Способ прогнозирования риска развития персистирующей инфекции, вызванной вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска Российский патент 2023 года по МПК G01N33/569 G01Q60/20 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и дерматовенерологии и может быть использовано в условиях женских консультаций и поликлиник для прогнозирования исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска. Метод основан на использовании данных о количестве лактобацилл в цервико-вагинальном содержимом и долях живых и апоптотических эпителиальных клеток.

Актуальность разработанного способа определяется высокой частотой встречаемости папилломавирусной инфекции гениталий у женщин (de Sanjosé, S. et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis. 7(7), 453-9 (2007).), что с учетом высокого онкогенного потенциала вируса папилломы человека приводит к увеличению частоты встречаемости ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки, влагалища и вульвы.

Особую опасность представляет не само наличие вируса папилломы, а его длительное персистирование (Ramakrishnan, S. et al. Overview of high-risk HPV's 16 and 18 infected cervical cancer: pathogenesis to prevention. Biomedicine & Pharmacotherapy, 70, 103-110. (2015).) в организме человека. В связи с этим, повышение точности прогнозирование исходов, то есть персистирования или элиминации инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, будет способствовать индивидуализации тактики наблюдения за пациенткой, позволит оценивать эффективность проводимой терапии, что будет способствовать профилактике и ранней диагностике предраковых или раковых состояний шейки матки, влагалища и вульвы.

Известен способ (патент RU 2520710 C1) прогнозирования персистенции онкогенных типов вируса папилломы человека в цервикальном эпителии, основанный на использовании иммунологических показателей. Другой известный способ (патент RU 2646785 C1) прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ-ассоциированным цервицитом, основан на оценке генных полиморфизмов в гене TLR6 и в гене ТР53. Также известны способы прогнозирования течения ВПЧ инфекции, основанные на обнаружении мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ (Fontecha N. et al. Assessment of human papillomavirus E6/E7 oncogene expression as cervical disease biomarker. BMC Cancer, 16(1), 852-859. (2016)) или pl6ink4a (патент RU 2572340 C1).

Недостатком указанных способов является то, что они не учитывают состояние нормальной микрофлоры влагалища и цервикального канала. Известно, что изменение видового состава микрофлоры является весомым фактором повышения риска развития рака шейки матки (Gao, W. et al.Comparison of the vaginal microbiota diversity of women with and without human papillomavirus infection: a cross-sectional study. BMC infectious diseases, 13(1), 271. (2013).; Mitra, A. et al. The vaginal microbiota, human papillomavirus infection and cervical intraepithelial neoplasia: what do we know and where are we going next? Microbiome. 4(1), 58 (2016).). Другим недостатком указанных способов является то, что они не позволяют оценить апоптоз инфицированных эпителиальных клеток, который является одним из мощных защитных механизмов (Upton, J.W. et al. Staying alive: cell death in antiviral immunity. Mol Cell. 54(2), 273-80 (2014).), используемых организмом человека в борьбе с вирусными инфекциями. Способность ВПЧ подавлять апоптоз инфицированных вирусом клеток (Orzalli, М.Н. et al. Apoptosis and Necroptosis as Host Defense Strategies to Prevent Viral Infection. Trends Cell Biol. 27(11), 800-809 (2017).) является причиной его длительного персистирования в организме, и, следовательно, увеличивает вероятность развития предраковых состояний. Кроме того, эти способы дороги, требуют сложного дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

В качестве прототипа был выбран способ диагностики (патент RU 2379690 С1) типа течения ВПЧ инфекции, основанный учете большого количества анамнестических и клинико-лабораторных параметров, включающих данные о состоянии вагинальной микробиоты, в том числе данные о количестве лактобацилл и иммунологических показателях. Одним из недостатков данного способа является необходимость проведения большого объема исследований, что подразумевает определенные материальные затраты, а также увеличивает время для постановки диагноза, другим недостатком является то, что способ направлен на диагностику типа течения и не позволяет прогнозировать исход ВПЧ инфекции.

Целью изобретения является повышение точности прогнозирования исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, что будет способствовать индивидуализации выбора тактики ведения таких пациенток.

Для достижения поставленной цели было обследовано 184 пациентки с подтвержденным методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) диагнозом папилломавирусной инфекции гениталий. До начала исследования у всех пациенток бактериологическим и молекулярно-биологическим методом определяли количество лактобацилл, условно-патогенных микроорганизмов и вирусную нагрузку ВПЧ в цервико-вагинальном содержимом, методом иммуноферментного анализа определяли концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов (IL-1β, ra IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, TGFβ, INFγ) и секреторного иммуноглобулина А. Дополнительно к этому, в первичной культуре эпителиальных клеток, полученных от пациенток, после обработки раствором пероксида водорода в концентрации не менее 50 мМ, методом флуоресцентной микроскопии с использованием набора, содержащего аннексии V-флуоресцеин в сочетании с пропидиум йодидом, оценивали изменение доли живых и апоптотических клеток. Через 6 и 12 месяцев в цервико-вагинальном содержимом повторно оценивали вирусную нагрузку ВПЧ. По результатам этих исследований все пациентки были разделены на 2 группы: 1 - пациентки у которых вирусная нагрузка снизилась или вирус папилломы человека полностью элиминировался (п=119); 2 - пациентки у которых количество вирусная нагрузка осталась на прежнем уровне или увеличилась (п=65).

