СИСТЕМА И СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ НЕКЛАССИФИЦИРОВАННОГО ИЗОБРАЖЕНИЯ ТКАНИ НА ПРЕДМЕТНОМ СТЕКЛЕ, КЛАССИФИКАТОР ТКАНИ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ И СПОСОБ ЕГО ОБУЧЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61B5/00 G06V10/40 G06V30/18 G06T7/00 G01N33/483 C12M1/34 C12N5/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает преимущество и приоритет по предварительной заявке США №62/694,829, поданной 6 июля 2018 г., объект изобретения которой включен в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Описанные варианты реализации относятся к количественному подходу для осуществления количественного гистоморфологического анализа цифровых изображений клеток в образце ткани для определения жизнеспособных тканей-кандидатов для трансплантации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Изобретение может быть понятным в отношении изготовления аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, хотя настоящее раскрытие и формула изобретения не ограничены таким вариантом реализации изобретения.

[0004] Было показано, что аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса, полезен для лечения Т-клеточного иммунодефицита (первичного иммунодефицита), вызванного врожденной атимией, например, для лечения полного синдрома Ди Георга (cDGA), связанного с делецией 22q11.2, и синдрома CHARGE (колобома, порок сердца, атрезия хоан, задержка роста или развития, генитальная гипоплазия и аномалии уха или глухота), связанного с мутациями в гене chd7 (геликазный хромодомен ДНК-связывающего белка 7) и у бестимусных пациентов с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1). Врожденная атимия является редким смертельным заболеванием, и в настоящее время не существует вариантов ее медикаментозного лечения с использованием разрешенных к применению лекарственных препаратов.

[0005] Экспериментальная трансплантация аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, в котором сохранены эпителиальные клетки тимуса (ЭКТ), успешно применялась для лечения педиатрических пациентов с врожденной атимией (Markert ML, Devlin ВН, McCarthy ЕА, 2010, «Thymus transplantation», Clin Immunol., 135(2): 236-46; Markert ML и др., 2004, «Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome», Blood 104(8):2574-2581; Markert ML и др., 1999, «Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome», N Engl J Med 341(16):1180-1189 27).

[0006] Аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса, представляет собой тканеинженерный продукт, который изготавливают, культивируют и хранят до 21 дня для получения срезов ткани тимуса, частично лишенных Т-клеток, и который дифференцируют от собственного тимуса с помощью процесса кондиционирования. Режим кондиционирования частично обедняет культивированные срезы ткани тимуса тимоцитами донора. На основании полученных in vitro данных (иммуногистохимия), период культивирования от 12 до 21 дня сохраняет эпителиальную сеть согласно оценке с использованием антител к цитокератину. Культивирование предпочтительно проводят при температуре 37°С в инкубаторе с 5% CO₂.

[0007] Процесс культивирования существенно модифицирует биологические характеристики донорской ткани тимуса и содержащихся в ней клеток следующим образом, чтобы оптимизировать эффективные терапевтические свойства срезов аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Процесс культивирования обеспечивает получение определенного состава культивированных клеток/ткани, обладающей необходимыми биологическими характеристиками, посредством способа, подходящего для хирургической имплантации субъекту, чтобы обеспечить восстановление иммунной системы субъекта. Процесс культивирования приводит к потере тимоцитов и относительному обогащению эпителиальных клеток тимуса и других стромальных клеток в срезах донорской ткани тимуса. Дополнительно процесс культивирования приводит к обеднению тимоцитами и поддержанию ЭКТ, чтобы обеспечить восстановление иммунной системы реципиента, и обеспечивает развитие толерантности у реципиента к HLA-антигенам в тимусе донора.

В целом, процесс производства предназначен для обеднения донорской ткани тимуса тимоцитами и для сохранения функционального строения стромы тимуса (эпителиальных клеток тимуса и фибробластов).

[0008] Хирургическое введение аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса (например, «RVT-802»), бестимусным пациентам приводит к каскаду событий, приводящих к развитию функциональной иммунной системы. После хирургического введения аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, реципиенту, ЭКТ донора и дендритные клетки (ДК) реципиента обучают Т-клетки. ЭКТ донора в сочетании с ДК реципиента обеспечивают толерантность к имплантированной донорской ткани тимуса, которую имплантируют в виде культивированных срезов ткани тимуса. Это такая же индукция толерантности, что и в нормальном тимусе. ЭКТ реципиента в сочетании с ДК реципиента обеспечивают аутотолерантность.

[0009] Тимопоэз был подтвержден биопсиями аллотрансплантата и присутствием наивных Т-клеток реципиента на периферии (Markert ML, 2010; Markert ML и др., 2008, «Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation», J Immunol 180(9):6354-6364; Markert ML и др., 2007, «Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants», Blood 109(10):4539-454728), которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0010] Исследования у детей, получавших лечение с помощью исследуемого аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, демонстрируют толерантность к главному комплексу гистосовместимости (major histocompatibility complex, «МНС») донора по реакциям смешанной культуры лимфоцитов (Chinn IK, Devlin ВН, Li YJ и Markert ML, 2008, «Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly», Clin Immunol 126(3):277-281). Кроме того, младенцы с врожденной атимией после трансплантации аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, могут бороться с такими инфекциями, как вирус Эпштейна-Барра (Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiences, eds Sullivan KE и Stiehm ER (Academic Press), 1-e издание, стр. 1059-1067.

[0011] Исторически критерии для выпуска аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, включали гистопатологическую оценку гематоксилина-эозина и иммуноокрашенных срезов ткани в середине процесса изготовления, которая позже была уточнена до 5-9-го дней периода культивирования. Эта гистопатологическая оценка служила анализом активности, и ее осуществляли как количественный анализ патологом, сертифицированным министерством здравоохранения. Образцы для оценки подготавливали либо посредством заморозки, либо фиксации формалином до выполнения среза ткани и последующего прикрепления к предметному стеклу. Образцы, подготовленные таким образом, являются устойчивыми на протяжении длительного времени, что позволяет осуществлять повторный анализ.

[0012] Архивные образцы, доступные из более 20 лет истории развития, могут быть связаны с положительными клиническими результатами и, таким образом, обеспечивать весомый набор данных для развития количественного гистологического анализа для оценки качества продукта.

[0012а] Из патента US 20170372117 А1 (опубл. 21.04.2020, класс МПК G06K 9/00) известна компьютерная система для классификации клеток на изображении образца ткани, окрашенного в иммуногистохимическом (IHC) анализе на присутствие биомаркера PD-L1. Система содержит один или несколько процессоров и по меньшей мере одно устройство для хранения данных, содержащее некратковременные машиночитаемые инструкции для выполнения одним или несколькими процессорами вычисления признаков ядер, при этом признаки ядер выделяют из признаков ядер на изображении образца ткани; вычисления отличительных признаков интересующих ядер на изображении образца ткани; и классификации клеток на изображении образца ткани на основании признаков ядер и отличительных признаков ядер. При этом клетки классифицируют как по меньшей мере одно из следующего: положительные иммунные клетки, положительные опухолевые клетки, отрицательные иммунные клетки, отрицательные опухолевые клетки или другие клетки.

[0013] Новый цифровой гистологический анализ был разработан с использованием отсканированных изображений предметных стекол с использованием гематоксилин-эозина из предыдущих серий и из экспериментальных лотов аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Эти изображения были проанализированы для использования в количественном анализе высвобождения, как описано ниже.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0014] Варианты реализации, полностью описанные в настоящем документе, описывают способ количественной оценки общих характеристик ядра ткани, представленной в изображении предметного стекла.

[0015] Одно применение раскрытых вариантов реализации заключается в разработке, путем обучения классификатора ткани, анализа, выполненного с возможностью определения активности или качества ткани до трансплантации в тела пациентов. Например, нижеописанные способы могут быть применены для определения активности срезов аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для пациентов, страдающих полным синдромом Ди Георга. Описанные варианты реализации могут быть использованы как анализ для определения характеристик ткани срезов аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, который оценивает активность ткани тимуса на основании гистологического анализа изображения предметного стекла и ассоциирует удовлетворительные ткани с удовлетворительной классификацией и неудовлетворительные ткани с неудовлетворительной классификацией с точки зрения активности. Как показано на фиг. 1 ниже, в качестве ввода классификатор получает неклассифицированное изображение предметного стекла и на основании анализа неклассифицированного изображения предметного стекла определяет, является ли ткань в неклассифицированном изображении предметного стекла тканью-кандидатом для трансплантации.

[0016] Как будет более подробно описано ниже, в описанных вариантах реализации описана стадия обучения, включающая обучение классификатора на основании библиотеки изображений предметного стекла, и стадия классификации, включающая применение обученного классификатора к неклассифицированному изображению предметного стекла для определения активности ткани, представленной в неклассифицированном изображении предметного стекла. Стадия обучения обучает классификатор посредством количественной оценки характеристик ядра, связанных с составом ткани и жизнеспособностью клетки. Стадия обучения включает анализ удовлетворительных и неудовлетворительных изображений предметного стекла для обучения классификатора распознавать соответствующие характеристики ядра в удовлетворительных и неудовлетворительных изображениях предметного стекла. Полученный в результате классификатор осуществляет анализ, который распознает удовлетворительные и неудовлетворительные характеристики состава и жизнеспособности на основании архивных данных, который обеспечивает успешное восстановление иммунитета после имплантации ткани.

[0017] В варианте реализации стадия обучения включает две части. Первая часть включает подтверждение обучающего набора данных, который используют для генерации критериев пригодности для подходящих значений метаданных, фоновых значений и энтропии ткани, и может определять допустимые диапазоны или значения, которые считаются допустимыми для количественного анализа. Обучающий набор данных содержит изображения предметного стекла, о которых известно, что они имеют удовлетворительную и неудовлетворительную классификацию для трансплантации. Это могут быть изображения предметного стекла, которые были проанализированы, например, патологом или другим медицинским специалистом. Вторая часть включает применение допустимых диапазонов или значений, сгенерированных в первой части, к изображениям в пределах контрольной библиотеки, в результате чего обеспечивается кластеризация изображений на положительные и отрицательные контрольные группы. Как будет описано ниже в описании и Примерах, каждая контрольная группа содержит изображения предметного стекла, сгруппированные на основании наличия подобных отличительных признаков. Положительные контрольные группы содержат изображения предметного стекла с подобными отличительными признаками, определенными как удовлетворяющие критериям для трансплантации; отрицательные контрольные группы содержат изображения предметного стекла с подобными отличительными признаками, определенными как не удовлетворяющие критериям для трансплантации.

[0018] В варианте реализации стадия классификации затем анализирует новые изображения предметного стекла на основании положительных и отрицательных контрольных групп и кластеризует новые изображения предметного стекла на основании соответствующих отличительных признаков. Стадия классификации затем определяет активность новых изображений предметного стекла на основании кластеризации новых изображений предметного стекла с положительными или отрицательными контрольными группами.

[0019] В варианте реализации отличительные признаки основаны на четырех определениях культивированных клеток тимуса. К ним относятся «площадь», «округлость», «интегральная плотность» и «периметр». Как описано ниже, «площадь» определяет площадь ядра, которая больше для эпителиальных клеток тимуса, чем для тимоцитов. Клетки, находящиеся в процессе апоптоза, также с большей вероятностью имеют меньший размер. «Округлость» определяет, насколько круглыми являются клетки. Округлость измеряют по шкале от 0 до 1, где 1 - идеальный круг. Тимоциты имеют большую округлость по сравнению с эпителиальными клетками тимуса. Нежизнеспособные клетки имеют меньшую округлость по сравнению с жизнеспособными клетками. Другими словами, округлость может ожидаемо снижаться с течением времени культивирования по мере того, как уменьшается количество тимоцитов, и может ожидаться наблюдение нежизнеспособных клеток в срезах ткани. Деградированные образцы также ожидаемо имеют меньшую округлость в связи с большим количеством нежизнеспособных клеток, таким образом смещающих распределение к меньшей округлости. «Интегральная плотность» отражает темноту окрашивания ядра. Интегральная плотность является высокой для тимоцитов, которые характеризуются однородным темным окрашиванием. Эпителиальные клетки тимуса имеют темные края и, главным образом, прозрачную нуклеоплазму с выделяющимся темным ядрышком. В заключение, «периметр» представляет очертание обнаруженных ядер. Периметр связан с жизнеспособностью клетки; при деградации клеток очертание ядра становится неравномерным и его периметр увеличивается. Периметр также будет увеличиваться при увеличении пропорции ЭКТ к общему количеству клеток по мере развития культуры. Изменения периметра в культуре ожидаемы со временем, а также по мере деградации ткани.

[0020] Описанные варианты реализации являются усовершенствованием относительно известных подходов, которые полагаются исключительно на качественный анализ человеком посредством иммуногистохимического (IHC) исследования и гистопатологического исследования при помощи гематоксилина-эозина (Н&Е) изображений предметного стекла для определения активности. Эти современные подходы страдают от ряда ограничений, которые снижают эффективность настоящих качественных анализов, включая невозможность превращения этих качественных анализов в полуколичественные или количественные, и то, что при человеческом анализе патолог не имеет доступа ко всей ткани. Вместо этого, патолог смотрит только на часть ткани (индивидуальное поле зрения) вместо всего среза ткани.

[0021] Кроме того, описанные варианты реализации являются особенно более эффективными, чем известные подходы, для анализа сложных тканей, таких как ткань тимуса. В сложных тканях ориентация образца ткани может значительно влиять на изменения результата. Например, два отдельных среза с сильно отличающимися морфологиями (например, кортикомедуллярное соотношение) могут считаться «хорошими» образцами (т.е. иметь удовлетворительную классификацию) с допустимой активностью. Описанные варианты реализации не имеют этого ограничения и, следовательно, эффективны в классификации всех тканей.

[0022] Описанные варианты реализации полагаются на количественный анализ путем эффективного использования библиотеки изображений предметного стекла с известной активностью и эффективностью. Изображения предметного стекла в библиотеке включают изображения ткани, о которых известно их удовлетворение или неудовлетворение критериям активности для конкретной ткани, путем ассоциации таких тканей с хорошими или плохими клиническими результатами (например, выживание или не выживание). Удовлетворительные изображения предметного стекла могут быть ассоциированы с удовлетворительной классификацией, а неудовлетворительные изображения предметного стекла могут быть ассоциированы с неудовлетворительной классификацией.

[0023] Описанные варианты реализации могут быть реализованы на одном или более процессорах. Один или более процессоров могут быть совмещены или распределены по сети, такой как локальная вычислительная сеть, глобальная вычислительная сеть или интернет (например, облако). Один или более таких процессоров могут представлять собой графический процессор (ГП). В варианте реализации, графический процессор может являться процессором, который представляет собой специализированную электронную схему, выполненную с возможностью обработки приложений, требующих значительных математических расчетов. Графический процессор может иметь параллельную структуру, которая эффективна для параллельной обработки больших блоков данных, например, данных, требующих значительных математических расчетов, свойственных применениям, связанным с компьютерной графикой, изображениями, видео и т.д. Указанный один или более процессоров могут быть соединены с запоминающим устройством, содержащим один или более уровней кэш-памяти, и который может иметь логику управления (например, компьютерное программное обеспечение) и/или данные, хранящиеся на нем.

[0024] Первый аспект настоящего изобретения обеспечивает способ обучения классификатора ткани для осуществления количественной гистопатологической оценки, включающий:

преобразование изображения предметного стекла в бинарное изображение предметного стекла, при этом изображение предметного стекла выбрано из библиотеки контрольных изображений, при этом каждое изображение предметного стекла в библиотеке контрольных изображений ассоциировано с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией;

обнаружение одного или более ядер в пределах бинарного изображения предметного стекла;

извлечение признака из обнаруженного ядра для каждого обнаруженного ядра, при этом признак представляет собой свойство обнаруженного ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит по меньшей мере одно из площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра или округлости обнаруженного ядра;

для каждого обнаруженного ядра, генерацию отличительного признака, ассоциируемого с бинарным изображением предметного стекла, на основании признака, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

включение бинарного изображения предметного стекла в кластер, при этом кластер содержит множество изображений, при этом каждое из первого множества изображений ассоциировано с соответствующим отличительным признаком, и при этом включение основано на сравнении отличительного признака с соответствующим отличительным признаком;

применение предельного верхнего значения к кластеру для образования множества групп, при этом предельное верхнее значение минимизирует количество групп в пределах множества групп на основании многомерного дисперсионного анализа кластера;

категоризацию первой группы в пределах множества групп как положительного контрольного набора, если первая группа содержит первые изображения предметного стекла, ассоциированные с удовлетворительной классификацией; и категоризацию второй группы в пределах множества групп как отрицательного контрольного набора, если вторая группа содержит вторые изображения предметного стекла, ассоциированные с неудовлетворительной классификацией.

