СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИКОБИЛИПРОТЕИНОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения фикобилипротеинов, а именно натуральных пигментов С-фикоэритрина и С-фикоцианина, экстрагированных из цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpx.

В последнее время возрос интерес к использованию природных источников сырья для получения натуральных красителей, так как многие синтетические красители токсичны. К таким перспективным пищевым красителям можно отнести и фикобилипротеины, содержащиеся в красных микро- и макроводорослях, а также цианобактериях. Эти пигменты абсолютно нетоксичны, имеют белковую природу, что открывает широкие перспективы для использования в пищевой, косметической и медицинской промышленности.

Фикобилипротеины обладают мощными антиоксидантными свойствами благодаря своей способности удалять свободные радикалы. Это позволяет им предотвращать возникновение потенциально опасных заболеваний, таких как рак, болезни сердца, он может усиливать активность традиционных противораковых лекарств, уменьшая их побочные эффекты и снижая гепатотоксичность [Tan et al., 2023; Carmona et al., 2022].

На данный момент фикобилипротеины получают из цианобактерий, красных микроводорослей или макрофитов. У разных видов водорослей содержание фикоэритрина может колебаться от 0,14 мг/г до 200 мг/г [Freitas et al., 2022а; Freitas et al., 2022b]. Фикоцианин производят, преимущественно, из спирулины десятками тонн. Менее доступен фикоэритрин из макроводорослей, его производство считается недостаточным для удовлетворения спроса мирового рынка. Биомасса макроводоролей Palmaria palmata имеет самое высокое содержание фикоэритрина (12,36 мг/г сухой массы) [Freitas et al., 2022а].

Красные микроводоросли содержат в пять раз больше фикоэритрина, чем макроводоросли. Однако красные микроводоросли, такие как Porphyridium, выделяют в окружающую среду большое количество полисахаридов, что делает процедуры сбора биомассы и очистки фикоэритрина затратными и трудоемкими [Mishra et al., 2011]. Высокая стоимость производства фикоэритрина побуждает исследователей совершенствовать производственный процесс или искать новые источники. Цианобактерии являются перспективным источником фикобилипротеинов, поскольку они представляют собой быстрорастущие микроорганизмы с высоким содержанием фикобилипротеинов, особенно С-фикоэритрина и С-фикоцианина. В отличие от большинства низших фототрофов, цианобактерии могут расти в открытых водоемах при неблагоприятных условиях.

Известен Способ для получения фикоэритрина с высокой оптической плотностью (Патент 2315094, RU, МПК C12N 1/12, С12Р 21/04, С12М 1/36 (2006.01), 2004). В способе фикоэритрин получают экстрагированием из водорослей, выбранных из группы Galaxaura oblongata, Halymenia ceulanica, Helminthocladia australis. Водоросли выращивают до стадии образования колоний, затем собирают и фильтруют. Профильтрованные водоросли сушат, измельчают в порошок, добавляют в раствор с уровнем pH в пределах 5-10. После центрифугирования получают раствор пигмента, а затем, путем добавления 20-30% насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄ получают неочищенный фикоэритрин. Для получения неочищенного фикоэритрина с высокой оптической плотностью добавляют 60-65 % насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄. Осажденный неочищенный фикоэритрин дополнительно очищают методом гель-хроматографии или ультрафильтрации. Недостатки способа заключаются в его трудоёмкости, длительности и многостадийности, поэтому данный способ трудно использовать при получении фикоэритрина в промышленных масштабах.

Известен Способ получения фикоэритрина из красной микроводоросли (Патент 2548111, RU, МПК C12N 1/12, 2009), в котором красную микроводоросль Porphyridium purpurewn культивируют в условиях естественного или искусственного освещения, барботирования газовоздушной смесью с 3 % СО₂, с применением питательной среды Тренкеншу и квазинепрерывного режима культивирования. Отбор биомассы осуществляют при ежедневном обмене. Для разрушения биомембран 6-9 раз проводят процедуру «замораживание - оттаивание». Затем экстрагируют водным буферным раствором с pH 7-7,5 в соотношении 1: 3 в течение 24 часов при 3-5°C в отсутствии света. К полученному водному раствору пигмента добавляют этиловый спирт до конечной концентрации 20 % для последующего хранения. Основным недостатком известного способа является многостадийность и длительность. Кроме того, экстрагирование фикоэритрина из Porphyridium purpurewn связано со сложностями сбора биомассы из-за большого количества экзометаболитов, которые выделяется в процессе выращивания водорослей.

Задачей заявленного изобретения является разработка технологии получения фикобилипротеинов - фикоэритрина и фикоцианина - из цианобактерии Leptolyngbya cf. Qctocarpi.

