Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Мартина-Белл Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/68 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.

Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования синдрома Мартина-Белл. Синдром Мартина-Белл - это наследственное Х-сцепленное заболевание, проявляющееся преимущественно у лиц мужского пола, и являющееся второй, после синдрома Дауна, наиболее частой генетической причиной нарушения умственного развития. Синдром Мартина-Белл встречается с частотой около 1 на 4000 для мужского пола и 1 на 8000 для женского пола. Это заболевание приводит к серьезному нарушению психомоторного развития ребенка, умственной отсталости. Для данного заболевания, при Х-сцепленном доминантном типе наследования, вероятность рождения ребенка мужского пола с этим заболеванием в семье составляет 50%; для детей женского пола вероятность наследования также 50%, но симптомы заболевания выражены намного меньше.

К заболеванию синдром Мартина-Белл могут приводить патогенные генетические варианты в гене FMR1, располагающемся на хромосоме X [Garber, K. et. al. Eur J Hum Genet 16, 666-672 (2008)]. Этот ген кодирует белок FMRP (fragile X mental retardation protein, белок умственной отсталости, связанной с синдромом хрупкой X хромосомы), который является РНК-связывающим белком и играет важную роль в развитии синапсов между нейронами, а так же не до конца ясную на данный момент роль в нормальном функционировании женской репродуктивной системы.

ПГТ синдрома Мартина-Белл проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленным патогенными вариантом, обуславливающим этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенного варианта и, следовательно, без риска развития заболевания.

Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является -малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации, образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.

Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ синдрома Мартина-Белл, предложенное Emmanuelle Kieffer и коллегами [Emmanuelle Kieffer et al, 2015] для детекции экспансии CGG-повторов в гене FMR1 с помощью мультплексной гнездовой ПЦР в 2 раунда на единичных клетках с применением косвенной диагностики с помощью анализа 9-ти сцепленных полиморфных маркеров. Учитывая высокую вероятность непрохождения амплификации для прямой диагностики, или низкой информативности прямой диагностики, такая тест-система не позволяет достичь высокой информативности и универсальности. Важным преимуществом предлагаемого нами подхода является использование большего количества полиморфных маркеров для косвенной диагностики, что снижает вероятность недостоверного результата из-за выпадения аллеля или рекомбинации.

Представленный нами метод ПГТ синдрома Мартина-Белл решает задачу разработки более точного способа преимплант ационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.

Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта - экспансии тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 [Garber, K. et. al. Eur J Hum Genet 16, 666-672 (2008)] с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Чаще всего такая мутация наследуется ребенком от матери - носителя премутации, т.е. более короткой экспансии тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена, длины которой недостаточно для развития синдрома Мартина-Белл. При формировании яйцеклеток экспансия удлиняется, и ребенок наследует полную мутацию. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетического варианта экспансия тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию нормального аллеля с помощью ПЦР с последующим фрагментным анализом. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена.FMR1 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может, варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген FMR1, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген FMR1 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 16 STR локусов для гена FMR1: D17S1449, D17S1452, D17S1455, D17S1460.1, D17S1460.2, D17S1461, D17S1463, D17S1467, D17S1472, D17S1475, FMR1-CA525D, D17S1476, FMR1-GT624D, D17S1477, D17S1482, D17S1483. Праймеры для амплификации находятся на X хромосоме в районе координат 144913360-148380426 (в соответствии с hg19). Последовательности праймеров указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-50. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п. н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п. н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.

Подготовительный этап ПГТ

На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт WGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mМ, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией 10 mМ каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1×PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.

В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.

Полугнездовая ПЦР

Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п. н. Для второго этапа были, подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. Последовательности праймеров для амплификации фрагментов, содержащих STR локусы, указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-50. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×ПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 mМ каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% DMSO и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.

В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×ПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5xRediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μM каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).

Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона). Детекция патогенного варианта экспансия тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 проводилась с помощью праймеров для амплификации: 5'-(6-FAM)-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-3' (F), 5'-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC-3' (R).

Пример 1

Пациенты A

В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием синдром Мартина-Белл с патогенным вариантом экспансия тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, унаследованном от матери-носителя премутации. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания синдром Мартина-Белл в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.

Гаплотипирование семьи

На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Фрагменты ДНК, содержащие полиморфные маркеры, амплифицировались с помощью праймеров, последовательности которых указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-50. Было проанализировано 16 STR локусов. Из них 7 оказались информативными по матери. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры.

Аллели полиморфных маркеров, совпадающие у пациентки (матери) и у ребенка с заболеванием синдром Мартина-Белл с заранее установленным носительством патогенного варианта экспансия тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, признаются сцепленными с патогенным вариантом и друг с другом. Аллели полиморфных маркеров, не совпадающие у матери и у ребенка с заболеванием, признаются сцепленными друг с другом и с нормальным аллелем гена FMR1. Аллели полиморфных маркеров партнера (отца), признаются сцепленными друг с другом и с нормальным геном FMR1. Косвенная диагностика позволяет сделать вывод о наследовании нормального или мутантного аллеля гена даже в случае выпадения аллеля или непрохождения реакции при амплификации фрагментов ДНК для прямой диагностики.

