ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ДЛЯ БОРЬБЫ С КОЛОРАДСКИМ ЖУКОМ Российский патент 2015 года по МПК A01N63/02 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, может быть использовано в производстве препаратов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, в частности с колорадским жуком, и представляет собой новый штамм кристаллообразующих бактерий.

Обеспечение продовольственной безопасности в значительной степени связано с защитой сельскохозяйственных культур от вредных членистоногих, уничтожающих до 30% урожая. Широкое использование химических инсектицидов опасно для окружающей среды и приводит к формированию резистентных рас вредителей. Более безопасны биологические препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis.

Известен штамм В. thuringiensis var. thuringiensis - продуцент промышленного препарата - битоксибациллина (Кандыбин, 1972). Недостаток штамма В. thuringiensis var. thuringiensis - низкая патогенность в отношении колорадского жука.

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis spp. thuringiensis 16-T50 для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов, отобранный путем многоступенчатой селекции по признакам экзотоксинобразования, термостабильности спор и фагоустойчивости (патент РФ №2061376, 1996). Бактерии В. thuringiensis подвида thuringiensis I серотипа, кроме эндотоксина, продуцируют термостабильный экзотоксин (синонимы бета-экзотоксин, fly-фактор), представляющий собой атипичный нуклеотид, в состав которого входят остатки аденина, рибозы, глюкозы, аллослизевой и ортофосфорной кислот. Эндотоксин бактерий Bac. thuringiensis subsp. thuringiensis токсичен для представителей отряда чешуекрылых. Экзотоксин имеет широкий спектр действия для насекомых, так как может быть использован как кишечный и контактный яд, однако согласно современным представлениям небезопасен для теплокровных и человека.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Bacillus thuringiensis, используемый для борьбы с жесткокрылыми насекомыми (патент РФ №2204598, 2003). Действующим началом инсектицидной активности у этого штамма является белковый кристаллический эндотоксин, обладающий высокой специфичностью действия в отношении насекомых. Недостаток прототипа - недостаточно высокая активность штамма в отношении личинок старших возрастов и имаго колорадского жука. Выживаемость личинок через 10 дней после обработки жидкой препаративной формой составляла 50,0%. В отношении имаго колорадского жука штамм был не активен.

Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой энтомоцидной активностью в отношении колорадского жука. Штамм получен в 2012 году путем селекции штамма B. thuringiensis 16T100.

Задача решается получением нового штамма В. thuringiensis 16T100/18 путем селекции известного штамма В. thuringiensis 16T100 для повышения инсектицидной активности в отношении личинок старших возрастов и имаго колорадского жука. Полученный штамм зарегистрирован в Коллекции микроорганизмов ВИЗР под номером 16T100/18.

Номенклатурные данные: Род: Bacillus, Cohn, год регистрации - 1872.

Вид: B. thuringiensis.

Штамм В. thuringiensis 16T100/18 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Вегетативные клетки представляют собой грамположительные подвижные, одиночные или в цепочках спорообразующие палочки размером (2.6-5.0)×(0.7-1.0) мкм, перитрихи. Споры овальные, размером (1.0-1.6)×(0.6-1.1), спорангии не расширяют. Споры расположены центрально. При споруляции образуются параспоральные включения различной формы - овальные, круглые, кубические, неправильные четырехгранники. Преобладают кристаллы овально-круглых форм.

Хорошо растет на мясопептонном агаре (МПА), рыбном агаре (РА) и других питательных средах с добавлением пептона и дрожжевого или кукурузного экстракта.

На РА образует пигмент коричневого цвета. Колонии плоские с неровными лопастными краями пастообразной консистенции. На желточной среде, ломтиках картофеля и среде с добавлением БВК пигмент не образует. Оптимальная температура роста 28-30°C.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм продуцирует каталазу, гидролизует крахмал, казеин, разжижает желатин. Образует ацетилметилкарбинол, лецитиназу, уреазу. Не разлагает эскулин и салицин. Не образует кислоты и газы из мальтозы, лактозы и сахарозы. Усваивает глюкозу, маннозу с образованием кислоты без газа. Сероводород и индол не образует.

Отношение к источникам азота

Использует аммонийные и нитратные формы азота. Нитраты восстанавливает. Усваивает азотные соединение, входящие в состав кукурузного экстракта, мясной воды и пептона.