Техническим результатом от использования изобретения является извлечение фикобилипротеинов - фикоэририна и фикоцианаина - из биомассы цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi с помощью одностадийного способа, перспективного для дальнейшего использования в промышленных масштабах. Указанный технический результат достигается тем, что в Способе получения фикобилипротеинов, включающий культивирование водоросли и экстракцию фикобилипротеинов дистиллированной водой, в качестве сырья используют цианобактерию Leptolyngbya cf ectocarpi. Культуру выращивают в течение 7 суток на стандартной питательной среде BG11, приготовленной на стерильной морской воде. Накопительное культивирование осуществляют в плоскопараллельном фотобиореакторе на модифицированной питательной среде BG11 (г/л): NaNO₃ - 3,37; NaН₂РО₄ × 2Н₂О - 0,065; лимонная кислота 0,006; Na₂EDTA - 0,001; FeC₆H₅O₇ - 0,006; 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): Н₃ВО₃ - 2,86; CuSO₄ × 5Н₂О - 0,08, ZnSO₄ × 7Н₂ - 0,22, СоСl₂ × 6Н₂О - 0,05, МnСl₂ × 4Н₂О - 1,81, NaMoO₄ × 2Н₂О - 0,4, приготовленной на стерильной морской воде, в течение 10 суток до плотности 16 г сырой биомассы на литр среды при круглосуточном освещении 13 клк и температуре 34°C с последующей лиофилизацией полученной биомассы. Для получения порошка фикобилипротеинов проводят их экстракцию из лиофилизированной биомассы. Для этого к биомассе добавляют дистиллированную воду в соотношении 1: 1 по массе и экстрагируют в течение 30 мин при температуре 38°С, после чего осадок удаляют центрифугированием при 8000 об/мин, а полученный водный экстракт фикобилипротеинов подвергают лиофильной сушке. Кроме того, культивирование ведут в плоскопараллельных фотобиореакторах вертикального типа с рабочим слоем 5 см и объемом 10 литров. В фотобиореактор вносят дополнительный субстрат- носитель клеток Leptolyngbya cf. ectocarpi в виде диоксида кремния коллоидного в концентрации 0,1 г/л.

Указанные выше параметры подобраны экспериментальным путем и являются оптимальными.

Общим с прототипом является культивирование водоросли в контролируемых условиях и экстракция фикобилипротеинов водой. Отличие заключается в применении модифицированной питательной среды при культивировании, обеспечивающей интенсивное наращивание цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi. Отличие от прототипа заключается также в применяемых в заявляемом способе режимах культивирования и экстрагирования.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, обеспечивающие получение заявляемого технического результата, включают:

- применение в качестве сырья цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi и разработку способа извлечения фикобилипротеинов, что позволяет ввести новый перспективный источник сырья для промышленного использования;

- ультивирование на модифицированной питательной среде в контролируемых условиях, что позволяет получить высокий выход биомассы с высокой концентрацией фикобилипротеинов в биомассе.

- цианобактерия Leptolyngbya cf. ectocarpi является представителем бентоса, поэтому культуры клетки в отсутствие перемешивания достаточно быстро оседают, что позволяет удешевить этап отделения биомассы от культуральной среды.

- экспериментально подобранные параметры экстракции позволяют обеспечить выход фикобилипротеинов из биомассы Leptolyngbya cf. ectocarpi на уровне 95 %.

Изобретение поясняется описанием.

В качестве перспективного источника получения фикобилипротеинов использовали цианобактерию Leptolyngbya cf. ectocarpi, выделенную из бухты Карантинная Черного моря, способную прикрепляться к любым поверхностям в морской среде и обнаруживаемую в течение всего года. Яркий малиноворозовый цвет трихомов предполагает высокое содержание в клетках С- фикоэритрина. Leptolyngbya cf. ectocarpi является бентосным видом, что упрощает сбор биомассы, так как плотность клеток больше плотности воды, и, при отсутствии перемешивания, культура полностью оседает на дно. Цианобактерия Leptolyngbya cf. ectocarpi ведет прикрепленный образ жизни, поскольку является представителем бентоса. Для ее интенсивного культивирования обязательным условием является введение в культуральную среду (рабочий объем) дополнительного субстрата-носителя для пассивной иммобилизации клеток Leptolyngbya cf. ectocarpi. Также по нашим данным содержание белка у цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi достигает 60 % сухой массы. Основную долю занимает С-фикоэритрин, концентрация которого составляет 9 % сух. массы, и С-фикоцианин, концентрация которого составляет 2,5 % сух. массы. Именно поэтому разработка простого способа получения фикобилипротеинов из Leptolyngbya cf. ectocarpi позволяет получить заявленный технический результат.

