл), содержащие 20 мМ гистидина, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5, с любым из флокулянтов, перечисленных выше, или одной из алюминиевых солей, перечисленных выше. Образцы тестировали на сокращение времени ресуспендирования (после центрифугирования образцов в течение 45 минут при 200 об/мин в 1,5-мл центрифужных пробирках), скорость оседания, размеры частиц, поверхностный заряд, а также общее содержание, и содержание связанных, конъюгатов.

Среди всех протестированных флокулянтов NaCl и фосфат калия были способны приводить к сильному сокращению времени ресуспендирования до менее 20 секунд в сравнении с 180 секундами в случае контрольного препарата GBS6. Данные представлены на Фигуре 39 и в Таблице 42. Скорость оседания этих двух образцов также была меньше, чем у других препаратов с солями кальция или аммония, или SDS. Данные представлены на Фигуре 40. Препарат, содержащий 1 M NaCl, имел большой размер частиц и низкий поверхностный заряд, как и ожидалось, исходя из теории флокуляции. Однако такие же результаты не наблюдали в случае образцов, содержащих 50 мМ фосфата, это свидетельствовало о том, что фосфат способствовал ресуспендированию по другому механизму, нежели NaCl. Данные приведены в Таблице 42.

Из двух протестированных солей алюминия, алгидрогель^® 85 продемонстрировал лучшие характеристики ресуспендирования, чем адъюфос^®. Основная проблема с препаратом, содержащим алгидрогель^® 85, заключается в том, что он прочно связывается с антигенами, об этом свидетельствует более высокая сила связывания с антигенами в сравнении с AlPO₄. Данные приведены в Таблице 43. Есть сообщения о том, что это явление отрицательно влияет на иммунный ответ, вызываемый вакцинами. Egan, P.M., et al., Vaccine, 27:3175-3180 (2009).

Таблица 43. Характеристики ресуспендирования препаратов GBS6 с флокулянтом или солью алюминия

Партия 00708311-114 Размер частиц (мкм) Время ресуспендирования (сек) Дзета-потенциал (мОсм) Связывание (%) D10 D50 D90 1 GBS6 контроль 4,46 7,25 12,27 180 -7,9 40,8 2 0,25 мг/мл сульфат аммония 4,40 7,23 11,90 47 -7,2 36,8 3 сульфат+KCl 4,62 7,81 15,83 33 -7,8 37,1 4 0,25 мг CaCl₂ 4,47 7,34 13,27 90 -6,9 40,5 5 алгидрогель^® 85 и AlPO₄ 4,96 6,95 9,76 40 -9,2 68,2 6 1,0% SDS 5,13 6,94 9,52 155 -20,0 17,6 7 50 мМ фосфатный буфер 4,53 7,27 12,33 20 -12,5 10,8 8 1 M NaCl 7,10 13,10 25,13 17 -1,5 11,2 9 0,25 мг/мл алгидрогель^® 85 12,80 23,20 42,10 10 -5,3 93,1 10 0,25 мг/мл адъюфос^® 2,37 5,27 18,87 120 -8,5 16,2

Пример 23: Оптимизация уровней NaCl и фосфата

Проводили исследование для оптимизации концентраций NaCl и фосфата калия до уровней, которые соответствовали бы не только желательным характеристикам ресуспендирования, но и другим показателям, таким как осмоляльность и связывание антигена с алюминием, которые являются двумя важными аспектами, связанными с реактогенностью и эффективностью вакцины.

Готовили препараты GBS6 в высокой дозе (общая доза антигена 240 мкг/мл), содержащие NaCl в разных концентрациях (150-690 мМ), 20 мМ гистидина, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5. Также готовили препараты, содержащие фосфат калия в разных концентрациях (10-50 мМ) и NaCl в двух разных концентрациях (150 мМ и 240 мМ) для исследования эффекта сочетания двух солей. Сформулированные нефасованные образцы тестировали на скорость оседания, время ресуспендирования после центрифугирования, размер частиц и поверхностный заряд.

Увеличение концентрации NaCl приводило к значительному уменьшению времени ресуспендирования. Данные представлены на Фигуре 41. Имело место резкое уменьшение времени ресуспендирования в случае 300 мМ NaCl, это свидетельствовало о том, что препарат перешел из дефлокулированного во флокулированное состояние, и концентрация 300 мМ NaCl была критической концентрацией коагуляции (ККК) для этого перехода. ККК была снижена до 240 мМ в присутствии 10 мМ, или более, фосфата, свидетельствуя о том, что имел место синергетический эффект NaCl и фосфата. Данные представлены на Фигуре 42. Быстрое оседание и флокулированные осадки наблюдали в образцах, содержащих 10-30 мМ фосфата с 240 мМ NaCl, как показано на Фигурах 43A и 43B. Данные по дзета-потенциалу и размеру частиц показали, что увеличение концентрации NaCl приводит к уменьшению поверхностного заряда и увеличению размера частиц, что свидетельствовало в пользу теории флокуляции. Эта тенденция не была очевидной в случае фосфата. Данные приведены в Таблице 44. На основании результатов данного исследования, 240 мМ NaCl и 20 мМ фосфата были признаны оптимальными целевыми концентрациями.

Таблица 44. Эффект NaCl и фосфата на дзета-потенциал и размер частиц

Дзета-потенциал Размер частиц ДП (мВ) СО D10 D50 D90 150 мМ NaCl -9,1 0,5 2,6 5,5 16,3 200 мМ NaCl -7,6 0,8 3,3 6,3 12,4 250 мМ NaCl -8,2 0,9 3,5 6,6 15,4 300 мМ NaCl -5,5 0,5 4,3 7,1 11,9 390 мМ NaCl -6,8 0,9 4,6 7,2 11,5 540 мМ NaCl -5,1 0,5 5,3 9,3 19,9 690 мМ NaCl -3,4 0,5 5,9 10,8 22,9 150 мМ NaCl+10 мМ фосфата -8,9 0,4 3,4 6,3 11,1 150 мМ NaCl+20 мМ фосфата -8,3 0,8 3,2 6,2 12,6 150 мМ NaCl+30 мМ фосфата -9,9 0,9 3,2 6,2 12,2 240 мМ NaCl+10 мМ фосфата -6,0 0,4 5,3 6,5 7,9 240 мМ NaCl+20 мМ фосфата -10,5 0,9 4,3 7,1 11,6 240 мМ NaCl+30 мМ фосфата -5,5 2,1 4,5 7,4 13,4

Дополнительно характеризовали три партии препарата GBS6, содержащего полисахарид в концентрации 40 мкг/мл для каждого серотипа (общая доза антигена 240 мкг/мл), 20 мМ фосфата, 240 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5. Препарат GBS6, содержащий 20 мМ His буфера, 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5, включали в качестве контроля. Все 3 препарата с дополнительным содержанием NaCl и фосфата при pH 6,5 отличались легкостью ресуспендирования со средним временем ресуспендирования 16 секунд (в сравнении с 120 секундами для контроля) и имели осмоляльность выше 500 мОсм. Количество связанной антигенности было приблизительно на 20% ниже, чем в контроле, для каждого из серотипов. Данные приведены в Таблице 45.

