Низкомолекулярные ингибиторы фосфорилированные BCL-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) Российский патент 2023 года по МПК C07D211/06 C07D241/04 C07D213/53 C07D295/96 C07D295/155 C07D295/192 C07D307/52 C07D333/20 C07D413/04 A61K31/445 A61K31/496 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к новым соединениям и, в частности, к соединениям, которые являются ингибиторами Bcl-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) в раковых клетках, к соединениям для применения в лечении или предупреждении рака и к фармацевтическим композициям, содержащим данные соединения.

Апоптоз или программируемая смерть клеток представляет собой регуляторный механизм, повторно участвующий в уничтожении аутореактивных клеток иммунной системы, состарившихся клеток и клеток с невосстанавливаемым повреждением ДНК [1]. Апоптоз осуществляется двумя отличающимися механизмами у позвоночных - внешним и внутренним путем [2]. Внутренний путь активируется в условиях гипоксии, после серьезного повреждения генома, окислительного стресса или после истощения факторов роста [3]. Белки семейства BCL-2 играют ведущую роль в регуляции внутреннего апоптотического пути [4]. Более 20 членов семейства BCL-2 идентифицировано и широко подразделено на антиапоптотические, проапоптотические и только ВН3 белки. BCL-2, BCL-xL и BCL-w являются антиапоптотическими; BAK и ВАХ являются проапоптотическими; и BAD, BIM, PUMA, NOXA являются преобладающими проапоптотическими только ВН3 белками [5-7]. Таким образом, члены семейства BCL-2 выполняют как про-, так и антиапоптотические функции при равновесии, поддерживаемом между ними, и проапоптотические только ВН3 белки обычно репрессируются с обеспечением гомеостаза [8].

Супрессия апоптоза способствует ненадлежащему выживанию клеток и развитию и/или прогрессированию рака [9-11]. В большинстве злокачественных опухолей уровень экспрессии антиапоптотических белков повышается, приводя к развитию устойчивости к апоптозу. Bcl-2-ассоциированный промотор смерти (BAD) играет решающую роль в регуляции апоптоза посредством взаимодействия с Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w [12]. Человеческий BAD фосфорилируется в положении Ser75 (эквивалентный мышиный остаток представляет собой Ser112) МАР-киназой р44/42 и в положении Ser99 (эквивалентный мышиный остаток представляет собой Ser136) посредством AKT/p70S6K [13]. Оба сериновых остатка также фосфорилируются киназами семейства Pim, что предотвращает апоптоз [14]. Фосфорилирование BAD на уровне одного из данных остатков приводит к потере способности hBAD к гетеродимеридации с BCL-xL или BCL-2 [15]. Фосфорилированный белок BAD гетеродимеризован с белком 14-3-3 и секвестрирован в цитоплазме [16]. При инициировании апоптоза BAD подвергается дефосфорилированию и гетеродимеризуется с BCL-2, BCL-xL или BCL-w, что позволяет BAK и ВАХ стимулировать высвобождение цитохрома С в цитоплазму с последующей стимуляцией внутреннего апоптотического пути [17]. Также сообщалось, что BAD сохраняет другие белковые и функциональные взаимодействия в пределах клетки. Например, экспрессия BAD регулируется р53 и комплексами BAD с р53, что стимулирует апоптоз [18]. Bad демонстрирует транскрипционно повышающую регуляцию р53 и образует комплекс Bad/p53 в митохондриях, вызывая апоптоз [18]. Клинически, высокий уровень экспрессии BAD ассоциирован с высокими значениями шкалы Глисона при раке предстательной железы [15], и сообщалось, что фосфорилирование BAD предсказывает низкую общую выживаемость при раке яичника [19] и ассоциировано с устойчивостью к циспластину [19]. Кроме того, фосфорилированный BAD наблюдается в более чем 80% популяции CD44 позитивных опухолевых стволовых клеток (CSC - от англ. cancer stem cell) при раке молочной железы, и сообщалось, что фосфорилирование BAD является существенным для выживания CSC [20].

Разработаны многочисленные низкомолекулярные модуляторы программируемой смерти клеток, нацеленные на белки семейства BCL-2, для терапевтического применения против разных злокачественных опухолей человека [21-23]. На сегодняшний день не сообщалось о низкомолекулярных модуляторах только ВНЗ белков, таких как BAD. Таким образом, существует необходимость в разработке лучших и эффективных соединений/терапий для контролирования рака посредством ингибирования фосфорилирования BAD, не влияя на происходящие ранее события.

В настоящем изобретении предложено соединение общей формулы (I):

где:

каждый R¹ независимо представляет собой галогено, ОН, циано, нитро, NR¹⁰R¹¹, C(O)R¹⁰, C(O)OR¹⁰, C(O)NR¹⁰R¹¹, -S(O)_qNR¹⁰R¹¹, C_1-6 алкил, C_{1-6 галогеналкил, -O(С1-6 алкил), -O(С1-6 галогеналкил), арил, гетероарил, -О-арил или -О-гетероарил,}

где

каждый из R¹⁰ и R¹¹ независимо выбран из Н или С_1-6 алкила, факультативно замещенного одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, циано, NH₂, арила или гетероарила;

алкильная и галогеналкильная группы R¹ факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из ОН, циано, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, арила, гетероарила, -О-арила или -О-гетероарил -O(C_1-6 алкила), факультативно замещенного арилом или -O(C_1-6 галогеналкилом);

арильная или гетероарильная группы R¹ факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -NR⁴R⁵, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, -C(O)R⁴, -C(O)OR⁴ или -C_1-6 алкила или -O(C_1-6 алкила), каждый из которых факультативно замещен одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, арила, гетероарила, -O(С_1-6 алкила), O(C_1-6 галогеналкила), -О-арила или -О-гетероарила);

p равен 1 или 2;

каждый из R⁴ и R⁵ независимо выбран из Н или C_1-4 алкила, или R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 3- или 8-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;

n равен 0, 1, 2, 3, 4 или 5;

каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой C_1-6 алкил, факультативно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, арила или гетероарила; или

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S и факультативно замещенных одним или более заместителями R⁶;

каждый R⁶ независимо выбран из арила, гетероарила, -О-арила, -О-гетероарила, карбоциклила, гетероциклила, -О-карбоциклила, -О-гетероциклила, R¹², OR¹², C(O)R¹², C(O)OR¹¹, C(O)NR¹¹R¹², CN, OH,

каждый из R¹¹ и R¹² независимо представляет собой Н или С_1-4 алкил, каждый из которых может быть замещен одной или более арильными или гетероарильными группами, где арильные и гетероарильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -NR⁴R⁵, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, -C(O)R⁴, -C(O)OR⁴ или -C_1-6 алкила или -O(C_1-6 алкила), каждый из которых факультативно замещен одним или более заместителями, выбранными из ОН, галогено, арила, гетероарила, -O(C_1-6 алкила), O(C_1-6 галогеналкила), -О-арила или -О-гетероарила);

где R⁴ и R⁵ представляют собой такие, как определено выше; или R¹¹ и R¹² могут объединяться с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-8-членного гетероциклического кольца, содержащего один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из N, О и S, и факультативно замещенного C_1-4 алкилом, C_1-4 галогеналкилом или галогеном;

R³ представляет собой арил, гетероарил, карбоциклил или гетероциклил, любой из которых факультативно замещен одним или более заместителями R⁷, выбранными из галогено, -С_1-4 алкила, факультативно замещенного арилом, -O(C_1-4 алкила), факультативно замещенного арилом, - C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 галогеналкила) или -C(O)NR⁸R⁹;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н, C_1-4 алкила или С_3-6 циклоалкила, или R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват или гидрат, или их дейтерированный или тритированный вариант, включая все стереоизомеры.

Соединения общей формулы (I) ингибируют сайт-специфичное фосфорилирование BAD, не оказывая влияния на действующую выше киназу, и, таким образом, являются полезными в стимулировании апоптоза во множестве клеток ракового происхождения.

В настоящем описании изобретения, за исключением случаев, когда из контекста следует иное за счет ясно выраженного языка или необходимо подразумеваемого положения, слово «включает» или варианты, такие как «сдержит» или «содержащий», используется во включающем смысле, то есть для определения наличия указанных признаков, но не для исключения наличия или добавления дополнительных признаков в разных воплощениях изобретения.

В настоящем описании изобретения термин «C_1-6 алкил» относится к полностью насыщенной неразветвленной или разветвленной углеводородной цепи, имеющей от 1 до 6 атомов углерода. Примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, трет-бутил, н-гексил.

Термин «C_1-4 алкил» имеет похожее значение, но относится к алкильным группам с 1-4 атомами углерода.

Термин «C_1-6 галогеналкил» относится к C_1-6 алкильной группе, как определено выше, в которой один или более атомов водорода заменены атомами галогена. Галогеналкильные группы могут иметь любое число заместителей - атомов галогена от 1 до полного замещения атомами галогена. Примеры включают хлорметил, трифторметил, 1-бромэтил, 1,1,2,2-тетрафторэтил и т.д.

Термин «карбоциклил» относится к неароматическому углеводородному кольцу, имеющему от 3 до 7 атомов углерода и факультативно содержащему одну или более углерод-углеродных двойных связей. Примеры включают C_3-7 циклоалкильные группы, такие как следующие группы: циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил, и циклоалкенильные группы, такие как циклогексенил.

Термин «гетероциклил» относится к неароматическому кольцу, имеющему от 5 до 7 атомов углерода и по меньшей мере один кольцевой гетероатом, выбранный из N, О и S. Примеры включают пиперазинил, пиперидинил, морфолинил, пирролидинил и имидазолинил.

В настоящем описании изобретения термин «галогено» относится к фтор-, хлор-, бром- или йод-.

Термин «арил» в контексте настоящего описания изобретения относится к кольцевой системе с ароматическим характером, имеющей от 5 до 14 кольцевых атомов углерода, если не указано иное, и содержащей вплоть до трех колец. Когда арильная группа содержит более одного кольца, не все кольца должны быть полностью ароматическими по характеру. Примеры ароматических группировок представляют собой бензол, нафталин, индан и инден.

