СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И В ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к способу ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота.

Существуют различные способы ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота [1, 2, 3], среди которых способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина [3].

В способе проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, предложенном Rincon G. and Medrano J.F. (2003) [3], используется принцип тетра-праймерной ARMS-PCR, где в реакции применяют 4 олигонуклеотида, два из которых являются внешними (общие праймеры «JK5» и «JK3»), инициирующими при совместном фланкировании амплификацию фрагмента ДНК гена каппа-казеина любого из его аллелей, а остальные два - внутренними (аллель-специфичные праймеры «INNERKCAS FORWARD» и «INNERKCAS REVERSE»), каждый из которых при совместном фланкировании только с одним из внешних праймеров инициирует амплификацию соответствующего аллель-специфичного фрагмента ДНК [3]. (схема 1). Следует отметить, что каждый внутренний праймер помимо рефракторного 3'-терминального «mismatch-нуклеотида» имеет дополнительный некомплементарный ни к одному из аллелей гена каппа-казеина «mismatch-нуклеотид» в позиции -2 от 3'-терминального нуклеотида (-0+) праймера.

Цель изобретения - разработка эффективной техники проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина.

Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, схожий со способом, предложенным Rincon G. and Medrano J.F. (2003) [3], включающим подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза; отличается тем, что используются другие последовательности праймеров, все из которых являются аллель-специфичными, не имеющие дополнительных некомплементарных ни к одному из аллелей гена каппа-казеина крупного рогатого скота «mismatch-нуклеотидов» в позиции -2 от 3'-терминальных нуклеотидов праймеров, но имеющие 5'-некомплементарные участки (n) длиной 5-3 нуклеотидов: В-аллель-специфичные праймеры «B-F-hs»: 5'-cccccGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3' и «B-R-hs»: 5'-cCcccGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3', которые инициируют амплификацию B-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp; A-аллель-специфичные праймеры A-F-hs: 5'-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3' и A-R-hs: 5'-gggGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTTCG-3', которые инициируют амплификацию A-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp; проводят 2-стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72°С.

Условия проведения реакции

Предлагаемый способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы, 2 пары аллель-специфичных праймеров: 1-ая пара В-аллель-специфичных праймеров = 0.5 мкМ праймера «B-F-hs»: 5'-cccccGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3', 0,5 мкМ праймера «B-R-hs»: 5'-cCcccGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3' (ПЦР амплификация В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp); 2-ая пара A-аллель-специфичных праймеров = 0.5 мкМ праймера «A-F-hs»: 5'-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3', 0,5 мкМ праймера «A-R-hs»: 5'-gggGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTTCG -3' (ПЦР амплификация A-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp); 1 мкл пробы ДНК, выделенной из лейкоцитов крови крупного рогатого скота в следующем оптимальном режиме амплификации: ×1: 94°С - 4 мин; ×40: 94°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; ×1: 72°С - 10 мин (схема 1, чертеж).

Визуализацию амплифицированной ДНК проводили методом гель-электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивали с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в H₂O) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносили в лунки 2,5% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл, и подвергали горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 15 В/см в течение 1 часа с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм) (чертеж).

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию предлагаемого способа проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в способности ДНК-анализа аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота (идентификация генотипов АА, ВВ, АВ) при использовании разработанной нами техники аллель-специфичной ПЦР с праймерами «B-F-hs»+«B-R-hs»+«A-F-hs»+«A-R-hs» (чертеж).

Источники информации

1. Kaminski S. (1993). PCR-RFLP identification of kappa-casein genotype in bulls. PhD Thesis, Agricultural University, Olsztyn.

2. Medrano, J.F. and E.Aguilar-Cordova. 1990. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification. Bio/Technology. 8: 144-146.

3. Rincon G. and Medrano J.F. (2003), Single nucleotide polymorphism genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR J. Anim. Breed. Genet. 120: 331-337.

Изобретение относится к области генетики и молекулярной биологии и может быть использовано в селекции сельскохозяйственных животных. Крупный рогатый скот генотипируют по аллелям А и В гена каппа-казеина с помощью двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данную реакцию осуществляют с помощью двух В-аллель-специфичных праймеров и двух А-аллель-специфичных праймеров. Применение изобретения обеспечивает эффективную аллель-специфичную ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина. 1 ил.

Способ проведения аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина, включающий подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, 4-х праймеров; проведение ПЦР; детекцию амплифицированных фрагментов ДНК методом гель-электрофореза, отличающийся тем, что используют последовательности праймеров, все из которых являются аллель-специфичными: В-аллель-специфичные праймеры «B-F-hs»: 5'-cccccGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3' и «B-R-hs»: 5'-cCcccGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3', которые инициируют амплификацию В-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 156 bp; А-аллель-специфичные праймеры «A-F-hs»: 5'-gggggCTGTTCACACACAAAAACAGTAAAC-3' и «A-R-hs»: 5'-gggGGGTGCCTAACCTTATACAGCCTTTCG-3', которые инициируют амплификацию А-аллель-специфичного фрагмента ДНК гена каппа-казеина крупного рогатого скота размером 242 bp; проводят 2-х стадийную ПЦР с совмещением температуры отжига и синтеза при 72°С.