Пример 1

Для получения инокулята культуру Leptolyngbya cf. ectocarpi, выделенную из бухты Карантинная Черного моря, выращивали в течение 7 суток в колбах объемом 1 при освещении 6 клк на стандартной питательной среде BG11, приготовленной на стерильной морской воде, с составом (г/л): NaNO₃ - 1,5; К₂НРО₄ × 3Н₂О - 0,04; Na₂CO₃ - 0,02; MgSO₄ × 7H₂O - 0,075; СаСl₂×2Н₂О - 0,05; лимонная кислота - 0,006; Na₂EDTA - 0,001; FeC₆H₅O₇ - 0,006; 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): Н₃ВО₃ - 2,86; CuSO₄ × 5Н₂О - 0,08; ZnSO₄ × 7Н₂О - 0,22; СоСl₂ × 6Н₂О - 0,05; МnСl₂ × 4Н₂О - 1,81; NaMoO₄ × 2Н₂О - 0,4.

Полученную культуру переносили в модифицированную питательную среду BG11 (г/л): NaNO₃ - 3,37; NаН₂РО₄ × 2Н₂О - 0,065; лимонная кислота 0,006; Na₂EDTA - 0,001; FеС₆Н5О₇ - 0,006; 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): Н₃ВО₃ - 2,86; CuSO₄ × 5Н₂O - 0,08, ZnSO₄ × 7Н₂О 0,22, СоСl₂ × 6Н₂О - 0,05, МnCl₂ × 4Н₂О - 1,81, NaMoO₄ × 2Н₂О - 0,4.

Модификация заключалась в исключении навесок MgSO₄x7H₂O; СаСl₂×2Н₂О, так как в морской воде содержатся большие концентрации ионов магния и кальция, а также в корректировке концентраций нитрата натрия и фосфатов в питательной среде по расчётам потребностей по азоту и фосфору. В качестве дополнительного субстрата-носителя клеток Leptolyngbya cf. ectocarpi использовали диоксид кремния коллоидный (полисорб) в концентрации 0,1 г/л, который вносили в рабочий объем фотобиореактора.

Далее накопительное культивирование вели в четырёх плоскопараллельных фотобиореакторах вертикального типа с толщиной рабочего слоя 5 см и объемом 10 литров при круглосуточном освещении 13 клк и температуре 34°С в течение 10 суток до плотности 16 г сырой биомассы на литр среды. На третьи сутки стационарной фазы роста получали 160 г сырой биомассы с одного фотобиореактора с высокой концентрацией фикобилипротинов: С-фикоэритрина (78 мг/г сухой массы) и С-фикоцианина (24 мг/г сухой массы).

Полученную биомассу лиофилизировали. Затем 55 г лиофилизированной биомассы Leptolyngbya cf. ectocarpi переносили в стакан и заливали дистиллированной водой с температурой 38°C в соотношении 1: 1 биомасса и дистиллированная вода, соответственно. Экстракция фикобилипротеинов дистиллированной водой проходила на водяной бане в течение 30 минут при температуре 38°C. Осадок удаляли центрифугированием при 8000 об/мин. Полученный водный экстракт фикобилипротеинов подвергали лиофильной сушке, в результате которой получали порошкообразный продукт массой 20 г с концентрацией С-фикоэритрина 200 мг/г сухого порошка и С-фикоцианина 50 мг/г сухого порошка, что представляет интерес для дальнейшего использования в промышленных масштабах.

Источники литературы, принятые во внимание:

1. Tan Н.Т., Yusoff F.M., Khaw Y.S., Noor Mazli N.A.I., Nazarudin M.F., Shaharuddin N.A., Katayama T., Ahmad S.A. A review on a hidden gem: phycoerythrin from blue-green algae // Marine Drugs. 2023. Vol. 21, iss. 1. P. 1-24. https://doi. org/10.3390/md21010028

2. Carmona R., Murillo M.C., Lafarga T., Bermejo R. Assessment of the potential of microalgae-derived phycoerythrin as a natural colorant in beverages // Journal of Applied Phycology. 2022. Vol. 34. P. 3025-3034.

