СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКСОКСАНТОФИЛЛА И ОСЦИЛЛАКСАНТИНА ИЗ БИОМАССЫ СПИРУЛИНЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K36/02 C12P23/00 B01D11/02 B01D11/04 C12N1/12 

Предлагаемый способ относится к биотехнологии и может быть использован в медицине, фармацевтической и пищевой промышленности для получения медицинских препаратов, иммуномодуляторных и функциональных продуктов, обогащенных миксоксантофиллом и осциллаксантином.

При создании фармацевтических препаратов и БАВ на основе каротиноидов обычно используют пигменты в кристаллической форме или пигменты с высокой степенью очистки от примесей (Khaw et al., 2021). Широкое применение пигментов в кристаллической форме ограничено из-за сложности их получения и низкого выхода конечного продукта (Бритон, 1986; et al., 2020; Khaw et al., 2021). Получение пигментов с высокой степенью очистки также ограничено из-за многостадийности процесса и использования хроматографических методов, что влечет за собой значительное увеличение цены конечного продукта ( et al., 2020; Malhão et al., 2020).

На сегодняшний день разработано множество технологий получения каротиноидов из различных видов микроводорослей. Одним из наиболее распространенных объектов культивирования в промышленных масштабах во всем мире является спирулина (Arthrospira (Spirulina) platensis). Известно, что в состав спирулины входят уникальные каротиноиды, такие как миксоксантофилл и осциллаксантин, обладающие высокой противораковой активностью (Aakermann et al., 1992; Tsushima et al., 1995; Пат. 10046838, DE, МПК A61Q 19/08, 2000). Однако, несмотря на то, что биомассу A. (S.) platensis производят сотнями тонн в различных странах мира, промышленные технологии извлечения миксоксантофилла и осциллаксантина по-прежнему отсутствуют. Отчасти это связано с тем, что все технологии получения каротиноидов основаны на методе хроматографического разделения, который при масштабировании процесса в значительной мере усложняет технологию.

Известен «Способ получения фукоксантина» (Пат. RU 2054442 С1, РФ, МПК С09В 61/00, 1996). В способе для получения каротиноидного пигмента фукоксантина измельченные бурые водоросли Cistozeira barbata экстрагируют водным раствором спирта, который предварительно насыщают хлоридом калия, затем осаждают примеси ацетоном при соотношении экстракт - ацетон 1:4 - 1:6, обрабатывают экстракт диэтиловым эфиром с последующим промыванием эфирного слоя водой. Недостатком существующей технологии является трудоемкость, многостадийность и крайне низкая эффективность извлечения таких каротиноидов как миксоксантофилл и осциллаксантин из биомассы A. (S.) platensis при использовании известной методики.

Известен «Способ получения фукоксантинола из фукоксантина» (Pat. Int. Appl. No. WO 2007060811 A1, WIPO (PCT), JAPAN, МПК A61K 31/336, 2007), предусматривающий четыре стадии. На первой стадии 0,5 г фукоксантина растворяют в 300 мл метанола, добавляют 2,5 г таурохелата до полного растворения. На второй стадии образовавшийся раствор упаривают досуха.

Далее (третья стадия), остаток растворяют в 500 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, добавляют 10 г липазы, полученной из панкреазы, и образующийся раствор выдерживают при температуре 37°С в течение 2 часов. Образующийся фукоксантинол очищают с помощью колоночной хроматографии. Недостатком существующей технологии является многостадийность и использование методов хроматографии. Кроме того, такой способ не позволяет извлечь миксоксантофилл и осциллаксантин из A, (S.) platensis. Известен «Способ получения миксоксантофилла из биомассы Spirulina platensis» (пат. 4360, MD, МПК С12Р 23/00, B01D 11/00, А61К 36/02, C12N 1/12, 2013). Способ состоит в том что осуществляют повторную экстракцию миксоксантофилла из биомассы 70-96%-ным водным раствором этанола с отделением биомассы центрифугированием и унифицированием полученных экстрактов, к которым добавляют 40%-ный гидроксид калия, в соотношении 3:1 к количеству экстрагированной биомассы, выдерживают 4-6 часов и добавляют гексан, после чего путем декантирования отделяют этиловую фракцию с содержанием миксоксантофилла, которую разбавляют водой до концентрации этилового спирта 45-50%, центрифугируют при 6000 об/мин, а полученные кристаллы промывают раствором 45-50%-ного этанола и высушивают. Недостатком данного способа является экстракция только одного пигмента микосоксантофилла, а также трудоемкость, многостадийность процесса и высокая себестоимость продукта.