Термин «гетероарил» в контексте описания изобретения относится к кольцевой системе с ароматическим характером, имеющей от 5 до 14 кольцевых атомов (если не указано иное), по меньшей мере один из которых представляет собой гетероатом, выбранный из N, О и S, и содержащей вплоть до трех колец. Когда гетероарильная группа содержит более одного кольца, не все кольца должны быть полностью ароматическими по характеру. Примеры гетероарильных групп включают пиридин, пиримидин, индол, изоиндол, бензофуран, бензимидазол, бензоксазол, бензизоксазол и индолен.

В соединениях общей формулы (I) n надлежащим образом равен 2 или 3, например, 2. По меньшей мере одна R¹ группа может представлять собой ОН. В данном случае ОН группа надлежащим образом находится в положении, расположенном рядом с -CH(R³)NR^2aR^2b группой.

Надлежащим образом, соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IA):

где R¹, R^2a, R^2b и R³ представляют собой такие, как определено выше, и m равен 0, 1, 2, 3 или 4.

Надлежащим образом, в соединении общей формулы (I) и (IA):

каждый R¹ независимо представляет собой галогено, C_1-6 алкил, C_1-6 галогеналкил, арил или гетероарил, где арильная или гетероарильная группы факультативно замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, циано, нитро, -S(O)_pNR⁴R⁵, -C(O)NR⁴R⁵, - C_1-6 алкила, факультативно замещенного арилом, - C_1-6 галогеналкила, -O(C_1-6 алкила), факультативно замещенного арилом, или -O(C_1-6 галогеналкила);

р равен 0, 1 или 2;

каждый из R⁴ и R⁵ независимо выбран из Н или C_1-4 алкила, или R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;

Каждый из R^2a и R^2b независимо представляют собой C_1-6 алкил, факультативно замещенный одним или более заместителями, выбранными из галогено, ОН, арила или гетероарила; или

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S, и факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶;

каждый R⁶ независимо выбран из арила, гетероарила, -О-арила, -О-гетероарила или C_1-4 алкила, замещенного одной или более арильными или гетероарильными группами, где арильная и гетероарильная группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, алкила, C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 алкила) или -O(C_1-4 галогеналкила);

R³ представляет собой арил, гетероарил, карбоциклил или гетероциклил, любой из которых факультативно замещен одним или более заместителями R⁷, выбранными из галогено, -C_1-4 алкила, факультативно замещенного арилом, -O(C_1-4 алкила), факультативно замещенного арилом, - C_1-4 галогеналкила, -O(C_1-4 галогеналкила) или -C(O)NR⁸R⁹;

каждый R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н, C_1-4 алкила или С_3-6 циклоалкила, или R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N и S;

или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат, или их дейтерированный или тритированный вариант, включая все стереоизомеры.

В некоторых подходящих соединениях общей формулы (IA) m равен 0, таким образом, что группа R¹ отсутствует.

В других подходящих соединениях m равен 1 или 2, но чаще 1.

В некоторых случаях R¹ надлежащим образом представляет собой галогено, в частности, хлор- или фтор-; или в качестве альтернативы, R¹ представляет собой арильную или гетероарильную группу, факультативно замещенную, как описано выше. Чаще R¹ представляет собой, хлор-, фтор- или арил, факультативно замещенный, как описано выше.

Когда R¹ представляет собой арильную или гетероарильную группу, он соответствующим образом находиться в 4-ом положении фенильного кольца (где атом углерода, замещенный ОН-группой, обозначается положением 1).

Подходящие заместители для арильных или гетероарильных групп R¹ включают галогено, ОН, циано, нитро, -SO₂NH₂, -C(O)NR⁴R⁵, -C_1-4 алкил, факультативно замещенный арилом, -С_1-4 галогеналкил, -O(C_1-4 алкил), факультативно замещенный арилом, или -O(C_1-4 галогеналкил), где R⁴ и R⁵ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидиновое или пирролидиновое кольцо.

Более подходящие заместители для арильных или гетероарильных групп R¹ включают хлор-, фтор-, метил, этил, этил, трифторметил, бензил, метокси, этокси, бензилокси, трифторметокси и пиперидин-1-карбонил.

В некоторых подходящих соединениях по изобретению R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно содержащее один или более дополнительных гетероатомов, выбранных из О, N или S, и факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶, где R⁶ представляет собой такой, как определено выше.

Более подходящим образом, R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 6-членное гетероциклическое кольцо, факультативно замещенное одним или более заместителями R⁶.

Еще более подходящим образом, 6-членное кольцо, образованное R^2a и R^2b, представляет собой пиперидиновое или пиперазиновое кольцо, наиболее подходящим образом пиперазиновое кольцо. Когда R^2a и R^2b образуют пиперазиновое кольцо, оно факультативно может быть замещено одним или более заместителями R⁶, как определено выше, но подходящим образом замещено единственным заместителем R⁶ в 4-ом положении пиперазина таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IB):

где R¹, n, R³ и R⁶ представляют собой такие, как определено для общих формул (I) и (IA).

Особенно подходящие заместители R⁶ включают арил, гетероарил, -О-арил, -О-гетероарил или метил, замещенный одной или двумя арильными или гетероарильными группами; где арильные и гетероарильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из галогено, метила, этила, трифторметила, метокси, этокси или трифторметокси.

Еще более подходящие заместители R⁶ включают фенил, гетероарил, -О-фенил, -О-гетероарил, бензил, -СН(фенил)₂, -СН₂-гетероарил и -СН(гетероарил)₂, где гетероарильная группа выбрана из пиридинила, индолила, изоиндолила, бензоксазолила и бензизоксазолила, и где любая из приведенных выше групп R⁶ может быть заменена, как описано выше, но более подходящим образом одним или более заместителями, выбранными из галогено, метила, этила и трифторметила.

В более подходящих соединениях общей формулы (I) и (IA) R³ представляет собой арил или гетероарил, факультативно замещенный одним или более заместителями R⁷, как описано выше.

Наиболее подходящим образом, R³ представляет собой фенил, факультативно замещенный одним или более заместителями R⁷, таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IC):

где R¹, n, R^2a, R^2b и R⁷ представляют собой такие, как определено для общей формулы (I) или (IA), и z равен 0-5.

Более подходящим образом, z равен 0, 1, 2 или 3, наиболее подходящим образом 0, 1 или 2.

R⁷ представляет собой такой, как определено выше, но в некоторых подходящих соединениях R⁷ отсутствует (то есть z равен 0), или R⁷ представляет собой галогено, -C_1-4 алкил, бензил, -O(C_1-4 алкил) бензилокси, -С_1-4 галогеналкил, -O(C_1-4 галогеналкил) или -C(O)NR⁸R⁹, где R⁸ и R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперидинильное кольцо или где R⁸ представляет собой Н и R⁹ представляет собой С_3-7 циклоалкил.

Более подходящим образом, R⁷ отсутствует или каждый R⁷ независимо представляет собой галогено, особенно хлор- или фтор-, метил, этил, бензил, метокси, этокси, бензилокси, -С(O)-пиперидинил или -C(O)NH-C_3-7 циклоалкил.

Некоторые особенно подходящие соединения по изобретению представляют собой соединения общей формулы (ID):

где R¹, n, R⁶, R⁷ и z представляют собой такие, как определено выше для общих формул (I), (IA), (IB) и (IC).

Иллюстративные соединения общей формулы (I) включают следующие соединения:

2-((2-хлорфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 1);

2-((4-хлорфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 2);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 3);

(4-((2-гидроксифенил)(4-(4-Метоксифенил)пиперазинил)метил)фенил)(пиперидин-1-ил)метанон (Соединение 4);

3-((5-хлор-2-гидроксифенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 5);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил)метил)-4-хлорфенол Соединение 6);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(6-фторбензо[d]изоксазол-3-ил)пиперидин-1-ил)метил)фенол (Соединение 7);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(о-толил)метил)фенол (Соединение 8);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)бензамид (Соединение 9, NPB);

2-((4-(бензилокси)-3-фторфенил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метилфенол (Соединение 10);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(фенил)метил)фенол (Соединение 11);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(п-толил)метил)фенол (Соединение 12);

2-((4-хлорфенил)(4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 13);

2-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(4-этилфенил)метил)фенол (Соединение 14);

(4-((4-((4-хлорфенил)(фенил)метил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)фенил)(пиперидин-1-ил)метанон (Соединение 15);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-[1,1'-бифенил-3-ил)метил)бензамид (Соединение 16);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-2'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 17);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 18);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-метил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 19);

3-((2'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 20);

3-((3'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 21);

3-((4'-хлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 22);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4'-этил-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 23);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-(пиперидин-1-карбонил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 24);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-метокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 25);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2'-этил-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 26);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 27);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(3'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 28);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4'-фтор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил-3-ил)метил)бензамид (Соединение 29);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-нитро-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 30);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-сульфамоил-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 31);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-2'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 32);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-3'-трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 33);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-гидрокси-4'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)метил)бензамид (Соединение 34);

3-((2'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 35);

3-((3'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-цикпопентилбензамид (Соединение 36)

3-((4'-циано-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 37);

3-((2'-хлор-4-гидрокси-4'-(трифторметил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 38);

N-циклопентил-3-((2',4'-дихлор-4-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)бензамид (Соединение 39);

3-((4'-хлор-2',4-дигидрокси-[1,1'-бифенил]-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 40);

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 41, NCK1);

2-((4-хлорфенил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 42, NCK2);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(3-метоксифенил)метил)фенол (Соединение 43, NCK3);

1-(5-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)тиофен-2-ил)этанон (Соединение 44, NCK4);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(нафталин-1-ил)метил)фенол (Соединение 45, NCK5);

5-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)фуран-2-карбальдегид (Соединение 46, NCK6);

2-((4-(5,6-дихлорциклогекса-1,5-диен-1-ил)пиперазин-1-ил)(2-фтор-3-метилпиридин-4-ил)метил)фенол (Соединение 47, NCK7);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 48, NCK8);

2-((6-хлор-5-метилпиридин-3-ил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 49, NCK9);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(пиридин-3-ил)метил)фенол (Соединение 50, NCK10);

1-(5-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)тиофен-2-ил)этанон (Соединение 51, NCK14);

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 52, NCK16);

N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)бензамид (Соединение 53, NCK18);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидрокси-4,6-диметоксифенил)метил)бензамид (Соединение 54, NCK19);

2-((4-хлорфенил)(4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 55, NCK20);

2-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(6-метилпиридин-3-ил)метил)фенол (Соединение 56, NCK21);

2-(о-толил(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 57, SG1);

2-((4-(п-толил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 58, SG2);

N-циклопентил-4-((2-гидроксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)бензамид (Соединение 59, SG3);

2-((4-хлорфенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 60, SG4);

2-((3-метоксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 61, SG5);

5-((2-гидроксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фуран-2-карбальдегид (Соединение 62, SG6); и

2-((6-метилпиридин-3-ил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 63, SG7).

