СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ АСТМЫ, ОБОСТРЕНИЯ АСТМЫ, АЛЛЕРГИЧЕСКИХ АСТМАТИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ И/ИЛИ РАССТРОЙСТВ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СВЯЗАННЫХ С МИКРОБИОТОЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 A61P11/00 A61P11/02 A61P11/04 A61P11/06 A61P17/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым способам и путям введения особых бактериальных экстрактов, получаемых щелочным лизисом грамположительных и/или грамотрицательных видов бактерий, и к устройствам доставки для лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, и/или симптомов, связанных с бронхообструкцией, и/или расстройств дыхательной системы, связанных с микробиотой, у людей, к перестройке защитной микробиоты у астматиков, а также к перестройке микробиоты в направлении защитного иммунитета у здоровых людей.

Уровень техники в области изобретения

Хронические заболевания дыхательных путей, такие как астма, аллергическая астма и другие бронхообструктивные заболевания, являются одной из основных проблем здравоохранения, особенно у детей. Астма является воспалительным заболеванием дыхательных путей в легких и бронхиолах, в результате которого временно воспаляются, сдавливаются и сужаются дыхательные пути. Астма может быть вызвана аллергенами или раздражителями, которые вдыхаются в легкие. Симптомы включают затрудненность дыхания, чрезмерное образование слизи и мокроты, бронхообструкцию, кашель и стеснение в груди. Первопричиной астмы является комплекс генетических и экологических факторов, приводящих к значительной разнородности заболевания. В последние десятилетия распространенность астмы в западных странах резко возросла, что, по всей вероятности, связано с воздействием изменяющихся факторов окружающей среды.

Новейшие данные подтверждают роль микробиоты в развитии астмы и обструктивных заболеваний, предполагая, что изменения микробиоты связаны с симптомами хронических заболеваний дыхательных путей и, в частности, с астмой и астматическим бронхитом. Предполагается, что на ранних стадиях жизни эти воздействия могут нарушать состав микробиоты и, следовательно, способствовать дисрегуляции иммунной системы в форме гиперчувствительных расстройств.

Здоровый микробиом обеспечивает хозяину множество преимуществ, в том числе устойчивость к заселению широким спектром патогенов, биосинтез и всасывание незаменимых питательных веществ, а также иммунную защиту и стимуляцию иммунитета, что поддерживает здоровым кишечный эпителий и надлежащим образом контролируемый общий иммунитет. Таким образом, кишечная микробиота играет значительную роль в патогенезе многих заболеваний и расстройств, в том числе различных патогенных инфекций пищеварительного тракта.

В условиях дисбаланса функции микробиоты могут быть потеряны или перепутаны, что приводит к повышенной восприимчивости к патогенам, измененным метаболическим профилям или к возбуждению провоспалительных сигналов, которые могут привести к местному или общему воспалению, или аутоиммунной реакции. В частности, были идентифицированы изменения микробиоты, связанные с несколькими хроническими заболеваниями дыхательных путей и такими симптомами, как астма и бронхообструкция. Следовательно, пациенты становятся более восприимчивыми к патогенным инфекциям, когда нарушается нормальная кишечная микробиота из-за применения антибиотиков широкого спектра действия. Многие из этих заболеваний и расстройств являются хроническими состояниями, которые значительно снижают качество жизни пациента и могут в конечном итоге привести к летальному исходу.

Настоящее изобретение базируется на неожиданном открытии, что интраназальное или интратрахеальное введение особых бактериальных экстрактов, получаемых щелочным лизисом грамположительных и/или грамотрицательных видов бактерий, обеспечивает эффективный и надежный подход к предотвращению аллергического воспаления в дыхательных путях, в то же время восстанавливая здоровый микробиом хозяина, страдающего от астмы и вызванных аллергией обострений, связанных, по всей видимости, с дисбалансом микробиоты.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к новым путям введения и дозировкам бактериального экстракта для применения в способах лечения и/или профилактики астмы, обострений астмы, аллергических астматических расстройств, бронхообструкции, а также расстройств дыхательной системы, связанных с микробиотой, у нуждающихся в этом субъектов.