Наиболее близким к заявляемому способу является работа (Телегина и др., 2018), в которой сухую биомассу спирулины измельчали и экстрагировали смесью хлороформ : этанол в соотношении 2:1. После добавления к экстракту воды формируется двухфазная система с образованием оранжевого осадка в интерфазе, что говорит о присутствии в нем каротиноидов. Осадок был осажден центрифугированием. Недостатком является то, что для извлечения пигментов из биомассы спирулины используется метод центрифугирования, что в значительной мере удорожает себестоимость каротиноидов. Недостатком является то, что используется только сухая биомасса спирулины.

Задачей изобретения "Способ получения миксоксантофилла и осциллаксантина из биомассы спирулины" является создание простой и эффективной технологии получения каротиноидов из биомассы спирулины.

Техническим результатом заявляемого способа является возможность получения не только миксоксантофилла, но и осциллаксантина, способы получения которых не раскрыты в современных научных и патентных источниках. Изобретение позволяет обеспечить фармацевтическую промышленность минорными каротиноидами спирулины без привлечения сложного технического оборудования и значительных средств.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что в Способе получения миксоксантофилла и осциллаксантина из биомассы спирулины, включающем экстракцию пигментов из биомассы спирулины смесью этанола и хлороформа, выполнены ряд изменений. Для экстракции сухой биомассы спирулины используют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 2:1, а для сырой биомассы спирулины применяют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 1:1. Экстракцию ведут в течение 2-3 суток при температуре 5-7°С. Затем к полученному экстракту добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:3 и полученную смесь удерживают 7 суток при температуре 5-7°С с заменой дистиллированной воды один раз в 1-2 суток. После концентрирования миксоксантофилла и осциллаксантина в виде пены оранжево-красного цвета пигменты извлекают и очищают, промывая хлороформом 3-4 раза.

Общими с прототипом является экстракция пигментов из спирулины органическими растворителями. Отличительным признаком заявляемого способа от прототипа является то, что экстракцию биомассы спирулины ведут смесью 96% этанол: хлороформ, в соотношениях, подобранных как для сухой, так и сырой биомассы спирулины что обеспечивает получение не только миксоксантофилла, но и осциллаксантина без привлечения методов хроматографии. Отличительными признаками также являются режимы и параметры, обеспечивающие простое и дешевое извлечение миксоксантофилла и осциллаксантина.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна», т.к. из патентных источников, доступных авторам на момент подачи заявочных материалов, способы извлечения каротиноидов из A. (S.) platensis без хроматографических методов не были выявлены. Новым в изобретении является то, что два биологически активных каротиноида (миксоксантофилл и осциллаксантин) извлекаются из биомассы спирулины без хроматографии. Значения количественных параметров заявляемого продукта, режимы и способ его получения установлены авторами в оптимальных границах достижения технического результата. В отличие от существующих способов получения каротиноидов из биомассы водорослей предлагаемый способ является простым и дешевым, не требующим специального дорогостоящего оборудования.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», поскольку соответствует указанному назначению.

Изобретение поясняется описанием и иллюстрациями:

Фиг. 1 - каротиноиды на границе раздела фаз хлороформ : вода; Фиг. 2 - каротиноиды на поверхности воды; Фиг. 3 - каротиноиды, высушенные в токе аргона; Фиг. 4 - раствор каротиноидов в спирте.