Соединения общей формулы (I) могут быть получены в результате взаимодействия альдегида общей формулы (II):

где R¹ и n представляют собой такие, как определено для общей формулы (I); с соединением общей формулы (III):

где R^2a и R^2b представляют собой такие, как определено для общей формулы (I);

и бороновой кислотой общей формулы (IV):

где R³ представляет собой такой, как определено для общей формулы (I).

Реакция представляет собой реакцию Петасиса, которая представляет собой 3-х компонентную реакцию Петасиса-Бороно-Манниха, в которой используются бороновые кислоты общей формулы (IV) в качестве возможных нуклеофильных соединений для взаимодействия с производным салицилальдегида общей формулы (II) с амином общей формулы (III) с образованием новой углерод-углеродной связи. Реакция Петасиса протекает через образование иминиевых соединений, которые взаимодействуют с бороновой кислотой с образованием третичных аминов.

Подходящие реакционные растворители включают органические растворители, например, циклические простые эфиры, такие как диоксан.

Подходящим образом, способ включает:

i. взаимодействие соединения общей формулы (II) с соединением общей формулы (III) с образованием смеси, содержащей иминиевые соединения в качестве промежуточного соединения;

ii. взаимодействие продукта стадии (i) с соединением общей формулы (IV).

Подходящим образом стадию (ii) проводят при повышенной температуре, например при 50-100°С, например, при температуре кипения растворителя. Когда растворитель представляет собой диоксан, она составляет примерно от 85 до 95°С, обычно примерно 90°С.

Продукт может быть экстрагирован во второй растворитель, такой как этилацетат, высушен и очищен с использованием стандартных способов, таких как описано ниже в примерах.

Соединения общих формул (II), (III) и (IV) известны и имеются в продаже или могут быть получены с использованием известных способов.

Соединения общей формулы (I) могут быть также получены из других соединений общей формулы (I). Например, соединение общей формулы (I), в котором R¹ факультативно представляет собой замещенный арил или гетероарил, может быть получено из соединений общей формулы (I), в которых R¹ представляет собой галогено, в результате взаимодействия с соединением общей формулы (V):

где R^1a представляет собой арил или гетероарил, факультативно замещенный, как определено для общей формулы (I).

Реакцию можно проводить, используя реакцию сочетания Сузуки над палладиевым катализатором.

Соединения общей формулы (V) известны и имеются в продаже или могут быть получены с использованием известных способов.

Способы получения соединений общей формулы (I) представляют еще один аспект настоящего изобретения.

Соединения общей формулы (I) способны ингибировать/осуществлять понижающую регуляцию/подавлять белок - Bcl-2-ассоциированный промотор смерти (BAD), в частности, ингибировать/осуществлять понижающую регуляцию/подавлять фосфорилирование белка - Bcl-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) в раковой клетке. Ингибирование/понижающая регуляция/подавление BAD происходит без воздействия на расположенную выше Ser/Thr киназу, называемую Akt/протеинкиназой В (PKB - от англ. protein kinase В). Таким образом, соединения общей формулы (I) предпочтительно ингибируют/осуществляют понижающую регуляцию/подавляют фосфорилирование BAD.

Ингибирование/понижающая регуляция BAD осуществляется соединением общей формулы (I), занимающим гидрофобную бороздку в пределах поверхности белок-белкового контакта Bcl-2/BAD. Кроме того, соединение общей формулы (I) занимает дополнительный гидрофобный боковой карман в пределах поверхности контакта, образованной боковыми цепями Leu-97, Trp-144 и Phe-198 человеческого белка с дихлорфенильной группировкой.

Соединения формулы (I) представляют собой сильные ингибиторы/ понижающие регуляторы BAD в раковых клетках, в частности, в раковых клетках молочной железы, раковых клетках эндометрия, раковых клетках яичника, раковых клетках печени, раковых клетках толстой кишки, раковых клетках предстательной железы и раковых клетках поджелудочной железы, и индуцируют апоптоз за счет понижающей регуляции/ингибирования фосфорилирования BAD. Указанные соединения усиливают цитотоксичность раковых клеток и осуществляют мишень-специфичную понижающую регуляцию/ингибирование фосфорилирования BAD, не оказывая влияния на киназы, действующие выше.

Осуществляли скрининг соединений общей формулы (I) в отношении их противораковой активности против клеток MCF7, и было обнаружено, что NPB (Соединение 9) является наиболее сильным соединением. Затем NPB оценивали в отношении панели нормальных иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы (MCF10A и MCF12A), нормальных гепатоцитов (LO2), клеток карциномы молочной железы (ВТ549, MDA-MB-231, MCF7, T47D, ВТ474), раковых клеток эндометрия (Ishikawa, Есс1, RL95-2, AN3), раковых клеток яичника (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2, Ovca433), раковых клеток печени (Нер3В, Н2Р, Н2М), раковых клеток толстой кишки (НСТ116, DLD-1, Сасо-2), раковых клеток предстательной железы (РС3, LNCaP, DU145) и раковых клеток поджелудочной железы (AsPC-1, ВхРС-3). NPB значимо усиливал апоптоз во всех анализируемых линиях раковых клеток и NPB не демонстрировал существенной активности в отношении нормальных гепатоцитов и иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы. Используя наивный байесовский классификатор, модифицированный по Лапласу, NPB подвергают электронному анализу, который предполагает человеческую мишень NPB в виде белка BAD.

Было обнаружено, что NPB индуцировал апоптотическую смерть клеток у целого ряда клеток карциномы, но не оказывал цитотоксического действия на нормальные (иммортализованные) эпителиальные клетки.

Отличительными признаками клеток, подлежащих апоптозу, являются экстернализация фосфатидилсерина, активация каспазы и фрагментация геномной ДНК. В одном воплощении NPB демонстрирует апоптоз в отношении клеток MCF7 с использованием окрашивания FITC-аннексином-V и йодидом пропидия. Окрашивание FITC-аннексином-V подтверждает потерю целостности мембраны, и окрашивание PI (от англ. propidium iodide - йодид пропидия) подтверждает поздние события апоптоза, и данные результаты коррелируют с активностью каспазы 3/7.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретения предложено соединение общей формулы (I) для применения в медицине.

Соединения общей формулы (I) являются особенно полезными в лечении рака, подходящим образом, рака, при котором имеет место фосфорилирование BAD.

В еще одном аспекте, таким образом, предложено соединение общей формулы (I) для применения в лечении рака.

Кроме того, предложено применение соединения общей формулы (I) в получении агента для лечения рака.

Также предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения общей формулы (I).

Данные соединения особенно полезны для лечения рака, при котором происходит фосфорилирование BAD, и, например, рак может представлять собой рак молочной железы, рак эндометрия, рак яичника, рак печени, рак толстой кишки, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы, или другие виды рака эпителиального происхождения, при которых фосфорилирован BAD.

Соединения общей формулы (I) подходящим образом вводят в фармацевтической композиции, и, вследствие этого, в еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение общей формулы (I) и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Фармацевтически приемлемый эксципиент может представлять собой адъювант, разбавитель, носитель, гранулирующий агент, связывающий агент, смазывающий агент, разрыхлитель, подсластитель, вещество, обеспечивающее скольжение, антиадгезив, средство, снижающее статический заряд, поверхностно-активное вещество, антиоксидант, камедь, покрывающий агент, краситель, корригент, покрывающий агент, мягчитель, консервант, суспендирующий агент, эмульгатор, растительный целлюлозный материал, агент, обеспечивающий сферонизацию, другое широко известное фармацевтически приемлемый эксципиент или любую комбинацию эксципиентов.

В другом воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена для внутрибрюшинного введения, введения через воротную вену печени, внутривенного введения, внутрисуставного введения, введения через дуоденальную артерию поджелудочной железы или внутримышечного введения или их любой комбинации.

Теперь изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры и на графические материалы, в которых:

На Фиг. 1(a) и 1(b) изображены ¹Н-ЯМР (Ядерный магнитный резонанс) и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 1.

На Фиг. 2 изображены ¹³С-ЯМР спектры Соединения 2.

На Фиг. 3(a) и 3(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 3.

На Фиг. 4(a) и 4(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 4.

На Фиг. 5(a) и 5(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 5.

На Фиг. 6 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения 6.

На Фиг. 7(a) и 7(b) изображены ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры Соединения 7.

На Фиг. 8 изображены ¹³С-ЯМР спектры Соединения 8.

На Фиг. 9(a) и 9(b) изображены ¹Н-ЯМР и ЖХМС (жидкостная хроматография и масс-спектрометрия) спектры Соединения 9.

На Фиг. 10 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения 10.

На Фиг. 11: Значения IC₅₀ (концентрация полумаксимального ингибирования) NPB в целом ряде клеточных линий карциномы.

На Фиг. 12: NPB подавляет жизнеспособность клеток и стимулирует апоптоз в клеточных линиях карциномы.

Эффект NPB (5 мкМ), оказываемый на жизнеспособность клеток карциномы, включая линии клеток карциномы молочной железы, эндометрия, яичника, печени, толстой кишки, предстательной железы и поджелудочной железы. (А) Жизнеспособность клеток (В) активности каспазы 3/7 и (С) цитотоксичность оценивали, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex, как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента с использованием GraphPad Prism5. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, плюс/минус SD (от англ. standard deviation - стандартное отклонение). **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05. Примечание: RFU (от англ. relative fluorescence unit), относительная единица флуоресценции; RLU (от англ. relative luminescence unit), относительная единица люминесценции. #; нетрансформированные, иммортализованные эпителиальные клетки; МВ-231, MDA-MB-231.

