ТВЕРДАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ Российский патент 2023 года по МПК A01N63/20 C05F11/08 C12R1/15 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности, к более эффективному использованию композиций биопестицидов и содержащих микроорганизмы биоудобрений, способных защищать растения без воздействия на окружающую среду.

Уровень техники

Постоянно увеличиваются затруднения, связанные с применением химикатов в сельском хозяйстве и вредными воздействиями, которые они оказывают на здоровье и окружающую среду. С другой стороны, развивается резистентность у патогенов растений. Все это повышает интерес к применению полезных микроорганизмов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и увеличения продуктивности. Таким образом потребление пищи становится более безопасным и защищается и окружающая среда.

В почве имеются многочисленные микроорганизмы, обладающие способностью к биорегулированию, которые включены в разные практики интегрированной борьбы с вредителями и увеличения сельскохозяйственной продуктивности (Avis et al., (2008) Soil Biology & Biochemistry 40, 1733-1740).

Различные микроорганизмы которые обладают биорегулирующей активностью по отношению к различным вредителям в лабораторных условиях, нелегко использовать с такой же эффективностью в полевых условиях. Это обусловлено наличием факторов окружающей среды и конкуренцией с другими микроорганизмами в их нише, что может влиять на их рост, физиологию, метаболизм и экспрессию генов (Khare and Arora, NK Arora (ed.), Plant Microbes Symbiosis: Applied Facets, Springer India 2015). Для преодоления этих ограничений необходимо разработать препараты или композиции в средах, которые способны поддерживать жизнеспособность и мощность живых клеток на всех стадиях от производства до использования. Правильно приготовленные бактериальные препараты увеличивают возможность обеспечения оптимальных характеристик и их коммерческий успех при производстве сельскохозяйственных пищевых продуктов (Bashan et al., Plant Soil (2014) 378: 1-33).

С физической точки зрения композиции в виде смачивающихся порошков должны удовлетворять требованиям, предъявляемым к их нанесению. Низкая смачиваемость является одним из затруднений, обнаруживаемых для препаратов в форме порошков, которая приводит к образованию комков, засоряющих сопла опрыскивающих систем при использовании в поле. Обычно смачивание является процессом, при котором газовая фаза на поверхности твердой фазы заменяется на жидкую фазу; эти три фазы сосуществуют в течение некоторого времени, так что возможно перемешивание в некоторой степени. В конкретном случае распылительной сушки содержание окклюдированного воздуха может меняться в зависимости от рабочих параметров сушилки, состава высушиваемого крема и его физических характеристик. Высокая вязкость затрудняет свободный выход воздуха из крема. Энергичное перемешивание в баке, содержащем концентрат, способствует образованию частиц воздуха внутри массы. Температура крема также способствует сосуществованию большего количества воздуха в высушиваемом концентрате. Поэтому для исключения образования препарата с плохой смачиваемостью важно учитывать и рабочие параметры, и состав высушиваемого крема (Bhesh R. Bhandari, et al. (1997), Drying Technology, 15: 2, 671-684).

Нематоцидная активность штамма C-924 установлена в патенте EP0774906. Этот штамм классифицирован, как Corynebacterium paurometabolum, с использованием эталонной системы API-50 CH и был депонирован в 1995 г. в the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), в Baarn, the Netherlands (Deposit No. CBS 61395). Затем была подтверждена широкая пестицидная и противопаразитарная активность этого же штамма C-924, переклассифицированного, как Tsukamurella paurometabola (патент EP 1356733), так что его применяли для борьбы с паразитами животных и растений. Позднее была установлена активность этого же бактериального штамма в качестве биологического удобрения (патент EP2154121).

До настоящего времени использовали два препарата указанного микроорганизма, один жидкий и один твердый. Недостатком жидкого препарата является меньшая стабильность и использование большего объема для его введения. Использовавшийся до настоящего времени твердый препарат, хотя и показано, что он обладает большей стабильностью, чем жидкий, приводит к затруднениям со смачиваемостью и образованием комков, что неблагоприятно влияет на применимость в поле.

Поэтому необходимо создать композиции указанного микроорганизма, обладающего физическими характеристиками, которые облегчают его нанесение в поле, при улучшении его характеристик, как биопестицида и биологического удобрения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении указанная выше задача решена путем предоставления более эффективной твердой композиции микроорганизма с проверенными характеристиками, как биопестицида и биологического удобрения. Настоящее изобретение относится к твердой композиции для применения в сельском хозяйстве или ветеринарии, содержащей: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма C-924 и культуральной среды для роста и развития микроорганизмов или имеющейся в продаже органической добавки; 2) от 1,8% до 6,6% противовспенивающего вещества; 3) от 0,8% до 3% сахарозы и 4) обладающей остаточной влажностью, составляющей менее 12%. Установлено, что в указанной композиции содержание бактерий (штамм C-924) составляло от 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) до 10¹² КОЕ на 1 г твердой композиции.

Указанная композиция более эффективна, в ней сохраняется стабильность продукта и уменьшается время смачивания. Это делает нанесение продукта более подходящим, что улучшает плодородие почвы и условия в ней для более удовлетворительного развития выращиваемых в ней растений; защищает растения о нашествия нематод и фитопатогенных грибов, и обеспечивает борьбу с желудочно-кишечными зоонематодами животных.

Как указано выше, штамм C-924 который образует активный ингредиент композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, депонирован в соответствии с Будапештским договором, как Deposit No. CBS 61395. В настоящем изобретении раскрыта оптимизированная твердая композиция для борьбы с бактериями, фитопатогенными грибами и нематодами, и стимулирования роста растений, которая содержит указанный штамм микроорганизма. Оптимизация обеспечена путем облегчения повторного суспендирования для ее заключительного введения при улучшении стабильности продукта. В настоящем изобретении показано, что препарат обладает временем смачивания, меньшим 10 мин.