Таблица 45. Характеристики препаратов GBS6 с дополнительным содержанием NaCl и фосфата

Ресуспендирование (сек) Осмо (мОсм) Дзета-потенциал (мВ) Связывание антигена с AlPO4 (%) Размер частиц (мкм) Ia Ib II III IV V D10 D50 D90 GBS6 контроль 120 316 -9,1 41 43 51 34 41 51 2,6 5,5 16,3 GBS6 с 20 мМ фосфата и 240 мМ NaCl при pH 6,5* 16 519 -6,0 24 21 23 21 22 29 5,3 6,5 7,9

*Среднее значения для 3 партий.

Пример 24: Краткосрочная стабильность препаратов GBS6, содержащих 240 мМ NaCl и 20 мМ фосфата

Препараты GBS6 в трех дозах (общая доза антигена 60 мкг/мл, 120 мкг/мл и 240 мкг/мл), содержащие 20 мМ фосфата, 240 мМ NaCl, 0,02% полисорбата 80 и 0,5 мг/мл AlPO₄ при pH 6,5, вносили в BD HYPAK SCF™ PRTC (Becton, Dickinson and Company) 1-мл короткие стеклянные PFS с объемом наполнения 0,58 мл и укупоривали 4432/50 пробками (West Pharmaceutical Services, Inc.), сохраняя свободное пространство над продуктом приблизительно ~0,4 мм. Ресуспендирование после хранения как в положении кончиком вниз, так и в горизонтальном положении, в течение 1 месяца при RT и 3 месяцев при 5°C контролировали на стабильность.

Данные через один месяц показали, что препарат после хранения в PFS в горизонтальном положении мог быть ресуспендирован с использованием 10 или менее встряхиваний при всех трех уровнях доз. Однако для препарата, хранившегося в PFS в положении кончиком вниз, все-еще требовалось 40 или более встряхиваний. Данные приведены в Таблице 46. Общая антигенность и связывание с AlPO₄ для каждого серотипа были стабильны в течение 1 месяца при RT. Данные приведены в Таблице 47.

Таблица 46. Сравнение особенностей ресуспендирования препаратов в PFS, хранившихся в горизонтальном положении и в положении кончиком вниз

Доза pH Время хранения при 2-8°C (месяцы) Горизонтально (количество встряхиваний) Кончиком вниз (количество встряхиваний) Низкая 6,5 1 месяц 3 40 Средняя 6,5 8 >45 Высокая 6,5 7 >50 Высокая 6,0 10 50

Таблица 47. Общая антигенность препаратов GBS

Доза Временная точка Общая антигенность (мкг/мл) Ia Ib II III IV V Высокая 0 40 41,2 41,1 42,0 40,4 39,1 1 м RT 44,8 43,1 44,6 44,3 43,7 44,6 Средняя 0 18,3 17,9 19,0 18,2 18,4 17,9 1 м RT 19,5 19,3 21,7 20,4 20,0 20,6 Низкая 0 10,4 11,6 9,5 8,6 9,2 9,9 1 м RT 9,0 9,1 9,5 9,2 9,0 9,3 % Связывания с AlPO₄ Высокая 0 30,8 24,6 26,2 18,7 22,3 31,2 1 м RT 33,3 29,7 33,3 19,9 25,9 35,0 Средняя 0 39,9 40,0 29,1 20,0 25,5 37,9 1 м RT 45,0 40,5 39,9 33,6 34,0 40,8 Низкая 0 49,3 52,5 38,0 25,3 31,2 45,2 1 м RT 51,5 42,8 41,4 30,1 37,6 45,3

Пример 25: Применение концепций «дизайна эксперимента» (DoE) и «планируемого качества» (QbD) для препаратов GBS с флокулянтами в PFS

Применяли концепцию «дизайна эксперимента» (DoE) для определения оптимального препарата GBS6 для PFS. Оценивали три фактора с использованием методологии поверхности отклика (статистический план Бокса-Бенкена): 1) pH (6,0, 6,5 и 7,0); 2) концентрация NaCl (220 мМ, 240 мМ и 260 мМ) и 3) концентрация фосфата (15 мМ, 20 мМ и 25 мМ). В остальном, все препараты содержали дозу 240 мг/мл (60 мкг/мл для каждого серотипа), 0,02% PS80, приблизительно 10 мМ гистидина, перенесенного из лекарственной субстанции, и 0,5 мг/мл AlPO₄. Исследовали всего 15 препаратов на легкость ресуспендирования (смотри Таблицу 48).

Таблица 48. Препараты в DoE исследовании

Препарат NaCl (мМ) Na-фосфат (мМ) pH 1 240 20 6,5 2 260 15 6,5 3 240 15 7,0 4 220 25 6,5 5 260 25 6,5 6 240 25 6,0 7 240 20 6,5 8 240 15 6,0 9 220 20 7,0 10 240 20 6,5 11 260 20 6,0 12 240 25 7,0 13 220 15 6,5 14 220 20 6,0 15 260 20 7,0

Чтобы учесть любую связанную вариабельность, исследования были выполнены в трех повторах и двумя операторами. Образцы вносили в BD HYPAK SCF™ PRTC (Becton, Dickinson and Company) 1-мл короткие стеклянные PFS с объемом наполнения 0,58 мл и укупоривали 4432/50 пробками (West Pharmaceutical Services, Inc.), сохраняя свободное пространство над продуктом приблизительно ~0,4 мм. Заполненные шприцы хранили в горизонтальном положении при 2-8°C и 25°C в течение 3 месяцев. Ресуспендирование контролировали только в случае хранения при 5°C, и концентрацию методом нефелометрии контролировали в случае хранения при 5°C и 25°C. Результаты ресуспендирования приведены в Таблице 49.