3. Freitas M.V., Pacheco D., Cotas J., Mouga T., Afonso C., Pereira L. Red Seaweed Pigments from a Biotechnological Perspective // Phycology. 2022a, iss. 2. P. 1-29. doi:10.3390/phycology2010001

4. Freitas M.V., Inacio L.G., Martins M., Afonso C., Pereira L., Mouga T. Primary composition and pigments of 11 red seaweed species from the center of portugal // Journal of Marine Science and Engineering. 2022b. Vol. 10. P. 1-23. doi:10.3390/jmsel0091168

5. Mishra S.K., Shrivastav A., Mishra S. Preparation of Highly Purified C- Phycoerythrin from Marine Cyanobacterium Pseudan-abaena sp. // Protein Expression and Purification. 2011. Vol. 80, iss. 2. P. 234-238.doi: 10.1016/j.pep.2011.06.016

6. Singh P., Kumar D. Biomass and lipid productivities of cyanobacteria- Leptolyngbya foveolarum HNBGU001 // BioEnergy Research. 2021. Vol. 14, iss. 1. P. 278-291.

7. Prabha S., Vijay A.K., Devarajan A., George B. Concurrent purifcation of phycobiliproteins from Leptolyngbya sp. and their selective enhancement in response to different wavelengths of LED light // Bioresource Technology Reports. 2023. Vol. 21. P. 1-13. https://doi.Org/10.1016/j.biteb.2022.101299.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения фикобилипротеинов, а именно натуральных пигментов С-фикоэритрина и С-фикоцианина, экстрагированных из цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi. Способ получения фикобилипротеинов из цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi предусматривает получение биомассы с высоким содержанием фикоэритрина и фикоцианина путем культивирования цианобактерии на модифицированной питательной среде BG11 (г/л): NaNO₃ - 3,37; NaH₂PO₄ × 2Н₂О - 0,065; лимонная кислота - 0,006; Na₂EDTA - 0,001; FеС₆Н₅О₇ - 0,006; 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): Н₃ВО₃ - 2,86; CuSO₄ × 5Н₂О - 0,08, ZnSO₄ × 7Н₂О - 0,22, СоСl₂ × 6Н₂О - 0,05, МnСl₂ × 4Н₂О - 1,81, NaMoO₄ × 2Н₂О - 0,4, приготовленной на стерильной морской воде, в течение 10 суток в плоскопараллельных фотобиореакторах с рабочим слоем 5 см и объемом 10 л до плотности 16 г сырой биомассы на 1 литр среды при круглосуточном освещении 13 клк и температуре 34°С с последующей лиофилизацией биомассы цианобактерии и экстракцией фикобилипротеинов из лиофилизированной биомассы дистиллированной водой при температуре 38°C (1:1 лиофилизированная биомасса цианобактерии и дистиллированная вода) и лиофилизацией экстракта фикобилипротеинов. Изобретение позволяет извлечь фикобилипротеины - фикоэритрин и фикоцианин - из биомассы цианобактерии Leptolyngbya cf. ectocarpi с помощью одностадийного способа, перспективного для дальнейшего использования в промышленных масштабах. 2 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ получения фикобилипротеинов, включающий культивирование микроводоросли и экстракцию фикобилипротеинов дистиллированной водой, отличающийся тем, что в качестве сырья используют цианобактерию Leptolyngbya cf. ectocarpi, которую выращивают в течение 7 суток на стандартной питательной среде BG11, приготовленной на стерильной морской воде, после чего культуру культивируют в фотобиореакторе в накопительном режиме на модифицированной питательной среде BG11 (г/л): NaNO₃ - 3,37; NaH₂PO₄ × 2H₂О - 0,065; лимонная кислота - 0,006; Na₂EDTA - 0,001; FeС₆Н₅О₇ - 0,006; 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (г/л): Н₃ВО₃ - 2,86; CuSO₄ × 5H₂О - 0,08, ZnSO₄ × 7Н₂О - 0,22, СоСl₂ × 6H₂O - 0,05, МnСl₂ × 4Н₂О - 1,81, NaMoO₄ × 2H₂O - 0,4, приготовленной на стерильной морской воде, в течение 10 суток до плотности 16 г сырой биомассы на 1 литр среды при круглосуточном освещении 13 клк и температуре 34°C с последующей лиофилизацией полученной биомассы, и для получения порошка фикобилипротеинов лиофилизированную биомассу экстрагируют в соотношении 1:1 биомасса цианобактерии:дистиллированная вода в течение 30 мин при температуре 38°C, после чего осадок удаляют центрифугированием при 8000 об/мин, а полученный водный экстракт фикобилипротеинов подвергают лиофильной сушке.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование ведут в плоскопараллельных фотобиореакторах вертикального типа с рабочим слоем 5 см и объемом 10 литров.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в фотобиореактор вносят дополнительный субстрат-носитель для пассивной иммобилизации клеток Leptolyngbya cf. ectocarpi в виде диоксида кремния коллоидного в концентрации 0,1 г/л.