Настоящее изобретение относится также к способу мониторинга лечения или профилактики болезни или патологии или несбалансированного микробиома у объекта исследования, включающему: (a) обработку объекта исследования терапевтически эффективным количеством очищенного бактериального экстракта, получаемого щелочным лизисом грамположительных и/или грамотрицательных видов бактерий; (b) анализ сигнатуры микробиома объекта исследования; и (c) сравнение указанной сигнатуры или профиля микробиома объекта исследования с сигнатурой или профилем микробиома здорового объекта, причем показателем эффективности лечения является повышение сходства сигнатуры микробиома объекта исследования с сигнатурой микробиома здорового объекта после лечения терапевтически эффективным количеством стабильного очищенного бактериального экстракта по сравнению со сходством сигнатуры микробиома объекта исследования с сигнатурой микробиома здорового объекта до лечения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает протокол, использовавшийся для оценки эффектов бактериального экстракта BV (сокращенно BV) в классической мышиной модели экспериментальной астмы, обусловленной аллергенами, с использованием мышей линии BALB/c. Использовавшаяся схема протокола была одинаковой в обоих экспериментах, за исключением дозы BV, показанной на фигуре 2.

Фиг. 2 показывает эффекты BV на эозинофилию бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), выраженную в процентах содержания клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, проиллюстрированные здесь с данными из исследования 1. Значительное ингибирование эозинофилии было получено при использовании дозы 1 мг BV, введенной 14 раз.

Фиг. 3 показывает эффекты BV на эозинофилию бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), как на фигуре 2, но с данными, полученные из другого эксперимента, причем содержание эозинофилов в БАЛ выражалось как доля от всех клеток БАЛ.

Фиг. 4 показывает репрезентативный пример корреляции функциональной эффективности, изображенной на фигурах 2 и 3, проиллюстрированный здесь с использованием функции легких в качестве представления данных. Гиперчувствительность дыхательных путей (AHR) существенно предотвращалась BV с достижением наивысшей эффективности при дозе 1 мг во всех контрольных точках. Значительное снижение AHR выражалось по отношению к яичному альбумину (OVA).

Фиг. 5 показывает протокол, использовавшийся для оценки защитного эффекта BV в модели аллергической астмы, вызванной альтернарией.

Фиг. 6 показывает репрезентативный пример защитного эффекта BV в модели аллергической астмы, вызванной альтернарией, после интраназального введения. Мониторинг эффективности основывался на подсчете различных видов клеток в БАЛ. Содержание эозинофилов в БАЛ выражалось в процентах клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, полученного согласно схеме эксперимента, описанной в примере 5.

Фиг. 7 показывает эффекты интраназального введения (i.n.) BV в модели Alternaria: сопротивление респираторной системы (Rrs) - максимальный ответ (отражает общее сопротивление дыхательных путей). Ответ Rrs в значительной степени предотвращался благодаря BV с достижением наивысшей эффективности при дозе 1 мг во всех контрольных точках. Было отмечено значительное снижение AHR в отношении Alternaria.

Фиг. 8 показывает более короткий протокол лечения астмы, вызванной OVA (19 вместо 39 дней, и 8 обработок вместо 14, по сравнению с фигурой 1).

Фиг. 9 показывает эозинофилию БАЛ, выраженную в процентах, а также в числе клеток, но происходящую из модифицированной схемы OVA-индуцированной астмы, изображенной на фигуре 8. В этих новых условиях также была подтверждена значительная блокада эозинофилии посредством BV.

Фиг. 10 показывает дополнительную схему астмы, вызванной OVA, использованную для мышей линии C57 BL6 и проверенной с BV, используя, как и ранее, 14 обработок дозой 1 мг в сутки на мышь, доставленной интраназально.

Фиг. 11 показывает, что бактериальный экстракт BV вызывает защитное снижение эозинофилии, а также защитное повышение нейтрофилии БАЛ, выраженное в процентах клеток.

Фиг. 12 является графиком PCoA невзвешенного UniFrac бета-разнообразия во всех экспериментах, показывая экстремальную кластеризацию между параллельными экспериментами (100, 101, 113), сравнивающими мышей, обработанных интраназально бактериальным экстрактом BV с или без OVA, или одним OVA, или PBS. Все обработки значительно отличались друг от друга (q<0,05; PERMANOVA).

Фиг. 13 показывает слева филогенетические профили уровня филума параллельных экспериментов (100, 101, 113), которые свидетельствуют об экстремальном различии в сообществах; и справа альфа-разнообразие параллельных экспериментов (101, 101 и 113), измеренное по наблюдаемым ESV и индексу разнообразия Шеннона, при этом прямоугольники показывают квартили 25-75%, а усы доверительные интервалы 95%.