[0025] Второй аспект настоящего изобретения представляет собой способ осуществления количественной гистопатологической оценки неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле, включающий:

обнаружение гематоксилинового канала из неклассифицированного изображения предметного стекла, при этом гематоксилиновый канал ассоциирован с клеточным ядром в пределах неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле;

извлечение признака из обнаруженного гематоксилинового канала, при этом признак представляет собой свойство ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит по меньшей мере одно из площади ядра, периметра ядра, интегральной плотности ядра или округлости ядра;

генерацию, на основании признака, отличительного признака, ассоциированного с неклассифицированным изображением предметного стекла, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

совместную кластеризацию отличительного признака с первым набором отличительных признаков, ассоциированных с одним или более положительными контрольными наборами, и со вторым набором отличительных признаков, ассоциированных с отрицательным контрольным набором, при этом положительный контрольный набор(ы) содержит первый набор изображений предметного стекла, ассоциированный с удовлетворительной классификацией, а отрицательный контрольный набор содержит второй набор изображений предметного стекла, ассоциированный с неудовлетворительной классификацией; и

определение, на основании совместной кластеризации, является ли отличительный признак ассоциированным с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией.

[0026] Третий аспект настоящего изобретения представляет собой систему для классификации объектов в пределах цифровых изображений ткани, содержащую:

средство для преобразования изображения предметного стекла в бинарное изображение предметного стекла, при этом изображение предметного стекла выбрано из библиотеки контрольных изображений, при этом каждое изображение предметного стекла в библиотеке контрольных изображений ассоциировано с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией;

средство для обнаружения ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла;

средство для извлечения признака из обнаруженного ядра, при этом признак представляет собой свойство обнаруженного ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит по меньшей мере одно из площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра или округлости обнаруженного ядра;

средство для генерации отличительного признака, ассоциируемого с бинарным изображением предметного стекла, на основании признака, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

средство для включения бинарного изображения предметного стекла в кластер, при этом кластер содержит множество изображений, при этом каждое из первого множества изображений ассоциировано с соответствующим отличительным признаком, и при этом включение основано на сравнении отличительного признака с соответствующим отличительным признаком;

средство для применения предельного верхнего значения к кластеру для образования множества групп, при этом предельное верхнее значение минимизирует количество групп в пределах множества групп на основании многомерного дисперсионного анализа кластера;

средство для категоризации первой группы в пределах множества групп как положительного контрольного набора, если первая группа содержит первые изображения предметного стекла, ассоциированные с удовлетворительной классификацией; и

средство для категоризации второй группы в пределах множества групп как отрицательного контрольного набора, если вторая группа содержит вторые изображения предметного стекла, ассоциированные с неудовлетворительной классификацией.

[0027] Четвертый аспект настоящего изобретения представляет собой классификатор, содержащий:

средство для обнаружения гематоксилинового канала из неклассифицированного изображения предметного стекла, при этом гематоксилиновый канал ассоциирован с клеточным ядром в пределах неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле;

средство для извлечения признака из обнаруженного гематоксилинового канала, при этом признак представляет собой свойство ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит по меньшей мере одно из площади ядра, периметра ядра, интегральной плотности ядра или округлости ядра;

средство для генерации, на основании признака, отличительного признака, ассоциированного с неклассифицированным изображением предметного стекла, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

средство для совместной кластеризации отличительного признака с первым набором отличительных признаков, ассоциированных с положительным контрольным набором, и со вторым набором отличительных признаков, ассоциированных с отрицательным контрольным набором, при этом положительный контрольный набор содержит первый набор изображений предметного стекла, ассоциированный с удовлетворительной классификацией, а отрицательный контрольный набор содержит второй набор изображений предметного стекла, ассоциированный с неудовлетворительной классификацией; и

средство для определения, на основании совместной кластеризации, является ли отличительный признак ассоциированным с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией.

[0028] В определенных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения способы, система и классификатор могут содержать классификатор ткани или использовать классификатор ткани, выполненный с возможностью определения активности или пригодности для трансплантации ткани субъекта, предпочтительно субъекта-человека.

[0029] В определенных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения ткань представляет собой ткань тимуса, предпочтительно срезы аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для трансплантации в тело субъекта-человека.

[0030] В конкретных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения человек может страдать полным синдромом Ди Георга, связанным с делецией 22q11.2; колобомой, пороком сердца, атрезией хоан, задержкой роста или развития, генитальной гипоплазией и аномалиями уха или глухотой - синдромом CHARGE, или атимией, связанной с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1).

[0031] В конкретных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения классификатор ткани определяет активность неизвестной ткани путем генерации отличительных признаков определенных ядер в пределах изображений предметного стекла в контрольной библиотеке и кластеризации изображений предметного стекла на основании их соответствующих отличительных признаков, предпочтительно, ткани тимуса.

[0032] В конкретных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения ткань тимуса подвергали процессу культивирования в среде органа тимуса на протяжении периода времени для частичного обеднения ткани тимуса тимоцитами.

В некоторых вариантах реализации период времени составляет до 21 дня. В других вариантах реализации период времени составляет от приблизительно 12 дней до приблизительно 21 дня, или от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней.

[0033] В некоторых вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения процесс культивирования сохраняет функциональное строение стромы тимуса, предпочтительно строма тимуса содержит эпителиальные клетки тимуса и фибробласты.

[0034] В некоторых вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения ткань выбрана из группы, содержащей сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

[0035] В определенных вариантах реализации первого-четвертого аспектов настоящего изобретения отличительный признак генерируют из измерений, содержащих численные значения площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра и округлости обнаруженного ядра.

[0036] Также следует понимать, что определенные признаки, описанные в настоящем документе, которые для ясности описаны в контексте разных аспектов настоящего изобретения и/или в отдельных вариантах реализации, также могут быть совмещены в одном варианте реализации. И наоборот, различные признаки, которые для краткости описаны в контексте одного аспекта настоящего изобретения и/или в одном варианте реализации, также могут быть представлены по отдельности или в любом подходящем подсочетании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0037] Для более полного понимания принципов, раскрытых в настоящем документе, и их преимуществ приводится следующее описание со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых:

[0038] На фиг. 1 схематически показано функционирование классификатора, который принимает ввод неклассифицированного изображения предметного стекла и на основании анализа неклассифицированного изображения предметного стекла и сравнения с заранее установленными критериями определяет, является ли ткань в неклассифицированном изображении предметного стекла тканью-кандидатом для трансплантации.

[0039] На фиг. 2 показан приведенный в качестве примера кластер и древовидная кластерная схема, в которой кластер был разделен на разные группы а, b, с, d и е.

[0040] На нижеследующих фиг. 3A-3D показаны изображения предметного стекла, имеющие различные количества фоновых пикселей. На фиг. 3А показано изображение предметного стекла, на котором изображен образец ткани на подходящем количестве фоновых пикселей. На фиг. 3В и 3С показаны изображения предметного стекла с излишним количеством фоновых пикселей. На фиг.3D показано изображение предметного стекла с недостаточным количеством фоновых пикселей.

[0041] На фиг. 4А-4С показаны изображения предметного стекла с разной степенью сегментации ядер. На фиг.4А показано изображение предметного стекла с надлежащим образом сегментированными ядрами, а на фиг. 4В и 4С показаны изображения предметного стекла с неверно сегментированными ядрами.

[0042] На фиг. 5 показаны этапы обработки изображения для анализа изображения гематоксилина образца ткани тимуса. На фиг. 5 показан образец ткани тимуса, окрашенный гематоксилином, который идентифицирует поле для анализа как очертание в квадрате, увеличенное на среднем изображении и преобразованное в красный канал изображения предметного стекла, которое было извлечено и инвертировано для образования бинарного изображения в изображении справа.

[0043] На фиг. 6A-6D показаны приведенные в качестве примера результаты извлечения признака в варианте реализации, в котором ткань представляет собой ткань тимуса, а извлеченные признаки включают площадь, периметр, интегральную плотность и округлость. На фиг. 6А показаны определения площади. На фиг. 6В показаны определения периметра. На фиг. 6С показаны определения интегральной плотности. На фиг. 6D показаны определения округлости.

[0044] На фиг. 7 показано представление отличительных признаков, сгенерированных для изображений предметного стекла. Отличительные признаки являются количественными выражениями лежащих в основе признаков ядер в пределах изображения.

[0045] На фиг. 8 показано представление необработанного вывода из этапа кластеризации, содержащего образец тимуса, полученный от Университета Дьюка (Duke University).

[0046] На фиг. 9 показан результат этапа группирования во время стадии обучения. На фиг. 9 изображено несколько положительных и отрицательных контрольных групп, кластеризованных на основании изображений предметного стекла экспериментальных образцов ткани тимуса.

[0047] На фиг. 10 показаны приведенные в качестве примера результаты статистического анализа различий между популяциями в пределах каждой сегментированной группы по таблице 2. На фиг. 10 изображено, что популяция изображений предметного стекла в пределах каждой группы существенно не изменялась, что указывает на то, что эти изображения предметного стекла имеют общие отличительные признаки.

[0048] На фиг. 11 показана функциональная схема примера анализа изображения предметного стекла. В варианте реализации функциональная схема реализована классификатором, который осуществляет этапы обработки, описанные выше. Изображение предметного стекла может быть сначала оценено для определения того, является ли изображение подходящим для анализа во время этапа классификации.

[0049] На фиг. 12A-12D показаны моделированные примеры использования, изображающие приведенные в качестве примера отличительные признаки на основании некоторых извлеченных признаков изображения ткани тимуса на предметном стекле. На фиг. 12А показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для площади ядра. На фиг. 12В показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для периметра ядра. На фиг. 12С показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для интегральной плотности ядра. На фиг. 12D показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для округлости ядра.

[0050] На фиг. 13A-13F показаны отличительные признаки из приведенного в качестве примера применения классификатора к приведенному в качестве примера изображению предметного стекла кортикальных тимоцитов с положительной и отрицательной контрольной группой. На фиг. 13А показано приведенное в качестве примера изображение ткани тимуса на предметном стекле, ассоциируемое с положительной контрольной группой. На фиг. 13В показано приведенное в качестве примера изображение ткани тимуса на предметном стекле, ассоциируемое с отрицательной контрольной группой. На фиг. 13С показаны отличительные признаки, ассоциированные с определениями округлости. На фиг. 13D показаны отличительные признаки, ассоциированные с определениями площади. На фиг. 13Е показаны отличительные признаки, ассоциированные с определениями интегральной плотности. На фиг. 13F показаны отличительные признаки, ассоциированные с определениями периметра.

[0051] На фиг. 14A-14D изображены ядра клинической и деградированной культивированной ткани тимуса. На фиг. 14А-14С отображены три партии образцов культивированной клинической ткани тимуса. На фиг. 14D отображена деградированная ткань тимуса.

[0052] На фиг. 15 показана тенденция количества клеток в день, нормализованная по площади ткани.

[0053] На фиг. 16А-16В показаны изображения ткани тимуса в День 0 процесса культивирования. На фиг. 16А показана фотография культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, в День 0. На фиг. 16В показан вид в увеличенном масштабе участка культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, с 40-кратным увеличением.

[0054] На фиг. 17А-17В показаны изображения ткани тимуса на День 5 процесса культивирования. На фиг. 17А показана фотография культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, в День 5. На фиг. 17В показан вид в увеличенном масштабе участка культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, с 40-кратным увеличением.

[0055] На фиг. 18А-18В показаны изображения ткани тимуса в День 9 процесса культивирования. На фиг.18А показана фотография культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, в День 9. На фиг. 18В показан вид в увеличенном масштабе участка культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, с 40-кратным увеличением.

[0056] На фиг. 19А-19В показаны изображения ткани тимуса в День 12 процесса культивирования. На фиг. 19А показана фотография культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, в День 12. На фиг. 19В показан вид в увеличенном масштабе участка культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, с 40-кратным увеличением.

[0057] На фиг. 20А-20В показаны изображения ткани тимуса в День 21 процесса культивирования. На фиг. 20А показана фотография культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, в День 21. На фиг. 20В показан вид в увеличенном масштабе участка культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилином-эозином, с 40-кратным увеличением.

[0058] На фиг. 21А-21Е показаны изображения культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилин-эозин, в Дни 0, 5, 9, 2 и 21, на которых изображены изменения во внешнем виде ядер в День 0, 5, 9, 12 и 21. На фиг. 21А показана высокая пропорция ядер, имеющих более высокую интегральную плотность, которая указывает на большое количество тимоцитов. Поскольку тимоциты вымываются из ткани, на День 5 (фиг. 21В), 9 (фиг. 21С), 12 (фиг. 21D) и 21 (фиг. 21Е), ткань демонстрирует заметное снижение интегральной плотности и профиль, более похожий на профиль эпителиальных клеток тимуса.

[0059] На фиг. 22 показан график, изображающий временную динамику определений интегральной плотности из технических партий аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. По мере вымывания тимоцитов из ткани, на День 5 ткань демонстрирует заметное снижение интегральной плотности и профиль, более похожий на профиль эпителиальных клеток тимуса. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0060] На фиг. 23 показан график, изображающий измерения округлости. Количество клеток с очень высокой округлостью уменьшается со временем на протяжении процесса культивирования. Вероятно, это связано с апоптозом, который приводит к менее круглыми ядрам, а также с вымыванием очень круглых тимоцитов. Для образцов в День 0 с более низкой округлостью это, вероятно, связано с нагромождением тимоцитов, измеряемых как единое целое с более низкой округлостью, чем одно ядро. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0061] На фиг. 24 показан график, изображающий измерения периметра. В День 0 присутствует большая пропорция клеток с высокими значениями периметра, что вероятно вследствие нагромождения клеток, считываемого программой как одна форма, что приводит к высоким значениям периметра. Увеличение периметра, вероятно, связано с сочетанием вымывания тимоцитов, апоптоза клеток в течение времени культивирования и результирующим увеличением значения периметра от указанного события. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0062] На фиг. 25 показан график, изображающий временную динамику площади. В этой технике использовано евклидово расстояние (корень квадратный суммы квадратов ошибки между образцом и большого центроида) для измерения сходства между двумя образцами при учете всех четырех исследуемых переменных. Например, чем ниже евклидово расстояние, тем больше сходства два образца имеют друг с другом. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0063] На фиг. 26 показан график основных эффектов и график взаимодействия данных. Данные, показанные на фиг. 26, подтверждают, что культивированная ткань тимуса ведет себя подобным образом с течением времени.

[0064] На фиг. 27 показан график, показывающий 95% доверительных интервалов расстояния от центроида на тимус в день.

[0065] На фиг. 28А и 28В показаны приведенные в качестве примера изображения эпителиальных клеток тимуса, которые были обведены патологом красным цветом.

[0066] На фиг. 29 показано изображение эпителиальных клеток тимуса (ЭКТ), обведенных патологом красным цветом. Тимоциты обведены синим.

[0067] На фиг. 30 показан график соотношения ЭКТ к общему количеству клеток из предметных стекол с окрашиванием гематоксилином-эозином.

[0068] На фиг. 31 показан график соотношения ЭКТ к общему количеству клеток, нормализованного по выбранной площади ткани.

[0069] На фиг. 32 показана древовидная кластерная схема, изображающая расстояние между группами «С» и «D», в качестве примера. Выделенные зеленые и красные прямоугольники обозначают группирования по одному признаку. Это основано на предельном верхнем значении оси у, составляющем 0,43. В этом примере группы С и D находятся на расстоянии 0,6 и, следовательно, считаются двумя отдельными группами. Образцы в пределах каждой группы считаются статистически подобными, а образцы в разных группах считаются статистически разными.

[0070] На фиг. 33 показан график, изображающий обучающий набор со всеми клинически положительными и подтвержденными отрицательными образцами. Кластер с прямоугольником представляет собой принудительно деградированные образцы.

[0071] На фиг. 34 показана итоговая библиотека образцов. Слева направо группы именованы как Группа 4, Группа 3, Группа 2 и Группа 1. Группы 1, 2 и 3 ассоциированы с удовлетворительной классификацией, а Группа 4 ассоциирована с неудовлетворительной классификацией.

[0072] На фиг. 35A-35D показаны репрезентативные изображения для каждой группы кластеров в итоговой библиотеке образцов. Группы 1 (фиг. 35А), 2 (фиг. 35В) и 3 (фиг. 35С) состоят из образцов с положительными клиническими результатами. Группа 4 (фиг. 35D) состоит из подтвержденных деградированных образцов. Образец Группы 1 взят из LOT-345, образец Группы 2 взят из LOT-160, образец Группы 3 взят из LOT-194, а образец Группы 4 взят из FD.SP17-40348-C1.1 (способ деградации: замораживание при -20°С).

[0073] На фиг. 36A-36D показано графическое отображение разных параметров, разделенных на группы. На фиг. 36А показано графическое отображение кластеров данных касательно определений площади. На фиг. 36В показано графическое отображение кластеров данных касательно определений округлости. На фиг. 36С показано графическое отображение кластеров данных касательно определений интегральной плотности. На фиг. 36D показано графическое отображение кластеров данных касательно определений периметра.

[0074] На фиг. 37 показано изображение из Группы 1 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0075] На фиг. 38 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в Группе 1.

[0076] На фиг. 39 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в Группе 1.

[0077] На фиг. 40 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в Группе 1.

[0078] На фиг. 41 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в Группе 1.

[0079] На фиг. 42 показано изображение Группы 2 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0080] На фиг. 43 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в Группе 2.

[0081] На фиг. 44 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в Группе 2.

[0082] На фиг. 45 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в Группе 2.

[0083] На фиг. 46 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в Группе 2.

[0084] На фиг. 47 показано изображение из Группы 3 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0085] На фиг. 48 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в Группе 3.