Для задач настоящего изобретения термин "противовспенивающее вещество" означает любое вещество, которое используют для подавления или уменьшения образования пены при микробиологической ферментации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения противовспенивающим веществом является смесь эфиров жирных кислот с сополимерами этиленоксид-пропиленоксид. В предпочтительном варианте осуществления противовспенивающим веществом является вещество типа Glanapon, такое как поставляемое фирмой Bussetti & Co, GmbH, Austria.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения культуральная среда, которая образует часть твердой композиции, выбрана из группы, состоящей из следующих: дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, пептон и триптон. В другом варианте осуществления органическая добавка, такая как гидролизаты белка и меласса, образует часть твердой композиции. Для получения твердой композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, концентрат рассматриваемых микроорганизмов (штамм C-924) сначала смешивают с культуральной средой или имеющейся в продаже органической добавкой, обычно использующейся для выращивания микроорганизмов.

В контексте настоящего изобретения "твердая композиция" означает любой твердый продукт, полученный с помощью приготовления и сушки биомассы, собранной в процессе ферментации микроорганизмами, в виде его концентрата. Примером твердой композиции с такими характеристиками является смачивающийся порошок.

Для приготовления продукта биомассу получают путем погружной ферментации в среде, богатой аминокислотами (предпочтительно дрожжевой экстракт, пептон, триптон или гидролизат казеина) и углеводами (предпочтительно сахароза, глюкоза или меласса). Условия выращивания позволяют получить культуру высокой плотности и сбор проводят на последней стадии экспоненциальной фазы и получают клетки, подготовленные для последующей стадии сушки. Сбор биомассы проводят центрифугированием или микрофильтрованием, выполняя промывку для удаления остатков культуральных сред до стадии приготовления концентрата микроорганизмов, в настоящем изобретении также называющегося, как "крем".

Без наложения ограничения на объем настоящего изобретения при его осуществлении, приготовление композиции проводили в две стадии: первой стадии приготовления концентрата микроорганизмов или крема и второй стадии распылительной сушки. На стадии приготовления смешивали первую культуральную среду, сахарозу и противовспенивающее вещество, и проводили термическую обработку смеси для снижения нежелательной микробной нагрузки и затем добавляли концентрированную биомассу микроорганизма. На второй стадии приготовленный крем сушили в распылительной сушилке при таких значениях температуры на входе и на выходе, которые обеспечивали высокую выживаемость рассматриваемых микроорганизмов. В заключение продукт упаковывали при условиях, которые обеспечивают низкую остаточную влажность и низкое содержание кислорода для гарантирования стабильности продукта.

В другом объекте настоящего изобретения раскрыто применение твердой композиции, содержащей: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма C-924 и культуральной среды для роста и развития микроорганизмов или имеющейся в продаже органической добавки; 2) от 1,8% до 6,6% противовспенивающего вещества; 3) от 0,8% до 3% сахарозы и 4) обладающей остаточной влажностью, составляющей менее 12%; для борьбы с патогенами растения и животного.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения патогеном, с которым проводят борьбу с помощью указанной твердой композиции штамма C-924 является паразитическая нематода. В предпочтительном варианте осуществления паразитическая нематода относится к роду Meloidogyne, Radopholus, Pratylenchus, Haemonchus, Trichostrongylus и Dictiocaulus.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения патогеном, с которым проводят борьбу с помощью указанной твердой композиции, является гриб. В предпочтительном варианте осуществления гриб выбран из группы, состоящей из следующих: Alternaria tabacina, Alternaria longipes, Bipolaris oryzae, Collectotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Pestalotia palmarum, Rhizopus stolonifer, Rhizoctonia solani, Sarocladium oryzae и Thielaviopsis paradoxa.

Настоящее изобретение также относится к применению твердой композиции, содержащей: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма C-924 и культуральной среды для роста и развития микроорганизмов или имеющейся в продаже органической добавки; 2) от 1,8% до 6,6% противовспенивающего вещества; 3) от 0,8% до 3% сахарозы; и которая обладает остаточной влажностью, составляющей менее 12%, для стимулирования прорастания семян и роста растений.

Другим объектом настоящего изобретения является способ борьбы с патогенами растений и животных, характеризующийся введением в почву или нуждающемуся в нем животному эффективного количества твердой композиции, содержащей: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма C-924 и культуральной среды для роста и развития микроорганизмов или имеющейся в продаже органической добавки; 2) от 1,8% до 6,6% противовспенивающего вещества; 3) от 0,8% до 3% сахарозы; и которая обладает остаточной влажностью, составляющей менее 12%; с помощью подходящей формы введения композиции указанному растению или животному.

Для растений "подходящая форма введения композиции" определяется, как все средства, с помощью которых суспензию композиции делают доступной для корневой системы растения, такие как автоматические системы полива или полив с помощью опрыскивателей или других аппаратов. В случае применения для животных "подходящая форма введения композиции" означает доставку твердой композиции или ее суспензии в качестве части корма или прямое введение пероральным путем.

Частью настоящего изобретения также является способ стимулирования прорастания семян и роста растений, характеризующийся введением в семена или растения эффективного количества твердой композиции, содержащей: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма C-924 и культуральной среды для роста и развития микроорганизмов или имеющейся в продаже органической добавки; 2) от 1,8% до 6,6% противовспенивающего вещества; 3) от 0,8% до 3% сахарозы; которая обладает остаточной влажностью, составляющей менее 12%, с помощью подходящей формы введения композиции в указанные семена или растения.

Для семян "подходящая форма введения композиции" определяется, как все средства, с помощью которых семена вводят во взаимодействие с суспензией твердой композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Например, подходящей формой введения композиции в семена является их погружение в указанную композицию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Изменение концентрации сухой биомассы в зависимости от времени во время ферментации штаммом микроорганизма C-924.