Фиг. 13: NPB стимулирует апоптотическую смерть клеток в клетках MCF7.

(А) Апоптотическая смерть клеток MCF7, измеряемая после обработки 10 мкМ NPB с использованием анализа проточная цитометрия. Окрашивание Аннексином V-FITC показано на оси X, и окрашивание PI - на оси Y. Нижний левый квадрант представляет живые клетки, нижний правый квадрант представляет апоптотические клетки на ранней стадии, верхний левый квадрант представляет некротические клетки, и верхний правый квадрант демонстрирует апоптотические клетки на поздней стадии. Получение данных по Аннексину V и PI представляли в виде процента (%) в каждом квадранте. (В) Анализ клеточного цикла клеток MCF7, оцениваемого после обработки 10 мкМ NPB с использованием анализа проточная цитометрия. (С) Жизнеспособность клеток образовавшихся колоний, образованных клеткой MCF7 после воздействия NPB или ДМСО (диметилсульфоксид), культивируемых 14 суток в 3D Матригеле, используя анализ жизнеспособности AlamarBlue®. Визуализация посредством микроскопии (ниже) окрашенных кальцеином AM (ацетооксиметиловый эфир кальцеина) колоний, образованных клетками MCF7, после воздействия NPB или ДМСО, культивируемых в 3D Матригеле. (D) Жизнеспособность клеток в колониях, образованных клеткой MCF7, после воздействия NPB или ДМСО, культивируемых к мягком агаре с использованием анализа жизнеспособности AlamarBlue®. (Е) Окрашивание кристаллическим фиолетовым очаговых колоний, образованных клетками MCF7 после воздействия NPB или ДМСО. Все анализы проводили, как описано в методологии. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента с использованием GraphPad PrismS. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, ±SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05.

Фиг. 14: Химическая информатика и анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance) предсказывает взаимодействие соединения NPB с белком BAD.

(А) Сенсограммы, полученные посредством анализа SPR NPB с белковой субъединицей BAD. Белковую субъединицу BAD иммобилизировали на поверхности сенсорного чипа СМ5. Раствор NPB в разных концентрациях (20-100 мкМ) инъецировали с получением конечных ответов связывания (RU), записываемых в виде функции времени (сек). Результаты анализировали, используя BIA evaluation 3.1. (В) Анализ на основе вестерн-блоттинга (WB - от англ. Western blot) использовали для оценки уровня фосфорилирования Ser99 BAD в клетках MCF7 после обработки NPB. (Ниже) Рассчитывали IC₅₀ NPB, исходя из зависимости доза-ответ, в отношении фосфорилирования BAD (Ser99), BAD и β-АКТИНА, как, например, показано выше, посредством применения программного обеспечения ImageJ от NIH, США (http://imagej.nih.gov/ij/). (С) WB анализ использовали для оценки уровня множества белков, участвующих выше BAD, в клетках MCF7 после обработки NPB. (D) WB анализ использовали для оценки уровня множества белков, участвующих в выживании клеток и пролиферации клеток в клетках MCF7 после обработки NPB. Для WB анализа растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. β-АКТИН (АСТВ) использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. Размеры выявляемых полос белка в кДа показаны с левой стороны.

Фиг. 15: NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD (на уровне Ser99) в линиях клеток карциномы, независимо от AKT сигнализации.

(A) WB анализ использовали для оценки уровней фосфорилированного человеческого BAD (в положении Ser75 и Ser99) и белка BAD в целом ряде линий клеток карциномы, включая рак молочной железы, яичника, эндометрия, гепатоцеллюлярный рак, рак толстой кишки и предстательной железы, после обработки NPB (5 мкМ). Общий BAD использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. (В) WB анализ использовали для оценки уровней pBAD (Ser99) и pAKT (Ser473), AKT и BAD в клетках MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1. 5 мкМ каждого ингибитора AKT (IV) и NPB использовали для обработки клеток. Истощение экспрессии AKT достигалось с использованием временной трансфекции короткой РНК, образующей шпильки, (кш)-РНК (1&2), направленной на транскрипт AKT, как описано в методике. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля для клеточного лизата. Для WB анализа, растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в материалах и методах. Размеры выявляемых полос белка в кДа показаны с левой стороны. Примечание: #; линия нетрансформированных иммортализованных клеток.

Фиг. 16: миРНК (малые интерферирующие РНК)-опосредованное истощение экспрессии BAD предотвращает эффект NPB в линиях клеток карциномы.

(A) WB анализ использовали для оценки уровней активности pBAD (Ser99) и белка BAD в клетках MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1 после обработки 5 мкМ NPB. Истощения экспрессии BAD достигали, используя временную трансфекцию малой интерферирующей (ми)-РНК, направленной на транскрипт BAD. Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в материалах и методах. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля. Эффекты NPB (5μ мкМ) в клетках MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1. (В) Жизнеспособность клеток и (С) активности каспазы 3/7 оценивали, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex. Все анализы проводили, как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (Р меньше 0,05 считали значимым) с использованием GraphPad Prism5. В столбце представлено среднее трех определений; столбцы, плюс/минус SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05. Примечание RFU, относительная единица флуоресценции; RLU, относительная единица люминесценции.

Пример 17: NPB ингибирует фосфорилирование Ser99 BAD при карциноме молочной железы и ингибирует опухолевый рост

(А) Измерение объема опухоли у самок мышей BALB/c-nu, как описано в материалах и методах. Животных (n равен 5 для каждой группы) обрабатывали носителем, 5 мг/кг NPB или 20 мг/кг NPB, и регистрировали относительную опухолевую нагрузку. Массу животных измеряли ежедневно на всем протяжении эксперимента. (В) Опухоли удаляли после реализации схемы обработки NPB и взвешивали. Репрезентативные резецированные опухоли показаны с правой стороны. (С) WB опухолевой ткани для определения уровней p-BAD (Ser99) и BAD. Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. β-АКТИН использовали в качестве входного контроля. Размеры полос выявляемого белка в кДа показаны с левой стороны. (D) Гистологические анализы окрашивания фосфо-BAD, BAD, Ki67 и TUNEL. Осуществляли иммуномечение срезов опухолевых тканей поликлональным антителом козы против pBAD (Ser 136) (Santa Cruz Biotechnology), мышиным моноклональным антителом против BAD (Santa Cruz Biotechnology) и антителом против Ki67 (Abcam, ab15580) и окрашивание гематоксилином. Апоптотическое фрагментирование ДНК выявляли, используя набор для выявления апоптоза TUNEL(Gen Script USA Inc.), как описано в методике. Статистическую значимость оценивали посредством непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (Р меньше 0,05 считали значимым) с использованием GraphPad PrismS. Точка представляет среднее трех экспериментов; столбцы, плюс/минус SD. **Р меньше 0,001, *Р меньше 0,05.

Фиг. 18:

(А) Анализ на основе вестерн блоттинга использовали для оценки уровня фосфорилирования Ser99 BAD pBAD, BAD, pAKT и AKT в клетках MCF7 после увеличивающегося периода обработки NPB (10 мкМ). Растворимые цельноклеточные экстракты прогоняли на SDS-PAGE и осуществляли иммуноблоттинг, как описано в методике. Размеры полос выявляемого белка в кДа показаны с левой стороны. (Б) Киназы и фосфорилированные субстраты выявляли, используя панель для вестерн блоттинга (набор Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array. Клетки MCF7 обрабатывали NPB (10 мкМ) или ДМСО на протяжении 12 ч при 37°С перед получением клеточного лизата. Среднюю плотность пикселей анализировали, используя программное обеспечение ImageJ, и она представлена ниже.

На Фиг. 19 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK5.

На Фиг. 20 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK16.

На Фиг. 21 изображены ¹Н-ЯМР спектры Соединения NCK18.

На Фиг. 22А, 22Б, 22В, 22Г и 22Д: значения IC₅₀ структурных аналогов NPB в линиях клеток карциномы.

Примечание: NV (от англ. no value), отсутствует значение

Материалы, используемые для того, чтобы получить Примеры настоящего раскрытия

Клеточная культура и реагенты

Линии иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы человека, MCF10A и MCF12A, и линию иммортализованных гепатоцеллюлярных эпителиальных клеток, LO2, получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС - от англ. American Type Culture Collection, Rockville, MD) и культивировали в соответствии с инструкциями по наращиванию АТСС. Клеточные линии МС, MCF7, T47D, ВТ474, ВТ549 и MDA-MB-231 (обозначаемая МВ-231); линии клеток карциномы эндометрия, Ishikawa, ЕСС1, RL95-2 и AN3; линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы, Нер3В, Н2Р и Н2М; линии клеток карциномы толстой кишки, НСТ116, DLD-1 и Сасо-2; и линии клеток карциномы предстательной железы, РС3, LNCaP, DU145, получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Rockville, MD). Линии клеток карциномы яичника, SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2 и Ovca433 получали из лаборатории Dr Ruby Huang Онкологического института Сингапура, Национальный университет Сингапура (NUS - от англ. National University of Singapore). Лини клеток карциномы поджелудочной железы получали из лаборатории проф. Н. Phillip Koeffler Онкологического института Сингапура, Национальный университет Сингапура (NUS). Все лини клеток карциномы культивировали в соответствии с инструкциями по наращиванию АТСС. Ингибитор AKT IV приобретали в Calbiochem (San Diego, СА, США). «Стеле» (кш)-РНК-BAD, направленную на BAD (кшРНК-BAD1, 5'-GCUCCGCACCAUGAGUGACGAGUUU-3' и кшРНК-BAD2, 5'AAACUCGUCACUCAUCCUCCGGAGC3'), приобретали в Life Technologies (Сингапур). кшРНК, направленную на AKT (кшРНК- AKT1, 5'-CCGGCGCGTGACCATGAACGAGTTTCTCGAGAAACTCGTTCATGGTCACGCGTTTTTG-3' и кшРНК2-AKT, 5'-CCGGGGACTACCTGCACTCGGAGAACTCGAGTTCTCCGAGTGCAGGTAGTCCTTTTTG-3'), приобретали у Life Technologies (Сингапур) и клонировали в вектор PLKO.1 (Sigma, Сингапур). Клетки временно трансфицировали 20 нМ кшРНК (AKT или BAD) или универсальным отрицательным контролем (Invitrogen, Carlsbad, СА, США) с использованием FuGENE HD (Promega) в течение 24 ч и проводили дальнейшие анализы. Коммерческие наборы для определения аланинтрансаминазы (ALT - от англ. Alanine transaminase), аспартатаминотрансферазы (AST - от англ. aspartate transaminase), лактатдегидрогеназы (LDH - от англ. lactate dehydrogenase), креатинкиназы (CK - от англ. creatine kinase), азота мочевины крови (BUN - от англ. blood urea nitrogen) приобретали у AGAPPE Diagnostics Ltd, Kerala, Индия.