[0086] На фиг. 49 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в Группе 3.

[0087] На фиг. 50 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в Группе 3.

[0088] На фиг. 51 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в Группе 3.

[0089] На фиг. 52 показано изображение из Группы 4 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0090] На фиг. 53 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в Группе 4.

[0091] На фиг. 54 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в Группе 4.

[0092] На фиг. 55 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в Группе 4.

[0093] На фиг. 56 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в Группе 4.

[0094] На фиг. 57 показаны графики анализа переменчивости между группами и в их пределах по каждой отдельной ячейке. Данные для параметра представлены на оси х сначала для группы, затем для ячейки. Верхний график для каждого параметра представляет индивидуальные значения, а нижний - стандартное отклонение для данной группы. Оба могут быть использованы для визуализации рассеивания данных.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0095] Названия, заголовки и подзаголовки, представленные в настоящем документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие различные аспекты изобретения. Соответственно, термины, определенные ниже, более полно определены ссылкой на описание в целом. Все источники, цитируемые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки.

[0096] Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понимаемые специалистами в данной области техники. Кроме того, если из контекста не следует иное, термины в единственном числе включают формы множественного числа, а термины во множественном числе включают единственное число. В данной заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное. В контексте пункта формулы изобретения с множественной зависимостью использование термина «или» означает ссылку на более чем один предшествующий независимый или зависимый пункт формулы исключительно в виде альтернативы.

[0097] Кроме того, следует отметить, что в контексте настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа, а также любое употребление любого слова в единственном числе включают множественное число объекта, если только объект явно и однозначно не ограничен единственным числом. В контексте настоящего документа термин «включать» и его грамматические варианты не имеют ограничительного характера, так что перечисление элементов в списке не исключает других подобных элементов, которыми могут быть заменены перечисленные элементы или которые могут быть добавлены к перечисленным элементам.

[0098] Настоящее изобретение может быть наилучшим образом понято со ссылкой на следующие определения:

[0099] Термин «приблизительно» используется в настоящем документе в значении примерно, в районе, порядка или около. При использовании термина «приблизительно» в сочетании с диапазоном численных значений он модифицирует указанный диапазон путем расширения границ в большую и меньшую сторону от приведенных численных значений. В целом, термин «приблизительно» используется в настоящем документе для модификации численного значения в большую и меньшую сторону от указанного значения с отклонением +/- 10%. В контексте настоящего документа термин «приблизительно» относится к численному значению, включая, например, целые числа, дроби и процентные доли, независимо от того, указаны они в явном виде или нет. Термин «приблизительно» относится к диапазону численных значений (например, ± 5-10% от приведенного диапазона), который специалист в данной области техники посчитает эквивалентным приведенному значению (например, имеющему ту же функцию или результат). Когда такие термины, как «по меньшей мере» и «приблизительно», предшествуют списку численных значений или диапазонов, указанные термины модифицируют все значения или диапазоны, представленные в списке. В некоторых случаях термин «приблизительно» может включать численные значения, округленные до ближайшей значащей цифры.

[0100] В контексте настоящего документа термины «содержащий» (и любая форма этого термина, включая такие, как «содержат», «содержит» и «содержащийся»), «имеющий» (и любая форма этого термина, включая такие, как «имеют» и «имеет»), «включающий» (и любая форма этого термина, включая такие, как «включает» и «включают») или «вмещающий» (и любая форма этого термина, включая такие, как «вмещает» и «вмещают») являются включительными или неограниченными и не исключают дополнительных, не перечисленных элементов или этапов способа. Дополнительно, термин, используемый в сочетании с термином «содержащий», также понимается как подходящий для использования в сочетании с термином «состоящий из» или «по существу состоящий из».

[0101] Термин «ткань» в контексте настоящего документа относится к любому типу ткани человека или животных и включает, не ограничиваясь перечисленным, сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

[0102] Как описано в настоящем документе, любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон отношений или целочисленный диапазон следует понимать как включающий значение любого целого числа в пределах указанного диапазона и, когда применимо, его долей (таких как одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано иное. Диапазоны являются приблизительными и могут отличаться более чем на целое число.

[0103] Единицы, приставки и символы обозначены в их общепринятой форме согласно Международной системе единиц (система СИ). Численные диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Измеренные значения считаются приблизительными с учетом значащих цифр и ошибки, связанной с измерением.

[0104] Следует также отметить, что отдельные признаки, описанные в настоящей заявке, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть объединены в одном варианте реализации. И наоборот, различные признаки, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, также могут быть представлены по отдельности или в любом подходящем подсочетании.

[0105] «Площадь» приведена в мкм². Площадь ядра у эпителиальных клеток тимуса больше, чем у тимоцитов. Клетки, находящиеся в процессе апоптоза, также с большей вероятностью имеют меньший размер.

[0106] «Округлость» представляет собой измерение того, насколько круглыми являются клетки. Округлость измеряют по шкале от 0 до 1, где 1 идеальный круг. Тимоциты имеют большую округлость по сравнению с эпителиальными клетками тимуса. Нежизнеспособные клетки имеют меньшую округлость по сравнению с жизнеспособными клетками. Другими словами, округлость может ожидаемо снижаться с течением времени культивирования по мере того, как уменьшается количество тимоцитов и может ожидаться наблюдение нежизнеспособных клеток в срезах ткани. Деградированные образцы также ожидаемо имеют меньшую округлость в связи с большим количеством нежизнеспособных клеток, таким образом смещающих распределение к меньшей округлости.

[0107] «Интегральная плотность» отражает насколько темно ядро окрашено. Интегральная плотность является высокой для тимоцитов, которые характеризуются однородным темным окрашиванием. Эпителиальные клетки тимуса имеют темные края и, главным образом, прозрачную нуклеоплазму с выделяющимся темным ядрышком.

[0108] «Периметр» выражает контур обнаруженных ядер и указан в мкм. Периметр связан с жизнеспособностью клетки; при деградации клеток очертание ядра становится неравномерным и его периметр увеличивается. Периметр будет также увеличиваться по мере увеличения пропорции клеток ЭТ к общему количеству клеток при развитии культуры. Изменения периметра в культуре ожидаемы со временем, а также по мере деградации ткани.

Обзор способа количественного гистологического анализа

[0109] Разработанный способ количественного гистологического анализа представляет собой алгоритм, основанный на изображениях, который кластерирует подобные изображения на основании свойств, которые были определены как статистически и биологически значимые для аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Создают сканируемые гистологические предметные стекла с окрашиванием гематоксилином-эозином. Предметное стекло загружают в программное обеспечение для анализа подтвержденной ткани тимуса как SCN или TIFF изображение. Если загруженный файл представляет собой SCN изображение, алгоритм преобразует его в TIFF изображение для анализа. Красный канал изображения извлекают и затем обращают, чтобы ядра, выделенные эозином, становились черными фигурами на белом фоне.

[0110] Площадь, периметр, интегральную плотность (насколько темной является форма) и округлость затем измеряют для каждого из ядер. Затем обеспечивается возможность сравнения распределений частот для каждого из этих атрибутов с известными положительными и отрицательными образцами в базе данных. Затем осуществляют статистическое кластеризующее сравнение атрибутов с целью определения того, является ли новый введенный образец статистически подобным известным образцам, и, таким образом, обеспечивается возможность его определения как «удовлетворяющего» или «не удовлетворяющего» ранее определенным критериям.

[0111] Определенное количество клинических и научно-исследовательских предметных стекол аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, с окрашиванием гематоксилином-эозином, было отсканировано с 40-кратным или 20-кратным увеличением. Изображения затем были загружены для разработки способа количественного гистологического анализа.

[0112] Для количественного выражения предметных стекол изображения сначала анализировали так, чтобы обеспечивать возможность извлечения атрибутивных данных из изображений. Для достижения этого изображения преобразовали в формат TIFF FGP и затем обработали алгоритмом обработки изображения через программу «ImageJ», в которой изображения откалибровали до 1 мкм/пиксель, красный канал извлекли и затем обратили красный канал так, чтобы ядра с более темным окрашиванием приводили к более высокой пиксельной интенсивности. Обратимся к фиг. 5А-С, на которых приведено изображение этого анализа.

[0113] Пороговые значения были определены и установлены на подходящих значениях для выбора ядер с целью обеспечения последовательности анализа изображений от одного изображения к другому. Изображения анализировали на предмет частиц (ядер клетки), определенных в данном случае как сплошные области пикселей, превышающие 10 мкм² по площади. Затем параметры были извлечены для каждой частицы, включая площадь, периметр, ширину и т.д. (см. таблицу 1 для полного списка оцениваемых параметров).

[0114] Признаками, которые были определены как имеющие статистическую значимость посредством анализа главных компонентов в изначально анализируемой популяции ткани, являлись площадь, периметр, интегральная плотность и округлость. Другие признаки были признаны неспособными способствовать различению между образцами, и их впоследствии не анализировали.

[0115] На фиг. 14A-14D показаны три партии клинических образцов культивированной ткани тимуса (фиг. 14А-14С) и образец деградированной ткани тимуса. Четыре признака площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14А, составляли: площадь=11,34; округлость=0,696; периметр=14,310 и интегральная плотность=1889,2. Четыре признака - площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14В, составляли: площадь=11,41; округлость=0,993; периметр=11,982 и интегральная плотность=1912,4. Четыре признака - площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14С, составляли: площадь=10,53; округлость=0,846; периметр=12,510 и интегральная плотность=1707,4. Четыре признака площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14D, составляли: площадь=13,0; округлость=0,352; периметр=21,556 и интегральная плотность=1786,0. Единственное ядро в каждом изображении обозначено кругом.

[0116] После регистрации четырех параметров для каждого ядра, для каждого параметра создают распределение частот, чтобы показать распределение ядер по всему предметному стеклу. В целом, для каждого предметного стекла существует более 100000 единиц данных. Ширина ячейки и предельное значение для каждого параметра в пределах распределения определяли путем выбора наименьшего количества ячеек, которые демонстрировали переменчивость между предметными стеклами. Определяют пропорцию ядер в каждой ячейке, и эти данные используют для кластеризующего анализа.

Обзор количественного анализа и кластеризации

[0117] Количественный анализ, описанный в настоящем документе, представляет собой объективный/интеграционный подход к цифровым патологическим исследованиям. Как стадия обучения, так и стадия классификации включают компьютеризированное извлечение признаков для генерации отличительного признака для каждого изображения. В варианте реализации отличительный признак выражает лежащие в основе признаки ядра каждого изображения. Использование извлечения клеточных признаков обеспечивает возможность количественного определения характеристик лежащей в основе популяции клеток внутри ткани, которая представлена в каждом изображении предметного стекла. Обе стадии также включают метод статистической иерархической агломеративной кластеризации для классификации гистологических срезов по количественным признакам, описывая каждую клетку в пределах изображения предметного стекла. Кластеризующий анализ категоризует изображения предметного стекла на разные группы на основании сходства между отличительными признаками, сгенерированными для каждого изображения предметного стекла. В варианте реализации используют иерархическую агломеративную кластеризацию в контексте анализа изображений как для обучения классификатора тканей, так и для использования обученного классификатора тканей для определения активности неизвестной ткани. Примеры кластеризующих вариантов реализации изобретения раскрыты ниже в описании, Чертежах и Примерах. В качестве примера и без ограничения, технологии кластеризации, описанные со ссылкой на фиг.2,7-9,32 и последующие, а также сопроводительный текст и Таблицы.

[0118] В контексте классификации тканей иерархическая агломеративная кластеризация включает составление кластеров непосредственно из данных для раскрытия интеграционных свойств лежащего в основе набора данных. На стадии классификации, в соответствии с вариантом реализации, техника кластеризации обеспечивает возможность классификации неизвестной ткани на основании сходства сгенерированных отличительных признаков неизвестной ткани с ранее кластеризованными отличительными признаками известной ткани (например, из библиотеки изображений предметного стекла). Техника кластеризации также полагается на анализ относительной высоты древовидной кластерной схемы (см. фиг. 2), которая указывает на расстояние между центральными точками кластеров. Относительная высота обычно пропорциональна разности между числовыми признаками кластеров (описаны ниже).

[0119] На фиг. 2 показан приведенный в качестве примера кластер и древовидная кластерная схема, в которой кластер был разделен на разные группы а, b, с, d и е. После генерации кластера и/или древовидной кластерной схемы, для определения групп, которые статистически существенно отличаются друг от друга, могут быть применены техники статистического анализа. Одним примером техники статистического анализа является многомерный дисперсионный анализ (multivariate analysis of variance, «MANOVA»), который представляет собой процедуру для определения отклонения между наборами данных, имеющих две или более (т.е. несколько) переменных.

[0120] Стадия обучения и классификации может включать один или более из следующих этапов: определение пригодности, обработка изображения, извлечение признака и кластеризация.

Определение пригодности

[0121] Определение пригодности относится к оценке характеристик изображения предметного стекла для определения, является ли изображение предметного стекла пригодным для дальнейшего количественного анализа, как описано в раскрытых вариантах реализации. Определение пригодности могут осуществлять как для обучающих наборов изображений, так и для новых изображений предметного стекла. В варианте реализации определение пригодности изображения предметного стекла включает анализ метаданных, анализ фоновых пикселей (например, оценка количества фоновых пикселей, присутствующих в изображении предметного стекла) и анализ энтропии ткани (и сегментации ядер) (например, оценка количества энтропии в изображении предметного стекла).

Анализ метаданных

[0122] Анализ метаданных изображений предметного стекла определяет, содержит ли изображение предметного стекла подходящие свойства метаданных для количественного анализа. Примеры метаданных, которые могут быть предусмотрены, без ограничения включают следующее: имя файла (например, является ли имя файла уникальным), дата последнего изменения (дата, когда файл был изменен последний раз), размер файла (например, размер файла в байтах), формат (например, тип файла, такой как TIF), ширина изображения (например, значение, содержащее ширину изображения предметного стекла в пикселях), высота изображения (например, значение, содержащее высоту изображения предметного стекла в пикселях), глубина в битах (общее количество битов для цветовых каналов в изображении предметного стекла), тип цвета (тип цвета изображения, например, RGB), разрешение х (например, значение, выражающее разрешение изображения предметного стекла в направлении X), разрешение у (например, значение, выражающее разрешение изображения предметного стекла в направлении Y), единицы разрешения (например, цепочка, содержащая единицы свойств разрешения х и разрешения у), коэффициент фона изображения (соотношение количества фоновых пикселей к общему количеству пикселей), ярлык фона (ярлык, описывающий количество фоновых пикселей в изображении), энтропия ткани (энтропия, описывающая только сегментированные пиксели ткани) и ярлык сегментации ядра (ярлык, описывающий успешность анализа сегментации ядра).

[0123] В варианте реализации изображение предметного стекла может считаться подходящим для количественного анализа на основании анализа одного или более свойств метаданных, описанных выше. Например, в варианте реализации, если все вышеуказанные поля присутствуют и читаемы в пределах заголовка изображения предметного стекла, и изображение предметного стекла имеет разрешение х от 0,8 мкм до 1,2 мкм и разрешение у от 0,8 мкм до 1,2 мкм, то изображение предметного стекла является подходящим для количественного анализа. В другом варианте реализации, если поля отсутствуют или повреждены, изображение предметного стекла может быть исключено из количественного анализа.

Анализ фона

[0124] Анализ фоновых пикселей представляет этап, целью которого является обеспечение того, что изображение ткани является подходящим для дальнейшего анализа, который требует анализа ткани на фоне. В варианте реализации количественный анализ использует стандартизованное количество фоновых пикселей в изображении предметного стекла, чтобы обеспечить осуществление правильного сегментирования во время сегментирования ткани и сегментирования ядер. Изображения со слишком большим количеством фоновых пикселей (пустые изображения) или изображения с недостаточным количеством фоновых пикселей (обрезанные изображения) дадут низкий результат во время анализа сегментации (описан ниже) и, следовательно, диапазон фоновых пикселей должен быть определен так, чтобы отсеивать изображения за пределами этого диапазона до перехода к количественному анализу раскрытых вариантов реализации.

[0125] Результаты анализа фона могут обеспечивать ассоциацию ярлыка фона (например, удовлетворительный или неудовлетворительный) с изображением предметного стекла. Например, на фиг. 3A-3D показаны изображения предметного стекла с разными количествами фоновых пикселей. На фиг. 3А показано изображение предметного стекла, на котором изображен образец ткани на подходящем количестве фоновых пикселей. В варианте реализации изображение предметного стекла с подходящим количеством пикселей считается подходящим для дальнейшего анализа. Этот тип изображения может считаться первым классом фона.

[0126] На фиг. 3В и 3С показаны изображения предметного стекла с излишним количеством фоновых пикселей. В варианте реализации изображение предметного стекла со слишком большим количеством фоновых пикселей считается неподходящим для дальнейшего анализа. Этот тип изображения может считаться вторым классом фона.

[0127] На фиг. 3D показано изображение предметного стекла с недостаточным количеством фоновых пикселей. В варианте реализации такое изображение предметного стекла считается неподходящим для дальнейшего анализа. Этот тип изображения может считаться третьим классом фона.