Фиг. 2. Влияние добавления разных веществ на смачиваемость композиций штамма микроорганизма C-924 и органического вещества. Использовали следующие добавки: A - камедь акации, B - ксантановая камедь, C - трагакантовая камедь, D - додецилсульфат натрия (SDS), E - полисорбат 80 (Tween 80), F - полисорбат 20 (Tween 20 ), G - желатин, H - альгинат натрия, I - сахароза, J - сульфат аммония, K - Glanapon DG -158, L- лецитин сои, M - карбоксиметилцеллюлоза (CMC), N - полиэтиленгликоль 600 (PEG 600), O -полиэтиленгликоль 8000 (PEG 8000), P - контроль (без какой-либо добавки). Максимальной и минимальной являются две концентрации исследуемых добавок.

Фиг. 3. Влияние концентрации сахарозы на смачиваемость композиций штамма микроорганизма C-924 и органического вещества.

Фиг. 4. Прорастание в процентах семян маиса, обработанных композициями, содержащими штамм микроорганизма C-924, Azotobacter chrococcum INIFAT 12 и Pseudomonas fluorescens C16 соответственно. Контроль: необработанные семена. Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения при p ˂ 0,05 в соответствии с критерием Дункана.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение биомассы.

Биомассу бактериального штамма C-924 с номером депозита CBS 613.95 получали с помощью погружной ферментации в системе периодического действия в культуральной среде, обладающей следующим составом: дрожжевой экстракт, 59 г/л; сахароза, 170 г/л; гептагидрат сульфата магния, 4,8 г/л и противопенная добавка Glanapon DG-158 1 г/л. Ферментацию проводили в ферментаторе с рабочим объемом 50 л при 36°C при перемешивании скоростью 500 об/мин при аэрации в размере 1,5 л воздуха на 1 л культуральной среды и давлении в стеклянном ферментаторе, равном 1 бар. Культуру выдерживали в течение 72 ч до полного израсходования добавленной сахароз и затем ее выдерживали в стационарной фазе в течение не менее 4 ч. Микроорганизмы собирали центрифугированием в трубчатой центрифуге и надосадочную жидкость культуры отбрасывали. Полученную биомассу использовали для приготовления крема или концентрата бактерий, который сушили. На фиг. 1 представлена полученная кинетика роста. На основании параметров, приведенных на указанном чертеже, можно наблюдать высокую плотность роста, поскольку значения концентрации сухой биомассы превышают 100 г/л, что обеспечивает лучшее получение клеток для последующей процедуры сушки.

Пример 2. Выбор добавок для улучшения смачиваемости композиции.

Проводили исследование влияния разных добавок на физические характеристики препарата бактериального штамма C-924, определяемого на основании смачиваемости. Биомассу получали, как описано в примере 1. Исследовали следующие добавки: камедь акации, ксантановая камедь, трагакантовая камедь, SDS, полисорбат 80 (tween 80), полисорбат 20 (tween 20), желатин, альгинат натрия, сахароза, сульфат аммония, Glanapon DG-158 (Bussetti & Co, GmbH, Austria), лецитин сои, карбоксиметилцеллюлоза (CMC), полиэтиленгликоль 600 (PEG 600) и полиэтиленгликоль 8000 (PEG 8000). Получали композиции с концентрацией микроорганизма (бактериальный штамм C-924) от 8,4% до 9,2% (мас./мас.) и культуральной среды (дрожжевой экстракт) от 76% до 85% (мас./мас.). Добавки прибавляли в двух концентрациях, одной минимальной (2,3% (мас./мас.)) и другой максимальной (10,5% (мас./мас.)) за исключением ксантановой камеди. Для этого соединения минимальное значение составляло 0,23% и максимальное значение составляло 1,2% (мас./мас.); вследствие высокой вязкости, придаваемой этой добавкой крему или концентрату, готовили в сухом виде. В качестве контроля использовали препарат без добавок, содержащий 9,5% (мас./мас.) биомассы и 85,5% (мас./мас.) дрожжевого экстракта. Приготовленные кремы сушили в распылительной сушилке с предварительным нагреванием на технологической линии с помощью теплообменника до 37 ± 1°C и сушили при температуре на входе, равной 130 ± 2°C, и температуре на выходе, равной от 60°C до 62°C. Полученные композиции упаковывали в трехслойный материал (полиэтилен, алюминий и сложный полиэфир) с помощью вакуумного герметизирующего устройства. Остаточная влажность композиций после сушки в среднем составляла 5%. Исследуемым параметром являлась смачиваемость композиций, которую определяли по методике, описанной в Collaborative International Pesticides Analytical Council (CIPAC) in CIPAC MT53.3.

На фиг. 2 показано, что добавление противовспенивателя Glanapon DG-158 в двух исследованных концентрациях (2,3% и 10,5%) неожиданно приводит к уменьшению времени смачивания композиции до равного менее 10 мин, что значительно улучшает физические характеристики композиции и поэтому ее применимость для имеющихся систем полива.

Пример 3. Влияние концентрации Glanapon DG-158 на смачиваемость композиции.

Для исследования влияния концентрации Glanapon DG-158 на смачиваемость композиции проводили два эксперимента, один в присутствии и другой при отсутствии органического вещества, кроме того, концентрацию противовспенивающего агента Glanapon DG-158 меняли от 0 до 6,6%. Дрожжевой экстракт включали в препарат первого эксперимента. Его проводили с использованием концентрации 23,5% сухой биомассы, 67,1% дрожжевого экстракта, 1,1% сахарозы и для Glanapon DG-158 она равнялась от 0 до 6,6%. Композиция второго эксперимента не включала дрожжевой экстракт и обладала концентрацией 90,6% сухой биомассы, 1,1% сахарозы и Glanapon DG-158 от 0 до 6,6%. Биомассу получали, как описано в примере 1. Процедуру сушки проводили, как описано в примере 2, с использованием температуры на выходе, равной 80°C. Исследуемым параметром являлась смачиваемость, которую определяли по методике CIPAC MT53.3. В таблице 1 приведены результаты, полученные в первом эксперименте, когда дрожжевой экстракт включали в препарат. Полученные результаты показывают, что при концентрации Glanapon DG-158, большей или равной 1,8%, обеспечивается смачиваемость, составляющая менее 1 мин.