Пример 1

Синтез и характеристика соединений Формулы I

Общий синтез Соединения Формулы I

Пиперазины (0,8 ммоль) и салицилальдегид (0,8 ммоль) отбирали в RBF (от англ. round bottom flask - круглодонная колба) и перемешивали в течение примерно 10 минут, используя диоксан в качестве растворителя. Спустя примерно 10 минут, арилбороновую кислоту (0,8 ммоль) добавляли к смеси и нагревали с обратным холодильником при непрерывном перемешивании на протяжении примерно 8 часов с использованием Диоксана в качестве растворителя на электроплитке, поддерживаемой при примерно 90°С. Спустя примерно 8 часов, в реакционную смесь добавляли этилацетат и воду, и слой этилацетата отделяли, используя разделительную воронку, и сушили над безводным сульфатом натрия. Этилацетат выпаривали с получением продукта. Желательный продукт - фенольное соединение получают посредством разделения с использованием колоночной хроматографии.

Специфичные реагенты, используемые для получения Соединений 1-15 и 41-63, предложены ниже в Таблице 1.

Соединения, показанные в Таблице 2, получали в результате взаимодействия бромида NPB (см. столбец 1 Таблицы 2) с бороновой кислотой, используя реакцию сочетания Сузуки, катализируемую палладием, как показано на Схеме 1.

Характеристика Соединения 1:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 3.691(s, 3Н), 5.303(s, 1Н, С-Н), 1.184-3.691 (m, 8Н-протоны пиперазина), 7.597-7.615(d, 1Н, J=7.2 Гц), 7.341-7.323(d, 1Н, J=7.2 Гц), 7.060-7.189(m, 4H-ArH), 6.555-6.815(m,5H-ArH), 6.956-6.974, (d, 1H, J=7.2 Гц) 11.85(s, 1H-OH brd пик);¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.854, 55.521, 69.50, 114.45, 117.17, 118.44, 119.547, 122.05, 127.78, 128.83, 129.01, 129.19, 129.84, 129.93, 133.89, 145.11, 156.60; Температура плавления 120-124°С. (Фиг. 1)

Характеристика Соединения 2:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ:2.539-3.065(m, 8Н), 3.674(s, 3Н), 4.359(s, 1Н), 6.651 (m, 1Н), 6.740-6.804(m, 5Н), 6.855-6.872(d, 1Н, J=6.8 Гц), 7.086(m, 1Н), 7.165(m, 2Н), 7.280(m, 1Н), 7.361 (m, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.74, 51.76, 55.52, 75.86, 114.49, 117.24, 118.43, 119.62, 124.41, 126.58, 128.28, 128.54, 128.92, 129.20, 130.28, 134.66, 141.63, 145.07, 154, 156.18; Температура плавления 85-89°С. (Фиг. 2)

Характеристика Соединения 3:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.194-3.079(m, 8H), 3.689(s, 3Н), 4.336(s, 1Н), 5.041 (s, 2Н), 6.672-6.702(m, 1Н), 6.781-6.819(m, 5Н), 6.863-6.867(m, 2Н), 7.026-7.082(m, 2Н), 7.196(m, 1Н), 7.279-7.348(m, 5Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.770, 55.52, 71.26, 75.36, 114.46, 115.46, 117.16, 118.42, 119.54, 124.82, 127.34, 128.14, 128.62, 128.76, 129.14, 145.04, 156.14; Температура плавления 72-76°С. (Фиг. 3)

Характеристика Соединения 4:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.183-2.469(m, 10H), 2.557-3.684(m, 8Н), 3.684(s, 3Н), 4.412(s, 1Н), 6.631(m, 2Н), 6.745-6.813(m, 4Н), 7.059-7.095(m, 1Н), 7.191-7.216(m, 1Н), 7.261-7.269(m, 2Н), 7.351-7.409(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 24.51, 26.525, 29.68, 43.60, 48.73, 50.71, 51.80, 55.51, 76.04, 114.45, 117.134, 118.366, 119.198, 119.52, 124.75, 126.74, 127.50, 128.04, 128.50, 128.79, 129.29, 136.18, 141.02, 145, 154, 156.2, 169.79(С=O); Температура плавления 78-82°С. (Фиг. 4)

Характеристика Соединения 5:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.186-1.650(m, 8Н), 1.978-3.633(m, 8Н), 3.689(s, 3Н), 4.298-4.345(m, 1Н), 4.421 (s, 1Н), 5.979-5.992(s, 1Н) 6.736-6.803(m, 5Н), 6.860(m, 1Н), 7.192(s, 1Н), 7.737(s, 1Н), 7.304-7.339(m, 1Н), 7.540-7.557(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 23.79, 33.18, 50.67, 51.83, 55.51, 67.06, 75.06, 114.46, 118.45, 118.58, 124.02, 126.11, 126.42, 128.72, 128.87, 129.39, 139.39, 144.89, 154.19, 154.95, 166.68; Температура плавления 102-106°С. (Фиг. 5)

Характеристика Соединения 6:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.179-3.620(m, 8Н), 3.676(s, 3Н), 4.261 (s, 1Н), 5.029(s, 2Н), 6.716-6.791 (m, 5Н), 6.823(m, 1Н), 6.862-6.882(m, 1Н), 6.973-7.015(m, 2Н), 7.110-7.139(m, 1Н), 7.243-7.258(m, 2Н), 7.280-7.317(m, 1Н), 7.331-7.350(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 50.70, 51.59, 55.52, 71.27, 74.93, 114.48, 115.52, 118.58, 123.97, 124.39, 126.3, 127.3, 128.2, 128.8, 132.1, 136.27, 144.96, 146.74, 154.19, 154.93; Температура плавления 60-64°С. (Фиг. 6)

Характеристика Соединения 7:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 2.648-3.820 (m, 8Н) 4.245(s, 1Н), 5.009(s, 1Н), 5.651 (s, 2Н), 7.276(s, 1Н), 7.436-7.485(m, 3Н), 7.606-7.682(m, 3Н), 7.797(m, 2Н), 7.876-7.954(m, 5Н), 8.185(s, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 30.972, 50.76, 67.60, 71.79, 75.85, 98.16, 100.9, 104.9, 113.16, 115.97, 117.65, 119.96, 122.84, 125.4, 127.8, 128.6, 129.1, 129.6, 133.2, 136.8, 157.06, 160.87, 164.51, 165.86; Температура плавления 58-62°С. (Фиг. 7)

Характеристика Соединения 8:

¹Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ: 2.479(s, 3Н), 4.927(s, 1Н), 2.260-3.063(m, 8Н), 6.533-6.551 (d, 1Н, J=7.2 МГц), 6.631-6.692(m, 2Н), 6.739-6.758(d, 1Н, J=7.6 МГц), 6.789-6.809(d, 1Н, J=8 Гц), 6.864(m, 3Н), 7.092-7.183(m, 1Н), 7.281-7.297(m, 1Н), 7.537-7.552(d, 1Н, J=6 Гц); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 20.92, 51.16, 51.42, 73.44, 116.07, 116.96, 117.14, 118.716, 119.27, 119.83, 124.965, 125.24, 126.445, 127.12, 127.545, 128.266, 128.729, 129.260, 130.869, 134.072, 138.171, 150.600, 156.443 Температура плавления 108-112°С. (Фиг. 8)

Характеристика Соединения 9 (NPB):

¹Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ: 1.183-1.647(m, 8Н), 2.019-3.067(m, 8Н), 4.509(s, 1Н), 4.312-4.327(m, 1Н, NH), 5.965(s, 1Н), 6.668(m, 1Н), 6.801-6.896(m, 3Н), 7.073-7.190(m, 3Н), 7.305(m, 1Н), 7.527-7.542(m, 2Н), 7.770(s, 1Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 23.78, 33.18, 51.22, 51.78, 76.10, 117.14, 118.59, 119.67, 124.69, 124.98, 126.22, 127.53, 128.85, 129.29, 131.08, 134.08, 135.53, 140.28, 150.5, 156.1, 166.73; m/z (М+2,526.2,527.2) Температура плавления 174-178°С. (Фиг. 9)

Характеристика Соединения 10:

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ: 1.183-3.074(m, 8Н), 4.361 (s, 1Н), 5.034(s, 2Н), 6.658-6.694(t, 1Н, J=7,2 Гц), 6.768(m, 1Н), 6.856-6.873(m, 3Н), 7.023(m, 1Н), 7.055-7.094(m, 3Н), 7.164(m, 1Н), 7.231 (m, 1Н), 7.266(m, 1Н), 7.304(m, 1Н), 7.322-7.355(m, 2Н); ¹³С ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 51.264, 71.260, 75.434, 117.15, 118.6, 119.6, 124.8, 124.9, 127.3, 127.5, 128.1, 128.6, 128.8, 129.18, 150.5, 156.09; Температура плавления 75-80°С. (Фиг. 10)

Пример 2

Соединение формулы I снижает жизнеспособность клеток целого ряда клеток карциномы

Анализ онкогенности

Исходно авторы изобретения исследовали эффект недавно синтезированных низкомолекулярных соединений в отношении клеток MCF7 (ER+ МС клетки) с использованием анализа жизнеспособности клеток AlamarBlue®. Среди ряда новых низкомолекулярных соединений, NPB идентифицировали как эффективное низкомолекулярное соединение, уменьшающее жизнеспособность клеток MCF7, по сравнению с клетками, обработанными носителем (ДМСО). Среди данных соединений Соединение 9 N-цикпопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)бензамид (NPB) идентифицируют как наиболее сильное антипролиферативное соединение с IC₅₀ 6,5 мкМ. Далее авторы изобретения определяли ингибирующую концентрацию 50% (IC₅₀) NPB в широком диапазоне линий клеток карциномы, включая линии клеток карциномы, происходящие из ER-карциномы молочной железы (ВТ549, MDA-MB-231), ER+ карциномы молочной железы (MCF7, T47D и ВТ474), карциномы эндометрия (Ishikawa, ЕСС-1, RL95-2 и AN3), яичника (SK-OV-3, OVCAR-2, Caov-3, HEY С2 и OVCA433), гепатоцеллюлярной карциномы (Нер3В, Н2Р и Н2М), карциномы толстой кишки (НСТ116, DLD-1 и Сасо-2), предстательной железы (РС3, LNCaP и DU145) и поджелудочной железы (AsPC-1, ВхРС-3). В качестве контролей - нормальных клеток авторы изобретения также включали иммортализованные эпителиальные клетки молочной железы (MCF10A и MCF12A), и иммортализованные гепатоциты (LO2) в панели клеточных линий. Значения IC₅₀ для NPB в линиях клеток карциномы приведены в таблице на Фиг. 11.