Таблица 49. Число встряхиваний, необходимых для ресуспендирования через 3 месяца

Препарат Оператор 1* Оператор 2* 1 11 8 2 8 6 3 7 4 4 11 8 5 8 8 6 19 12 7 7 7 8 19 14 9 10 6 10 8 6 11 11 13 12 8 4 13 11 11 14 28 17 15 5 5

*Среднее значение для 3 образцов.

Использовали статистическую программу JMP (SAS Institute) для анализа данных и предсказания оптимального и наиболее надежного препарата, для ресуспендирования которого потребовалось бы ≤10 встряхиваний. Рекомендации системы профилирования программы JMP на основании данных ресуспендирования, полученных одним из операторов, приведены на Фигуре 45. Значение pH и концентрация соли были значительными индивидуальными факторами, влияющими на число встряхиваний. Кроме того, важным было взаимодействие между фосфатом и pH. Исходя из индекса желательности, следующие условия делают возможным более легкое ресуспендирование (количество встряхиваний ≤10): pH 7,0±0,5, 245±20 мМ NaCl и 20±5 мМ фосфата. Аналогичные результаты были получены при анализе данных, полученных вторым оператором.

Однако при использовании рекомендованных параметров препарата степень связывания была ниже. Как показано на Фигуре 46, связывание конъюгатов для каждого из серотипов GBS варьировалось в пределах 10-20%. Кроме того, рекомендованный препарат имел более высокую осмоляльность (приблизительно 500 мОсм/кг), которая, однако, все-еще находилась в пределах допустимого для вакцины.

Пример 26: Препараты GBS6 на основе Al(OH)₃

Как описано в примере 22, препараты GBS6 с Al(OH)₃ имели превосходные характеристики ресуспендирования, но при этом имело место более сильное связывание с антигенами, что могло бы отрицательно влиять на иммунный ответ. Соответственно, были проведены эксперименты для определения характеристик связывания Al(OH)₃ с конъюгатами GBS и модулирования силы адсорбции Al(OH)₃.

Препараты GBS6 в высокой дозе (общая доза конъюгатов 240 мкг/мл), содержащие 20 мМ гистидина, 150 мМ NaCl и 0,02% PS80 при pH 6,5, готовили с разными концентрациями Al(OH)₃ (0,7 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,05 мг/мл). Связывание определяли путем измерения общей и находящейся в супернатанте антигенности методом нефелометрии. Как показано на Фигуре 47, связывание с Al(OH)₃ выходило на плато при концентрации 0,5 мг/мл Al(OH)₃ для всех шести серотипов. Адсорбционную емкость и коэффициент адсорбции определяли по формуле Ленгмюра. Данные приведены в Таблице 50, с данными для AlPO₄ в качестве компаратора.

Таблица 50. Характеристики связывания конъюгатов GBS с AlPO₄ и Al(OH)₃

Серотип GBS Адсорбционная емкость
мкг антигена серотипа/мг Al Коэффициент адсорбции
мл/мг белка С AlPO₄ Ia 39,5 1488,2 Ib 38,6 1786,2 II 41,8 377,6 III 25,6 1649,8 IV 29,8 1407,6 V 41,7 1403,5 С Al(OH)₃ Ia 109,9 5352,9 Ib 117,6 3400,0 II 161,3 3263,2 III 122,0 2411,8 IV 138,9 3428,6 V 147,1 2956,5

Для модулирования силы связывания Al(OH)₃ буфер в препарате заменяли на фосфат натрия с целью замены поверхностных гидроксилов на гидроксиде алюминия фосфатом и уменьшения обмена лигандов. Препараты GBS6, содержащие 150 мМ NaCl, 0,02% PS80 и 0,15 мг/мл Al(OH)₃ при pH 6,5, готовили с 3 разными концентрациями фосфата (10 мМ, 20 мМ и 30 мМ) и в разных дозах (общая доза конъюгатов 15 мкг/мл, 30 мкг/мл, 60 мкг/мл, 90 мкг/мл, 120 мкг/мл, 150 мкг/мл и 210 мкг/мл). Связывание определяли на основании общей и находящейся в супернатанте антигенности. Адсорбционную емкость и коэффициент адсорбции определяли по формуле Ленгмюра. Данные приведены в Таблице 51, с данными для AlPO₄ в качестве компаратора.

Таблица 51. Влияние концентрации фосфата на связывание конъюгатов GBS с Al(OH)₃

Серотип GBS Конц. Na-фосфата (мМ)* Коэффициент адсорбции (мл/мг) Адсорбционная емкость (мкг антигена серотипа/мг Al) Связывание с Al (%)** % Экстракции*** Ia 0 5353 110 >95 14 10 890 32 66 103 20 665 26 52 101 30 429 19 45 109 Препарат с AlPO₄ 40 1488 46 н/а Ib 0 3400 118 >95 6 10 1622 56 66 93 20 520 21 63 105 30 338 15 44 103 Препарат с AlPO₄ 39 1786 50 н/а II 0 3263 161 >95 2 10 1333 86 80 99 20 852 79 75 105 30 711 67 66 103 Препарат с AlPO₄ 42 378 57 н/а III 0 2412 122 >95 10 10 878 37 66 104 20 478 23 47 107 30 207 7 30 109 Препарат с AlPO₄ 26 1650 37 н/а IV 0 3429 139 >95 4 10 2571 62 73 102 20 1509 39 63 104 30 1114 29 47 95 Препарат с AlPO₄ 30 1408 44 н/а V 0 4957 147 >95 3 10 2040 65 77 104 20 1982 45 64 106 30 1758 47 58 95 Препарат с AlPO₄ 42 1404 53 н/а

*Препарат с AlPO₄ содержит ~10 мМ гистидина, перенесенного из лекарственной субстанции;

**Связывание в препарате с AlPO₄ представляет собой среднее значение для 3 партий;

***Условия экстракции: 0,1 Н NaOH, RT, вращение в течение 24 час.

Емкость связывания и коэффициент связывания GBS6 с Al(OH)₃ были в 3-4 раза выше, чем с AlPO₄. Однако сила адсорбции гидроксида алюминия для GBS6 была модулирована за счет введения фосфата в препарат. Концентрация фосфата отрицательно влияла на силу и емкость адсорбции. Фосфат также влиял на связывание, в процентах, антигена, однако уровень все еще превышал уровень в случае AlPO₄. Кроме того, GBS можно было полностью экстрагировать от алюминия в присутствии фосфата. На основании полученных результатов было определено, что 20 мМ фосфата, 150 мМ NaCl и 0,2% PS80 при pH 6,5 были оптимальными значениями для использования с гидроксидом алюминия.