Таблица 1. Влияние концентрации Glanapon DG-158 на смачиваемость композиции, включающей дрожжевой экстракт.

Концентрация Glanapon DG-158 (%) Смачиваемость (ЧЧ:ММ:СС) 0,5 0:07:00 (b)* 1 0:16:12 (a) 1,8 0:00:22 (c) 3,5 0:00:20 (c) 5 0:00:19 (c) 6,6 0:00:18 (c)

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения смачиваемости (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05). Смачиваемость представляется, как время смачивания в часах:минутах:секундах (ЧЧ:ММ:СС).

В таблице 2 приведены результаты, полученные во втором эксперименте, когда дрожжевой экстракт не включали в препарат. Полученные результаты показывают, что при концентрации Glanapon DG-158, большей или равной 1,8%, обеспечивается смачиваемость, составляющая менее 10 мин.

Таблица 2. Влияние концентрации Glanapon DG-158 на смачиваемость композиции без дрожжевого экстракта.

Концентрация Glanapon DG-158 (%) Смачиваемость (ЧЧ:ММ:СС) 0 1:40:00 (a)* 1 0:15:00 (b) 1,8 0:07:48 (c) 2,5 0:02:09 (d) 3 0:00:36 (e) 4 0:00:24 (e) 5 0:00:12 (e) 6,6 0:00:09 (e)

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения смачиваемости (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05). Смачиваемость представляется, как время смачивания в часах:минутах:секундах (ЧЧ:ММ:СС).

Результаты, приведенные в обеих таблицах, показывают, что Glanapon DG-158 при концентрации, большей или равной 1,8%, уменьшает время смачивания до равного менее 10 мин, это время меньше, чем в случае, когда дрожжевой экстракт присутствует в препарате. Для композиций, приготовленных при концентрации Glanapon DG-158, превышающих 6,6%, наблюдается уменьшение сыпучести полученного порошка, что неблагоприятно влияет на физические характеристики продукта.

Пример 4. Влияние концентрации сахарозы на смачиваемость твердой композиции.

Исследовали влияние концентрации сахарозы на смачиваемость продукта. Получали разные варианты высушенного крема с основным составом, включающим 23,5% сухой биомассы, 2% Glanapon DG-158, 67% дрожжевого экстракта, от 0 до 3,3% сахарозы. Биомассу получали, как описано в примере 1. Кремы получали при полной концентрации твердого вещества, равной 40%. Сушку проводили в распылительной сушилке при температуре на входе, равной 130 ± 2°C, и температуре на выходе, равной 80°C. Исследуемым параметром являлась смачиваемость, которую определяли по методике CIPAC MT53.3.

На фиг. 3 показано, что при использовании сахарозы при концентрации от 0,8 до 3% обеспечивается смачиваемость, равная менее 10 мин, что является желательным временем для продукта этого типа.

Пример 5. Получение композиций для исследований биологической активности.

Высушенный крем, содержащий бактерии штамма C-924, получали при полной концентрации твердого вещества, равной 30%. Сначала дрожжевой экстракт и сахарозу добавляли к кремам в количествах, необходимых для каждого приготовляемого препарата, и в каждом препарате использовали 15% от общего объема Glanapon DG-158 в объеме технологической воды, который делает возможным добавление полученной влажной биомассы. Полученные смеси гомогенизировали в баке для перемешивания с регулированием температуры. Их нагревали при 95°C в течение 1 ч. Затем, их охлаждали до температуры ниже 15°C. После достижения указанной температуры полученную влажную биомассу и остаток Glanapon DG-158 добавляли к каждому препарату и выдерживали при перемешивании в течение не менее 1 ч.

Полученные смеси сушили в распылительной сушилке. Для этого предназначенные для сушки кремы предварительно нагревали на технологической линии с помощью теплообменника до 37±1°C и сушили при температуре на входе, равной 130±2°C, и температуре на выходе, равной 80°C. Участок, на который выгружали продукт, обладал остаточной влажностью, составляющей менее 55% и температурой, равной от 22°C до 26°C. Полученные композиции упаковывали в трехслойный материал (полиэтилен, алюминий и сложный полиэфир) с помощью вакуумного герметизирующего устройства.

Конечные составы приготовленных препаратов были следующими:

Препарат 1: Контроль без микроорганизмов. Сухая биомасса 0%; дрожжевой экстракт 90,4%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Препарат 2: сухая биомасса 2,3%; дрожжевой экстракт 88,2%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Препарат 3: сухая биомасса 4,5%; дрожжевой экстракт 85,9%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Препарат 4: сухая биомасса 22,6%; дрожжевой экстракт 67,8%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Препарат 5: сухая биомасса 45,2%; дрожжевой экстракт 45,2%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Препарат 6: сухая биомасса 90,4%; дрожжевой экстракт 0%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%.

Остаточная влажность всегда равнялась 5%. Полученные композиции после концентрирования обладали содержаниями каждого компонента, находящимися в следующих диапазонах: смесь дрожжевого экстракта и сухой биомассы меньшей или равной 92,4%; Glanapon DG-158 от 1,8% до 6,6%; сахароза от 0,8% до 3%; вода (остаточная влажность) менее 12%. Использовали микроорганизмы, состоящие из бактериального штамма C-924 в концентрации от 10¹⁰ до 10¹² КОЕ/г композиции.

Пример 6. In vitro исследование нематоцидного эффекта композиций штамма микроорганизма C-924.