Условия хранения - в виде лиофильно высушенной культуры в запаянных ампулах.

По физиологическим свойствам отличается от B. thuringiensis var. thuringiensis (Н-I) тем, что не усваивает эскулин, не образует кислоты из сахарозы. Пигмент образует. По инсектицидной активности отличается тем, что штамм действует на личинки старших возрастов и имаго колорадского жука.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами использования штамма B. thuringiensis 16Т100/18.

Пример 1

Штамм B. thuringiensis 16Т100/18 хранили на скошенном мясопептонном агаре (МПА) (Жукова и др., 1978) при комнатной температуре с периодическим пересевом на свежую среду. Перед использованием в работе проводили 3-кратный пассаж культуры на МПА, содержащий 1,0% глюкозы, выросшую культуру проверяли на чистоту путем высева на среду МПА. Посевную суспензию готовили из 5-суточной культуры из расчета посевной дозы 10⁶ спор/мл стерильной питательной среды по стандарту мутности.

Изучение морфологии клеток, спор и кристаллов проводили с помощью световой оптической микроскопии по методике Smirnoff [Smirnoff, 1962].

Культивирование штамма ВТ с целью получения культуральной жидкости и приготовления препаративных форм проводили в стерильной жидкой питательной среде следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат кильки - 10,05, натрия хлорид - 4,95, вода до 1,0 л, pH=7,2±0,2, в колбах Эрленмейера емкостью 750 см³, содержащих 50 и 100 мл среды, при 28-30°C при постоянном перемешивании на качалке (n=250 об/мин). Продолжительность культивирования составляла 72-96 часов. Для инокуляции использовали 1-суточную культуру изучаемого штамма. Стерильность процесса контролировали методом световой микроскопии и путем прямого высева на агаризованную питательную среду в чашки Петри. Титр жизнеспособных клеток определяли на 1-4 сутки путем посева 6-8 разведения культуральной жидкости на поверхность МПА. В процессе ферментации осуществляли контроль образования кристаллов при помощи светооптических методов и стерильности методом световой микроскопии и путем прямого высева на агаризованную питательную среду в чашки Петри. Процесс кристаллообразования заканчивался к 72 часам роста штамма. Полученную культуральную жидкость лиофилизировали (сушилка FreeZone -105°C 4,5L, настольная, до -105°C, Labconco), (Каталог Диаэм 2012).

Пример 2

Оценку инсектицидной активности штамма проводили в лабораторных условиях с использованием в качестве тест-объектов личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (колорадского жука) I-II возраста 2-й генерации жука, вышедших из яиц, отложенных молодыми природными жуками 1-й летней генерации (Шагов и др., 1992).