Аспекты изобретения

Следующие пункты описывают дополнительные варианты осуществления изобретения.

C1. Иммуногенный полисахарид-белковый конъюгат, содержащий капсульный полисахарид стрептококка группы B (GBS) и белок-носитель, причем капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 60%.

C2. Иммуногенный конъюгат по п.C1, в котором капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из полисахаридов серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX.

C3. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу Ia.

C4. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу Ib.

C5. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу II.

C6. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу III.

C7. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу IV.

C8. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу V.

C9. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу VI.

C10. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу VII.

C11. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу VIII.

C12. Иммуногенный конъюгат по п.C2, в котором капсульный полисахарид относится к серотипу IX.

C13. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C12, в котором капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты более приблизительно 95%.

C14. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C13, в котором капсульный полисахарид имеет уровень сиаловой кислоты приблизительно 100%.

C15. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C14, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,6 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C16. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C15, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,65 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C17. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C16, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,7 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C18. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C17, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,75 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C19. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C18, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,8 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C20. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C19, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,85 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C21. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C20, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,9 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C22. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C21, в котором капсульные полисахариды имеют по меньшей мере приблизительно 0,95 мМ сиаловой кислоты на мМ полисахарида.

C23. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C22, в котором капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от приблизительно 5 кДа до приблизительно 1000 кДа.

C24. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C23, в котором капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от приблизительно 25 кДа до приблизительно 750 кДа.

C25. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C24, в котором капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от приблизительно 25 кДа до приблизительно 400 кДа.

C26. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C25, в котором капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от приблизительно 25 кДа до приблизительно 200 кДа.

C27. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C25, в котором капсульный полисахарид имеет молекулярную массу от приблизительно 100 кДа до приблизительно 400 кДа.

C28. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C27, причем молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 300 кДа до приблизительно 20000 кДа.

C29. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C28, причем молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 15000 кДа.

C30. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C29, причем молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 1000 кДа до приблизительно 10000 кДа.

C31. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C30, в котором капсульный полисахарид имеют уровень O-ацетилирования от приблизительно 0% до приблизительно 40%.

C32. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C31, в котором капсульный полисахарид имеет уровень O-ацетилирования менее приблизительно 5%.

C33. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C32, в котором капсульный полисахарид имеет уровень O-ацетилирования менее приблизительно 4%.

C34. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C33, в котором капсульный полисахарид имеет уровень O-ацетилирования менее приблизительно 3%.

C35. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C34, в котором капсульный полисахарид имеет уровень O-ацетилирования менее приблизительно 2%.

C36. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C35, в котором капсульный полисахарид имеет уровень O-ацетилирования менее приблизительно 1%.

C37. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C36, в котором капсульный полисахарид содержит по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C38. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C37, в котором капсульный полисахарид содержит по меньшей мере приблизительно 0,2 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C39. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C38, в котором капсульный полисахарид содержит по меньшей мере приблизительно 0,3 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C40. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C39, в котором капсульный полисахарид содержит по меньшей мере приблизительно 0,35 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C41. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C40, в котором капсульный полисахарид содержит приблизительно 0,4 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C42. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C41, в котором капсульный полисахарид содержит менее приблизительно 0,01 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C43. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C42, в котором капсульный полисахарид содержит менее приблизительно 0,05 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C44. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C43, в котором капсульный полисахарид содержит менее приблизительно 0,04 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C45. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C44, в котором капсульный полисахарид содержит менее приблизительно 0,03 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C46. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C45, в котором капсульный полисахарид содержит менее приблизительно 0,02 мМ O-ацетата на мМ сахаридной повторяющейся единицы.

C47. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C46, причем все полисахариды отдельно конъюгированы с белком-носителем.

C48. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C47, в котором белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇ или токсоид столбняка.

C49. Иммуногенный конъюгат по любому из пунктов C1-C48, в котором белок-носитель представляет собой CRM₁₉₇.

C50. Способ выделения капсульного полисахарида, включающий проведение реакции органического реагента с клеточным бульоном, содержащим продуцирующую капсульный полисахарид бактерию.

C51. Способ по п.C50, в котором бактерию не лизируют.

C52. Способ по п.C50 или C51, в котором бактерию убивают нагреванием.

C53. Способ по любому из пунктов C50-C52, дополнительно включающий стадию центрифугирования для получения клеточной пасты.

C54. Способ по любому из пунктов C50-C53, дополнительно включающий стадию фильтрования.

C55. Способ по п.C54, в котором указанная стадия фильтрования представляет собой диафильтрацию.

C56. Способ по любому из пунктов C50-C56, в котором продуцирующую капсульный полисахарид бактерию выбирают из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis.

C57. Способ по п.C56, в котором бактерия представляет собой Streptococcus agalactiae.

C58. Способ по любому из пунктов C50-C57, в котором указанные органические реагенты представляют собой дериватизированные соединения гидроксиламина.

C59. Способ по любому из пунктов C50-58, в котором гидроксиламин представляет собой любой гидроксиламин, приведенный в Таблице 2 примера 2.

C60. Способ по любому из пунктов C50-C59, в котором гидроксиламин выбирают из группы, состоящей из дибензилгидроксиламина; диэтилгидроксиламина; гидроксиламина; этилендиамина; триэтилентетрамина; 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина и 2,6,10-триметил-2,6,10-триазаундекана.

C61. Способ по любому из пунктов C50-C60, в котором концентрация гидроксиламина составляет от приблизительно 5 мМ до приблизительно 200 мМ.

C62. Способ по любому из пунктов C50-C61, в котором значение pH реакционной смеси составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 9,5.

C63. Способ по любому из пунктов C50-C62, в котором реакция происходит при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 85°C.

C64. Способ по любому из пунктов C50-C63, в котором продолжительность реакции составляет от приблизительно 10 часов до приблизительно 90 часов.

C65. Способ получения иммуногенного полисахарид-белкового конъюгата по любому из пунктов C1-C49, причем капсульный полисахарид выделяют способом по любому из пунктов C50-C64.