Фиг. 14 показывает: (A) величину эффекта (LEfSe) согласно линейному дискриминантному анализу, которая выявляет характерные различия в нескольких таксономических уровнях между "любым BV" (BV/OVA и только BV) и "без BV" (только OVA и только PBS) в параллельных экспериментах 100, 101 и 113, используя отсечение q <0,05 и оценку LDA > 2. (B) Филогенетические соотношения между характерными свойствами (g: вид; f: семейство; o: порядок; c: класс).

Подробное описание изобретения

Итак, настоящее изобретение предлагает способ лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, симптомов, связанных с бронхообструкцией, а также расстройств, связанных с микробиотой, у нуждающегося в этом субъекта, или при риске развития таких расстройств, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества бактериального экстракта BV, получаемого щелочным лизисом грамположительных и/или грамотрицательных видов бактерий, причем указанный бактериальный экстракт вводится интраназально или интратрахеально.

Астматическое состояние может представлять собой астму, резистентную к стероидам, нейтрофильную астму или неаллергическую астму. Аллергическое заболевание или расстройство может представлять собой эозинофильное заболевание или расстройство, в частности, заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из узелковых утолщений, эозинофилии, эозинофильного ревматизма, дерматита и отечности (NERDS).

Было показано, что новые интраназальные и интратрахеальные пути введения бактериального экстракта BV согласно настоящему изобретению являются особенно выгодными для применения в процессах лечения, и/или профилактики, и/или ослабления астмы, обострений астмы, аллергических астматических расстройств, бронхообструкции, а также расстройств, связанных с микробиотой, у нуждающегося в этом субъекта.

Авторы изобретения продемонстрировали ниже в примерах, что интраназальное или интратрахеальное введение бактериального экстракта BV обеспечивает эффективную защиту от аллергической астмы в более низких дозировках и эффективно обеспечивает полную защиту от вызванной аллергенами гиперчувствительности дыхательных путей (AHR) и респираторных воспалений, полностью устраняя эозинофилию и обеспечивая повышенный защитный эффект нейтрофилии. Кроме того, авторы показали, что дозировки бактериального экстракта BV, вводимые интраназально или интратрахеально в более низких дозах, приводят к значительному снижению уровней IL13 и IL5 в легких, тогда как уровни IL17 значительно повышались, тем самым вовлекая путь, опосредованный IL17, в защитные эффекты BV.

Кроме того, заявители продемонстрировали, что интраназальное или интратрахеальное введение бактериального экстракта BV, даже в малых дозах, приводит к значительной реорганизации желудочно-кишечного тракта и обеспечивает защитный эффект против аллергической астмы и заметное снижение аллергической реакции из-за изменений микробиома.

Выражение "бактериальные экстракты BV" относится к бактериальному экстракту, получаемому щелочным лизисом одного или более патогенов, выбранных из Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и/или Streptococcus sanguinis, как описано в международной публикации WO2008/109669. Способ приготовления бактериального экстракта BV, полученного щелочным лизисом, предпочтительно при pH выше 10, также был описан в международной публикации WO2008/109669. Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт BV может содержать комбинацию всех перечисленных выше патогенов, которая продается под торговой маркой Бронхо-Ваксом^® (Broncho-Vaxom^®) для лечения респираторных заболеваний.

Типично бактериальные экстракты BV получают ферментацией с последующей тепловой инактивацией и щелочным лизисом и фильтрацией. В настоящее время ферментация, щелочной лизис и фильтрация хорошо известны в данной области и описаны, наряду с прочими, в международной публикации WO2008/109669.

Ферментацию обычно осуществляют путем выращивания каждого штамма бактерий до подходящей оптической плотности в культуральной среде. Чтобы получить достаточное количество материала каждого штамма, ферментацию культур можно начать, исходя из рабочего посевного материала, с последующей инокуляцией в более крупные ферментационные емкости. Например, ферментацию можно начать с малой культуры, как, например 0,1-1,0 литр, выдерживая примерно 3-6 часов при температуре от 30°C до 40°C, например, при 37°C, чтобы получить оптическую плотность (OD) на 700 нм от 3,0 до 5,0. После стадии мелкомасштабного культивирования можно провести дополнительное культивирование в одном или ряде более крупных ферментеров при температуре от 30°C 40°C в течение периода от 3 часов до 20 часов, например, 3-10 часов или 8 часов.