Для испытания брали суспензию лиофилизированной культуральной жидкости штамма в концентрациях 1,0; 2,0; и 5,0%. Культуральную жидкость получали, как в примере 1. Для содержания насекомых использовали пластмассовые чашки Петри диаметром 90 мм, имеющие небольшие уступы на нижнем крае крышки, что обеспечивает вентиляцию внутреннего объема чашки. На дно чашки клали бумажный фильтр, на фильтр - лист или фрагменты листьев картофеля в один слой, закрывающий дно. Кормом для жуков и личинок служили листья, срезаемые с кустов картофеля сорта Чародей, благоприятного для питания и развития колорадского жука, которые выращивались на опытном поле ВИЗР, а также в теплице - в целях обеспечения экспериментального биоматериала кормом в осенний период. Листья картофеля обрабатывали водной суспензией соответственно в концентрациях 1,0%, 2,0% и 5,0% путем окунания листа в сосуд с препаратом на 2 сек. В контрольных вариантах листья окунали в чистую воду. Далее в подготовленные таким образом чашки с листьями подсаживали по 15 личинок в 4 повторностях, в целом по 60 личинок в каждом опытном и контрольном вариантах. Экспериментальный материал содержали при комнатной температуре (в среднем 23,5°C) в месте, защищенном от прямых солнечных лучей. Первое добавление корма проводили через 2-3 дня после подсадки личинок, добиваясь практически полного поедания ими первых листьев, обработанных изучаемыми препаратами. При первом добавлении корма в чашки клали листья, обработанные тем же препаратом, но после окунания сохраненные в холодильнике просохшими; при последующих сменах корма клали необработанные листья. Учеты количества выживших личинок в каждой чашке проводили на 3-й, 5-й и 10-й день после начала опыта. Во всех вариантах и повторностях, где оставались живые личинки или предкуколки, опыт вели до его полного окончания - до окрыления имаго или до полной гибели биоматериала на тех или иных стадиях. Повторность опыта 4-кратная. Данные, полученные в работе, статистически обрабатывали, используя стандартные методы [Доспехов, 1985]. Результаты лабораторного эксперимента приведены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние лиофилизированной культуральной жидкости штамма B. thuringiensis 16Т100/18 на выживаемость колорадского жука в лабораторных условиях Концентрация суспензии Исходная выборка L1, экз. % выживших L2-L3 (5-й день) % выживших L4 (10-й день) % окрылившихся имаго 1,0% 15 73,3 53,3 33,3 15 86,7 66,7 26,7 15 66,7 0 0 15 66,7 46,7 13,3 Всего: 60 73,3±4,1 b 41,7±12,5 b 18,3±6,4 b 2,0% 15 0 0 0 15 40,0 26,7 6,7 15 46,7 20,0 6,7 15 26,7 0 0 Всего: 60 28,3±8,9 c 11,7±5,9 c 3,3±1,7 c 5,0% 15 73,3 66,7 60,0 15 46,7 46,7 46,7 15 0 0 0 15 0 0 0 Всего: 60 30,0±15,7 c 28,3±14,6 b 26,7±13,5 b Контроль 15 100 93,3 60,0 15 100 86,7 66,7 15 100 100 80,0 15 93,3 86,7 66,7 Всего: 60 98,3±1,5 a 91,7±2,8 a 68,3±3,6 a a, b, c - различия между вариантами и с контролем (а) значимы при P>0,95…0,99

Анализ полученных результатов показал, что в условиях лабораторного опыта лиофилизированная культуральная жидкость штамма B. thuringiensis 16T100/18 проявляла высокую инсектицидную активность в отношении развивающихся личинок жука. При использовании 1%-ной концентрации выжило 41,7%, а окрылилось 18,3% жуков. При увеличении концентрации суспензии до 2% выживаемость личинок снизилась до 11,7%, а выход имаго достиг только 3,3%, тогда как в контроле выжило более 90% личинок, а выход имаго составил 68,3%. Повышение концентрации суспензии до 5% несколько снизило эффективность обработки. В целом, средние показатели выживаемости личинок и окрыляемости имаго в опыте при всех трех концентрациях препарата были значительно ниже, чем в контроле, особенно при использовании суспензии в оптимальной концентрации 2%.

Пример 3

В примере 2 сохранена методика содержания личинок и имаго жука в лабораторных экспериментах, соответствующая традиционно применяемой в исследованиях абиотических или пищевых адаптаций вредителя и описанная в примере 1.

В опыт помещали личинок младших возрастов (преимущественно второго), при массовом появлении которых на растениях обычно проводят обработки инсектицидами и биопрепаратами в полевых условиях, а также имаго (взрослых жуков). Личинок для использования в опыте выводили из кладок яиц, собранных на полях Северо-Кавказского региона. В вариантах с имаго использовали жуков летнего (молодого) поколения, успевших после своего окрыления пройти нажировочное питание.

В опытных вариантах перед подсаживанием личинок или взрослых жуков в чашки листья картофеля обрабатывали неразведенной и разведенной в 2 раза культуральной жидкостью штамма. Культуральную жидкость получали, как в примере 1. Листья картофеля окунали в сосуд с культуральной жидкостью на 2 сек. В контрольных вариантах листья окунали в чистую воду. Далее в чашки с обработанными листьями подсаживали насекомых: личинок - по 10-20 штук (4 повторности, в целом по 55-80 личинок в каждом опытном или контрольном варианте), взрослых жуков - по 8 штук (4 или 8 повторностей, в целом по 32 или 64 жука в каждом варианте).