C66. Иммуногенный полисахарид-белковый конъюгат, содержащий капсульный полисахарид, полученный способом по любому из пунктов C50-C64.

C67. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенный полисахарид-белковый конъюгат по любому из пунктов C1-C49 или C66.

C68. Иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие капсульные полисахариды из стрептококка группы B (GBS) серотипа IV и по меньшей мере одного дополнительного серотипа, выбранного из группы, состоящей из Ia, Ib, II, III, V, VI, VII, VIII и IX.

C69. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип Ia.

C70. Иммуногенная композиция по п.C69, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа Ib.

C71. Иммуногенная композиция по п.C69 или C70, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа II.

C72. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C71, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа III.

C73. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C72, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа V.

C74. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C73, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VI.

C75. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C74, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C76. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C75, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C77. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C69-C76, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C78. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип Ib.

C79. Иммуногенная композиция по п.C78, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа II.

C80. Иммуногенная композиция по п.C78 или C79, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа III.

C81. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C78-C80, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа V.

C82. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C78-C81, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VI.

C83. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C78-C82, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C84. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C78-C83, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C85. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C78-C84, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C86. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип II.

C87. Иммуногенная композиция по п.C86, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа III.

C88. Иммуногенная композиция по п.C86 или C87, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа V.

C89. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C86-C88, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VI.

C90. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C86-C89, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C91. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C86-C90, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C92. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C86-C91, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C93. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип III.

C94. Иммуногенная композиция по п.C93, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа V.

C95. Иммуногенная композиция по п.C93 или C94, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VI.

C96. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C93-C95, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C97. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C93-C96, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C98. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C93-C97, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C99. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип V.

C100. Иммуногенная композиция по п.C99, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VI.

C101. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C99 или C100, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C102. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C99-C101, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C103. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C99-C102, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C104. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип VI.

C105. Иммуногенная композиция по п.C104, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VII.

C106. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C104 или C105, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C107. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C104-C106, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C108. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип VII.

C109. Иммуногенная композиция по п.C108, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа VIII.

C110. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C108 или C109, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C111. Иммуногенная композиция по п.C68, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип VIII.

C112. Иммуногенная композиция по п.C111, дополнительно содержащая конъюгат, содержащий капсульный полисахарид из GBS серотипа IX.

C113. Иммуногенная композиция по п.C112, причем по меньшей мере один дополнительный серотип представляет собой серотип IX.

C114. Иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие капсульные полисахариды из GBS серотипов Ia, Ib, II, III и IV.

C115. Иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие капсульные полисахариды из GBS серотипов Ia, Ib, II, III и V.

C116. Иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие капсульные полисахариды из GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V.

C117. Иммуногенная композиция, содержащая полисахарид-белковые конъюгаты, содержащие по меньшей мере четыре капсульных полисахарида GBS серотипов, выбранных из группы, состоящей из серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX.

C118. Иммуногенная композиция по п.C117, содержащая капсульные полисахариды GBS по меньшей мере пяти серотипов.

C119. Иммуногенная композиция по п.C117 или C118, содержащая капсульные полисахариды GBS по меньшей мере шести серотипов.

C120. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C117-C119, содержащая капсульные полисахариды GBS по меньшей мере семи серотипов.

C121. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C117-C120, содержащая капсульные полисахариды GBS по меньшей мере восьми серотипов.

C122. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C117-C121, содержащая капсульные полисахариды GBS по меньшей мере девяти серотипов.

C123. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C117-C122, содержащая капсульный полисахарид GBS серотипа V.

C124. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C117-C123, отличающаяся отсутствием иммунной интерференции.

C125. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C124, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый эксципиент, буфер, стабилизатор, адъювант, криопротектор, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, ингибитор вызываемого свободными радикалами окисления, носитель, или их смесь.

C126. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C125, дополнительно содержащая буфер.

C127. Иммуногенная композиция по п.C126, в которой буфер выбран из группы, состоящей из HEPES, PIPES, MES, Tris (триметамин), фосфата, ацетата, бората, цитрата, глицина, гистидина и сукцината.

C128. Иммуногенная композиция по п.C127, в которой буфер представляет собой гистидин.

C129. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C128, дополнительно содержащая сурфактант.

C130. Иммуногенная композиция по п.C129, в которой сурфактант выбран из группы, состоящей из сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, полисорбата-80, полисорбата-60, полисорбата-40, полисорбата-20 и полиоксиэтиленалкиловых эфиров.

C131. Иммуногенная композиция по п.C130, в которой сурфактант представляет собой полисорбат-80.

C132. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C131, дополнительно содержащая эксципиент.

C133. Иммуногенная композиция по п.C132, в которой эксципиент выбран из группы, состоящей из крахмала, глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита, палатинита, желатина, солода, риса, муки, мела, силикагеля, стеарата натрия, глицерин моностеарата, талька, глицина, аргинина, лизина, хлорида натрия (NaCl), сухого снятого молока, глицерина, пропиленгликоля, воды, этанола.

C134. Иммуногенная композиция по п.C133, в которой эксципиент представляет собой хлорид натрия.

C135. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C134, дополнительно содержащая адъювант.

C136. Иммуногенная композиция по п.C135, в которой адъювант представляет собой адъювант на основе алюминия или QS-21.

C137. Иммуногенная композиция по п.C136, в которой адъювант на основе алюминия выбран из группы, состоящей из фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия и гидроксида алюминия.

C138. Иммуногенная композиция по п.C137, в которой адъювант представляет собой фосфат алюминия.

C139. Иммуногенная композиция по п.C138, в которой адъювант представляет собой гидроксифосфат алюминия.

C140. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C139, содержащая буфер, сурфактант, эксципиент, и необязательно, адъювант, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0.

C141. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C140, содержащая гистидин, полисорбат-80, хлорид натрия, и необязательно, фосфат алюминия, причем значение pH буфера композиции составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0.

C142. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C141, содержащая от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ гистидина, от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (об/масс) полисорбата-80, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ хлорида натрия и, необязательно, от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия.

C143. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C142, содержащая дозу от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.

C144. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C143, лиофилизированная, необязательно, в присутствии по меньшей мере одного эксципиента.