В результате гаплотипирования и определения групп сцепления для семьи А из примера были получены результаты, представленные в таблице 1. Аллели, указанные на одной строке, располагаются на одной хромосоме, то есть, представляют группу сцепления. Таким образом для пациентки представлено 2 группы сцепления, соответствующие каждой из двух X хромосом. Партнер и ребенок с заболеванием мужского пола имеют только по 1 X хромосоме и только по 1 группе сцепления. N в таблице обозначает отсутствие экспансии тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, mut -присутствие экспансии тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, premut - премутацию. Цифрами записаны длины ампликонов в парах нуклеотидов; их длины зависят от количества повторов в маркере STR. Патогенный вариант экспансия тринуклеотидного повтора в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 в таблице обозначен коротко - FRAXA.

В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: DXS1449 - 248, DXS1455 - 222, DXS1460.1 - 236, DXS1463 - 208, GT624D - 249, DXS1482 - 292, DXS1483 - 220.

Преимплантационное генетическое тестирование

В цикле ЭКО было получено 6 эмбрионов, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (lllumina, США).

Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. Также были добавлены праймеры для маркеров половых хромосом - SRY/AMEL. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты:

По результатам прямой и косвенной диагностики 4 эмбрионов (эмбрионы 3, 4, 5 и 6) не унаследовали заболевание, у 2 эмбрионов (эмбрионы 1 и 2) выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. Эмбрионы, не унаследовавшие заболевание, были рекомендованы к переносу по результатам ПГТ-М.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

преимплантационного генетического тестирования синдрома

Мартина-Белл_11111.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2022-12-02">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022129270</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-11</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2022129270</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022129270</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-11</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Акционерное общество &quot;Центр

Генетики и Репродуктивной Медицины &quot;Генетико&quot;

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Genetico</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ преимплантационного

генетического тестирования Мартина-Белл</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>50</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaatccctccctgatctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caagacaatctcaccgctct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgaatgaggctctggttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agatcttggctatgtgttactaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgtttcattctaagattcaggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatcccccataatcacactct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcagaacatcttgggcatct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctgactaggcatgttcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggcatgatgggtaactatac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcatgggataaagcaggta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggaaaaaggttggtgaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cccaagcctccacaataat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttactcattacaactgggcaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcactggtcagcggag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="15">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q30">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctctcacaagaagactgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="16">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaagcacaatagaagcaggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="17">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggagctgagcattagttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="18">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gggttacaacgtactcctgtag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="19">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcatttggaggaaagacact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="20">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctgatgacttggcctatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="21">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggttcacttttcttttgagtca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="22">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtatggtagaatatgctagtgga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="23">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtaaaagctgcaacctacaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="24">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q48">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagtctaattaggttttactgtggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="25">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q50">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatcatcggtaggttaggagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="26">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q52">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggaaacgctttgatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="27">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q54">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actgggcattaagagtcacat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="28">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q56">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggatggtgtaatagtgggact</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="29">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q58">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaagcccagttcctagagaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="30">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q60">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgctgagatttggtcaaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="31">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q62">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgtttccatgcttgctataa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="32">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q64">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctgataacaaagcacgtgtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="33">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q66">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gacatgggcatttctaagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="34">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q68">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttctccttttcattcttcctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="35">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q70">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcatctctttattctgctacactc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="36">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q72">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcaccaggtaccatttgtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="37">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q74">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgctgcagtgttagttacca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="38">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q76">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggccaattacaaacccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="39">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q78">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atttactgggtactggactgtg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="40">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q80">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attgaatctgctaggtaggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="41">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q82">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaactgagagtctgagaagtctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="42">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q84">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caacaacagagacagccaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="43">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q86">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aggaccgaggctcttttag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="44">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q88">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caggctctcgttctacttagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="45">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q90">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caagttgaacacgattgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="46">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q92">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctaaaagtggcttggatct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="47">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q94">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgtcagctacaactcaaagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="48">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q96">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgcaagccttagagtgatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="49">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q98">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacaaaagggcttattgga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="50">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q100">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttgtttatcggttgctgtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) моногенных заболеваний. Описан способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Мартина-Белл. Способ предусматривает выявление наследования экспансии тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную. Прямую детекцию осуществляют с помощью праймеров для амплификации, последовательности которых указаны в формуле. Косвенную детекцию осуществляют с помощью праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом, выбранных из SEQ ID NO 1-50. Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенного варианта - экспансии тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1 с двойной системой детекции - прямой и косвенной. 2 табл., 1 пр.

Способ преимплантационного генетического тестирования синдрома Мартина-Белл, предусматривающий выявление наследования экспансии тринуклеотидного повтора CGG в 5'-нетранслируемой области гена FMR1, включающий двойную систему детекции - прямую и косвенную, где прямую детекцию осуществляют с помощью праймеров для амплификации:

прямой праймер: 5'-(6-FAM)-TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA-3';

обратный праймер: 5'-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC-3',

а косвенную детекцию осуществляют с помощью праймеров для анализа наследования молекулярно-генетических маркеров типа STR, сцепленных с патогенным вариантом, выбранных из SEQ ID NO 1-50, при этом используют праймеры, направленные на те STR, аллели которых разные на хромосомах родителя-носителя мутации, где внешние праймеры обозначены как Fout (прямой праймер) и Rout (обратный праймер), а внутренние праймеры обозначены как Fin (прямой праймер) и Rin (обратный праймер), при этом диагностику проводят в два этапа полугнездовой ПЦР: на первом этапе проводят мультиплексную ПЦР с внешними праймерами, на втором этапе проводят индивидуальную ПЦР каждого фрагмента с внутренними праймерами для STR, а также проводят простую ПЦР и фрагментный анализ для определения патогенного варианта в гене FMR1.