Процедуру проводили в лабораторном масштабе для исследования нематоцидного эффекта композиций, содержащих штамм C-924, причем менялось отношение органическое вещество/микроорганизмы. Дрожжевой экстракт использовали в качестве органического вещества. В этом эксперименте использовали композиции, описанные в примере 5. В качестве критерия активности in vitro определяли подавление выведения из яиц и смертность молодых особей для каждой композиций. Это исследование проводили для разных видов нематод.

Образцы экстрагировали из корней растений, зараженных фитонематодами (Meloidogyne incognita, Radopholus similis и Pratylencus coffeae); из сычуга жвачных животных (Haemonchus contortus и Trichostrongilus colubriformis) и из легких овец (Dictyocaulus viviparus), зараженных зоонематодами. Образцы помешали в 1% раствор гипохлорита натрия на 3 мин, и затем промывали 3 или 4 раза стерильной деионизированной водой для удаления остатка гипохлорита. Молодь выводили из яиц, инкубированных при 28°C в стерильной деионизированной воде в течение от 2 до 6 дней. Образцы получали незадолго до начала исследований, которые проводили в стерильных культуральный планшет из 24 лунок. В среднем в каждую лунку помещали100 яиц (или 100 молодых особей).

Для исследования эффекта для каждой композиции штамма C-924 во всех случаях их сначала суспендировали в деионизированной воде, бактерии собирали центрифугированием, промывали и суспендировали в воде с 1% пептона до обеспечения плотности клеток, равной 5×10⁴ КОЕ/лунка.

После помещения яиц планшеты осматривали под микроскопом и проверяли возможное наличие молодых особей в каждой лунке. В каждую лунку добавляли 0,1 мл каждого препарата и объем доводили до 1 мл стерильной деионизированной водой. Контроли помещали в отдельный планшет. Они содержали такое же количество яиц и молодых особей в воде только с пептоном. В каждом случае делали три повтора.

При изучении активности по отношению к яйцам исследование проводили через 96 ч, подсчитывая количество появившихся за это время молодых особей под микроскопом. Количество выведенных из яиц рассчитывали с учетом полного количества яиц, помещенных в начале исследования, подавление выведения из яиц в процентах для каждого исследования определяли относительно количества выведенных из яиц в процентах для композиции 1, использованной в качестве контроля.

При изучении активности по отношению к молодым особям исследование проводили после 72 ч инкубации. Затем молодых особей переносили в стерильную деионизированную воду и инкубировали в течение еще 24 ч, затем под микроскопом проводили окончательный подсчет количества живых и погибших молодых особей. В этом исследовании выживаемость молодых особей рассчитывали после окончания эксперимента и определяли его уменьшение по сравнению с вызванным контрольным препаратом.

В обоих исследованиях критерием выбора наиболее эффективных композиций было увеличение подавления выведения из яиц и уменьшение выживаемости молодых особей на 50% или более. Результаты исследования подавления выведения из яиц приведены в таблице 3. Значения являются средними значениями для трех повторов.

Таблица 3. Подавление выведения нематод из яиц разными композициями штамма микроорганизма C-924.

Композиция Вид нематоды 1 2 3 4 5 6 Haemonchus contortus 2,8%
(a) * 27%
(b) 63,2%
(c) 99%
(e) 95%
(e) 84,8%
(d) Trichostrongilus
colubriformis 13,1%
(a) 45,4%
(b) 68%
(c) 98,5%
(e) 93%
(e) 81,5%
(d) Dictyocaulus
viviparus 37,3%
(a) 50,1%
(b) 74,2%
(c) 97,6%
(d) 96,2%
(d) 95%
(d) Meloidogyne incognita 2,6%
(a) 39,9%
(b) 78%
(c) 99,2%
(d) 98,7%
(d) 96,2%
(d) Radopholus similis 4,1%
(a) 47%
(b) 75,5%
(c) 98,7%
(e) 96%
(e) 93,2%
(d) Pratylencus coffeae 10%
(a) 41,2%
(b) 70,2%
(c) 99,5%
(e) 97,5%
(d) 95,5%
(d)

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05)

При подавлении выведения из яиц композиции 3, 4, 5 и 6 характеризуются борьбой, составляющей более 50%, и с зоонематодами, и с фитонематодами. Наилучшие результаты получали для композиции 4. С другой стороны, результаты исследования смертности молодых особей приведены в таблице 4.

Таблица 4. Смертность молодых особей, вызванная разными композициями штамма C-924.

Композиция Вид нематоды 1 2 3 4 5 6 Haemonchus contortus 7,9%
(a)* 22,5%
(b) 58,7%
(c) 84,7%
(e) 69,9%
(d) 67%
(d) Trichostrongilus
colubriformis 17,5%
(a) 26,8%
(b) 60,7%
(c) 88,1%
(d) 71,2%
(c, d) 57,8%
(c) Dictyocaulus
viviparus 22,8%
(a) 33,7%
(b) 54,9%
(c) 91,5%
(e) 77,5%
(d) 60,4%
(c ) Meloidogyne incognita 8,5%
(a) 35,2%
(b) 67,4%
(c) 98,2%
(e) 79%
(d) 62,3%
(c) Radopholus similis 6,3%
(a) 25,8%
(b) 65%
(c) 90,8%
(e) 74,3%
(d) 60%
(c) Pratylencus coffeae 10,2%
(a) 30%
(b) 61,9%
(c) 88,1%
(e) 71,2%
(c, d) 59,6%
(c)

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05)

Для смертности молодых особей композиции 3, 4, 5 и 6 также соответствуют критерию обеспечения гибели более 50% молодых особей. В этом случае композиция 4 обеспечивала наибольшую эффективность.

Пример 7. In vivo исследование нематоцидного эффекта композиций штамма микроорганизма C-924.