[0128] Ниже будут описаны приведенные в качестве примера этапы анализа фона. Фон изображения для изображений предметного стекла будет классифицирован с использованием классификационных интервалов на основании отношения количества фоновых пикселей к общему количеству пикселей. Например, пустые изображения (например, фиг. 3В, 3С) характеризуются очень высоким коэффициентом фона изображения (например, 95%); обрезанные изображения характеризуются очень низким коэффициентом фона изображения (например, 5%) (например, фиг. 3D), а изображения с нормальным количеством фоновых пикселей и ткани характеризуются умеренным коэффициентом фона изображения (например, от 20% до 80%) (например, фиг. 3А). Эти значения приведены исключительно в качестве примера и могут быть определены в динамическом режиме на основании анализа изображений в пределах обучающего набора.

[0129] Анализ фона осуществляют для изображений в пределах обучающего набора (например, для генерации подходящих диапазоном и значений, которые считаются подходящими для количественного анализа) для изображений в контрольном наборе (например, для определения, находятся ли фоновые значения изображений в контрольном наборе в пределах сгенерированных подходящих диапазонов) и для новых неклассифицированных изображений. В варианте реализации определение классификации коэффициента фона изображения для изображений предметного стекла без ограничения включает следующие этапы.

[0130] В варианте реализации определение классификации коэффициента фона изображения для изображений предметного стекла для обучающего набора без ограничения включает следующие этапы:

1. Вычисление коэффициента фона изображения для всех изображений в обучающем наборе.

a. Вычисление нормализованных количественных показателей гистограммы из изображения.

b. Использование функции инверсии на всех пикселях изображения из канала красного цвета для отделения пикселей ткани от фоновых пикселей (например, функция otsu_dark в приложении ImageJ)

c. Генерация количественных показателей гистограммы из всех пикселей изображения с N ячейками, где N=2^{-битьной глубиной изображения предметного стекла}.

d. Деление всех количественных показателей гистограммы на общее количество пикселей в изображении для нормализации данных.

e. Вычисление пропорции пикселей, превышающих пороговое значение. Эта пропорция выражает коэффициент фона изображения.

2. Вычисление классифицирующего интервала коэффициента фона изображения для изображений, которые считаются такими, что имеют подходящее количество фоновых пикселей (например, удовлетворительно).

a. Вычисление среднего коэффициента фона изображения и стандартного отклонения для каждого из первого, второго и третьего классов фона.

b. Вычисление верхней границы диапазона классификации.

i. Вычисление средней точки между средним коэффициентом фона изображения для первого и второго классов фона. Это значение может быть установлено как верхняя граница принятого классифицирующего интервала.

c. Вычисление нижней границы диапазона классификации.

ii. Вычисление средней точки между средними коэффициентами фона изображения для первого, второго и третьего классов фона. Это значение устанавливают в качестве нижней границы принятого классифицирующего интервала.

[0131] В варианте реализации результаты предшествующих этапов, выполненных над обучающим классом изображений предметного стекла, обеспечивают приемлемый диапазон фона. Изображения предметного стекла, значения фона которых находятся в пределах допустимого диапазона фона, могут считаться подходящими для дальнейшего количественного анализа. Допустимый диапазон фона затем могут применять для классификации новых изображений, не входящих в обучающий класс, таких как изображения в пределах контрольной библиотеки. Например, новые изображения предметного стекла, которые были определены как имеющие коэффициент фона в пределах диапазона фона, вычисленного для изображений с первым классом фона (например, фиг. 3А), классифицируют как имеющие подходящее количество фоновых пикселей и принимают для следующего этапа анализа. В противном случае, новые изображения предметного стекла, находящиеся за пределами диапазона фона, вычисленного для изображений с первым классом фона (например, фиг. 3B-D), отклоняют, и они не переходят к дальнейшему анализу.

Анализ энтропии ткани

[0132] Анализ сегментации ядра обеспечивает подходящее отделение пикселей ядер от других пикселей в изображении предметного стекла. Отличительные признаки изображений предметного стекла частично основаны на характеристиках ядра, поэтому правильно сегментированные пиксели ядер необходимы для количественного анализа в вариантах реализации. Результаты анализа сегментации ядра могут обеспечивать ассоциацию ярлыка сегментации ядра (например, удовлетворительно или неудовлетворительно) с изображением предметного стекла.

[0133] Анализ сегментации ядра включает оценку энтропии пикселей ткани для обеспечения достаточной энтропии, чтобы происходила правильная сегментация ядра. Энтропия изображения, подобно термодинамической энтропии, соответствует количеству состояний в системе. Изображение с множеством различных значений пикселей, равномерно распределенных по изображению, имеет большое количество состояний и, следовательно, высокую энтропию. Изображение со значениями пикселей, неравномерно распределенными по изображению, будет иметь малое количество состояний и, следовательно, низкую энтропию. Оценка энтропии пикселей ткани в изображении предметного стекла обеспечивает наличие надлежащей контрастности и резкости в изображении, что способствует количественному анализу изображения предметного стекла. Изображения с низкой контрастностью будут иметь более низкую энтропию по сравнению с изображениями с нормальным количеством контрастности ткани. Количество и конфигурация пикселей для каждого ядра соответствует его «признакам» и используется для генерации отличительных признаков, которые используют для кластеризации образцов ткани. Эти признаки будут варьироваться от ядра к ядру в изображении предметного стекла. В варианте реализации изображения, которые прошли два предыдущих этапа (анализ метаданных, фон изображения), переходят к этому анализу энтропии ткани.

[0134] При применении к обучающему набору анализ энтропии ткани создает диапазон для допустимой энтропии ткани в пределах изображения. В варианте реализации анализ энтропии ткани может без ограничения включать следующие этапы: 1. Отделение всех пикселей ткани от фоновых пикселей.

i. Использование функции инверсии на всех пикселях изображения из канала красного цвета для отделения пикселей ткани от фоновых пикселей (например, функция otsudark в приложении ImageJ).

ii. Вычисление энтропии всех пикселей ткани с использованием уравнения энтропии и сохранение соответствующих значений. Пример уравнения энтропии показан ниже, где ЕТ представляет собой энтропию ткани для всех пикселей ткани, р представляет собой нормализованные количественные показатели гистограммы пикселей ткани в ячейке i, а N представляет собой количество ячеек гистограммы, используемых в гистограмме:

.

iii. Создание бинарной маски всех сегментированных ядер в пределах изображения предметного стекла (например, применение функции otsu_dark ко всем пикселям ткани). Бинарная маска соответствует конкретному изображению и указывает на пиксели, которые будут использованы. Бинарные маски обычно создают при осуществлении сегментации. Например, бинарная маска ядра, которая соответствует изображению с окрашиванием гематоксилином-эозином, будет представлять собой матрицу с такими же размерами, что и исходное изображение, где маска ядра лишь 1-битная и только содержит заранее определенные значения (например, 0 или 1). Расположения пикселей, которые соответствуют расположению ядер в исходном изображении, будут иметь заранее определенное значение (например, 1), причем пиксели, не относящиеся к ядрам, будут иметь заранее определенное значение, составляющее (например, 0). 2. Создание ярлыков сегментирования ядер для всех изображений. Этот ярлык описывает успешность осуществленной сегментации ядер в способе обработки изображений, описанном выше в отношении анализа энтропии ткани. Сегментация ядер представляет собой отделение пикселей ядер от всех остальных пикселей в исходном изображении предметного стекла (например, с окрашиванием гематоксилином-эозином). Сегментацию ядер осуществляют для того, чтобы обеспечить проведение объектного анализа только ядра клетки в изображении.

i. Определение точности сегментации ядер. Например, этот этап может быть осуществлен с использованием приложения и сравнения с ключом изображения, который предоставляет примеры правильной и неправильной сегментации.

1. Наложение бинарной маски ядра на изображение красного канала с использованием определенного значения непрозрачности (фиг. 4А-С ниже).

2. Проверка заранее определенного количества ядер (например, 50) на предмет правильной сегментации, которая определена надлежащим наложением масок сверху на ядра.

a. Если из заранее определенного количества ядер количество правильно сегментированных ядер больше или равно определенному количеству ядер (например, 45), изображению может быть присвоен первый ярлык сегментации ядер (например, «0») (фиг. 4А).

b. Если количество правильно сегментированных ядер меньше определенного количества ядер, изображению может быть присвоен второй ярлык сегментации ядер (например, «1») (фиг. 4В, С).

3. Вычисление классифицирующего интервала энтропии ткани для изображений с первым ярлыком сегментации ядер.

i. Вычисление среднего значения энтропии ткани и стандартного отклонения для каждого из изображений, имеющих первый и второй ярлыки сегментации ядер.

ii. Вычисление нижней границы диапазона классификации.

1. Вычисление средней точки между средним значением энтропии ткани для первого и второго ярлыков сегментации ядер. Это значение устанавливают в качестве нижней границы диапазона энтропии ткани.

2. Принятый диапазон значений энтропии ткани может проходить от нижней границы диапазона, вычисленной на этапе 3.ii.1, до бесконечности.

[0135] В варианте реализации результаты предшествующих этапов, выполненных над обучающим классом изображений предметного стекла, обеспечивают приемлемый диапазон классификации для энтропии ткани в изображении предметного стекла. Допустимый диапазон классификации затем могут применять для классификации новых изображений предметного стекла. Изображения предметного стекла со значением энтропии ткани, превышающим нижнюю границу диапазона классификации (см. этап 3.ii.1), классифицируют как имеющие подходящее количество энтропии ткани, и их принимают для анализа с использованием этого способа. Изображения предметного стекла со значением энтропии ткани меньше нижней границы диапазона классификации отклоняют, и они не переходят к дальнейшему количественному анализу.

[0136] На фиг. 4А-4С показаны изображения предметного стекла с разной степенью сегментации ядер. На фиг. 4А показано изображение предметного стекла с надлежащим образом сегментированными ядрами, а на фиг. 4В и 4С показаны изображения предметного стекла с неверно сегментированными ядрами.

Обработка изображений

[0137] Признак обработки изображений будет более подробно описан ниже в связи с анализом гематоксилиновых каналов изображений предметного стекла, так как этот канал изображает признаки ядра каждой клетки. В варианте реализации гематоксилиновое изображение отделяют от эозинового изображения. В варианте реализации этап обработки изображения может также включать преобразование изображений предметного стекла в бинарные изображения для анализа, как показано на фиг. 5А-С ниже. В варианте реализации изображения предметного стекла (фиг. 5А) анализируют с одинаковым разрешением и масштабом. Сплошные области пикселей затем извлекают из бинарных изображений для обнаружения ядер и соответствующих признаков ядер (как показано на фиг. 5В). В варианте реализации красный канал изображения предметного стекла извлекают и обращают для образования бинарного изображения, как показано на фиг. 5С. В некоторых системах красный канал изображения обеспечивает наилучшее изображение ядер в пределах изображений предметного стекла.

Извлечение признаков

[0138] В варианте реализации этап извлечения признаков включает извлечение признаков для каждого ядра, обнаруженного в изображении предметного стекла, и генерацию отличительного признака для каждого из извлеченных признаков. В варианте реализации признаки выражены численными значениями признаков. На приведенной ниже таблице 1 перечислены признаки, которые в качестве примера и без ограничения характеризуются возможностью обнаружения и, следовательно, возможностью извлечения для каждого ядра. Для каждого ядра может быть извлечен один или более признаков. Например, некоторые признаки могут иметь большую значимость для целей различных применений определения активности. Другими словами, может быть определено, что некоторые признаки существенно варьируются между удовлетворительными и неудовлетворительными тканями.

[0139] В варианте реализации, в котором ткань, подлежащая классификации, является тканью тимуса (которая может или может быть частью анализа), извлекаемые значимые признаки представляют собой площадь каждого обнаруженного ядра, периметр каждого обнаруженного ядра, интегральную плотность каждого обнаруженного ядра и округлость каждого ядра. Что касается площади, то площадь ядра у эпителиальных клеток тимуса больше, чем у тимоцитов. Периметр связан с жизнеспособностью клетки; при деградации клеток очертание ядра становится неравномерным и его периметр увеличивается. Интегральная плотность высока для тимоцитов, которые характеризуются однородным темным окрашиванием. Эпителиальные клетки тимуса имеют темные края и, главным образом, прозрачную нуклеоплазму с выделяющимся темным ядрышком. Тимоциты имеют большую округлость по сравнению с эпителиальными клетками тимуса. Нежизнеспособные клетки имеют меньшую округлость по сравнению с жизнеспособными клетками.

[0140] В варианте реализации интегральная плотность выражена размером обнаруженного ядра и значением темноты, ассоциированным с обнаруженным ядром. Округлость представляет оценку круглой формы обнаруженного ядра и в варианте реализации может быть выражена диапазоном (например, от 0,0 до 1,0, где 1,0 представляет собой идеальный круг).

[0141] Ниже описано определение отличительного признака для изображения предметного стекла согласно варианту реализации. Сперва создают числовой отличительный признак для каждого из извлеченных признаков. Например, в варианте реализации, описанном выше, отличительный признак генерируют для каждого из площади, периметра, интегральной плотности и округлости ядер в пределах изображений предметного стекла. В варианте реализации для каждого из извлеченных признаков (например, площадь, периметр, интегральная плотность и округлость) генерируют гистограммы. Каждая гистограмма показывает частоту результатов в конкретных диапазонах (ячейках) для признака. Отличительный признак генерируют из совмещенных гистограмм для каждого изображения предметного стекла. Кластеризация (описана ниже и в Примерах, изложенных ниже) основана на статистическом анализе извлеченных признаков. Гистограммы показаны на фиг. 6A-6D. Фиг. 6A-D изображают приведенные в качестве примера результаты извлечения признака в варианте реализации, в котором ткань представляет собой ткань тимуса, а извлеченные признаки включают площадь, периметр, интегральную плотность и округлость. На фиг. 6А показаны определения площади. На фиг. 6В показаны определения периметра. На фиг. 6С показаны определения интегральной плотности. На фиг. 6D показаны определения округлости.

Кластеризация

[0142] В варианте реализации кластеризация может включать составление кластеров на основании отличительных признаков изображения предметного стекла. В варианте реализации матрица евклидовых расстояний для сгенерированного отличительного признак представлена в таблице. Матрицу расстояний затем могут использовать для иерархической агломеративной кластеризации посредством поиска оптимальной конфигурации изображений предметного стекла, чтобы минимизировать отклонение внутри группы изображений предметного стекла.

[0143] В варианте реализации отличительные признаки могут быть выражены числовым значением для каждого изображения предметного стекла, сгенерированным из совмещенных гистограмм извлеченных признаков, как указано выше. На стадии обучения, иерархическую агломеративную кластеризацию применяют к отличительным признакам изображений предметного стекла из библиотеки контрольных изображений с известными наборами данных, такими как предметные стекла образцов Дьюк (Markert Lab), Принудительная деградация (СТ2) и Производство (СТ2). В варианте реализации кластеризация также включает осуществление статистического анализа для определения предельного верхнего значения, на котором кластеры подлежат разделению на группы, для обеспечения статистической значимости между изображениями предметного стекла в пределах каждой группы. На стадии классификации неизвестные образцы классифицируют посредством совместной кластеризации с изображениями предметного стекла из библиотеки. Затем неизвестные образцы классифицируют на основании группы в пределах кластера, в которой осуществляют совместную кластеризацию неизвестных образцов.

[0144] На фиг. 7 ниже показано приведенное в качестве примера представление отличительных признаков, сгенерированных для изображений предметного стекла. Как указано выше, отличительные признаки являются количественными выражениями лежащих в основе признаков ядер в пределах изображения.

[0145] На фиг. 8 ниже показано приведенное в качестве примера представление необработанного вывода из этапа кластеризации, который включает данные из образцов ткани, предоставленные Университетом Дьюка.

[0146] В варианте реализации этап кластеризации может включать разделение кластера на группы. Затем следует вычислить верхнее предельное значение, с помощью которого будет осуществляться разделение статистически значимым способом. В варианте реализации верхнее предельное значение вычисляют посредством системного увеличения некоторого верхнего предельного значения при помощи соответствующего многомерного дисперсионного анализа («MANOVA») между и среди группирований, и выбранное верхнее предельное значение минимизирует количество групп, при этом увеличивая статистическую значимость различий в отличительных признаках между популяциями групп. В приведенном в качестве примера экспериментальном анализе, в котором ткань представляла собой ткань тимуса, а извлеченные признаки включали площадь, периметр, интегральную плотность и округлость, верхнее предельное значение (например, 0,4) было определено путем сегментации кластеров, что привело к разделению кластеров на определенное количество групп (например, 9).

[0147] В приведенном в качестве примера экспериментальном анализе после образования групп им было присвоено значение положительной контрольной группы, если популяция образцов в пределах группы состояла из изображений предметного стекла из образцов, которые ранее были определены как такие, что удовлетворяют критериям активности (т.е. «хорошие» образцы, имеющие удовлетворительную классификацию). Примеры этих групп включают наборы данных Дьюк и Производство. Группам присваивали значение отрицательной контрольной группы, если популяция образцов в пределах группы состояла из предметных стекол, которые ранее были определены как такие, что не удовлетворяют критериям активности (т.е. «плохие» образцы, имеющие неудовлетворительную классификацию). Примеры этих групп включали набор данных принудительной деградации.

[0148] На фиг. 9 ниже показан приведенный в качестве примера результат этапа группирования во время стадии обучения.