Пример 3

NPB вызывает апоптотическую смерть клеток в целом ряду линий клеток карциномы

Кроме того, NPB оценивают в отношении нескольких клеточных линий ракового происхождения для определения эффекта, оказываемого на жизнеспособность цельных клеток, апоптоз и цитотоксичность, используя набор для анализа ApoTox-Glo™ Triplex, Promega (Сингапур), в соответствии с инструкциями производителя (Фиг. 12). Кратко, клетки засевают в черные непрозрачные 96-луночные планшеты (Corning®, Сингапур). После инкубации клеток в течение ночи среду меняют на указанную концентрацию NPB. После примерно 48 часов инкубации реагент для определения жизнеспособности/цитотоксичности, содержащий как субстрат GF-AFC, так и субстрат бис-AAF-R110, добавляют к клеткам, как предложено поставщиком. После примерно 45 минут инкубации при примерно 37°С флуоресценцию регистрируют в условиях возбуждения при 400 нм/ испускания при 505 нм в случае жизнеспособности и в условиях возбуждения при 485 нм / испускания при 520 нм в случае цитотоксичности, используя микропланшет-ридер Tecan для флуоресценции (Tecan, Сингапур). К клеткам дополнительно добавляют реагент Caspase-Glo 3/7 и, спустя примерно 25 минут инкубации при комнатной температуре, регистрируют люминесценцию, используя микропланшет-ридер Tecan. Количество жизнеспособных, цитотоксических и апоптотических клеток измеряют в трехкратной повторности.

Анализ апоптоза на основе Аннексина V и йодида пропидия (Аннексин V-PI)

Воздействие на фосфатидилсерин и смерть клеток оценивают посредством анализа FACS (от англ. Fluorescence-activated cell sorting - Сортировка клеток с активированной флуоресценцией) с использованием набора для окрашивания Annexin-V-FLUOS (Life Technologies, Сингапур) и PI-окрашенных клеток. Кратко, 1×10⁵ клеток MCF/лунка (190 мкл/лунка) засевают в 6-луночные планшеты и инкубируют с разными концентрациями NPB в течение примерно 24 часов, и образцы, обработанные ДМСО, используют в качестве контроля. Затем клетки промывают Аннексин V-связывающим буфером (10 мМ HEPES (от англ. 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)/NaOH, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂), окрашивают Аннексином V FITC в течение примерно 30 мин при комнатной температуре в темноте, затем снова промывают и ресуспендируют в Аннексин V -связывающем буфере, содержащем PI. Образцы сразу же анализируют на клеточном сортере BD FACSAria (BD Biosciences, San Jose, СА).

Потеря целостности мембраны и транслокация фосфатидилсерина к внешнему листку плазматической мембраны представляют собой ранние события апоптоза, которые могут быть выявлены с использованием окрашивания FITC-конъюгированным аннексином-V и йодидом пропидия. Отмечено, что NPB вызывает апоптоз в клетках MCF7, используя FITC-аннексин V и йодид пропидия. При обработке NPB увеличение уровня как ранних (PI негативных, FITC-Аннексин V позитивных), так и поздних апоптотических клеток (PI позитивных, FITC-Аннексин V позитивных) наблюдают дозозависимым образом, как показано на Фиг. 13А.

Пример 4

Молекулярное взаимодействие NPB с рекомбинантным белком BAD

Для обеспечения молекулярного взаимодействия наиболее перспективного кандидата, аффинности связывания NPB с BAD, авторы изобретения проводили измерения плазмонного поверхностного резонанса (SPR) с иммобилизованной субъединицей BAD, используя NPB в качестве аналита. Авторам изобретения известно, что BAD может связываться с субъединицей BAD in vitro. Вследствие этого, авторы изобретения анализировали данное взаимодействие, используя систему BIAcore. Рекомбинантный BAD иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5. Для определения кривых ассоциации и диссоциации разные концентрации NPB отдельно инъецировали на поверхность сенсорного чипа, покрытого BAD. Наложенные сенсограммы, показанные на Фиг. 14, совместно анализировали. Демонстрировали прямое связывание BAD с NPB (Фиг. 14А). Расчет кинетических параметров для взаимодействия NPB и BAD выявил константу скорости ассоциации (1,4±0,4)×10³ М^-1сек^-1 и константу скорости диссоциации (5,4±0,38)×10³ сек^-1 аффинности связывания, что давало константы равновесия диссоциации (Kd) 37,12 мкМ. Данные кинетические параметры демонстрируют подтверждение аффинности в отношении взаимодействия BAD со структурой NPB.

Анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса

Молекулярные взаимодействия анализировали на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием системы BIAcore-2000 (BIAcore АВ, Uppsala, Швеция). Человеческий рекомбинантный белок BAD (кат. № MBS143012, MyBiosource, США) иммобилизировали на сенсорном чипе, как описано в протоколе производителя. Для исследования взаимодействия BAD с NPB разные концентрации NPB (20-100 мкМ) в подвижном буфере (HBS-EP, рН 7,4, BIAcore АВ) инъецировали на поверхность сенсорного чипа с иммобилизированным BAD со скоростью потока 15 мкп/мин в соответствии с указаниями производителя. NPB давали взаимодействовать с субъединицей BAD в течение 2 мин в случае ассоциации и диссоциации, соответственно, после чего сенсорный чип регенерировали посредством инъецирования 1 М NaCl на протяжении 2 мин перед следующей инъекцией. Используя пробный выпуск программного обеспечения BIA 4.1 (BIAcore АВ), кинетические параметры представляли собой такие, как константы скорости ассоциации и диссоциации (ka и kd), константы равновесия диссоциации (Kd) с использованием модели связывания 1:1 с массопереносом. Полученные сенсограммы накладывались с использованием пробного выпуска программного обеспечения BIA.

Пример 5

Воздействие NPB на фосфорилирование ВАР является специфичным в отношении Ser99 (человека)

Фосфорилирование hBAD на уровне остатков Ser-75 (остаток серина 112 мышиного BAD) и Ser-99 (остаток серина 136 мышиного BAD) являются ключевыми в регулировании активности семейства BCL-2 антиапоптотических белков [15]. Форсфорилирование hBAD или в положении Ser-75, или Ser99 (или в положении соответствующих остатков в мышином Bad) приводит к потери способности hBAD к гетеродимеризации с BCL-xL или BCL-2 [15]. Для дополнительного подтверждения предсказанной мишени, авторы изобретения сначала проанализировали воздействие NPB на фосфорилирование hBAD в положении Ser99 посредством анализа вестерн-блоттинг. Обработка клеток MCF7 NPB приводила к дозозависимому снижению уровня фосфорилирования Ser99 hBAD без значимого изменения в общем белке hBAD (Фиг. 14Б). Рассчитанная ЕС₅₀ (полумаксимальная эффективная концентрация) для ингибирования фосфорилирования Ser99 BAD под действием NPB составляла 0,41 плюс/минус 0,21 мкМ.

Далее авторы изобретения анализировали воздействие NPB на фосфорилирование hBAD в обоих положениях Ser75 и Ser99 посредством анализа вестерн-блоттинг у 25 линий клеток карциномы, происходящих от семи разных типов рака. Наблюдалось, что NPB главным образом ингибирует фосфорилирование BAD в сайте Ser99 во всех анализируемых линиях клеток карциномы; однако, NPB не демонстрировал воздействия на фосфорилирование hBAD в сайте Ser75 в тех же клетках, указывая на то, что NPB специфично ингибирует фосфорилирование в положении Ser99 hBAD (Фиг. 15).

миРНК (малые интерферирующие РНК)-опосредованное истощение экспрессии BAD отменяет эффект NPB в линиях клеток карциномы

Для подтверждения функциональной специфичности NPB, направленной на белок BAD, авторы изобретения дополнительно исследовали эффект воздействия NPB после миРНК-опосредованного истощения экспрессии BAD у 6 линий клеток карциномы (MCF7, ВТ474, Caov-3, Ishikawa, AsPC-1 и DLD-1). Временная трансфекция разных клеток карциномы миРНК, направленной на транскрипт BAD, снижала уровень экспрессии BAD и также снижала уровни фосфор-Ser99 BAD, по сравнению с их контрольными клетками (трансфицированными рандомизированными олигонуклеотидами), как наблюдалось посредством анализа вестерн-блоттинг (Фиг. 16А). Жизнеспособность клеток, равно как и апоптоз, значимо не менялись при миРНК-опосредованном истощении BAD, как сообщалось ранее [26]. Как описано выше, NPB обработка линий контрольных трансфицированных клеток карциномы снижала уровень фосфорилирования BAD (Ser99), по сравнению с клетками, обработанными носителем. Одновременно, воздействие NPB на те же линии клеток карциномы снижало жизнеспособность клеток и повышало активность каспазы 3/7, по сравнению с клетками, подвергающимися воздействию носителя. Напротив, NPB не влиял на жизнеспособность клеток, равно как и на активность каспазы 3/7 в линиях клеток карциномы с истощенной экспрессией BAD (Фиг. 16В и С).