A) Регулируемые условия при использовании горшков

Нематоцидную активность композиций по отношению к Meloidogyne incognita определяли при условиях in vivo (горшки емкостью в 1 кг). В этом эксперименте использовали композиции, описанные в примере 5. Использовали растения томатов сорта UC 8213, восприимчивые к нашествию фитонематод. Для каждой композиции использовали 50 растений. В качестве субстрата использовали 1:1 смесь стерильного песка и торфа, которая в каждом горшке была заражена с помощью 1000 яиц нематод за 3 дня до первого введения композиций. Отвешивали 6,25 г каждой твердой композиции и суспендировали в 5 л воды. В каждый горшок вводили 100 мл. При исследованиях введения композиций проводили трижды. Первое введение проводили за 7 дней до пересаживания рассады, второе введение проводили через 14 дней после пересаживания и третье проводили через 21 день после второго введения.

Через 40 дней после высаживания рассады исследовали поражение корней, вызванное нашествием нематод, с использованием шкалы степеней заражения Bridge и Page (Tropical Pest Management Vol. 26, Iss. 3, 1980). Значения степеней заражения растений, обработанных каждой композицией, сопоставляли статистически. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5. Степень заражения корней растений томатов при нашествии нематод Meloidogyne incognita.

Обработка Степень заражения Композиция 1 6,73 (a) * Композиция 2 5,88 (a) Композиция 3 3,53 (b) Композиция 4 1,50 (d) Композиция 5 1,76 (d) Композиция 6 2,04 (c)

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05)

В соответствии с результатами, полученными при исследовании нематоцидной активности в горшках, показано, что композиции 3, 4, 5 и 6 обеспечивают меньшее поражение при нашествии нематод в горшках со статистически значимыми отличиями при сопоставлении с растениями, которым вводили другие препараты. Растения, обработанные композициями 4 и 5, характеризовались наибольшей степенью защиты от нашествия вредителей.

Полевые условия

Нематоцидную активность исследуемых композиций определяли в условиях на закрытом участке площадью 0,1 га. Начальное заражение почвы определяли путем случайного отбора проб и высаживания индикаторных растений. Был выбран закрытый участок с высокой степенью начального заражения, равной 7, по данным результатов с использованием шкалы Bridge и Page. Использовали растения гибридов томатов марки 3019, восприимчивые к нашествию нематод. Композиции вводили по схеме случайных блоков. Концентрированные растворы каждой композиции получали, суспендируя 500 г каждой композиции в 50 л воды. Из этих суспензий готовили разведения 1:8 до введения в каждый блок и при первом введении 100 мл вводили на участок, куда пересаживали каждую рассаду. При втором и третьем введении использовали от 200 мл до 300 мл указанного разведения на растение в зависимости от развития растения. Схема введения была аналогична использованной в исследовании с применением горшков: первое введение за 7 дней до пересаживания рассады в борозды, второе введение проводили через 14 дней после пересаживания и третье проводили через 21 день после второго введения. Поражение корней исследовали для всех растений, обработанных каждым препаратом, с использованием шкалы Bridge и Page, в течение 70 дней выращивания. Значения поражения сопоставляли статистически. Также определяли урожайность для каждой обработки по полной массе плодов (в конце цикла выращивания, 125 дней). Полученные результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6. Степень заражения корней растений томатов при нашествии нематод Meloidogyne incognita.

Обработка Степень заражения Урожайность (т/га) Композиция 1 9,2 (a) * 1,93 Композиция 2 7,8 (b) 21,84 Композиция 3 6,1 (c) 24,12 Композиция 4 4,6 (d) 35,22 Композиция 5 5,2 (c) 32,10 Композиция 6 5,4 (c) 28,20

*Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05)

При исследованиях в полевых условиях композиции 4, 5 и 6 обеспечивали наибольшую борьбу с поражениями при нашествии нематод. В случае композиции 4 степень заражения составила 50% от вызванной у растений, когда вводили препарат 1. Эти результаты также согласуются с полученными для урожайности, когда композиция 4 обеспечила получение на 1725% больше плодов, чем препарат 1, использованный в качестве контроля.

Пример 8. Определение активности композиций, содержащих бактериальный штамм C-924 по отношению к фитопатогенным грибам.

Исследование активности по отношению к фитопатогенным грибам проводили в чашках Петри с твердой культуральной средой. Инокуляцию грибов проводили, когда среда была еще жидкой (температура около 40°C). После затвердевания среды в центр каждой чашки помещали диск из фильтровальной бумаги, увлажненный суспензией концентрации 1 мг/мл каждой композиции, и инкубировали при 30°C. Композиции, использованные в этом эксперименте, описаны в примере 5. Для каждой обработки использовали 3 чашки Петри. Через 5 дней определяли зоны подавления для каждой обработки и значения, соответствующие одной и той же композиции для типов грибов усредняли. Полученные результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7. Подавление фитопатогенных грибов композициями, содержащими штамм C-924.

Зона подавления (мм) Композиция A B C D E F G H I J 1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2 1,5 3,5 0,0 0,0 2,5 0,0 1,5 0,0 1,0 0,0 3 12,5 10,5 2,5 2,0 4,0 3,0 4,0 3,0 6,0 4,0 4 19,0 20,0 15,0 15,0 15,5 15,5 14,5 18,0 15,5 14,0 5 17,0 15,0 14,0 14,5 13,5 13,0 12,5 16,5 14,5 13,5 6 18,0 18,0 15,0 13,5 13,5 15,5 13,0 17,0 15,0 13,0

A) Alternaria tabacina B) Alternaria longipes C) Bipolaris oryzae D) Collectotrichum gloeosporioides E) Fusarium oxysporum F) Pestalotia palmarum G) Rhizopus stolonifer H) Rhizoctonia solani I) Sarocladium oryzae J) Thielaviopsis paradoxa

Эти результаты указывают на антагонистическую активность твердых композиций, содержащих штамм C-924, по отношению ко всем фитопатогенным грибам, приведенным в таблице 7. В частности, композиции 4, 5 и 6 приводят к образованию более значительных зон подавления фитопатогенных грибов.