Экспериментальный материал содержали при комнатной температуре (в среднем, 22…24°C) в месте, защищенном от прямых солнечных лучей, а в сентябре-октябре - в термостате при температуре 24…25°C. Первое добавление корма проводили через 2-3 дня после подсадки личинок, добиваясь практически полного поедания ими первых листьев, обработанных культуральной жидкостью штамма. В дальнейшем при смене или добавлении корма в чашки клали необработанные листья.

Учеты количества выживших личинок в каждой чашке проводили на 3-й, 5-й, 7-й и 10-й день после начала опыта. Помимо этого во всех вариантах, где оставались живые личинки или предкуколки, опыт продолжали до его полного окончания - до окрыления имаго или до полной гибели биоматериала на тех или иных стадиях. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 Выживаемость личинок и молодых имаго северо-кавказской популяции колорадского жука (северный экотип вредителя) при воздействии культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis 16Т100/18 Вариант опыта Исходное количество подсаженных личинок жука (100%) Выжило личинок (% к исходному количеству) Окрылилось молодых жуков (% к количеству подсаженных личинок) На 3-й день На 5-й день На 7-й день На 10-й день (с указанием фазы развития личинок) ЛИЧИНКИ Контроль (без обработки) 40 (4×10) 100 100 100 100
4-й возраст + предкуколки
35,3±2,7 4-й возраст + предкуколки 92,4±4,2
2,6±1,9 Культуральная жидкость
(разведение ×2) 68 (4×17) 72,6±2,4 52,9±2,2 41,2±5,0     ИМАГО Контроль (без обработки) 48 (6×8) 100 100 100 100   Культуральная жидкость (разведение ×2) 64 (8×8) 42,2±4,8 39,1±5,9 39,1±9,8 37,5±6,0 4-й возраст + предкуколки

Данные таблицы 2 свидетельствуют, что культуральная жидкость штамма Bacillus thuringiensis 16T100/18 была одинаково активна против личинок 1-2 возраста и молодых имаго. Выживаемость личинок через 10 дней после обработки разбавленной вдвое культуральной жидкостью составила 35,3%; имаго - 37,5%, тогда как в контроле выжило более 90% насекомых. Таким образом, инсектицидная активность предлагаемого штамма в отношении личинок колорадского жука в 2 раза превосходит прототип. В отличие от прототипа предлагаемый штамм активен в отношении имаго колорадского жука.

Литература

1. Азизбекян P.P., Кузнецова Н.И., Миненкова И.Б., Смирнова Т.А., Шагов Е.М., Шамшина Т.Н. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis Н-8, предназначенный для борьбы с жесткокрылыми насекомыми. Патент РФ №2204598, 2003.

2. Жукова Р.А., Коммунарская А.Д., Пронина М.И., Терешин И.М., Журавлева Н.П., Шабас М.Н. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов. 1978. Л.: «Медицина». С.135.

3. Кандыбин Н.В. Новый энтомопатогенный препарат "Битоксибациллин". Бактериальные средства и методы борьбы с насекомыми и грызунами. Автореферат, докт. дис. - Ленинград, 1972.

4. Каталог Диаэм 2012: оборудование, пластик, стекло, принадлежности, реактивы, наборы, рус., 1300 стр.

5. Кузнецова Н.И.; Королева Ю.В.; Григорьева Т.М.; Азизбекян P.P.; Дебабов В.Г. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis spp. thuringiensis для производства экзотоксинсодержащих биоинсектицидов. Патент РФ №2061376, 1996.

6. Шагов Е.М., Миненкова И.Б., Константинова Г.Е. 1992. Биотехнология N1:75-77.

7. Каталог Диаэм 2012: оборудование, пластик, стекло, принадлежности, реактивы, наборы, рус., 1300 стр.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве препаратов для борьбы с колорадским жуком. Штамм Bacillus thuringiensis 16T100/18 (ВИЗР) обладает высокой инсектицидной активностью в отношении личинок и имаго колорадского жука. Культуральная жидкость штамма активна против личинок 1-2 возраста и молодых имаго. Штамм депонирован в Государственной Коллекции Микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей (ГНУ ВНИИ защиты растений) под регистрационным номером Б 94-1 ВИЗР. Изобретение позволяет сократить количество имаго колорадского жука. 2 табл.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis Б 94-1 ВИЗР для борьбы с колорадским жуком.