Затем, для всех изучаемых параметров было проведено вычисление показателя информативности и прогностических коэффициентов с использованием последовательного анализа Вальда.

Прогностический коэффициент (ПК) вычисляли по формуле:

ПК=10×lgP₁/P₂, где

Р₁ - относительная частота признака в первой группе, выраженная в долях единицы.

Р₂ - относительная частота признака во второй группе, выраженная в долях единицы.

Показатель информативности (I_k) определяли с использованием критерия Кульбака по следующей формуле: I_k=ПК×0,5×(Р₁-Р₂).

Проведенный анализ позволил выделить наиболее информативные показатели для прогнозирования исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, которые представлены на Фиг 1.

Информативными показателями для прогноза исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска явились: количество лактобацилл в цервико-вагинальном содержимом, доля живых эпителиальных клеток и доля апоптотических эпителиальных клеток. Для каждого показателя были определены диапазоны признаков с разными прогностическими коэффициентами. Для количества лактобацилл менее 10⁴ КОЕ/мл ПК=+6, от 10⁴ КОЕ/мл до 10⁵ КОЕ/мл ПК=+1, 10⁵ КОЕ/мл и более - ПК=-5; для показателя доля живых эпителиальных клеток более 70% ПК=+7, от 50% до 70% ПК=+3, менее 50% - ПК=-4; для показателя доля апоптотических эпителиальных клеток менее 20% ПК=+5, от 20% до 30% ПК=+1, более 30% ПК=-7.

При суммировании прогностических коэффициентов у пациентов 1 группы, у которых через 6 или 12 месяцев вирусная нагрузка снизилась или вирус папилломы человека полностью элиминировался сумма прогностических коэффициентов была отрицательна. При суммировании прогностических коэффициентов у пациентов 2 группы, у которых через 6 или 12 месяцев вирусная нагрузка осталось на прежнем уровне или увеличилась, сумма прогностических коэффициентов была положительна.

Сущность изобретения заключается в том, что для прогнозирования исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, определяют количество лактобацилл в цервико-вагинальном содержимом и оценивают изменение после обработки эпителиальных клеток, полученных от конкретной пациентки раствором пероксида водорода в концентрации не менее 50 мМ долей живых и апоптотических эпителиальных клеток. Оценку исследуемых показателей проводят с помощью прогностических коэффициентов (ПК), где при количестве лактобацилл менее 10⁴ КОЕ/мл ПК=+6, от 10⁴ КОЕ/мл до 10⁵ КОЕ/мл ПК=+1, 10⁵ КОЕ/мл и более - ПК=-5; при доле живых эпителиальных клеток более 70% ПК=+7, от 50% до 70% ПК=+3, менее 50% - ПК=-4; при доле апоптотических эпителиальных клеток менее 20% ПК=+5, от 20% до 30% ПК=+1, более 30% ПК=-7, затем прогностические коэффициенты суммируют. Если сумма прогностических коэффициентов положительна, выносят решение о риске развития персистирующей инфекции, то есть, неблагоприятном исходе заболевания; если отрицательна - об отсутствии риска, то есть, благоприятном исходе заболевания.

Способ осуществляется следующим образом:

У пациентки, инфицированной ВПЧ, бактериологическим или молекулярно-биологическим методом определяют количество лактобацилл в цервико-вагинальном содержимом.

Одновременно с этим, путем соскоба клеток с влагалищной части шейки матки после удаления отслоившихся клеток стерильным физиологическим раствором получают первичную культуру многослойного плоского эпителия. С целью уменьшения количества бактерий и удаления разрушенных эпителиальных клеток, образец промывают один раз десятикратным объемом забуференного физиологического раствора с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 200 g. Количество эпителиальных клеток доводят до 10⁶ на мл с помощью гемоцитометра и делят на две части. К первой добавляют раствора Н²О² до концентрации не менее 50 мМ, ко второй вместо пероксида водорода добавляют такой же объем стерильного физиологического раствора. Через час в обеих частях определяют долю живых и апоптических эпителиальных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием набора, содержащего аннексии V-флуоресцеин в сочетании с пропидиум йодидом.