Пример 9. Подтверждение стабильности композиции, обладающей наибольшей биологической активностью.

Удовлетворительные результаты, полученные в экспериментах по биологической активности позволили провести исследование в реальном масштабе времени стабильности восьми партий, изготовленных с композицией 4; содержащей сухой биомассы 22,6%; дрожжевого экстракта 67,8%; сахарозы 1,4%; Glanapon DG-158 3,2% и обладающей остаточной влажностью, составляющей 5%. Температура на выходе из распылительной сушилки равнялась 80°C. Партии хранили при температуре от 2°C до 8°C. Индикаторы стабильности партий анализировали в начале и в разные моменты времени приготовления вплоть до завершения 24 месяцев хранения.

Показано, что композиция, содержащая сухую биомассу 22,6%; дрожжевой экстракт 67,8%; сахарозу 1,4%; Glanapon DG-158 3,2%; и обладающая остаточной влажностью, составляющей 5%, сохраняла стабильность в течение не менее 24 месяцев при температуре от 2°C до 8°C, что представлено в таблице 8.

Таблица 8. Стабильность партий при хранении при температуре от 2°C до 8°C.

Индикатор 0 месяцев 6 месяцев 12 месяцев 18 месяцев 24 месяца Количество жизнеспособных (×10¹¹ КОЕ) 16,9 ±4,0 7,36 ± 0,60 4,48 ± 0,70 2,32 ± 0,70 1,48 ± 0,60 Суспендируемость (%) 100 100 100 99 99 Смачиваемость (ЧЧ:ММ:СС) 0:03:30 ± 0:00:48 0:05:03 ± 0:00:42 0:04:03 ± 0:00:54 0:04:35 ± 0:00:48 0:05:31 ± 0:00:55

Смачиваемость представляется, как время смачивания в часах:минутах:секундах (ЧЧ:ММ:СС).

Пример 10. Подтверждение применимости в качестве биологического удобрения композиции, обладающей наибольшей биологической активностью.

Для проверки активности твердой композиции штамма C-924, которая проявляла наибольший эффект по отношению к нематодам и грибам (препарат 4), в качестве биологического удобрения для растений кукурузы, инокуляцию почвы проводили за 7 дней до и через 7 дней после высаживания рассады. Смачивающийся порошок препарата суспендировали в концентрации, равной 10⁸ КОЕ/мл. Вводили 100 мл на горшок. В качестве положительного контроля использовали растения, обработанные стимулирующими рост растений бактериями Pseudomonas fluorescens C16 и Azotobacter chroococcum INIFAT 12. В качестве отрицательного контроля использовали неинокулированные растения. Использовали 20 растений для каждой обработки. Семена высевали при норме расхода одно семя на ячейку, четыре ячейки на горшок и на глубину в 3 см в горшки объемом 1 дм³.

Бактерии P. fluorescens C16 (в концентрации, равной 2,7×10¹⁰ КОЕ/мл) и A. chroococcum INIFAT 12 (в концентрации, равной 4,5×10¹⁰ КОЕ/мл) вносили в момент высевания. Оба штамма использовали в растворе твердой смеси бактерий с предварительно просеянным гумусом в дозе 2 кг/га.

Исследовали следующие переменные:

Доля в процентах семян, проросших за 7 дней после высевания.

Высота растений от шейки корня до пазухи кроющего листа (в см, измеренная через 7 дней и 35 дней после высевания растений).

Диаметр стебля растений на высоте 2 см (в мм).

Как можно видеть на фиг. 4, через 7 дней после высевания семян наибольшая степень прорастания (95,6%) наблюдалась для растений, обработанных выбранной C-924 твердой композиции. В случае остальных обработок (растения, инокулированные посредством A. chrococcum INIFAT 12 или P. fluorescens C16) получали данные, сходные с полученными для контроля без инокуляции.

Для переменной "высота растения" наилучшие результаты (со статистически значимым различиями) получали с использованием твердой композиции, содержащей C-924, что показано в таблице 9.

Таблица 9. Высота инокулированных растений кукурузы.

7 дней 35 дней Необработанный контроль 11,73 ^b 72,41 ^c Композиция with C-924 14,15 ^a 83,40 ^a A. chroococcum INIFAT 12 11,82 ^b 76,53 ^b P. fluorescens C16 13,03 ^a 78,64 ^b Стандартная погрешность 0,667* 1,825*

Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения при p ˂ 0,05 в соответствии с критерием множественного ранжирования Тьюки. Высоту растений (в см) измеряли через 7 и 35 дней после высевания растений.

Для диаметра стебля во время первых трех недель эксперимента различия между растениями, включая контроль (таблица 10) не наблюдались. Через 28 дней было установлено, что вариант, в котором содержалась твердая композиция C-924, приводит к наилучшим результатам для этой переменной. Эти значения были больше (со статистической значимостью), чем полученные для контроля без инокуляции, и растений, обработанных стимулирующими рост растений бактериями, использованными в качестве положительного контроля, данные для которых били близки друг к другу.

Таблица 10. Диаметр стебля инокулированных растений кукурузы.

7 дней 21 день 28 дней 35 дней Контроль 2,46 4,54 7,0 ^b 8,67 ^b C-924 2,25 4,58 8,09 ^a 10,52 ^a A. chroococcum INIFAT 12 2,33 4,00 6,43 ^b 8,85 ^b P. fluorescens C16 2,33 4,31 6,61 ^b 8,66 ^b Стандартная погрешность 0,132 ^n.s 0,245 ^n.s. 0,311^* 0,713^*

Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения при p ˂ 0,05 в соответствии с критерием множественного ранжирования Тьюки. Диаметр измеряли через 7, 21, 28 и 35 дней после высаживания.

