Способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена CSN3 (kappa-casein, каппа-казеин) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Разработанный нами способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции вместе с его ближайшим прототипом [1] относится к разновидности анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени (anti-primer-based quantitative real-time PCR, aQRT-PCR), предложенной J. Li & G.M. Makrigiorgos (2009) [2], способной эффективно идентифицировать однонуклеотидный полиморфизм.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе ПЦР в реальном времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Нами разработан способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, предусматривающий использование двух 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфических праймеров (CSN3-A и SCN3-B), одного обратного общего праймера (CSN3-R), и одного анти-праймера (CSN3-S), меченого гасителем флуоресценции с 3/-конца олигонуклеотида (табл. 1, фиг. 1).

Основным отличием разработанного нами способа от прототипа [1] является конструктивная особенность 5'-флуоресцентно-меченых прямых аллель-специфических праймеров, полностью состоящих из генспецифичных последовательностей, на которых, в том числе и путем конкурентной гибридизации, отжигается комплементарный анти-праймер меньшей длины, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида.

Условия проведения реакции.

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлена сорбционным способом («ДНК-сорб В», ЦНИИ Эпидемиологии, Россия).

Разработанный способ проведения ПНР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 выполняли на амплификаторе Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно протоколу, представленному в табл. 1.

В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и ООО «ДНК-синтез» (Россия).

Апробацию разработанного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 провели на пробах ДНК от 70 быков-производителей ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан Российской Федерации.

Заключение

В результате практических исследований, направленных на апробацию разработанного способа проведения ПНР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции, нами получен обеспечиваемый предложенным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (АА, ВВ, АВ) ввиду корректной интерпретации данных кривых увеличения интенсивности флуоресценции (фиг. 2).

Источники информации

2. Rashydov, A.N. Identification of allele variants of cattle milk productivity genes using PCR and the anti-primer method / A.N. Rashydov, V.G. Spiridonov, O.N. Konoval, M.D. Melnychuk // Cytology and Genetics. - 2010. - V. 44. - N. 5. - P. 272-275.

2. Li, J. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping / J. Li, G.M. Makrigiorgos // Nature protocols. - 2007. - V. 2. - N. 1. - P. 50-58.

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1.

Выравнивание фланкируемых с праймерами CSN3-A + CSN3-B + CSN3-R нуклеотидных последовательностей аллелей An В гена CSN3 Bos Taurus

Пояснение к фиг. 2.

Результат предложенного способа проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3 (праймеры CSN3-A + CSN3-B + CSN3-R и анти-праймер CSN3-S)

Обозначения:

Слева - канал детекции Green. Справа - канал детекции Yellow. Кривые роста флуоресценции для генотипов АА (1-3), АВ (7-9) и ВВ (4-6). ОКО (10).

Изобретение относится к области биотехнологии и генетики сельскохозяйственных животных. Предложен способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, в котором используют 5'-флуоресцентно-меченый прямой А-аллель-специфический праймер CSN3-A: 5'-FAM-ACTGTAGCTACTCTAGACGA-3', 5'-флуоресцентно-меченый прямой B-аллель-специфический праймер CSN3-B: 5'-VIC-ACTGTAGCTACTCTAGATGC-3', обратный общий праймер CSN3-R: 5'-GCTCTCAATAACTTCTGGAGAA-3', анти-праймер CSN3-S, меченый гасителем флуоресценции с 3'-конца олигонуклеотида: 5'-TCTAGAGTAGCTACAGT-3'-BHQ1. Изобретение позволяет эффективно осуществить генотипирование крупного рогатого скота по гену CSN3 на основе ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции. 2 ил., 1 табл.

Способ проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена CSN3, отличающийся тем, что используются:

5^/-флуоресцентно-меченый прямой А-аллель-специфический праймер CSN3-А: 5^/-FAM-ACTGTAGCTACTCTAGACGA-3' (SEQ ID NO: 1),

5^/-флуоресцентно-меченый прямой B-аллель-специфический праймер CSN3-В: 5^/-VIC-ACTGTAGCTACTCTAGATGC-3^/ (SEQ ID NO: 2),

обратный общий праймер CSN3-R: 5^/-GCTCTCAATAACTTCTGGAGАА-3^/ (SEQ ID NO: 3),

анти-праймер CSN3-S, меченый гасителем флуоресценции с 3^/-конца олигонуклеотида: 5^/-TCTAGAGTAGCTACAGT-3^/-BHQ1 (SEQ ID NO: 4).