Пример 1

100 г сухой биомассы A. (S.) platensis заливали смесью 96%-ный этанол : хлороформ (2:1) по объему так, чтобы покрыть смесью всю биомассу спирулины. Раствор выдерживали при температуре 5°С в течение 2 суток. Затем осадок удаляли, а к 200 мл экстракта добавляли 800 мл дистиллированной воды. Смесь удерживали при температуре 5°С в течение 7 суток или более. Периодически один раз в 1-2 дня удаляли воду и добавляли такой же объем свежей дистиллированной воды. После концентрирования миксоксантофилла и осциллаксантина на поверхности раздела фаз вода: хлороформ в виде пены оранжево-красного цвета (Фиг. 1), пигменты извлекали и очищали 3-4 раза промывкой хлороформом. Затем высушивали в потоке инертного газа (Фиг. 3). Выход миксоксантофилла и осциллаксантина составлял 0.085% и 0.088%, соответственно.

Пример 2

37 г сырой биомассы A. (S.) platensis заливали 200 мл смесью 96%-ный этанол : хлороформ (1:1) по объему так, чтобы покрыть смесью всю биомассу спирулины. Раствор выдерживали при температуре 7°С в течение 3 суток. Осадок удаляли, а к экстракту добавляли дистиллированную воду 700 мл для удаления спиртовой фракции. Смесь удерживали при температуре 7°С в течение 7 суток. Периодически раз в 1-2 дня удаляли воду и добавляли такой же объем свежей дистиллированной воды. После концентрирования миксоксантофилла и осциллаксантина на поверхности раздела фаз вода: хлороформ в виде пены оранжево-красного цвета (Фиг. 1, Фиг. 2), которую извлекали из емкости, и очищали пигменты многократной промывкой хлороформом. Затем высушивали в потоке инертного газа (Фиг. 3).

Выход миксоксантофилла и осциллаксантина в пересчете на сухую массу спирулины составлял 0.083% и 0.084%, соответственно. Спиртовые растворы миксоксантофилла и осциллаксантина из A. (S.) platensis характеризуются длительным сроком хранения в темном месте при температуре 5-7°С, что открывает широкие возможности для дальнейшего использования в промышленных масштабах.

Каротиноиды идентифицировали по известным спектральным (UV-Vis) характеристикам (Aakermann et al, 1992, Takaichi et al, 2005).

Список использованной литературы

1. Бритон Г. Биохимия природных пигментов: Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. - 422 с.

2. Способ получения миксоксантофилла из биомассы Spirulina platensis (пат. 4360, MD, МПК С12Р 23/00 (2006.01), B01D 11/00 (2006.01), A61K 36/02 (2006.01), C12N 1/12 (2006.01), 2013).

3. Aakermann Т., Skulberg О.М., Liaaen-Jensen S. A comparison of the carotenoids of strains of Oscillatoria and Spirulina (Cyanobacteria) // Biochemical Systematics and Ecology. - 1992. - Vol. 20, iss. 8. - P. 761-769. doi: 10.1016/0305-1978(92)90035-C.

4. Khaw Y.S., Yusoff F.M., Tan H.T., Mazli N.A.I.N., Nazarudin M.F., Shaharuddin N.A., Omar A.R. The Critical Studies of Fucoxanthin Research Trends from 1928 to June 2021: A Bibliometric Review // Marine Drugs. - 2021. - Vol. 19, iss. 11. - P. 1-25. doi: 10.3390/md19110606.

5. C., Garcia-Oliveira P., Carpena M., Fraga-Corral M., Jimenez-Lopez C., Pereira A.G., Prieto M.A., Simal-Gandara J. Scientific approaches on extraction, purification and stability for the commercialization of fucoxanthin recovered from brown algae // Journals Foods. - 2020. - Vol. 9, iss. 8. - P. 1-20. doi:10.3390/foods9081113.