C145. Иммуногенная композиция по п.C144, в которой по меньшей мере один эксципиент выбран из группы, состоящей из крахмала, глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита, палатинита, желатина, солода, риса, муки, мела, силикагеля, стеарата натрия, глицерин моностеарата, талька, глицина, аргинина, лизина, хлорида натрия (NaCl), сухого снятого молока, глицерина, пропиленгликоля, воды и этанола.

C146. Иммуногенная композиция по п.C145, в которой по меньшей мере один эксципиент представляет собой сахарозу.

C147. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C144-C146, содержащая от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) по меньшей мере одного эксципиента.

C148. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C144-C147, содержащая дополнительный эксципиент.

C149. Иммуногенная композиция по п.C148, в которой дополнительный эксципиент представляет собой маннит или глицин.

C150. Иммуногенная композиция по п.C148 или C149, содержащая от приблизительно 1% (масс./об.) до приблизительно 10% (масс./об.) дополнительного эксципиента.

C151. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C143-C150, восстановленная водой, водой для инъекций (WFI), суспензией адъюванта или солевым раствором.

C152. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C151 для применения в качестве лекарственного средства.

C153. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C67-C152 для применения в способе индукции иммунного ответа против GBS у пациента.

C154. Иммуногенная композиция по п.C153, причем пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной.

C155. Иммуногенная композиция по п.C154, причем женщина находится во второй половине беременности.

C156. Иммуногенная композиция по п.C155, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере 20 недель.

C157. Иммуногенная композиция по п.C156, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере от 27 недель до 36 недель.

C158. Иммуногенная композиция по п.C157, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше.

C159. Иммуногенная композиция по п.C158, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше.

C160. Иммуногенная композиция по п.C159, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 85 лет или старше.

C161. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C153-C160, причем пациент имеет иммунную недостаточность.

C162. Иммуногенная композиция по п.C161, причем пациент имеет медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени.

C163. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C153-162, причем стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.

C164. Способ индукции иммунного ответа против стрептококка группы B, включающий введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пунктов C67-C150.

C165. Способ профилактики, или облегчения, заболевания или состояния, связанного со стрептококком группы B, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пунктов C67-C151.

C166. Способ по п.C164 или C165, причем пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной.

C167. Способ по п.C166, причем женщина находится во второй половине беременности.

C168. Способ по п.C166 или C167, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере 20 недель.

C169. Способ по любому из пунктов C166-C168, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере от 27 недель до 36 недель.

C170. Способ по п.C164 или C165, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше.

C171. Способ по п.C170, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше.

C172. Способ по п.C170 или C171, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 85 лет или старше.

C173. Способ по любому из пунктов C164-C172, причем пациент имеет иммунную недостаточность.

C174. Способ по п.C173, причем пациент имеет медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени.

C175. Способ по любому из пунктов C164-C174, причем стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.

C176. Антитело, которое связывает капсульный полисахарид в иммуногенном конъюгате по любому из пунктов C1-C49 или C66.

C177. Композиция, содержащая антитело по п.C176.

C178. Способ продуцирования антител, включающий введение пациенту иммуногенной композиции по любому из пунктов C67-C151.

C179. Антитело, полученное способом по п.C178.

C180. Способ создания пассивного иммунитета у пациента, включающий стадии:

(a) получения препарата антител с использованием иммуногенной композиции по любому из пунктов C67-C151; и

(b) введения препарата антител пациенту для создания пассивного иммунитета.

C181. Способ получения иммуногенного полисахарид-белкового конъюгата по любому из пунктов C1-C49 или C66, включающий стадии:

(a) проведения реакции капсульного полисахарида GBS с окислителем, с получением активированного полисахарида; и

(b) проведения реакции активированного полисахарида с белком-носителем, с получением полисахарид-белкового конъюгата.

C182. Способ по п.C181, в котором стадию (b) выполняют в полярном апротонном растворителе.

C183. Способ по п.C182, в котором растворитель выбирают из группы, состоящей из диметилсульфоксида (DMSO), сульфолана, диметилформамида (DMF) и гексаметилфосфорамида (HMPA).

C184. Способ по п.C183, в котором растворитель представляет собой диметилсульфоксид (DMSO).

C185. Способ по любому из пунктов C181-C184, в котором полисахарид вступает в реакцию с 0,01-10,0 молярными эквивалентами окислителя.

C186. Способ по любому из пунктов C181-C185, в котором окислитель представляет собой периодат.

C187. Способ по п.C186, в котором периодат представляет собой периодат натрия.

C188. Способ по любому из пунктов C181-C187, в котором продолжительность реакции окисления на стадии (a) составляет от 1 часа до 50 часов.

C189. Способ по любому из пунктов C181-C188, в котором температуру реакции окисления поддерживают на уровне от приблизительно 2°C до приблизительно 25°C.

C190. Способ по любому из пунктов C181-C189, в котором реакцию окисления проводят в буфере, выбранном из группы, состоящей из фосфата натрия, фосфата калия, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и Bis-Tris.

C191. Способ по п.C190, в котором буфер имеет концентрацию от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ.

C192. Способ по любому из пунктов C181-C191, в котором реакцию окисления проводят при значении pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0.

C193. Способ по п.C181, в котором окислитель представляет собой 2,2,6,6-тетрaметил-1-пиперидинилокси (TEMPO).

C194. Способ по п.C193, в котором N-хлорсукцинимид (NCS) является соокислителем.

C195. Способ по любому из пунктов C181-C194, в котором стадия (a) дополнительно включает гашение реакции окисления путем добавления гасителя.

C196. Способ по любому из пунктов C182-C195, в котором концентрация полисахарида составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10,0 мг/мл.

C197. Способ по любому из пунктов C181-C196, в котором степень окисления активированного полисахарида составляет от 5 до 25.

C198. Способ по любому из пунктов C181-C197, дополнительно включающий стадию лиофилизации активированного полисахарида.

C199. Способ по п.C198, в котором активированный полисахарид лиофилизируют в присутствии сахарида, выбранного из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, рафинозы, стахиозы, мелизитозы, декстрана, маннита, лактита и палатинита.

C200. Способ по любому из пунктов C181-C199, в котором стадия (b) включает:

(1) объединение активированного полисахарида с белком-носителем, и

(2) проведение реакции объединенных активированного полисахарида и белка-носителя с восстановителем, с получением конъюгата капсульного полисахарида GBS с белком-носителем.

C201. Способ по п.C200, в котором концентрация активированного полисахарида на стадии (2) составляет от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10,0 мг/мл.