[0149] На фиг. 9 изображено несколько положительных и отрицательных контрольных групп, кластеризованных на основании изображений ткани тимуса на предметном стекле. В таком варианте реализации единственный критерий активности удовлетворительно/неудовлетворительно может отсутствовать. Вместо этого несколько признаков могут различать образцы и могут рассматриваться на предмет активности. Среди положительных контрольных групп может быть больше вариативности на основании вариативности в изображениях предметного стекла, например, в области, из которой был взят срез, и в размере ткани. Например, срезы, взятые с разных областей более сложной ткани, такой как ткань тимуса, будут иметь разные кортикомедуллярные соотношения (например, распределение тимоцитов, эпителиальных ретикулярных клеток и количество телец Гассаля), но все равно могут удовлетворять удовлетворительным критериям активности.

[0150] В варианте реализации следующее описание контрольных групп на фиг. 9 является исключительно иллюстративным и предназначено для иллюстрации возможных общих признаков изображений предметного стекла, которые приводят к образованию соответствующих контрольных групп. Контрольные группы могут быть образованы на основании других признаков или сочетания признаков в пределах изображений предметного стекла, содержащихся в них. В примере по фиг. 9, первая отрицательная контрольная группа на фиг. 9 («neg.ctrl.1») была сгруппирована на основании наличия телец Гассаля, слабо выраженных медуллярной и кортикальной областей, а также обширного некроза и фиброза. Вторая отрицательная контрольная группа на фиг. 9 («neg.crtl.2») была сгруппирована на основании минимального наличия или отсутствия телец Гассаля, фиброза и некроза, а также слабо выраженных медуллярной и кортикальной областей. Третья отрицательная контрольная группа на фиг. 9 («neg.crtl.3») была сгруппирована на основании минимального наличия или отсутствия телец Гассаля, фиброза и некроза, а также слабо выраженных медуллярной и кортикальной областей.

[0151] Относительно положительных контрольных групп, изображенных на фиг. 9, в этом примере первая контрольная группа на фиг. 9 («pos.crtl.1») была сгруппирована на основании отсутствия выраженной кортикальной области и медуллярной области, наличия телец Гассаля и от низкого до нормального количества лимфоцитов. Вторая контрольная группа на фиг. 9 («pos.crtl.2 была сгруппирована на основании наличия нормальных эпителиальных клеток, нормальных кортикальной и медуллярной областей, наличия телец Гассаля и лимфоцитов с нормальными изменениями зрелых Т-клеток. Третья контрольная группа на фиг. 9 («pos.crtl.3») была сгруппирована на основании нормальных эпителиальных клеток, нормальных кортикальной и медуллярной областей, наличия телец Гассаля и лимфоцитов с нормальными изменениями зрелых Т-клеток. Четвертая контрольная группа на фиг. 9 («pos.crtl.4») была сгруппирована на основании низкого количества лимфоцитов, переменного содержания медуллярной и кортикальной областей, наличия некроза, отходящего от медуллярной области в кортикальную для некоторых тканей, и варьирования эпителиальных клеток от отсутствия до наличия. Пятая контрольная группа на фиг. 9 («pos.crtl.5») была сгруппирована на основании нормальных кортикальной и медуллярной областей, наличия телец Гассаля, нормального распределения тимоцитов, а также лимфоцитов с нормальными изменениями зрелых Т-клеток. Шестая контрольная группа на фиг.9 («pos.crtl.6») была сгруппирована на основании минимального наличия или отсутствия телец Гассаля, отсутствия идентификации для кортикальной и медуллярной областей, а также высокого содержания фиброзной ткани. Альтернативные техники кластеризации настоящего изображения раскрыты в Примерах настоящего описания.

[0152] На таблицах 2 и 3 ниже изображены приведенные в качестве примера результаты статистического анализа образования групп после осуществления анализа совместной кластеризации. В варианте реализации осуществляют многомерный дисперсионный анализ («MANOVA»). На таблице 2 показано, что группы, основанные на анализе совместной кластеризации, обеспечивали популяции между кластеризованными группированиями, которые существенно отличались друг от друга.

[0153] На фиг. 10 дополнительно показаны приведенные в качестве примера результаты статистического анализа различий между популяциями в пределах каждой сегментированной группы по таблице 2. На фиг. 10 изображено, что популяция изображений предметного стекла в пределах каждой группы существенно не изменялась, что указывает на то, что эти изображения предметного стекла имеют общие отличительные признаки.

[0154] Таблица 3 показывает, что группы случайно сгенерированных групп (т.е. без осуществления совместной кластеризации) не привели к существенной статистической значимость между популяциями каждой группы.

[0155] В варианте реализации после стадии обучения классификатор установил сегментированные группирования изображений предметного стекла из библиотеки. Группирования разделены на положительные контрольные группы и отрицательные контрольные группы, при этом положительные контрольные группы содержат изображения предметного стекла, которые ранее были определены как кандидаты для трансплантации (т.е. удовлетворительная классификация), а отрицательные контрольные группы содержат изображения предметного стекла, которые ранее были определены как такие, что не являются кандидатами для трансплантации (т.е. неудовлетворительная классификация).

[0156] На стадии классификации изображение образца на предметном стекле, подлежащее классификации, анализируют для оценки активности ткани в изображении предметного стекла. Изображение предметного стекла обрабатывают для подготовки к анализу. В варианте реализации это включает преобразование изображения в бинарное изображение. Далее осуществляют обнаружение признаков. В варианте реализации гематоксилиновый канал (т.е. ядра) извлекают из изображения предметного стекла. Для извлеченного канала определяют признаки. Отличительный признак генерируют на основании признаков извлеченного канала. В варианте реализации отличительный признак может быть выражен гистограммой, как показано на фиг. 8 выше. В другом варианте реализации отличительный признак генерируют из признаков площади, периметра, интегральной плотности и округлости извлеченного канала.

[0157] Затем сгенерированный отличительный признак могут сравнивать с отличительными признаками положительных и отрицательных контрольных групп, которые были сгенерированы во время стадии обучения. В варианте реализации этап сравнения включает совместную кластеризацию сгенерированного отличительного признака с отличительными признаками положительных и отрицательных контрольных групп.

[0158] После совместной кластеризации могут осуществлять статистический анализ (например, «MANOVA») для оценки сформированных кластеров с целью определения, соотносятся ли сгенерированные кластеры отличительных признаков статистически значимым образом с какой-либо из положительных или отрицательных контрольных групп. Если результат статистического анализа указывает на отсутствие статистически значимой кластеризации, или указывает на то, что сгенерированные отличительные признаки кластеризуются с отрицательной контрольной группой, изображение предметного стекла либо считают таким, что не прошло критерии активности, и может быть ассоциировано с неудовлетворительной классификацией, либо его могут качественно оценить для распределения. Если результаты статистического анализа указывают на кластеризацию с положительной контрольной группой, изображение предметного стекла считают таким, что прошло критерии активности, и может быть ассоциировано с удовлетворительной классификацией.

[0159] На фиг. 11 ниже показана функциональная схема примера анализа изображения предметного стекла. В варианте реализации функциональная схема реализована классификатором, который осуществляет описанные выше этапы. Изображение предметного стекла может быть сначала оценено для определения того, является ли изображение подходящим для анализа во время этапа классификации. Если нет, изображение предметного стекла исключают и определяют его таким, что не удовлетворило требованиям пригодности для анализа. Если изображение предметного стекла соответствует необходимым требованиям пригодности, изображение предметного стекла не исключают и осуществляют его анализ. Анализ включает по меньшей мере один этап из обработки изображения, извлечения признаков и кластеризации, описанных выше. Результаты теста могут определять кластеризацию отличительного признака изображения предметного стекла с одной из положительных контрольных групп или отрицательных контрольных групп. Как показано на фиг. 11 ниже, при кластеризации с положительной контрольной группой, считается, что изображение предметного стекла соответствует критериям активности, и, следовательно, оно может быть ассоциировано с удовлетворительной классификацией. При кластеризации с отрицательной контрольной группой, считается, что изображение предметного стекла не соответствует критериям активности, и, следовательно, оно может быть ассоциировано с неудовлетворительной классификацией.

[0160] На таблице 4 ниже описаны соответствующие качественные характеристики ткани из изображений предметного стекла в отрицательных контрольных группах и положительных контрольных группах в экспериментальном варианте реализации при применении стадии классификации к библиотеке изображений ткани тимуса на предметном стекле.

[0161] Таблица 5 изображает соотношение характеристик между отрицательными контрольными группами (обозначены Отрицательная 1-5) и положительными контрольными группами (обозначены Положительная 1-6).

[0162] В варианте реализации кластеризация основана на составе и признаках ядер для всех клеток в пределах изображений предметного стекла. Для клеток тимуса тимоциты могут являться сопутствующим фактором для анализа, так как они содержат большинство популяции ядер. Медуллярные и кортикальные тимоциты по-разному влияют на отличительные признаки на основании признаков, используемых для отличительных признаков. Количественные отличия в популяции клеток приводят к количественным отличиям в отличительных признаках, что приводит к отличиям в кластеризации. Состав тимоцита отображает здоровье клетки, так как существенные отклонения в составе указывают на некроз, фиброз и общую деградацию. Кластеризация группирует образцы, которые имеют сходную схему отличительного признака и, следовательно, имеют сходные признаки их популяций клеток. Изображения образцов, отличительные признаки которых статистически существенно отличаются, будут помещены в разные группы.

[0163] Раскрытые варианты реализации для количественного анализа и генерации отличительных признаков обеспечивают возможностью обнаружения классификатором сдвигов в популяции клеток, так как при создании отличительных признаков оценивают каждое обнаруживаемое ядро в изображении предметного стекла. Во время культивирования общее количество тимоцитов в тканях должно уменьшаться. Однако относительная пропорция кортикальных и медуллярных тимоцитов должно оставаться устойчивым. Значимые изменения в этих пропорциях могут указывать на неравномерную деградацию ткани или ставить активность под сомнение. Значимые изменения в популяции клеток будут обнаружены как сдвиг в количественных отличительных признаках. Значимое изменение в соотношении кортикальных-медуллярных тимоцитов (увеличение или уменьшение) обеспечит сдвиг в отличительных признаках по направлению к отрицательным контрольным группам и, следовательно, образец будет кластеризован с отрицательными контрольными образцами.

[0164] На фиг. 12A-12D показаны моделированные примеры использования, которые могут изображать приведенные в качестве примера отличительные признаки на основании некоторых извлеченных признаков изображения ткани тимуса на предметном стекле. На фиг. 12А показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для площади ядра. На фиг. 12В показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для периметра ядра. На фиг. 12С показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для интегральной плотности ядра. На фиг. 12D показано отличие между изображениями предметного стекла, ассоциированными с положительной и отрицательной контрольными группами в отличительных признаках, сгенерированных для округлости ядра.

[0165] На фиг. 13А показаны отличительные признаки из приведенного в качестве примера применения классификатора к приведенному в качестве примера изображению ткани тимуса на предметном стекле, ассоциированного с отрицательной контрольной группой, и приведенному в качестве примера изображению ткани тимуса на предметном стекле, ассоциированного с положительной контрольной группой. Отличительные признаки, включая признаки площади и интегральной плотности, изображают отличия в кортикальных тимоцитах между отрицательной контрольной группой изображений предметного стекла и положительной контрольной группой изображений предметного стекла.

[0166] В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения способы осуществления количественного гистопатологического анализа неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле и способы обучения классификатора ткани для осуществления количественных гистопатологических анализов могут быть осуществлены следующим приведенным в качестве примера образом.

[0167] Период времени культивирования для ткани, подлежащей исследованию, выбирают на основании результатов, которые заключаются в положительных клинических результатах после имплантации желаемого тканеинженерного продукта. Касательно аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, период времени культивирования позволяет обеднять ткань тимоцитами путем их вымывания из ткани и/или посредством апоптоза. ЭКТ в культивированной ткани тимуса по существу поддерживают на протяжении времени культивирования.

[0168] Анализ исследует образец, полученный на 5-9 день культуры, для оценки пригодности культивированной ткани тимуса для выпуска и пригодности для трансплантации. Чтобы способствовать лучшему пониманию продукта и для лучшей оценки распознавательных способностей анализа, образцы отбирают между 1 и 21 днем и позже, данные о которых могут оценивать для определения явной тенденции.

[0169] Например, партии клинических образцов культивированной ткани тимуса и деградированной ткани тимуса могут исследовать на предмет гистопатологических признаков, таких как площадь, периметр, интегральная плотность и округлость. Исследуют общую тенденцию в количестве обнаруженных ядер, и ожидается, что оно будет уменьшаться со временем по мере вымывания тимоцитов из тканей или их апоптоза. Эти данные затем нормализуют для площади такни, так как разные срезы из разных партий исследуют в разные дни. Размер среза ткани может отличаться от среза к срезу и может обуславливать переменчивость в наборе данных, но в более поздние дни культуры может наблюдаться общая отрицательная тенденция с визуальным пошаговым изменением в данных приблизительно на День 10. Предыдущие данные показали, что большая часть тимоцитов были обеднены ранее в периоде культивирования по сравнению с уменьшением в общем количеством клеток. Культивированные образцы ткани могут затем анализировать в исследованиях временной динамики для оценки, например, межтканевой переменчивости. В иллюстративных целях будет описан процесс оценки межтканевой переменчивости ткани тимуса. Он будет включать оценку эпителиальных клеток тимуса и тимоцитов. Данные, полученные на этапе межтимусной переменчивости, будут подвергать иерархическому кластерному анализу. После установления обучающего набора данных будет определен анализ культивированной ткани тимуса по группам. Эти данные сравнят с данными, полученными в исследовании принудительной деградации ткани, и/или путем сравнения определения по группам с s набором данных, ассоциированным с неудовлетворительными образцами, имеющими отрицательные клинические результаты.

[0170] Общий вид ткани и, следовательно, гистологические предметные стекла изменяются на протяжении выбранного периода культивирования, например, на 0, 5, 9, 12 и 21 день, для культивированной ткани тимуса. Аналогично в изображении культурированной ткани тимуса, по мере вымывания тимоцитов из культивированной ткани тимуса. На 5-й, 9-й, 12-й и 21-й день ткань демонстрирует заметное снижение интегральной плотности и профиль, более похожий на профиль эпителиальных клеток тимуса. Количество клеток с очень высокой округлостью уменьшается со временем на протяжении процесса культивирования. Вероятно, это связано с апоптозом, который приводит к менее круглыми ядрам, а также с вымыванием очень круглых тимоцитов. Для образцов в День 0 с более низкой округлостью это, вероятно, связано с нагромождением тимоцитов, измеряемых как единое целое с более низкой округлостью, чем одно ядро. В День 0 присутствует большая пропорция клеток с высокими значениями периметра, что вероятно вследствие нагромождения клеток, считываемого программой как одна форма, что приводит к высоким значениям периметра. Увеличение периметра, вероятно, связано с сочетанием вымывания тимоцитов, апоптоза клеток в течение времени культивирования и результирующим увеличением значения периметра от указанного события. В целом, характеристики ядер в течение времени культивирования совпадают с теоретическими ожиданиями для тенденций. Большая часть явных сдвигов в данных происходит до дней запланированного выпуска партий. На основании этого можно предположить, что многие изменения происходят в ранние дни культуры, после которых обеспечивается возможность поддержания среды до 21 дня. Это способствует обнаружению действительных тенденций посредством анализа в популяциях клеток и их изменений с течением времени.

[0171] Межтимусную переменчивость исследуют, чтобы лучше понимать, есть ли сходство в образцах между тимусами. Межтимусную переменчивость могут оценивать подобно внутритимусной переменчивости, в которой исследуемые образцы были отобраны из одного дня, но вместо ограничения одним тимусом, оценка включает образцы из разных партий. Евклидово расстояние каждого образца может быть вычислено до центральной точки всех образцов в пределах изолированного набора данных. Затем к расстояниям к центру для тимуса применяют дисперсионные анализы («ANOVA»). Такой анализ применяют к образцам в Дни 5 и 9. Межтимусную переменчивость могут исследовать, чтобы лучше понимать, есть ли сходство в образцах между тимусами. Для каждого тимуса генерируют 95% доверительные интервалы на каждый день. Проводится более конкретный анализ только эпителиальных клеток тимуса, чтобы помочь охарактеризовать аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса. Предполагается, что эпителиальные клетки тимуса имеют решающее значение для механизма действия аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Патолог отбирает ядра для клеток, идентифицированных как эпителиальные клетки тимуса. Ядра эпителиальных клеток тимуса отличаются от других клеток в тканевой популяции. ЭКТ в целом имеют больший размер и характеризуются наличием ядрышка, которое выглядит как более темная пурпурная точка внутри центра более светлого пурпурного наружного ядра. Известные маркированные клетки затем извлекают как отдельные точки данных из программного обеспечения. С использованием этих данных может быть разработан фильтр для обеспечения возможности осуществлять выполнение этапов в последовательном порядке. Два фильтра размера удаляют любые клетки за пределами окна диапазона размера как до, так и после разделения сросшихся клеток. Были осуществлены следующие фильтрующие этапы.