Эти результаты показывают, что композиция, содержащая C-924 обладает активностью в качестве биологического удобрения вследствие стимулирования прорастания семян и роста, оцененного по высоте и толщине стебля растений.

Пример 11. Исследование нематоцидного эффекта композиций штамма C-924 с разными культуральными средами для микроорганизмов.

Нематоцидную активность по отношению к Meloidogyne incognita композиций, сходных с препаратом 4 примера 5, определяли in vivo. Эту композицию 4 выбрали, поскольку она показала наилучшие результаты для нематоцидной, фунгицидной и стимулирующей рост активности. Аналогичные композиции, исследованные в этом эксперименте, содержали разные культуральные среды для микроорганизмов и были следующими:

Композиция 4A (Контроль): сухая биомасса 22,6%; дрожжевой экстракт 67,8%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%

Композиция 4B: сухая биомасса 22,6%; гидролизат казеина 67,8%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%

Композиция 4C: сухая биомасса 22,6%; пептон 67,8%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%

Композиция 4D: сухая биомасса 22,6%; триптон 67,8%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%

Композиция 4E (контроль без микроорганизмов): сухая биомасса 0%; дрожжевой экстракт 90,4%, сахароза 1,4%, Glanapon DG-158 3,2%

Все композиции обладали остаточной влажностью, составляющей 5%. Использовали растения томатов сорта UC 8213, восприимчивые к нашествию фитонематод. Для каждой композиции использовали 50 растений. В качестве субстрата использовали 1:1 смесь стерильного песка и торфа, которая была заражена с помощью 1000 яиц на горшок за 3 дня до первого введения композиций. Отвешивали 6,25 г каждой твердой композиции и суспендировали в 5 л воды. В каждый горшок вводили 100 мл. Введение композиций проводили трижды: первое введение проводили за 7 дней до пересаживания рассады, второе проводили через 14 дней после высевания и последнее введение проводили через 21 день после второго. Через 40 дней после высаживания исследовали поражение корней, вызванное нашествием нематод, с использованием шкалы степеней заражения Bridge и Page. Значения степеней заражения растений, обработанных каждой композицией, сопоставляли статистически. Результаты, полученные через 40 дней после высаживания рассады, приведены в таблице 11.

Таблица 11. Степень заражения корней вследствие нашествия нематод на растения в горшках.

Обработка Степень заражения Композиция 4A 1,53 (b) Композиция 4B 2,18 (b) Композиция 4C 2,30 (b) Композиция 4D 1,93 (b) Композиция 4E 6,80 (a)

Разными буквами обозначены статистически значимо различные значения (простая классификация ANOVA, критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса p <0,05)

В соответствии с результатами, полученными при исследовании нематоцидной активности в горшках, показано, что нанесение композиций 4A, 4B, 4C и 4D обеспечивают меньшее поражение корней при нашествии нематод со статистически значимыми отличиями при сопоставлении с растениями, обработанными композицией без микроорганизмов (4E). Не наблюдались различия активности исследованной композиций C-924 в зависимости от использованной культуральной среды.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены твердая композиция для применения в сельском хозяйстве; ее применение для борьбы с фитопатогенными грибами и фитонематодами растения и для стимулирования прорастания семян и роста растений; способ борьбы с патогенами растения и способ стимулирования прорастания семян и роста растений, включающие введение эффективного количества твердой композиции с помощью подходящей формы введения. Твердая композиция содержит смесь концентрата бактерий штамма Corynebacterium paurometabolum CBS-61395 с содержанием бактерий от 10¹⁰ до 10¹² КОЕ на 1 г твердой композиции и культуральной среды для роста и развития указанного штамма; от 1,8 до 6,6% противовспенивающего вещества, где противовспенивающим веществом является смесь эфиров жирных кислот с сополимерами этиленоксид-пропиленоксид; от 0,8 до 3% сахарозы; остаточной влажностью менее 12%. Изобретения обеспечивают расширение арсенала биологических удобрений и средств защиты растений с улучшенными физическими характеристиками по смачиваемости, которые облегчают их нанесение в поле. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл., 11 пр.

1. Твердая композиция для применения в сельском хозяйстве, содержащая: 1) до 92,4% смеси концентрата бактерий штамма Corynebacterium paurometabolum CBS-61395 и культуральной среды для роста и развития указанного штамма; 2) от 1,8 до 6,6% противовспенивающего вещества, где противовспенивающим веществом является смесь эфиров жирных кислот с сополимерами этиленоксид-пропиленоксид; 3) от 0,8 до 3% сахарозы и 4) обладающая составляющей менее 12% остаточной влажностью, и для которой установлено, что содержание бактерий составляет от 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) до 10¹² КОЕ на 1 г твердой композиции.

2. Применение твердой композиции по п. 1 для борьбы с фитопатогенными грибами и фитонематодами растения.

3. Применение по п. 2, в котором фитонематоды растения относятся к роду Meloidogyne, Radopholus, Pratylenchus, Haemonchus, Trichostrongylus и Dictiocaulus.

4. Применение по п. 2, в котором фитопатогенные грибы выбраны из группы, состоящей из следующих: Alternaria tabacina, Alternaria longipes, Bipolaris oryzae, Collectotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Pestalotia palmarum, Rhizopus stolonifer, Rhizoctonia solani, Sarocladium oryzae и Thielaviopsis paradoxa.

5. Применение твердой композиции по п. 1 для стимулирования прорастания семян и роста растений.

6. Способ борьбы с патогенами растения, характеризующийся введением эффективного количества твердой композиции по п. 1 нуждающемуся в нем растению с помощью подходящей формы введения композиции указанному растению.

7. Способ стимулирования прорастания семян и роста растений, характеризующийся введением эффективного количества твердой композиции по п. 1 в семена или растения с помощью подходящей формы введения композиции указанным семенам или растениям.