Затем по таблице (Фиг. 1) информативных показателей для прогноза исходов инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, определяют и суммируют прогностические коэффициенты конкретной пациентки. Если сумма прогностических коэффициентов положительна, выносят решение о риске развития персистирующей инфекции, то есть, неблагоприятном исходе заболевания; если отрицательна - об отсутствии риска, то есть, благоприятном исходе заболевания.

Примеры конкретного выполнения

Пример №1. Пациентка А., 26 лет, находилась на обследовании с диагнозом папилломавирусная инфекция, подтвержденным методом ПЦР. Количество вирусных частиц составило 10⁵ копий ДНК ВПЧ/10⁵ клеток. При анализе количество лактобацилл составило менее 10⁴ КОЕ/мл (ПК=+6); доля живых эпителиальных клеток 63% (диапазон от 50% до 70% ПК=+3); доля апоптотических эпителиальных клеток 32% (ПК=-7). Сумма прогностических коэффициентов составила ПК=6+3-7=+3), на основании чего был сделан прогноз о риске персистирующей инфекции, то есть о неблагоприятном исходе заболевания, который был подтвержден через шесть месяцев с использованием метода ПЦР, согласно которому количество вирусных частиц увеличилось в 10 раз и составило 10⁶ копий ДНК ВПЧ/10⁵ клеток.

Пример №2. Пациентка К., 36 лет, находилась на обследовании с диагнозом папилломавирусная инфекция, подтвержденным методом ПЦР. Вирусная нагрузка составила 10⁵ копий ДНК ВПЧ/10⁵ клеток. При анализе количество лактобацилл составило более 10⁶ КОЕ/мл (ПК=-5); доля живых эпителиальных клеток- 53% (диапазон от 50% до 70% ПК=+3); доля апоптотических эпителиальных клеток 42% (ПК=-7). Сумма прогностических коэффициентов составила ПК=-5+3-7=-9), на основании чего был сделан прогноз об отсутствии рисков персистирования ВПЧ, то есть, благоприятном исходе заболевания, который был подтвержден уменьшением вирусной нагрузки в 10 раз через шесть месяцев и элиминацией вируса к 12 месяцу наблюдения.

Таким образом, заявленный способ позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать исходы, то есть, персистирование или элиминация инфекций, вызванных вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и дерматовенерологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития персистирующей инфекции, вызванной вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого онкогенного риска. В цервико-вагинальном содержимом определяют количество лактобацилл. В первичной культуре эпителиальных клеток, полученных от пациентки, инфицированной ВПЧ, оценивают изменение доли живых и апоптотических эпителиальных клеток. Оценку исследуемых показателей проводят с помощью прогностических коэффициентов (ПК), где при количестве лактобацилл менее 10⁴ КОЕ/мл ПК=+6, от 10⁴ КОЕ/мл до 10⁵ КОЕ/мл ПК=+1, 10⁵ КОЕ/мл и более - ПК=-5; при доле живых эпителиальных клеток более 70% ПК=+7, от 50% до 70% ПК=+3, менее 50% - ПК=-4; при доле апоптотических эпителиальных клеток менее 20% ПК=+5, от 20% до 30% ПК=+1, более 30% ПК=-7. Суммируют прогностические коэффициенты. Если сумма прогностических коэффициентов положительна, прогнозируют риск развития персистирующей инфекции; если отрицательна - прогнозируют отсутствие риска. Способ обеспечивает возможность достоверного прогнозирования исходов инфекций, вызванных ВПЧ высокого онкогенного риска, за счет использования данных о количестве лактобацилл и долях живых и апоптотических эпителиальных клеток. 1 ил., 2 пр.

Способ прогнозирования риска развития персистирующей инфекции, вызванной вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска, характеризующийся тем, что в цервико-вагинальном содержимом определяют количество лактобацилл, в первичной культуре эпителиальных клеток, полученных от пациентки, инфицированной ВПЧ, оценивают изменение доли живых и апоптотических эпителиальных клеток после обработки раствором пероксида водорода в концентрации не менее 50 мМ, оценку исследуемых показателей проводят с помощью прогностических коэффициентов (ПК), где при количестве лактобацилл менее 10⁴ КОЕ/мл ПК=+6, от 10⁴ КОЕ/мл до 10⁵ КОЕ/мл ПК=+1, 10⁵ КОЕ/мл и более - ПК=-5; при доле живых эпителиальных клеток более 70% ПК=+7, от 50% до 70% ПК=+3, менее 50% - ПК=-4; при доле апоптотических эпителиальных клеток менее 20% ПК=+5, от 20% до 30% ПК=+1, более 30% ПК=-7, суммируют прогностические коэффициенты и, если сумма прогностических коэффициентов положительна, прогнозируют риск развития персистирующей инфекции; если отрицательна - прогнозируют отсутствие риска.