[0172] Наиболее темные клетки убирают из набора данных путем определения порога включения ниже наиболее темных пикселей. Затем убирают клетки, имеющие площадь меньше 50 мкм². Пробелы заполняют и применяют переломное значение для разделения сросшихся клеток. Клетки за пределами диапазона 30-250 мкм² и с округлостью <0,75 затем отсеивают из набора данных. Описанные выше фильтры позволяют осуществлять анализ изображений с наборами данных, сгенерированными и ограниченными для характеристики ЭКТ. При исследовании общей пропорции клеток в ткани за продолжительность периода культивирования наблюдается общее увеличение количества ЭКТ. Увеличение количества ЭКТ по мере вымывания тимоцитов из ткани обусловлено тем, что большее количество остающихся клеток являются ЭКТ. Описанный выше анализ ЭКТ также обеспечивает лучший вид тенденций вымывания тимоцитов из ткани на протяжении всего периода культивирования. Подобный анализ может быть выведен из данных о том, что количество тимоцитов уменьшается в процессе культивирования при увеличении пропорции ЭКТ. Описанные выше данные могут быть использованы для изображения образцов, поделенных на группы. Группы генерируют путем иерархического кластерного анализа. Этот анализ систематически и статистически определяет образцы с подобными характеристиками путем итеративного группирования данных на основании сходств, в результате обеспечивая значимые кластеры данных сходных свойств (также именуемые «группами»). Процесс группирования клеток требовал выполнения следующих этапов:

[0173] Вычисление расстояния между группами. Расстояние является измерением сходства между группами. Вычисляют стоимость объединения двух групп. В этом случае стоимость представляет собой степень ошибки, добавляемую в результате объединения групп. Группы, которые имеют наименьшую стоимость слияния, объединяют. Процесс повторяют до тех пор, пока все данные не будут объединены в одну группу. Полученный в результате набор данных по существу показывает древовидную диаграмму того, насколько образцы являются «родственными» или подобными друг другу. Высота между ветками показывает степень родства двух групп друг с другом. Расстояние на горизонтальной оси х не указывает на какое-либо более близкое отношение при нанесении на график. Образцы в пределах каждой группы считаются статистически подобными, а образцы в разных группах считаются статистически разными.

[0174] Для определения нахождения предельного верхнего значения между разными группами может быть использован график собственных значений («Scree Plot») для исследования того, где расстояния между группами являются наиболее значимыми. Это исключает чрезмерное влияние минимальных различий между образцами на алгоритм. Слишком малые различия приведут к более вероятному разбиванию будущих образцов на независимые группы, так как образцы должны быть слишком сходны для совместной кластеризации, чем это реально для аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Альтернативно, группы должны иметь подходящее верхнее предельное значение, чтобы обеспечивать наличие дифференциации между образцами. В случае аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, существует высокая вероятность неоднородности вследствие природы ткани и переменчивости от парии к парии, которая может проявиться. Подходящий уровень дифференциации может быть определен путем исследования образцов, которые показали предшествующие положительные клинические результаты (здесь определенные выживанием) и сравнения с тканями, которые были подвергнуты деградации.

[0175] Может быть выбран обучающий набор, который содержит наибольшее количество информации касательно клинических результатов. Изначально включены образцы из различных научно-исследовательских исследований, а также множество условий принудительной деградации и клинических образцов. Эти данные могут быть кластерированы в хорошие и плохие группы. Обучающий набор может считаться наиболее информативным, если он ограничен известными «хорошими» и известными «плохими» образцами, которые представляют будущие оперативные образцы, подлежащие анализу для выпуска партии. Этот этап ограничивает образцы следующим образом.

[0176] Образцы могут быть удалены, если они были выбраны не из средней точки или Дня 5-9 периода культивирования. В примере аллогенной культивированной ткани, полученной из ткани тимуса, в этот момент могут быть взяты оперативные образцы для выпуска партии на основании количественной гистологии. Образцы могут быть также удалены, если они были из научно-исследовательских партий, которые считаются типичными, но ассоциированные клинические результаты для исследования отсутствуют. Кроме того, образцы могут быть удалены, если они были ассоциированы с отрицательными клиническими результатами. Образцы могут быть также удалены из плеча принудительной деградации, если ортогональные способы не смогли подтвердить деградацию.

[0177] Базовые данные могут группировать, чтобы лучше понимать, какие базовые признаки приводят к различным кластерам. Группы могут быть ассоциированы с положительными клиническими результатами и принудительно деградированными образцами и/или тканями, ассоциированными с отрицательными клиническими результатами. Разные параметры могут лежать в основе дифференциации групп с положительными клиническими результатами (например, площадь среднего размера, высокая округлость и большой периметр) от принудительно деградированных образцов и/или отрицательных клинических результатов.

[0178] Например, группа может быть охарактеризована большей пропорцией ядер, имеющих большие значения периметра, большие значения интегральной плотности и большую площадь с низкой округлостью. Это может быть обусловлено наличием нагромождений ядер, которые могут быть считаны программным обеспечением как независимые клетки. Это было бы более вероятно в тканях, которые все еще имеют большее количество тимоцитов в ранние дни периода культивирования.

[0179] Могут быть определены дополнительные группы, которые имеют положительные клинические результаты. Например, группы могут быть обозначены наличием больших количеств клеток с высокими значениями округлости и/или большей площадью в сравнении с другими группами и/или средней интегральной плотностью. Эти значения являются ожидаемыми для здоровых жизнеспособных тканей в середине периода культивирования. Гистограммы измерений площади, округлости, интегральной плотности и периметра могут быть составлены из данных.

[0180] Для сравнения могут проводить исследование с принудительной деградацией, в котором образцы помещают обратно в среду органа тимуса (thymus organ medium, «ТОМ») до удаления образцов в День 5 и 9. Это показывает то, насколько устойчив аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса, к изменениям в условиях производственного процесса. Не любое условие культивирования может вызывать деградацию, которая может быть обнаружена любыми используемыми средствами. Считается, что эти условия не наносят ткани необратимое повреждение, приводя ее в нефункциональное или нежизнеспособное состояние. Как и ожидается, деградированные образцы содержат высокие пропорции клеток с более низкой округлостью, малой площадью и большими значениями периметра. Это показывает клетки, которые больше не могут поддерживать жизнеспособность и, следовательно, претерпели изменения в морфологии и уменьшение со сморщенными краями. Для отображения подобности внутри группы исследуют анализ переменчивости для каждой группы; могут быть определены «хорошая» и «плохая» (удовлетворительно/неудовлетворительно) классификации. Анализ образцов ткани, ассоциированных с удовлетворительными и неудовлетворительными характеристиками, могут быть оценены с использованием вышеуказанных этапов.

[0181] Примеры.

[0182] Аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса (например, «RVT-802») обычно культивируют от 12 дней до 21 дня перед имплантацией в реципиента. Было исторически показано, что этот период времени культивирования приводит к положительным клиническим результатам после имплантации тканеинженерного продукта. Не ограничиваясь теорией, считается, что этот период времени культивирования позволяет обеднять ткань тимоцитами либо путем их вымывания из ткани, либо посредством апоптоза. Эпителиальные клетки тимуса поддерживают на протяжении всего времени культивирования.

[0183] Подтвержденный анализ исследует образец, полученный на 5-9 день культуры, для оценки пригодности культивированной ткани тимуса для выпуска. Чтобы способствовать лучшему пониманию продукта и для лучшей оценки распознавательных способностей анализа, образцы, полученные между 1 и 21 днем и позже, пропускали через программу системы программного обеспечения, а полученные в результате данные сравнивали друг с другом для оценки того, какие тенденции являются явными.

[0184] На фиг. 14A-14D показаны три партии клинических образцов культивированной ткани тимуса (фиг. 14А-14С) и образец деградированной ткани тимуса. Четыре признака - площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14А, составляли: площадь=11,34; округлость=0,696; периметр=14,310 и интегральная плотность=1889,2. Четыре признака площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14В, составляли: площадь=11,41; округлость=0,993; периметр=11,982 и интегральная плотность=1912,4. Четыре признака - площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14С, составляли: площадь=10,53; округлость=0,846; периметр=12,510 и интегральная плотность=1707,4. Четыре признака - площадь, периметр, интегральная плотность и округлость для образца, изображенного на фиг. 14D, составляли: площадь=13,0; округлость=0,352; периметр=21,556 и интегральная плотность=1786,0. Единственное ядро в каждом изображении обозначено кругом.

[0185] Также исследовали общую тенденцию в количестве обнаруженных ядер, и ожидается, что оно будет уменьшаться со временем по мере вымывания тимоцитов из тканей или их апоптоза, что показано на фиг. 15. Эти данные нормализовали для площади ткани, так как разные срезы из разных партий исследовали в разные дни; размер среза ткани может отличаться от среза к срезу и может обуславливать переменчивость в наборе данных, но в более поздние дни культуры наблюдалась общая отрицательная тенденция с визуальным пошаговым изменением в данных приблизительно на день 10. Предыдущие данные показали, что большая часть обеднения тимоцитами происходит ранее в периоде культивирования по сравнению с уменьшением общего количества клеток, показанным ниже.

[0186] Пример 1. Исследования временной динамики культивированной ткани тимуса

[0187] Общий вид ткани и, следовательно, гистологические предметные стекла изменяются на протяжении периода культивирования. Изображения, показанные на фиг. 16А-В, 17А-В, 18А-В, 19А-В и 20А-В показывают отличия в виде культивированной ткани тимуса в предметных стеклах с окрашиванием гематоксилином-эозином на разных временных интервалах, а именно, в День 0, 5, 9, 12 и 21. Изображения представлены с 40-кратным увеличением. Дни для этих изображений и дальнейшего анализа были выбраны из дней, которые были идентифицированы как важные с точки зрения процесса производства. День 0 выражает поступающую ткань. Гистологию на День 0 отбирают с целью опознания. Гистологические образцы Дней 0 и 5-9 были фиксированы формалином и отправлены в патологоанатомическую лабораторию для заливки в парафин и приготовления срезов. Срезы были окрашены и оценены патологом, сертифицированным министерством здравоохранения.

[0188] На фиг. 21А-21Е показаны изображения культивированной ткани тимуса, окрашенной гематоксилин-эозин, в Дни 0, 5, 9, 2 и 21, на которых изображены изменения во внешнем виде ядер в День 0, 5, 9, 12 и 21. На фиг. 21А показана высокая пропорция ядер, имеющих более высокую интегральную плотность, которая указывает на большое количество тимоцитов. Поскольку тимоциты вымываются из ткани, на День 5 (фиг. 21В), 9 (фиг. 21С), 12 (фиг. 21D) и 21 (фиг. 21Е), ткань демонстрирует заметное снижение интегральной плотности и профиль, более похожий на профиль эпителиальных клеток тимуса.

[0189] На фиг. 22 показана временная динамика определений интегральной плотности из технических партий аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. По мере вымывания тимоцитов из ткани, на День 5 ткань демонстрирует заметное снижение интегральной плотности и профиль, более похожий на профиль эпителиальных клеток тимуса. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0190] На фиг. 23 показаны измерения округлости. Количество клеток с очень высокой округлостью уменьшается со временем на протяжении процесса культивирования. Вероятно, это связано с апоптозом, который приводит к менее круглыми ядрам, а также с вымыванием очень круглых тимоцитов. Для образцов в День 0 с более низкой округлостью это, вероятно, связано с нагромождением тимоцитов, измеряемых как единое целое с более низкой округлостью, чем одно ядро. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0191] На фиг. 24 показаны измерения периметра. В День 0 присутствует большая пропорция клеток с высокими значениями периметра, что вероятно вследствие нагромождения клеток, считываемого программой как одна форма, что приводит к высоким значениям периметра. Увеличение периметра, вероятно, связано с сочетанием вымывания тимоцитов, апоптоза клеток в течение времени культивирования и результирующим увеличением значения периметра от указанного события. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0192] На фиг. 25 показано евклидово расстояние (корень квадратный суммы квадратов ошибки между образцом и большого центроида) для измерения сходства между двумя образцами при учете всех четырех исследуемых переменных. Например, чем ниже евклидово расстояние, тем больше сходства два образца имеют друг с другом. Линии ошибки представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения.

[0193] На фиг. 26 показан график основных эффектов и график взаимодействия данных. Данные, показанные на фиг.26, подтверждают, что культивированная ткань тимуса ведет себя подобным образом с течением времени.

[0194] В целом, характеристики ядер в течение времени культивирования совпадают с теоретическими ожиданиями для тенденций. Большая часть явных сдвигов в данных происходит до дней запланированного выпуска партий. На основании этого можно предположить, что многие изменения происходят в ранние дни культуры, после которых обеспечивается возможность поддержания среды до 21 дня. Это способствует обнаружению действительных тенденций посредством анализа в популяциях клеток и их изменений с течением времени.

[0195] Пример 2: Исследование межтимусной переменчивости

[0196] Межтимусную переменчивость исследовали для того, чтобы лучше понимать, есть ли сходство в образцах между тимусами. Межтимусную переменчивость оценивали подобно внутритимусной переменчивости, в которой исследуемые образцы отбирают из одного дня, но вместо ограничения одним тимусом, включены образцы из разных партий. Евклидово расстояние каждого образца было вычислено до центральной точки всех образцов в пределах изолированного набора данных. Затем к расстояниям к центру для тимуса применяли дисперсионные анализы («ANOVA»). Этот анализ применяли к образцам в Дни 5 и 9.

[0197] Межтимусную переменчивость исследовали для того, чтобы лучше понимать, есть ли сходство в образцах между тимусами. Межтимусную переменчивость оценивали подобно внутритимусной переменчивости, в которой исследуемые образцы отбирают из одного дня, но вместо ограничения одним тимусом, включены образцы из разных партий, евклидово расстояние каждого образца было вычислено до центральной точки всех образцов в пределах изолированного набора данных. Затем к расстояниям к центру для тимуса применяли дисперсионные анализы («ANOVA»). Этот анализ применяли к образцам в Дни 5 и 9.

[0198] В таблице 6 ниже обнаруживаемые отличия между партиями в День 9 отсутствуют. Присутствуют незначительные статистические отличия между тимусами в День 5. Сложно установить, приводят ли они к практическим различиям, которые приводят к различиям в качестве продукта. Для оценки этого другим образом, для каждого тимуса генерировали 95% доверительные интервалы на каждый день. Как показано на фиг. 27, партия MFG- 058 не перекрывается с доверительными интервалами для других тканей в День 5, но перекрывается к Дню 9. Эта партия была изготовлена типичным для других партий образом и не было обнаружено никаких отличий посредством макроскопического гистологического исследования в любой из этих дней. Другими словами, вероятно, что это продукт чувствительности способа к незначительным изменениям в распределении ядер между тканями.

[0199] Пример 3: Анализ эпителиальных клеток тимуса

[0200] Был проведен более конкретный анализ только эпителиальных клеток тимуса, чтобы помочь охарактеризовать аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса. Предполагается, что эпителиальные клетки тимуса имеют решающее значение для механизма действия аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Изображения были отправлены патологу. Патолог отобрал ядра для клеток, идентифицированных как эпителиальные клетки тимуса (см. фиг. 28А-В). Ядра эпителиальных клеток тимуса отличаются от других клеток в тканевой популяции. ЭКТ в целом имеют больший размер и характеризуются наличием ядрышка, которое выглядит как более темная пурпурная точка внутри центра более светлого пурпурного наружного ядра на фиг. 28А-В.

[0201] Известные маркированные клетки извлекли как отдельные точки данных из программного обеспечения. С использованием этих данных был разработан фильтр для обеспечения возможности осуществлять выполнение этапов в последовательном порядке. Два фильтра размера удаляют любые клетки за пределами окна диапазона размера как до, так и после разделения сросшихся клеток. Были осуществлены следующие фильтрующие этапы.

[0202] Наиболее темные клетки были убраны из набора данных путем определения порога включения ниже наиболее темных пикселей (включены пиксели от 100-130 до 150-180 интенсивности пикселей, зависящей от интенсивности окрашивания).

[0203] Клетки с площадью меньше 50 мкм² были удалены.

[0204] Пробелы заполнили, для разделения сросшихся клеток применили переломное значение.

[0205] Клетки за пределами диапазона 30-250 мкм² и с округлостью <0,75 были отсеяны из набора данных.

[0206] Описанные выше фильтры позволили осуществить анализ изображений с наборами данных, сгенерированными и ограниченными для характеристики ЭКТ. При исследовании общей пропорции клеток в ткани за продолжительность периода культивирования наблюдается общее увеличение количества ЭКТ. Увеличение количества ЭКТ по мере вымывания тимоцитов из ткани обусловлено тем, что большее количество остающихся клеток являются ЭКТ. Это изменение может быть визуализировано на фиг. 30: Соотношение ЭКТ к общему количеству клеток из предметных стекол с окрашиванием гематоксилином-эозином. Эти определения также показывают, что ЭКТ поддерживают на протяжении всего периода культивирования, как и требуется для эффективности продукта. Такую же тенденцию можно наблюдать при нормализации для площади ткани, как показано на фиг. 31. Данные для классификации и извлечения ЭКТ из набора анализа были получены из одного образца в день и подвержены переменчивости от образца к образцу.