Пример 6

NPB ингибирует фосфорилирование BAD, независимо от AKT сигнализации в линиях клеток карциномы

Расположенная выше Ser/Thr киназа AKT регулирует фосфорилирование hBAD в положении Ser99 [13]. Авторы изобретения, таким образом, определяли то, ингибирует ли NPB фосфорилирование hBAD (Ser99) посредством модуляции активности AKT (на что указывает фосфорилирование Ser473) с использованием анализа вестерн-блоттинг. Авторы изобретения не наблюдали изменения в уровнях pAKT или уровнях общего белка AKT после воздействия 10 мкМ NPB на четыре разные линии клеток карциномы (MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1). Однако, все NPB-обработанные линии клеток карциномы (MCF7, Caov-3, Ishikawa и AsPC-1) демонстрировали ингибирование фосфорилирования BAD в сайте Ser99 и отсутствие изменения в уровне общего белка BAD (Фиг. 15В). Кроме того, авторы изобретения исследовали фосфорилирование BAD после истощения AKT, используя две независимые короткие РНК, образующие шпильки, нацеленные на экспрессию AKT, или ингибирование активности AKT под действием ингибитора AKT IV в качестве положительного контроля в разных линиях клеток карциномы. Авторы изобретения наблюдали, что истощенная экспрессия AKT в линиях клеток карциномы была ассоциирована с сопутствующим снижением уровней pAKT (Ser474) и pBAD (Ser99), по сравнению с контрольными клетками; что указывает на то, что фосфорилирование Ser99 BAD зависит от AKT во всех анализируемых линиях клеток ракового происхождения и как ранее опубликовано другими [13, 15, 27-29]. Таким образом, NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD в положении Ser99, не оказывая влияния на активность расположенной выше киназы (AKT) [29]. Данные результаты согласуются с электронным целевым прогнозированием и связыванием NPB с BAD, наблюдаемым посредством SPR. Следовательно, NPB специфично ингибирует фосфорилирование BAD в положении Ser99, независимо от расположенной выше киназы (AKT).

Пример 7:

Самкам мышей BALB/c-nu 5-6-недельного возраста подкожно имплантировали пеллеты с 17β-эстрадиолом (Американское инновационное исследование) в количестве 0,72 мг/пеллет с 60-суточным высвобождением в заднюю часть шеи, спустя трое суток, после того, как мышам подкожно инъецировали 100 мкл клеточной суспензии (1×10⁷ клеток) в правый бок. Рост опухоли отслеживали посредством измерения размера опухоли, используя калиперы. Примерно 12 суток после имплантации мышей случайным образом распределяли и делили на три группы (в каждой группе, n равен 8), в соответствии с обработками вводили 200 мкл NPB (растворенного в 5% ДМСО, 50% ПЭГ (полиэтиленгликоль) 400 и 45% воды, рН 5,0) посредством внутрибрюшинной инъекции каждые сутки на протяжении семи суток. Первую группу мышей обрабатывали носителем, вторую - дозой NPB 5 мг/кг и третью - дозой NPB 20 мг/кг. Массу животного и объемы опухоли измеряли ежедневно. После завершения опухоли удаляли, фотографировали, взвешивали и фиксировали или хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Гистологический анализ проводили, как описано ранее (30-32).

Авторы изобретения исследовали in vivo эффективность NPB в ксенотрансплантате (MCF7) МС. Мышам с преформированными опухолями (объем примерно 150 см³), сгруппированным случайным образом, внутрибрюшинно инъецировали носитель или NPB в количестве 5 мг/кг или 20 мг/кг. Значимое уменьшение объема опухоли наблюдали у мышей, обработанных NPB, в сравнении с их аналогами, обработанными носителем (Фиг. 17А). На протяжении данного периода отсутствовало значимое различие в массе животных среди групп (Фиг. 17А, ниже). Однако масса опухоли NPB-обработанных животных уменьшалась, по сравнению с мышами, обработанными носителем, и дозозависимым образом (Фиг. 17В). Кроме того, авторы изобретения анализировали воздействие NPB на уровни фосфорилирования Ser99 hBAD в опухолевой ткани с использованием анализа WB (Фиг. 17С). Обработка NPB значимо ингибировала фосфорилирование BAD (в положении Ser99) в опухоли, по сравнению с контрольными образцами. Никакого изменения в общих уровнях белка BAD не наблюдалось у NPB-обработанных опухолей и опухолей, обработанных контролем.

Гистологические анализы образцов опухоли, резецированных у животных, обработанных NPB, демонстрировали значимо сниженный уровень p-BAD (Ser99), в сравнении с опухолями, обработанными носителем (Фиг. 17D), тогда как значимое различие в белке BAD между данными группами отсутствовало. Животные, обработанные NPB, демонстрировали значимо сниженный процент Ki67 позитивных клеток в опухолях и значимо повышенную TUNEL позитивность, по сравнению с животными, обработанными носителем (Фиг. 17D).

Пример 8:

Для выявления факультативности того, что NPB снижает уровень фосфорилирования Ser99 hBAD посредством модуляции киназной активности, авторы изобретения оценивали воздействие NPB на разные киназы с использованием набора Human Phospho-Kinase Antibody Array из R&D Systems. Значимых изменений в киназной активности или фосфорилированных субстратах не наблюдали в клетках MCF7, подвергающихся воздействию NPB, в сравнении с клетками, подвергающимися воздействию ДМСО, несмотря на ингибирование фосфорилирования Ser99 hBAD под действием NPB в том же экстракте (Фиг. 18).

Пример 9:

Авторы изобретения также генерировали дополнительные аналоги NPB (Фиг. 19, 20, 21) в соответствии с заявленной химической матрицей и которые могут демонстрировать фармакокинетические профили лучше, чем у NPB. Их структура и эффективность in vitro, как определено IC₅₀, показаны на Фиг. 22.

Ссылки

1. Rakesh KS, Jagadish S, Vinayaka AC, Hemshekhar M, Paul M, Thushara RM, Sundaram MS, Swaroop TR, Mohan CD and Sadashiva MP. A New Ibuprofen Derivative Inhibits Platelet Aggregation and ROS Mediated Platelet Apoptosis. PloS one. 2014; 9(9):e107182.

2. Krautwald S, Ziegler E, Rolver L, Linkermann A, Keyser KA, Steen P, Wollert KC, Korf-Klingebiel M and Kunzendorf U. Effective blockage of both the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis in mice by TAT-crmA. The Journal of biological chemistry. 2010; 285(26): 19997-20005.

3. Riedl SJ and Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004; 5(11):897-907.

4. Hardwick JM and Soane L. Multiple functions of BCL-2 family proteins. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2013; 5(2).

5. Czabotar PE and Lessene G. Bcl-2 family proteins as therapeutic targets. Current pharmaceutical design. 2010; 16(28):3132-3148.

6. Anilkumar U and Prehn JH. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins in acute neural injury. Frontiers in cellular neuroscience. 2014; 8:281.

7. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K. and Walter P. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science; 2008. Classic textbook now in its 5th Edition. 2010.

8. Hutt KJ. The role of ВН3-only proteins in apoptosis within the ovary. Reproduction (Cambridge, England). 2015; 149(2):R81-r89.

9. Ambrosini G, Adida С and Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nature medicine. 1997; 3(8):917-921.

10. Keerthy HK, Mohan CD, Siveen KS, Fuchs JE, Rangappa S, Sundaram MS, Li F, Girish KS, Sethi G and Bender A. Novel synthetic biscoumarins target tumor necrosis factor-a in hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 2014; 289(46):31879-31890.

11. Smith AJ, Karpova Y, D'Agostino R, Jr., Willingham M and Kulik G. Expression of the Bcl-2 protein BAD promotes prostate cancer growth. PloS one. 2009; 4(7):e6224.

12. Doerflinger M, Glab JA and Puthalakath H. ВН3-only proteins: A 20-year stock-take. The FEBS journal. 2015.

13. Hayakawa J, Ohmichi M, Kurachi H, Kanda Y, Hisamoto K, Nishio Y, Adachi K, Tasaka K, Kanzaki T and Murata Y. Inhibition of BAD phosphorylation either at serine 112 via extracellular signal-regulated protein kinase cascade or at serine 136 via Akt cascade sensitizes human ovarian cancer cells to cisplatin. Cancer research. 2000; 60(21):5988-5994.

14. Macdonald A, Campbell DG, Toth R, McLauchlan H, Hastie CJ and Arthur JS. Pirn kinases phosphorylate multiple sites on Bad and promote 14-3-3 binding and dissociation from Bcl-XL. BMC cell biology. 2006; 7:1.

15. Fang X, Yu S, Eder A, Mao M, Bast RC, Jr., Boyd D and Mills GB. Regulation of BAD phosphorylation at serine 112 by the Ras-mitogen-activated protein kinase pathway. Oncogene. 1999; 18(48):6635-6640.

16. Masters SC, Yang H, Datta SR, Greenberg ME and Fu H. 14-3-3 inhibits Bad-induced cell death through interaction with serine-136. Molecular pharmacology. 2001; 60(6):1325-1331.

17. Harada H, Becknell B, Wilm M, Mann M, Huang LJ-s, Taylor SS, Scott JD and Korsmeyer SJ. Phosphorylation and inactivation of BAD by mitochondria-anchored protein kinase A. Molecular cell. 1999; 3(4):413-422.

18. Jiang P, Du W, Heese K and Wu M. The Bad guy cooperates with good cop p53: Bad is transcriptionally up-regulated by p53 and forms a Bad/p53 complex at the mitochondria to induce apoptosis. Molecular and cellular biology. 2006; 26(23):9071-9082.