C202. Способ по п.C200 или C201, в котором начальное соотношение (по массе) активированного полисахарида и белка-носителя составляет от 5:1 до 0,1:1.

C203. Способ по любому из пунктов C200-C202, в котором восстановитель выбирают из группы, состоящей из цианоборгидрида натрия, триацетоксиборгидрида натрия, боргидрида натрия или цинка в присутствии кислот Бренстеда или Льюиса, пиридин-борана, 2-пиколин-борана, 2,6-диборан-метанола, диметиламин-борана, трет-BuMeⁱPrN-BH₃, бензиламин-BH₃ или 5-этил-2-метилпиридин-борана (PEMB).

C204. Способ по п.C203, в котором восстановитель представляет собой цианоборгидрид натрия.

C205. Способ по любому из пунктов C200-C204, в котором количество восстановителя составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0 молярных эквивалентов.

C206. Способ по любому из пунктов C200-C205, в котором продолжительность реакции восстановления на стадии (2) составляет от 1 часа до 60 часов.

C207. Способ по любому из пунктов C200-C206, в котором температуру реакции восстановления поддерживают на уровне от 10°C до 40°C.

C208. Способ по любому из пунктов C181-C207, дополнительно включающий стадию (стадия (c)) кэппирования непрореагировавших альдегидов путем добавления боргидрида.

C209. Способ по п.C208, в котором количество боргидрида составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0 молярных эквивалентов.

C210. Способ по п.C208, в котором боргидрид выбирают из группы, состоящей из боргидрида натрия (NaBH₄), цианоборгидрида натрия, боргидрида лития, боргидрида калия, боргидрида тетрабутиламмония, боргидрида кальция и боргидрида магния.

C211. Способ по п.C292, в котором боргидрид представляет собой боргидрид натрия (NaBH₄).

C212. Способ по любому из пунктов C207-C211, в котором продолжительность стадии кэппирования составляет от 0,1 часа до 10 часов.

C213. Способ по любому из пунктов C207-C212, в котором температуру на стадии кэппирования поддерживают на уровне от приблизительно 15°C до приблизительно 45°C.

C214. Способ по любому из пунктов C181-C213, дополнительно включающий стадию очистки полисахарид-белкового конъюгата.

C215. Способ по любому из пунктов C181-C214, в котором полисахарид-белковый конъюгат содержит менее приблизительно 40% свободного полисахарида относительно общего количества полисахарида.

C216. Способ по любому из пунктов C181-C215, в котором соотношение (по массе) полисахарида и белка-носителя в конъюгате составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0.

C217. Способ по любому из пунктов C181-C216, в котором степень конъюгации конъюгата составляет от 2 до15.

C218. Способ получения полисахарид-белкового конъюгата, включающий стадии:

(a) проведения реакции выделенного капсульного полисахарида GBS с окислителем;

(b) гашения реакции окисления стадии (a) путем добавления гасителя, с получением активированного капсульного полисахарида GBS;

(c) объединения активированного капсульного полисахарида GBS с белком-носителем,

(d) проведения реакции объединенных активированного капсульного полисахарида GBS и белка-носителя с восстановителем, с получением конъюгата капсульного полисахарида GBS и белка-носителя, и

(e) кэппирования непрореагировавшего альдегида путем добавления боргидрида натрия (NaBH₄),

при этом стадии (c) и (d) выполняют в DMSO.

C219. Иммуногенная композиция, содержащая капсульный полисахарид из стрептококка группы B (GBS), конъюгированный с белком-носителем, и адъювант на основе алюминия.

C220. Иммуногенная композиция по п.C219, в которой адъювант на основе алюминия выбран из группы, состоящей из фосфата алюминия, гидроксифосфата алюминия и гидроксида алюминия.

C221. Иммуногенная композиция по п.C219 или C220, в которой адъювант представляет собой фосфат алюминия.

C222. Иммуногенная композиция по п.C219 или C220, в которой адъювант представляет собой гидроксид алюминия.

C223. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C222, в которой адъювант на основе алюминия находится в концентрации от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл.

C224. Иммуногенная композиция по п.C223, в которой адъювант на основе алюминия находится в концентрации приблизительно 0,5 мг/мл.

C225. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C224, в которой капсульный полисахарид выбран из группы, состоящей из полисахаридов серотипов Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII и IX.

C226. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C225, представляющая собой шестивалентную конъюгатную композицию GBS.

C227. Иммуногенная композиция по п.C225, содержащая капсульные полисахариды из GBS серотипов Ia, Ib, II, III, IV и V.

C228. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C227, помещенная в шприц.

C229. Иммуногенная композиция по п.C228, причем шприц является стеклянным.

C230. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C229, помещенная в шприц со свободным пространством над продуктом от приблизительно 1 мм до приблизительно 15 мм.

C231. Иммуногенная композиция по п.C230, помещенная в шприц со свободным пространством над продуктом от приблизительно 2 мм до приблизительно 6 мм.

C232. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C231, ресуспендируемая посредством приблизительно 50 или менее встряхиваний.

C233. Иммуногенная композиция по п.C232, ресуспендируемая посредством приблизительно 10 или менее встряхиваний.

C234. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C233, дополнительно содержащая фосфат.

C235. Иммуногенная композиция по п.C234, в которой фосфат находится в концентрации от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ.

C236. Иммуногенная композиция по п.C235, в которой фосфат находится в концентрации приблизительно 20 мМ.

C237. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C236, дополнительно содержащая хлорид натрия.

C238. Иммуногенная композиция по п.C219-C237, в которой хлорид натрия находится в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ.

C239. Иммуногенная композиция по п.C238, в которой хлорид натрия находится в концентрации от приблизительно 225 мМ до приблизительно 265 мМ.

C240. Иммуногенная композиция по п.C239, в которой хлорид натрия находится в концентрации приблизительно 240 мМ.

C241. Иммуногенная композиция по п.C219-C238, в которой хлорид натрия находится в концентрации приблизительно

C242. Иммуногенная композиция по п.C241, в которой хлорид натрия находится в концентрации приблизительно 150 мМ.

C243. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C242, содержащая общую дозу конъюгатов от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл.

C244. Иммуногенная композиция по п.C243, в которой общая доза конъюгатов составляет от приблизительно 120 мг/мл до приблизительно 240 мкг/мл.

C245. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-C244, имеющая значение pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

C246. Иммуногенная композиция по п.C245, имеющая значение pH приблизительно 7,0.