[0207] Пример 4: Анализ тимоцитов

[0208] Анализ ЭКТ по Примеру 3 также обеспечивает лучший вид тенденций вымывания тимоцитов из ткани на протяжении всего периода культивирования. Подобный анализ не проводили для тимоцитов, но из вышеизложенных данных может следовать, что количество тимоцитов уменьшается в процессе культивирования при увеличении пропорции ЭКТ. Это изменение может быть также визуализировано на изображениях предметных стекол с окрашиванием гематоксилином-эозином при увеличении в несколько раз (см. фиг. 16-21, например). Тимоциты в этих изображениях представляют собой меньшие темные пурпурный ядра. На изображениях Дня 0 по фиг. 16А и 16В они присутствуют в большом количестве, а ко Дню 5 наблюдается их значительное уменьшение, как показано на фиг. 17А и 17В. Это было отмечено в многих патологических отчетах, а также в анализе цитокинов и хемокинов L-селектина, маркера тимоцитов (REP-016). Общие тенденции данных также подтверждают этот анализ с использованием количественного анализа, как описано выше.

[0209] Пример 5: Иерархический кластерный анализ

[0210] Данные, представленные в примерах 1-4, показывают образцы, разделенные на 4 группы, как показано на фиг. 32. Группы, изображенные на фиг. 32, были сгенерированы посредством иерархического кластерного анализа. Этот анализ систематически и статистически определяет образцы с подобными характеристиками путем итеративного группирования данных на основании сходств, в результате обеспечивая значимые кластеры данных сходных свойств (также именуемые «группами»). Процесс группирования клеток требовал выполнения следующих этапов:

[0211] Вычисление расстояния между группами. Расстояние является измерением сходства между группами.

[0212] Вычисляют стоимость объединения двух групп. В этом случае стоимость представляет собой степень ошибки, добавляемую в результате объединения групп.

[0213] Группы, которые имеют наименьшую стоимость слияния, объединяют.

[0214] Процесс повторяют до тех пор, пока все данные не будут объединены в одну группу.

[0215] Полученный в результате набор данных по существу показывает древовидную диаграмму того, насколько образцы являются «родственными» или подобными друг другу. Высота между ветками показывает степень родства двух групп друг с другом. Расстояние на горизонтальной оси х не указывает на какое-либо более близкое отношение. Обратимся к фиг. 32 для иллюстрации этого. На фиг. 32 показана древовидная кластерная схема, изображающая расстояние между группами «С» и «D», в качестве примера. Выделенные зеленые и красные прямоугольники обозначают группирования по одному признаку. Это основано на предельном верхнем значении оси у, составляющем 0,43. В этом примере группы С и D находятся на расстоянии 0,6 и, следовательно, считаются двумя отдельными группами. Образцы в пределах каждой группы считаются статистически подобными, а образцы в разных группах считаются статистически разными.

[0216] Для определения нахождения предельного верхнего значения между разными группами может быть использован скрининговый график («Screen Plot») для исследования того, где расстояния между группами являются наиболее значимыми. Это исключает чрезмерное влияние минимальных различий между образцами на алгоритм. Слишком малые различия приведут к более вероятному разбиванию будущих образцов на независимые группы, так как образцы должны быть слишком сходны для совместной кластеризации, чем это реально для аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса. Альтернативно, группы должны иметь подходящее верхнее предельное значение, чтобы обеспечивать наличие дифференциации между образцами. В случае аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, существует высокая вероятность неоднородности вследствие природы ткани и переменчивости от парии к парии, которая может проявиться. Подходящий уровень дифференциации может быть определен путем исследования образцов, которые показали предшествующие положительные клинические результаты (здесь определенные выживанием) и сравнения с тканями, которые были подвергнуты деградации.

[0217] Пример 6: Определение обучающего набора

[0218] В предпочтительном варианте реализации был выбран обучающий набор, содержащий наибольшее количество информации, относящейся к клиническим результатам. Изначально были включены образцы из различных научно-исследовательских исследований, а также множество условий принудительной деградации и клинических образцов. Это обеспечило кластеризующий анализ, который включал много хороших и плохих групп (см. фиг. 33). После дальнейшего развития анализа было установлено, что обучающий набор был бы наиболее информативным, если бы он ограничивался известными «хорошими» и известными «плохими» образцами, которые представляют будущие оперативные образцы, подлежащие анализу для выпуска партии. Это ограничивает образцы следующим образом.

[0219] Образцы были удалены, если они были выбраны не из средней точки или Дня 5-9 периода культивирования. В этот момент будут взяты оперативные образцы для выпуска партии на основании количественной гистологии.

[0220] Образцы удаляли, если они были из научно-исследовательских партий, которые считаются типичными, но ассоциированные клинические результаты для исследования отсутствуют.

[0221] Образцы удаляли, если они были ассоциированы с отрицательными клиническими результатами. Эти образцы не считали «плохими», так как они были выпущены из оборудования на основании качественного гистологического анализа в применении, и не было случаев, в которых считалось, что сама партия обуславливала клинические результат. Эти случаи удаляли из-за отсутствия подтверждения, что они были успешны.

[0222] Образцы удаляли из плеча принудительной деградации, если ортогональные способы не смогли подтвердить деградацию. Эти образцы были исследованы патологом, а также образцы отработанной среды были исследованы на цитокины и хемокины, и любой образец, который не был подтвержден как «плохой» посредством другого способа, не включали в итоговый обучающий набор. Было доказано, что аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса, является устойчивым к множеству условий, и анализ не следует искажать для обнаружения случаев, которые все же, вероятно, обеспечат «хорошую» ткань. Условия, которые остались в наборе для анализа, были взяты из образцов, которые были заморожены при температуре -20°С или в которых среда была заменена на 10-кратную концентрацию PBS. Для полного перечисления условий деградации и результатов см. таблицу 7.

[0223] Оставшиеся образцы, которые были использованы в итоговом обучающем наборе, представляют собой образцы, которые либо были выбраны из клинических случаев с доказанным выживанием за 1 год, либо из случаев, которые были подтверждены как деградированные научно-исследовательские ткани. Полученные в результате кластеры показаны на фиг. 33.

[0224] Это изначально привело к пяти кластерам, четыре кластера с клинически хорошими образцами и один кластер с подтвержденными плохими образцами. Один из хороших кластеров содержал только два образца; в нем не было высокой переменчивости и, следовательно, он оказывал бы влияние на модель, создавая сдвиги. Поэтому при исследовании новых образцов, более вероятно, что эти два образца обусловят смещение других кластеров, чтобы обеспечить надлежащее группирование указанных образцов. Для проверки этого предположения исследовали систематическое удаление каждого образца и последующую повторную кластеризацию. Было обнаружено, что любой из этих образцов, взятый отдельно, обусловил бы сдвиг в получаемых в результате образцах. Следовательно, эти образцы удалили. Было определено, что хотя это может приводить к отдельной кластеризации дополнительных образцов, которые подобны этим двум тканям, общий результат будет представлять собой более надежный алгоритм и обучающий набор для сравнения. Эти образцы могут быть использованы в сочетании с будущими образцами для повторной оценки лотков в более поздний день, когда набор данных может быть расширен. Итоговая обучающая библиотека, которая была подтверждена в программном обеспечении, показана на фиг.34.

[0225] Пример 7: Анализ по группам

[0226] Базовые данные для четырех групп, изображенных на фиг. 34, изучали, чтобы лучше понимать, какие базовые признаки приводят к различным кластерам. Группы будут именованы как группы 1, 2, 3 и 4. На древовидной кластерной схеме, упомянутой выше на фиг. 32, показано, какое название группы относится к каждому кластеру, но для дополнительной справки группы 1, 2 и 3 состоят из образцов с положительными клиническими результатами, а группа 4 состоит из принудительно деградированных образцов. Репрезентативные изображения клеток из каждой группы показаны на фиг. 35A-35D. На фиг. 35A-35D показаны репрезентативные изображения для каждой группы кластеров в итоговой библиотеке образцов. Группы 1 (фиг. 35А), 2 (фиг. 35В) и 3 (фиг. 35С) состоят из образцов с положительными клиническими результатами. Группа 4 (фиг.35D) состоит из подтвержденных деградированных образцов. Образец группы 1 взят из LOT-345, образец группы 2 взят из LOT-160, образец группы 3 взят из LOT-194, а образец группы 4 взят из FD.SP17-40348-C1.1 (способ деградации: замораживание при -20°С).

[0227] Графическое отображение всех кластеров рядом друг с другом показано на фиг. 36A-36D. На фиг. 36А показано графическое отображение кластеров данных касательно определений площади. На фиг. 36В показано графическое отображение кластеров данных касательно определений округлости. На фиг. 36С показано графическое отображение кластеров данных касательно определений интегральной плотности. На фиг. 36D показано графическое отображение кластеров данных касательно определений периметра.

[0228] На фиг. 36A-36D показаны репрезентативные изображения для каждой группы кластеров в итоговой библиотеке образцов. Группы 1, 2 и 3 состоят из образцов с положительными клиническими результатами. Группа 4 состоит из подтвержденных деградированных образцов. Образец группы 1 взят из LOT-345, образец группы 2 взят из LOT-160, образец группы 3 взят из LOT-194, а образец группы 4 взят из FD.SP17-40348-С1.1 (способ деградации: замораживание при -20°С).

[0229] Как показано на данных, нанесенных на графики на фиг. 36A-36D, разные параметры могут лежать в основе дифференциации групп с положительными клиническими результатами (например, площадь среднего размера, высокая округлость и большой периметр). Принудительно деградированные образцы также имеют множество заметных отличий от других групп, как показано красными столбцами на графиках. Эти данные показывают, что существует несколько наборов данных, которые обеспечивают хорошие клинические результаты. Могут существовать другие способы, в которых образцы, которые в настоящее время не включены в наборы данных и, следовательно, не были бы кластерированы в какую-либо группу, могут казаться хорошими или плохими.

[0230] Группа 1. Группа 1 представляет собой наибольший кластер. Она состоит из 19 разных тканей с положительными клиническими результатами. Группа 1 характеризуется большей пропорцией ядер, которые имеют большие значения периметра, большие значения интегральной плотности и большую площадь с низкой округлостью. Это, вероятно, обусловлено наличием нагромождений ядер, которые могут быть считаны программным обеспечением как независимые клетки. Это было бы более вероятно в тканях, которые все еще имеют большее количество тимоцитов в ранние дни периода культивирования. При проведении заслепленного исследования образец ткани из Дня 0 кластерировали в группу 1, таким образом подтверждая указанную выше теорию. Хотя, по-видимому, этот анализ не отвергнет клетки, которые имеют большие количества наличия тимоцитов, образцы в группе 1 имели положительные клинические результаты при имплантации в конце периода культивирования.

[0231] На фиг. 37 показано изображение из группы 1 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0232] На фиг. 38 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в группе 1.

[0233] На фиг. 39 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в группе 1.

[0234] На фиг. 40 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в группе 1.

[0235] На фиг. 41 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в группе 1.

[0236] Группа 2

[0237] Группа 2 содержит 10 партий тканей, которые имели положительные клинические результаты. Группы 2 и 3 имеют большие пропорции клеток с высокими значениями округлости. Группа 2 также, по-видимому, имеет клетки с большей площадью по сравнению с группами 3 и 4, а также средней интегральной плотностью. Эти значения являются ожидаемыми для здоровых жизнеспособных тканей в середине периода культивирования, как показано примерами, образующими группу 2. Гистограммы измерений площади, округлости, интегральной плотности и периметра показаны на фиг. 43-46.

[0238] На фиг. 42 показано изображение группы 2 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0239] На фиг. 43 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в группе 2.

[0240] На фиг. 44 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в группе 2.

[0241] На фиг. 45 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в группе 2.

[0242] На фиг. 46 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в группе 2.

[0243] Группа 3.

[0244] Группа 3 состоит из 6 партий, которые продемонстрировали положительные клинические результаты. Подобно группе 2, группа 3 имеет большую пропорцию клеток с высоким значением округлости, что указывает на тимоциты и общую жизнеспособность клеток. Группа 3 имеет наибольшую пропорцию клеток с наименьшей площадью и также интегральную плотность в более низком диапазоне (2-я и 3-я ячейки).

[0245] На фиг. 47 показано изображение из группы 3 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0246] Гистограммы измерений площади, округлости, интегральной плотности и периметра показаны на фиг. 48-51.

[0247] На фиг. 48 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в Группе 3.

[0248] На фиг. 49 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в Группе 3.

[0249] На фиг. 50 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в Группе 3.

[0250] На фиг. 51 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в Группе 3.

[0251] Группа 4.

[0252] Группа 4 состоит из 4 принудительно деградированных образцов. Показанные здесь условия деградации приведены для образцов, которые были заморожены при температуре -20ОС на протяжении 4 часов и образцов, в которых среда культивирования была заменена на 10-кратную концентрацию PBS на протяжении 24 часов. Оба эти условия продемонстрировали значимую деградацию с точки зрения качественной гистологии и значимые изменения при изучении CCL21, биомаркера здоровья ЭКТ. Таблица всех условий принудительной деградации и результаты для каждого способа приведена ниже.

[0253] На фиг. 52 показано изображение из группы 4 с выделенными признаками в пределах Площадь-10 (красный цвет), Округлость-0,9 (зеленый цвет), Периметр-18 (синий цвет) и Интегральная плотность-1500 (желтый цвет). Эти группы в целом показывают наибольшую изменчивость между группами.

[0254] Гистограммы измерений площади, округлости, интегральной плотности и периметра показаны на фиг. 53-56.

[0255] На фиг. 53 показана гистограмма, изображающая измерения площади клеток в группе 4.

[0256] На фиг. 54 показана гистограмма, изображающая измерения округлости клеток в группе 4.

[0257] На фиг. 55 показана гистограмма, изображающая измерения интегральной плотности клеток в группе 4.

[0258] На фиг. 56 показана гистограмма, изображающая измерения периметра клеток в группе 4.

[0259] Пример 8: Исследование с принудительной деградацией

[0260] Исследование с принудительной деградацией проводили в случаях, когда образцы были помещены обратно в среду органа тимуса («ТОМ») до удаления образцов в День 5 и 9. Это показывает то, насколько устойчив аллогенный культивированный продукт, полученный из постнатальной ткани тимуса, к изменениям в условиях производственного процесса. Следует отметить, что нагревание образцов до 55°С не обнаруживалось известным способом традиционной гистологии. Это вероятно вследствие того, что нагревание ткани по существу зафиксировало ее от гистопатологической перспективы. Однако деградация была очевидна из анализа CCL21. Многие из тестируемых условий не вызвали деградацию, обнаруживаемую любыми используемыми средствами. Считается, что эти условия не нанесли ткани необратимое повреждение, приводящее ее в нефункциональное или нежизнеспособное состояние. Существуют средства контроля за производственным процессом для исключения подвергания продукта каким-либо из вышеуказанных условий. Как и ожидается, деградированные образцы содержат высокие пропорции клеток с более низкой округлостью, малой площадью и большими значениями периметра. Это показывает клетки, которые больше не могут поддерживать жизнеспособность и, следовательно, претерпевают изменения в морфологии и уменьшение со сморщенными краями. Условия принудительной деградации исследования показаны в таблице 7.

[0261] Для отображения подобности внутри группы исследовали анализ переменчивости для каждой ячейки. Группа 4 регулярно демонстрировала наивысшее стандартное отклонение в пределах ячейки между образцами в ней. Вероятно, это происходило из-за меньшего количества образцов в этой группе, но при этом меньшая устойчивость не является ожидаемой для ткани во время ее деградации (см. фиг. 57).

[0262] На фиг. 57 показаны графики анализа переменчивости между группами и в их пределах по каждой отдельной ячейке. Данные для параметра представлены на оси х сначала для группы, затем для ячейки. Верхний график для каждого параметра представляет индивидуальные значения, а нижний - стандартное отклонение для данной группы. Оба могут быть использованы для визуализации рассеивания данных.

[0263] Сокращения

[0264] АЕ1/АЕ3: Коктейль из 2 антител, которые вступают в реакцию со всеми цитокератинами, для идентификации эпителиальных клеток.

[0265] CD3: Антитело, которое вступает в реакцию с Т-клетками, включая тимоциты. СК14: Антитело, обнаруживающее только цитокератин 14, компонент клеточного скелета в поднаборе эпителиальных клеток, которые гипотетически имеют потенциал восстановления популяции.

[0266] FFPE: Срезы ткани, фиксированные в формалине и залитые в парафин.

[0267] Н&Е: Гематоксилин и эозин, гистологические окрашивающие вещества, наиболее распространенные в использовании для светолучевой микроскопии срезов тканей млекопитающих.

[0268] Ki-67: Антитело Ki-67 распознает Ki-67 антиген, белок, связываемый с клеточной пролиферацией.

[0269] ТЕС: Эпителиальные клетки тимуса.

[0270] Цитируемые источники, обсуждаемые в заявке, полностью включены посредством ссылки для их предусмотренного назначения, которое ясно исходит из контекста заявки.

[0271] Все патенты, патентные заявки и публикации, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Раскрытие этих публикаций в их полном объеме настоящим включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[0272] Раскрытия всех без исключения патентов, патентных заявок, публикаций и регистрационных номеров, цитируемых в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[0273] Необходимо понимать, что, хотя изобретение было раскрыто в сочетании с его подробным описанием, вышеизложенное описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.