19. Marchion DC, Cottrill HM, Xiong Y, Chen N, Bicaku E, Fulp WJ, Bansal N, Chon HS, Stickles XB, Kamath SG, Hakam A, Li L, Su D, Moreno C, Judson PL, Berchuck A, et al. BAD phosphorylation determines ovarian cancer chemosensitivity and patient survival. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2011; 17(19):6356-6366.

20. Sastry KSR, Al-Muftah MA, Li P, Al-Kowari MK, Wang E, Ismail Chouchane A, Kizhakayil D, Kulik G, Marincola FM, Haoudi A and Chouchane L. Targeting proapoptotic protein BAD inhibits survival and self-renewal of cancer stem cells. Cell death and differentiation. 2014; 21(12): 1936-1949.

21. Anderson MA, Huang D and Roberts A. Targeting BCL2 for the treatment of lymphoid malignancies. Seminars in hematology. 2014; 51(3):219-227.

22. Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, Armstrong RC, Augeri DJ, Belli BA, Bruncko M, Deckwerth TL, Dinges J and Hajduk PJ. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature. 2005; 435(7042):677-681.

23. Keerthy HK, Garg M, Mohan CD, Madan V, Kanojia D, Shobith R, Nanjundaswamy S, Mason DJ, Bender A and Rangappa KS. Synthesis and characterization of novel 2-amino-chromene-nitriles that target Bcl-2 in acute myeloid leukemia cell lines. PloS one. 2014; 9(9):e107118.

24. Bruncko M, Oost TK, Belli BA, Ding H, Joseph MK, Kunzer A, Martineau D, McClellan WJ, Mitten M, Ng SC, Nimmer PM, Oltersdorf T, Park CM, Petros AM, Shoemaker AR, Song X, et al. Studies leading to potent, dual inhibitors of Bcl-2 and Bcl-xL. Journal of medicinal chemistry. 2007; 50(4):641-662.

25. Petros AM, Nettesheim DG, Wang Y, Olejniczak ET, Meadows RP, Mack J, Swift K, Matayoshi ED, Zhang H, Thompson CB and Fesik SW. Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation from structure, mutagenesis, and biophysical studies. Protein science: a publication of the Protein Society. 2000; 9(12):2528-2534.

26. Boisvert-Adamo K and Aplin AE. Mutant B-RAF mediates resistance to anoikis via Bad and Bim. Oncogene. 2008; 27(23):3301-3312.

27. Seow HF, Yip WK, Loh HW, Ithnin H, Por P and Rohaizak M. Immunohistochemical detection of phospho-Akt, phospho-BAD, HER2 and oestrogen receptors alpha and beta in Malaysian breast cancer patients. Pathology oncology research: POR. 2010; 16(2):239-248.

28. Kanamori Y, Kigawa J, Itamochi H, Shimada M, Takahashi M, Kamazawa S, Sato S, Akeshima R and Terakawa N. Correlation between loss of PTEN expression and Akt phosphorylation in endometrial carcinoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2001; 7(4):892-895.

29. Datta SR, Brunet A and Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Akts. Genes & development. 1999; 13(22):2905-2927.

30. Pandey V, Wu ZS, Zhang M, Li R, Zhang J, Zhu T, et al. Trefoil factor 3 promotes metastatic seeding and predicts poor survival outcome of patients with mammary carcinoma. Breast Cancer Res. 2014;16(5):429.

31. Wang XN, Wang SJ, Pandey V, Chen P, Li Q, Wu ZS, et al. Trefoil factor 3 as a novel biomarker to distinguish between adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Medicine (Baltimore). 2015;94(20):e860.

32. You M, Chen Y, Chong Q, Wu M, Pandey V, Chen R, et al. Trefoil factor 3 mediation of oncogenicity and chemoresistance in hepatocellular carcinoma is AKT-BCL-2 dependent. Oncotarget. 2017.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (I):

где каждый R¹ независимо представляет собой ОН, NR¹⁰R¹¹, при этом каждый из R¹⁰ и R¹¹ независимо выбран из C_1-6 алкила; n равен 1, 2 или 3; R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперазин, замещенный одним заместителем R⁶; каждый R⁶ независимо выбран из фенила, который может быть замещен 1-2 заместителями, выбранными из галогена, С_1-2 алкила; R³ представляет собой фенил, нафтил, 5-6-членный гетероарил, содержащий 1 гетероатом, выбранный из О, N и S, любой из которых необязательно замещен одним заместителем R⁷, выбранным из галогено, -O(C_1-4 алкила), -C_1-4 галогеналкила или -C(O)NR⁸R⁹; каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н или С_3-6 циклоалкила; или его фармацевтически приемлемой соли. Технический результат: получены новые соединения, которые представляют собой ингибиторы фосфорилирования Bcl-2-ассоциированного промотора смерти (BAD) и обладают антиапоптотической активностью и полезны в лечении рака, в частности, рака молочной железы, рака эндометрия, рака яичника, рака печени, рака толстой кишки, рака предстательной железы или рака поджелудочной железы. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 22 ил., 2 табл., 9 пр.

1. Соединение общей формулы (I):

где:

каждый R¹ независимо представляет собой ОН, NR¹⁰R¹¹,

при этом

каждый из R¹⁰ и R¹¹ независимо выбран из C_1-6 алкила;

n равен 1, 2 или 3;

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперазин, замещенный одним заместителем R⁶;

каждый R⁶ независимо выбран из фенила, который может быть замещен 1-2 заместителями, выбранными из галогена, С_1-2 алкила;

R³ представляет собой фенил, нафтил, 5-6-членный гетероарил, содержащий 1 гетероатом, выбранный из О, N и S, любой из которых необязательно замещен одним заместителем R⁷, выбранным из галогено, -O(С_1-4 алкила), -С_1-4 галогеналкила или -C(O)NR⁸R⁹;

каждый из R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н или С_3-6 циклоалкила;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение общей формулы (IA):

где:

каждый R¹ независимо представляет собой -O(C_1-6 алкил);

m равен 2;

R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперазин, замещенный одним заместителем R⁶;

каждый R⁶ независимо выбран из фенила, который может быть замещен 1-2 заместителями, выбранными из галогена, С_1-2 алкила;

R³ представляет собой фенил, нафтил, 5-6-членный гетероарил, содержащий 1 гетероатом, выбранный из О, N и S, любой из которых необязательно замещен одним заместителем R⁷, выбранным из галогено, -O(С_1-4 алкила), -С_1-4 галогеналкила или -C(O)NR⁸R⁹;

каждый R⁸ и R⁹ независимо выбран из Н или С_3-6 циклоалкила;

или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п. 1, в котором n равен 1 или 2, и по меньшей мере одна R¹ группа представляет собой ОН.

4. Соединение по п. 1 или 2, в котором R^2a и R^2b вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют пиперазин, замещенный одним заместителем R⁶ в 4-ом положении пиперазина, таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IB):

где R¹, R³ и R⁶ являются такими, как определено в п. 2, а n равно 2.

5. Соединение по любому из пп. 1-3, в котором R³ представляет собой фенил, необязательно замещенный одним заместителем R⁷ таким образом, что соединение общей формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (IC):

где R¹, n, R^2a, R^2b и R⁷ являются такими, как определено для общей формулы (I), и z равен 0-1.

6. Соединение по п. 5, в котором R⁷ представляет собой -C(O)NR⁸R⁹, где R⁸ представляет собой Н и R⁹ представляет собой С_3-6 циклоалкил.

7. Соединение по любому из пп. 1-5, которое представляет собой соединение общей формулы (ID):

где R¹, n, R⁶, R⁷ и z являются такими, как определено выше.

8. Соединение по п. 1, выбранное из следующих соединений:

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 41, NCK1);

2-((4-хлорфенил)(4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 42, NCK2);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(3-метоксифенил)метил)фенол (Соединение 43, NCK3);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(нафталин-1-ил)метил)фенол (Соединение 45, NCK5);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 48, NCK8);

2-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(пиридин-3-ил)метил)фенол (Соединение 50, NCK10);

3-((4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)-N-циклопентилбензамид (Соединение 52, NCK16);

N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(4-(диэтиламино)-2-гидроксифенил)метил)бензамид (Соединение 53, NCK18);

2-((4-хлорфенил)(4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 55, NCK20);

2-(о-толил(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)фенол (Соединение 57, SG1);

2-((4-(п-толил)пиперазин-1-ил)(4-(трифторметил)фенил)метил)фенол (Соединение 58, SG2); и

N-цикпопентил-4-((2-гидроксифенил)(4-(п-толил)пиперазин-1-ил)метил)бензамид (Соединение 59, SG3); или их фармацевтически приемлемой соли.

9. Соединение по п. 2, которое представляет собой N-циклопентил-3-((4-(2,3-дихлорфенил)пиперазин-1-ил)(2-гидрокси-4,6-диметоксифенил)метил)бензамид (Соединение 54, NCK19).

10. Способ получения соединения по любому из пп. 1-9, который включает одно из двух:

i. взаимодействие альдегида общей формулы (II):

где R¹ является таким, как определено в п. 1 или 2, а n является таким, как определено в п. 1;

с соединением общей формулы (III):

где R^2a и R^2b являются такими, как определено в п. 1;

и бороновой кислотой общей формулы (IV):

где R³ является таким, как определено в п. 1; или

ii. взаимодействие соединения общей формулы (I), в котором R¹ представляет собой галогено, с соединением общей формулы (V):

где R^1a представляет собой арил или гетероарил, необязательно замещенный, как определено для R¹ в п. 1 или 2;

посредством реакции сочетания Сузуки в присутствии палладиевого катализатора с получением соединения общей формулы (I), в которой R¹ представляет собой R^1a.

11. Применение соединения по любому из пп. 1-9 для лечения рака, при котором происходит фосфорилирование BAD.

12. Применение соединения по любому из пп. 1-9 в получении агента для лечения рака, при котором происходит фосфорилирование BAD.

13. Способ лечения рака, при котором происходит фосфорилирование BAD, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп. 1-9.

14. Применение или способ по любому из пп. 11-13, где рак, при котором происходит фосфорилирование BAD, представляет собой рак молочной железы, рак эндометрия, рак яичника, рак печени, рак толстой кишки, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы или любой другой рак эпителиального происхождения, при котором фосфорилирован BAD.