6. Malhão F., Macedo A.C., Costa C., Rocha E., Ramos A.A. Fucoxanthin holds potential to become a drug adjuvant in breast cancer treatment: evidence from 2D and 3D cell cultures // Molecules. - 2021. - Vol. 26, iss. 14. - P. 1-25. doi: 10.3390/molecules26144288.

7. Takaichi S., Mochimura M., Maoka T. and Katho H.i. Myxol and 4-ketomyxol 2'-fucosides, not rhamnosides, from Anabaena sp. PCC 7120 and Nostoc puncitiforme PCC 73102, and proposal for the biosynthetic pathway of carotenoids, Plant Cell Physiol., 46, 497-504 (2005). doi: 10.1093/pcp/pci049.

8. Tsushima M., Maoka Т., Katsuyama M., Kozuka M., Matsuno Т., Tokuda H., Nishino H., Iwashima A. Inhibitory effect of natural carotenoids on Epstein-Barr virus activation activity of a tumor promoter in Raji cells. A screening study for anti-tumor promoters // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 1995. - Vol. 18, iss. 2. - P. 227-233, doi: 10.1248/bpb. 18.227.

9. Use of myxoxanthophyll and/or echinenone for the prophylactic and/or therapeutic treatment of undesirable physical conditions conditioned or favoured by oxidative processes (пат. 10046838, DE, МПК A61Q 19/08, 2000).

10. Телегина Т.А., Геворгиз P.Г., Нехорошев M.В., Бирюков М.В., Вечтомова Ю.Л., Крицкий М.С. Спектральные характеристики каротиноидов из цианобактерии Arthrospira platensis в условиях адаптивного ответа на обезвоживание // Актуальные вопросы биологической физики и химии. 2018. Т. 3, №4. С. 706-710.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, фармацевтической и пищевой промышленности для получения медицинских препаратов, иммуномодуляторных и функциональных продуктов, обогащенных миксоксантофиллом и осциллаксантином. Представлен способ получения миксоксантофилла и осциллаксантина из биомассы спирулины, включающий экстракцию пигментов из биомассы спирулины смесью этанола и хлороформа, характеризующийся тем, что для экстракции сухой биомассы спирулины используют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 2:1 по объему, а для сырой биомассы спирулины применяют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 1:1 по объему и экстракцию ведут в течение 2-3 суток при температуре 5-7°С, затем к полученному экстракту добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:3 по объему и полученную смесь удерживают 7 суток при температуре 5-7°С с заменой дистиллированной воды один раз в 1-2 суток, а после концентрирования миксоксантофилла и осциллаксантина в виде пены оранжево-красного цвета пигменты извлекают и очищают, промывая хлороформом 3-4 раза. Изобретение обеспечивает возможность получения не только миксоксантофилла, но и осциллаксантина, способы получения которых не раскрыты в современных научных и патентных источниках. Кроме того, изобретение обеспечивает фармацевтическую промышленность минорными каротиноидами спирулины без привлечения сложного технического оборудования и значительных средств. 4 ил., 2 пр.

Способ получения миксоксантофилла и осциллаксантина из биомассы спирулины, включающий экстракцию пигментов из биомассы спирулины смесью этанола и хлороформа, отличающийся тем, что для экстракции сухой биомассы спирулины используют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 2:1 по объему, а для сырой биомассы спирулины применяют смесь 96%-ный этанол : хлороформ в соотношении 1:1 по объему и экстракцию ведут в течение 2-3 суток при температуре 5-7°С, затем к полученному экстракту добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:3 по объему и полученную смесь удерживают 7 суток при температуре 5-7°С с заменой дистиллированной воды один раз в 1-2 суток, а после концентрирования миксоксантофилла и осциллаксантина в виде пены оранжево-красного цвета пигменты извлекают и очищают, промывая хлороформом 3-4 раза.