[0274] Вышеприведенные варианты реализации и преимущества являются лишь иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Настоящее изобретение может быть легко применено к другим типам способов, систем и классификаторов, экспериментов и хирургических процедур. Также описание вариантов реализации настоящего изобретения предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема формулы изобретения. Многие альтернативы, модификации и варианты будут очевидны для специалистов в данной области техники.

[0275] Хотя настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на различные варианты реализации, очевидно, что другие варианты реализации и их варианты могут быть разработаны другими специалистами в данной области техники без отклонения от сущности и объема изобретения. Следует считать, что прилагаемая формула изобретения включает все такие варианты реализации и эквивалентные варианты.

[0276] Вышеизложенное письменное описание считается достаточным, чтобы обеспечить возможность осуществления вариантов его реализации специалистом в данной области техники. Вышеизложенное описание и Примеры подробно описывают отдельные варианты реализации и описывают наилучший вариант, рассматриваемый авторами. Однако следует иметь в виду, что, независимо от того, насколько подробно вышеприведенное может быть описано в тексте, вариант реализации может быть осуществлен многими способами и его следует истолковывать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

[0277] Цитируемые источники

[0278] Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, «Thymus transplantation», Clin Immunol, 135(2): 236-46.

[0279] Markert ML и др., 2004, «Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome», Blood 104(8):2574-2581.

[0280] Markert ML и др., 1999, «Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome)), N Engl J Med 341(16): 1180-1189 27).

[0281] Markert ML и др., 2008, «Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation», J Immunol 180(9):6354-6364.

[0282] Markert ML и др., 2007, «Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants», Blood 109(10):4539-454728).

[0283] Chinn IK, Devlin BH, Li YJ и Markert ML, 2008, «Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly», Clin Immunol 126(3):277-281).

[0284] Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiences, ред. Sullivan KE и Stiehm ER (Academic Press), 1-e издание, стр. 1059-1067.

Группа изобретений относится к количественному гистоморфологическому анализу цифровых изображений клеток в образце ткани для определения жизнеспособных тканей-кандидатов для трансплантации, а именно: к системе и способу количественной гистопатологической оценки неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле, классификатору ткани для осуществления такой оценки и способу его обучения. При этом преобразуют изображение предметного стекла в бинарное изображение. Изображение предметного стекла выбрано из библиотеки контрольных изображений, где каждое изображение ассоциировано с удовлетворительной или неудовлетворительной классификацией. Обнаруживают ядра в пределах бинарного изображения. Извлекают признак из обнаруженного ядра, который содержит площадь, периметр, интегральную плотность и округлость ядра. Для каждого обнаруженного ядра генерируют отличительный признак, ассоциируемый с бинарным изображением предметного стекла, который представляет собой численное значение. Включают бинарное изображение в кластер. Применяют предельное верхнее значение к древовидной кластерной схеме для образования множества групп. Предельное верхнее значение минимизирует количество групп в пределах множества групп на основании многомерного дисперсионного анализа кластера. Осуществляют категоризацию первой группы как положительной контрольной группы, если первая группа содержит первые изображения предметного стекла, ассоциированные с удовлетворительной классификацией. Осуществляют категоризацию второй группы как отрицательной контрольной группы, если вторая группа содержит вторые изображения предметного стекла, ассоциированные с неудовлетворительной классификацией. Достигается повышение эффективности качественных анализов с возможностью превращения их в полуколичественные или количественные. 4 н. и 56 з.п. ф-лы, 57 ил., 7 табл., 8 пр.

1. Способ обучения классификатора ткани для осуществления количественной гистопатологической оценки, включающий:

преобразование изображения предметного стекла в бинарное изображение предметного стекла, при этом изображение предметного стекла выбрано из библиотеки контрольных изображений, при этом каждое изображение предметного стекла в библиотеке контрольных изображений ассоциировано с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией;

обнаружение одного или более ядер в пределах бинарного изображения предметного стекла;

извлечение признака из обнаруженного ядра для каждого обнаруженного ядра, при этом признак представляет собой свойства обнаруженного ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит площадь обнаруженного ядра, периметр обнаруженного ядра, интегральную плотность обнаруженного ядра и округлость обнаруженного ядра;

для каждого обнаруженного ядра, генерацию отличительного признака, ассоциируемого с бинарным изображением предметного стекла, на основании признака, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

включение бинарного изображения предметного стекла в кластер, при этом кластер содержит множество изображений, при этом каждое из множества изображений ассоциировано с соответствующим отличительным признаком, и при этом включение основано на сравнении отличительного признака с соответствующим отличительным признаком;

применение предельного верхнего значения к древовидной кластерной схеме для образования множества групп, при этом предельное верхнее значение минимизирует количество групп в пределах множества групп на основании многомерного дисперсионного анализа кластера;

категоризацию первой группы в пределах множества групп как положительной контрольной группы, если первая группа содержит первые изображения предметного стекла, ассоциированные с удовлетворительной классификацией; и

категоризацию второй группы в пределах множества групп как отрицательной контрольной группы, если вторая группа содержит вторые изображения предметного стекла, ассоциированные с неудовлетворительной классификацией.

2. Способ по п. 1, в котором классификатор ткани выполнен с возможностью определения активности или качества ткани для трансплантации в тело субъекта.

3. Способ по п. 2, в котором ткань представляет собой ткань тимуса.

4. Способ по п. 3, в котором ткань представляет собой срезы аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для имплантации в субъекта-человека.

5. Способ по п. 4, в котором субъект-человек страдает полным синдромом Ди Георга, связанным с делецией 22q11.2; синдромом CHARGE, включающим колобому, порок сердца, атрезию хоан, задержку роста или развития, генитальную гипоплазию и аномалии уха или глухоту; или атимией, связанной с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1).

6. Способ по п. 2, в котором классификатор ткани определяет активность или качество ткани для трансплантации в тело субъекта неизвестной ткани для трансплантации посредством генерации отличительных признаков обнаруженных ядер в пределах изображений предметного стекла в контрольной библиотеке и кластеризации изображений предметного стекла на основании их соответствующих отличительных признаков.

7. Способ по п. 6, в котором неизвестная ткань представляет собой ткань тимуса.

8. Способ по п. 7, в котором ткань тимуса подвергали процессу культивирования в среде органа тимуса на протяжении периода времени для частичного обеднения ткани тимуса тимоцитами.

9. Способ по п. 8, в котором период времени составляет до 21 дня.

10. Способ по п. 8, в котором период времени составляет от приблизительно 12 дней до приблизительно 21 дня.

11. Способ по п. 8, в котором период времени составляет от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней.

12. Способ по п. 8, в котором процесс культивирования сохраняет функциональное строение стромы тимуса.

13. Способ по п. 12, в котором строма тимуса содержит эпителиальные клетки тимуса и фибробласты.

14. Способ по п. 1, в котором ткань выбрана из группы, содержащей сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

15. Способ по п. 1, в котором отличительный признак генерируют из измерений, содержащих численные значения площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра и округлости обнаруженного ядра.

16. Способ осуществления количественной гистопатологической оценки неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле, включающий:

обнаружение гематоксилинового канала из неклассифицированного изображения предметного стекла, при этом гематоксилиновый канал ассоциирован с клеточным ядром в пределах неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле;

извлечение признака из обнаруженного гематоксилинового канала, при этом признак представляет собой свойства ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит площадь ядра, периметр ядра, интегральную плотность ядра и округлость ядра;

генерацию, на основании признака, отличительного признака, ассоциированного с неклассифицированным изображением предметного стекла, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

совместную кластеризацию отличительного признака с первой группой отличительных признаков, категоризированной как положительная контрольная группа, или со второй группой отличительных признаков, категоризированной как отрицательная контрольная группа, при этом:

первую группу и вторую группу образуют путем применения предельного верхнего значения к древовидной кластерной схеме, и

положительная контрольная группа содержит первый набор изображений предметного стекла, ассоциированный с удовлетворительной классификацией, а отрицательная контрольная группа содержит второй набор изображений предметного стекла, ассоциированный с неудовлетворительной классификацией; и

определение, на основании совместной кластеризации, является ли отличительный признак ассоциированным с удовлетворительной классификацией или с неудовлетворительной классификацией.

17. Способ по п. 16, в котором отличительный признак определяет активность или качество ткани для трансплантации в тело субъекта.

18. Способ по п. 17, в котором ткань представляет собой ткань тимуса.

19. Способ по п. 18, в котором ткань представляет собой срезы аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для имплантации в субъекта-человека.

20. Способ по п. 19, в котором субъект-человек страдает полным синдромом Ди Георга, связанным с делецией 22q11.2; синдромом CHARGE, включающим колобому, порок сердца, атрезию хоан, задержку роста или развития, генитальную гипоплазию и аномалии уха или глухоту; или атимией, связанной с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1).

21. Способ по п. 17, в котором отличительный признак определяет активность или качество ткани для трансплантации в тело субъекта неизвестной ткани посредством генерации отличительных признаков обнаруженных ядер в пределах изображений предметного стекла в контрольной библиотеке и кластеризации изображений предметного стекла на основании их соответствующих отличительных признаков.

22. Способ по п. 21, в котором неизвестная ткань представляет собой ткань тимуса.

23. Способ по п. 22, в котором ткань тимуса подвергали процессу культивирования в среде органа тимуса на протяжении периода времени для частичного обеднения ткани тимуса тимоцитами.

24. Способ по п. 23, в котором период времени составляет до 21 дня.

25. Способ по п. 23, в котором период времени составляет от приблизительно 12 дней до приблизительно 21 дня.

26. Способ по п. 23, в котором период времени составляет от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней.

27. Способ по п. 23, в котором процесс культивирования сохраняет функциональное строение стромы тимуса.

28. Способ по п. 27, в котором строма тимуса содержит эпителиальные клетки тимуса и фибробласты.

29. Способ по п. 16, в котором ткань выбрана из группы, содержащей сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

30. Способ по п. 17, в котором отличительный признак генерируют из измерений, содержащих численные значения площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра и округлости обнаруженного ядра.

31. Система для осуществления количественной гистопатологической оценки неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле, содержащая:

средство для преобразования изображения предметного стекла в бинарное изображение предметного стекла, при этом изображение предметного стекла выбрано из библиотеки контрольных изображений, при этом каждое изображение предметного стекла в библиотеке контрольных изображений ассоциировано с удовлетворительной классификацией или неудовлетворительной классификацией;

средство для обнаружения одного или более ядер в пределах бинарного изображения предметного стекла;

средство для извлечения признака для каждого обнаруженного ядра, при этом признак представляет собой свойства обнаруженного ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит площадь обнаруженного ядра, периметр обнаруженного ядра, интегральную плотность обнаруженного ядра и округлость обнаруженного ядра;

средство для генерации отличительного признака, ассоциируемого с бинарным изображением предметного стекла, на основании признака, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

средство для включения бинарного изображения предметного стекла в кластер, при этом кластер содержит множество изображений, при этом каждое из множества изображений ассоциировано с соответствующим отличительным признаком, и при этом включение основано на сравнении отличительного признака с соответствующим отличительным признаком;

средство для применения предельного верхнего значения к древовидной кластерной схеме для образования множества групп, при этом предельное верхнее значение минимизирует количество групп в пределах множества групп на основании многомерного дисперсионного анализа кластера;

средство для категоризации первой группы в пределах множества групп как положительной контрольной группы, если первая группа содержит первые изображения предметного стекла, ассоциированные с удовлетворительной классификацией; и

средство для категоризации второй группы в пределах множества групп как отрицательной контрольной группы, если вторая группа содержит вторые изображения предметного стекла, ассоциированные с неудовлетворительной классификацией.

32. Система по п. 31, выполненная с возможностью определения активности или качества ткани для трансплантации в тело субъекта.

33. Система по п. 32, в которой ткань представляет собой ткань тимуса.

34. Система по п. 33, в которой ткань тимуса представляет собой срезы аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для имплантации в субъекта-человека.

35. Система по п. 34, в которой субъект-человек страдает полным синдромом Ди Георга, связанным с делецией 22q11.2; синдромом CHARGE, включающим колобому, порок сердца, атрезию хоан, задержку роста или развития, генитальную гипоплазию и аномалии уха или глухоту; или атимией, связанной с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1).

36. Система по п. 31, выполненная с возможностью классификации активности или качества ткани для трансплантации в тело субъекта неизвестной ткани посредством генерации отличительных признаков обнаруженных ядер в пределах изображений предметного стекла в контрольной библиотеке и кластеризации изображений предметного стекла на основании их соответствующих отличительных признаков.

37. Система по п. 36, в которой неизвестная ткань представляет собой ткань тимуса.

38. Система по п. 37, в которой ткань тимуса подвергнута процессу культивирования в среде органа тимуса на протяжении периода времени для частичного обеднения ткани тимуса тимоцитами.

39. Система по п. 38, в которой период времени составляет до 21 дня.

40. Система по п. 38, в которой период времени составляет от приблизительно 12 дней до приблизительно 21 дня.

41. Система по п. 38, в которой период времени составляет от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней.

42. Система по п. 38, в которой процесс культивирования сохраняет функциональное строение стромы тимуса.

43. Система по п. 42, в которой строма тимуса содержит эпителиальные клетки тимуса и фибробласты.

44. Система по п. 31, в которой ткань выбрана из группы, содержащей сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

45. Система по п. 36, в которой отличительный признак сгенерирован из измерений, содержащих численные значения площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра и округлости обнаруженного ядра.

46. Классификатор ткани для осуществления количественной гистопатологической оценки, содержащий:

средство для обнаружения гематоксилинового канала из неклассифицированного изображения предметного стекла, при этом гематоксилиновый канал ассоциирован с клеточным ядром в пределах неклассифицированного изображения ткани на предметном стекле;

средство для извлечения признака из обнаруженного гематоксилинового канала, при этом признак представляет собой свойства ядра в пределах бинарного изображения предметного стекла и содержит площадь ядра, периметр ядра, интегральную плотность ядра и округлость ядра;

средство для генерации, на основании признака, отличительного признака, ассоциированного с неклассифицированным изображением предметного стекла, при этом отличительный признак представляет собой численное значение, вычисленное из обработки признака;

средство для совместной кластеризации отличительного признака с первой группой отличительных признаков, категоризированной как положительная контрольная группа, и со второй группой отличительных признаков, категоризированной как отрицательная контрольная группа, при этом:

первая группа и вторая группа образованы путем применения предельного верхнего значения к древовидной кластерной схеме, и

положительная контрольная группа содержит первый набор изображений предметного стекла, ассоциированный с удовлетворительной классификацией, а отрицательная контрольная группа содержит второй набор изображений предметного стекла, ассоциированный с неудовлетворительной классификацией; и средство для определения, на основании совместной кластеризации, является ли отличительный признак ассоциированным с удовлетворительной классификацией или с неудовлетворительной классификацией.

47. Классификатор по п. 46, в котором система выполнена с возможностью определения активности или качества ткани для трансплантации в тело субъекта.

48. Классификатор по п. 47, в котором ткань представляет собой ткань тимуса.

49. Классификатор по п. 48, в котором ткань тимуса представляет собой срезы аллогенного культивированного продукта, полученного из постнатальной ткани тимуса, для имплантации в субъекта-человека.

50. Классификатор по п. 49, в котором субъект-человек страдает полным синдромом Ди Георга, связанным с делецией 22q11.2; синдромом CHARGE, включающим колобому, порок сердца, атрезию хоан, задержку роста или развития, генитальную гипоплазию и аномалии уха или глухоту; или атимией, связанной с дефицитом белка N1 семейства forkhead (FOXN1).

51. Классификатор по п. 46, в котором система выполнена с возможностью классификации активности неизвестной ткани посредством генерации отличительных признаков обнаруженных ядер в пределах изображений предметного стекла в контрольной библиотеке и кластеризации изображений предметного стекла на основании их соответствующих отличительных признаков.

52. Классификатор по п. 51, в котором неизвестная ткань представляет собой ткань тимуса.

53. Классификатор по п. 52, в котором ткань тимуса подвергнута процессу культивирования в среде органа тимуса на протяжении периода времени для частичного обеднения ткани тимуса тимоцитами.

54. Классификатор по п. 53, в котором период времени составляет до 21 дня.

55. Классификатор по п. 53, в котором период времени составляет от приблизительно 12 дней до приблизительно 21 дня.

56. Классификатор по п. 53, в котором период времени составляет от приблизительно 5 до приблизительно 9 дней.

57. Классификатор по п. 53, в котором процесс культивирования сохраняет функциональное строение стромы тимуса.

58. Классификатор по п. 57, в котором строма тимуса содержит эпителиальные клетки тимуса и фибробласты.

59. Классификатор по п. 46, в котором ткань выбрана из группы, содержащей сосудистую ткань, ткань кожи, печеночную ткань, ткань поджелудочной железы, нервную ткань, мочеполовую ткань, желудочно-кишечную ткань, ткань скелета, включая кости и хрящи, жировую ткань, соединительную ткань, включая сухожилия и связки, амниотическую ткань, хориальную ткань, твердую мозговую оболочку, перикард, мышечную ткань, железистую ткань, ткань лицевой области, глазную ткань.

60. Классификатор по п. 46, в котором отличительный признак сгенерирован из измерений, содержащих численные значения площади обнаруженного ядра, периметра обнаруженного ядра, интегральной плотности обнаруженного ядра и округлости обнаруженного ядра.