C247. Иммуногенная композиция, содержащая от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл фосфата алюминия, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 225 мМ до приблизительно 265 мМ хлорида натрия и общую дозу конъюгатов от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, причем имеющая значение pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

C248. Иммуногенная композиция, содержащая от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 0,75 мг/мл гидроксида алюминия, от приблизительно 15 мМ до приблизительно 25 мМ фосфата, от приблизительно 120 мМ до приблизительно 170 мМ хлорида натрия и общую дозу конъюгатов от приблизительно 60 мкг/мл до приблизительно 360 мкг/мл, причем имеющая значение pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5.

C249. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-248 для применения в качестве лекарственного средства.

C250. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C219-249 для применения в способе индукции иммунного ответа против GBS у пациента.

C251. Иммуногенная композиция по п.C250, причем пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной.

C252. Иммуногенная композиция по п.C251, причем женщина находится во второй половине беременности.

C253. Иммуногенная композиция по п.C252, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере 20 недель.

C254. Иммуногенная композиция по п.C253, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере от 27 недель до 36 недель.

C255. Иммуногенная композиция по п.C250, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше.

C256. Иммуногенная композиция по п.C255, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше.

C257. Иммуногенная композиция по п.C256, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 85 лет или старше.

C258. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C250-C257, причем пациент имеет иммунную недостаточность.

C259. Иммуногенная композиция по п.C258, причем пациент имеет медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени.

C260. Иммуногенная композиция по любому из пунктов C250-259, причем стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.

C261. Способ индукции иммунного ответа против стрептококка группы B, включающий введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пунктов C219-C248.

C262. Способ профилактики, или облегчения, заболевания или состояния, связанного со стрептококком группы B, у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по любому из пунктов C219-C248.

C263. Способ по п.C261 или C262, причем пациент является женщиной, планирующей беременность, или беременной женщиной.

C264. Способ по п.C263, причем женщина находится во второй половине беременности.

C265. Способ по п.C263 или C264, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере 20 недель.

C266. Способ по любому из пунктов C263-265, причем беременная женщина находится на сроке беременности по меньшей мере от 27 недель до 36 недель.

C267. Способ по п.C261 или C262, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 50 лет или старше.

C268. Способ по п.C267, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 65 лет или старше.

C269. Способ по п.C267 или C268, причем пациент является взрослым человеком в возрасте 85 лет или старше.

C270. Способ по любому из пунктов C261-C269, причем пациент имеет иммунную недостаточность.

C271. Способ по п.C270, причем пациент имеет медицинское состояние, выбранное из группы, состоящей из ожирения, диабета, ВИЧ-инфекции, рака, сердечно-сосудистого заболевания или заболевания печени.

C272. Способ по любому из пунктов C261-C271, причем стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.

C273. Способ продуцирования антител, включающий введение пациенту иммуногенной композиции по любому из пунктов C219-C248.

C274. Антитело, полученное способом по п.C273.

C275. Способ создания пассивного иммунитета у пациента, включающий стадии:

(a) получения препарата антител с использованием иммуногенной композиции по любому из пунктов C219-C248; и

(b) введения препарата антител пациенту для создания пассивного иммунитета.

Изобретение относится к области фармацевтики и может быть использовано для лечения или предотвращения инфекции, вызываемой стрептококком группы B. Предложена иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты полисахарид-белок-носитель, в которой каждый из конъюгатов включает капсульный полисахарид из другого серотипа стрептококка группы B (GBS), конъюгированный с белком-носителем, причем серотипы включают серотипы Ia, Ib, II, III, IV, и V, капсульный полисахарид в каждом конъюгате имеет уровень сиаловой кислоты более 60%, а белок-носитель содержит CRM₁₉₇. При этом иммуногенная композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации 150 мM или выше, полисорбат-80, гистидин и необязательно адъювант, представляющий собой фосфат алюминия. pH иммуногенной композиции составляет от 6,5 до 7,5 и иммуногенная композиция не вызывает пониженный иммунный ответ на серотип III. Изобретение обеспечивает стабильную 6-валентую иммуногенную композицию. 12 з.п. ф-лы, 47 ил., 51 табл., 26 пр.

1. Иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты полисахарид-белок-носитель, причем:

(i) каждый из конъюгатов включает капсульный полисахарид из другого серотипа стрептококка группы B (GBS), конъюгированный с белком-носителем, причем серотипы включают серотипы Ia, Ib, II, III, IV, и V, причем капсульный полисахарид в каждом конъюгате имеет уровень сиаловой кислоты более 60%, и причем белок-носитель содержит CRM₁₉₇; и

(ii) иммуногенная композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации 150 мM или выше, полисорбат-80, гистидин и необязательно адъювант, представляющий собой фосфат алюминия, причем pH иммуногенной композиции составляет от 6,5 до 7,5; и

причем иммуногенная композиция не вызывает пониженный иммунный ответ на серотип III.

2. Иммуногенная композиция по п.1, представляющая собой шестивалентную конъюгатную композицию GBS.

3. Иммуногенная композиция по п.1, в которой адъювант, представляющий собой фосфат алюминия, присутствует в концентрации от 0,25 мг/мл до 0,75 мг/ мл.

4. Иммуногенная композиция по п.1, в которой адъювант, представляющий собой фосфат алюминия, присутствует в концентрации 0,5 мг/мл.

5. Иммуногенная композиция по п.1, помещенная в шприц.

6. Иммуногенная композиция по п.1, в которой хлорид натрия присутствует в концентрации 225 мМ до 265 мМ.

7. Иммуногенная композиция по п.1, в которой хлорид натрия присутствует в концентрации 240 мМ.

8. Иммуногенная композиция по п.1, в которой хлорид натрия присутствует в концентрации 200 мМ.

9. Иммуногенная композиция по п.1, в которой хлорид натрия присутствует в концентрации 150 мМ.

10. Иммуногенная композиция по п.1, где иммуногенная композиция содержит общую дозу конъюгата от 60 мкг/мл до 360 мкг/мл.

11. Иммуногенная композиция по п.10, в которой общая доза конъюгата составляет от 120 мкг/мл до 240 мкг/мл.

12. Иммуногенная композиция по п.1, где иммуногенная композиция имеет рН 7,0.

13. Иммуногенная композиция по п.1, в которой стрептококк группы B представляет собой Streptococcus agalactiae.