Культуральная среда предпочтительно является средой, которая не несет рисков прион-ассоциированных заболеваний, (например, коровье бешенство, губчатый энцефалит и болезнь Крейтцфельда-Якоба) или других заболеваний и, таким образом, не содержит материалов на животной основе, таких как сыворотка или мясные экстракты, взятые у таких животных как коровы или овцы, или у любых других животных, которые переносят вызываемые прионами заболевания. Например, можно использовать среду неживотного происхождения, например, среду на растительной основе, такую как среда на основе сои, или синтетическую или полусинтетическую среду. Альтернативно можно использовать среды, содержащие лошадиную сыворотку, или среды, содержащие материалы, взятые от видов животных, которые не переносят прионные инфекции. Культуральная среда может также включать биологические экстракты, такие как экстракты дрожжей и лошадиную сыворотку, которые также не несут риска таких заболеваний. Можно также ввести дополнительные факторы роста, чтобы усилить рост некоторых видов бактерий.

После ферментации биомассу от каждого бактериального штамма или от комбинированных бактериальных штаммов обычно инактивируют путем термообработки, концентрируют и замораживают.

Щелочной лизис используют для лизиса бактериальных клеток в щелочных условиях, его обычно проводят с использованием органического или неорганического основания. Щелочной лизис можно провести на единственной бактериальной биомассе или на смеси бактериальных биомасс или ферментационных партий, в щелочных условиях, типично с концентрированным раствором гидроксидных ионов, таким, как раствор NaOH. Щелочной лизис предпочтительно проводить при pH выше, чем примерно 10, с отклонениями pH ±0,1. Специалист может оценить продолжительность лизиса, которая зависит от начального количества бактериальной биомассы. Лизис можно проводить при температурах в интервале от 30°C до 60°C, например, в интервале 30-40°C или 35-40°C, например, при 37°C. Обычно лизис останавливают, как это хорошо известно специалистам в данной области, когда на основе визуальных наблюдений оказывается, что все бактериальные клетки разрушились. Если используется более одного штамма одного и того же вида бактерий, эти штаммы можно подвергать лизису вместе или по отдельности. Таким образом, штаммы можно смешивать до или после лизиса.

Затем лизаты можно очистить центрифугированием и/или фильтрацией, чтобы удалить крупные продукты распада клеток или любые компоненты, которые недостаточно разложились, любой нерастворимый или дисперсный материал, чтобы получить растворимый бактериальный экстракт. Очистка, включающая центрифугирование и фильтрацию, хорошо известна в данной области для удаления дисперсного вещества из экстрактов. Например, лизаты можно центрифугировать на 9000g, с последующей одной или более ступенями фильтрации. Типично фильтрация может включать проведение экстракта или смеси экстрактов через один или более фильтров, таких, как микрофильтры (т.е. микрофильтрация) или ультрафильтры (т.е. ультрафильтрация), что можно повторить в несколько проходов или циклов. Например, можно провести последовательные ступени фильтрации на фильтрах с более крупными порами с последующей микрофильтрацией с использованием фильтра с более мелкими порами, как фильтр 0,2 микрон. Можно также применять ультрафильтрацию, чтобы облегчить экстракцию растворимых веществ из экстракта, например, возвращая пермеат с ультрафильтрации на дополнительную микрофильтрацию. Можно использовать способ фильтрации тангенциальным потоком (TFF) для фильтрации экстракта и для экстрагирования солюбилизованных молекул из более крупных остатков разрушенных клеток. Это хорошо известно в данной области и описано, наряду с прочим, Wayne P. Olson в "Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications", Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, USA, pp. 126-135.

До настоящего времени бактериальный экстракт BV вводили пациентам перорально для профилактики инфекций дыхательных путей у взрослых и детей. Некоторые клинические исследования продемонстрировали, что энтеральное (пероральное) введение бактериального экстракта BV было способно предотвратить аллергическую астму и приступы бронхообструкции, спровоцированные острыми респираторными заболеваниями у детей при пероральном приеме. Указанные бактериальные экстракты BV продавались под торговой маркой Бронхо-Ваксом^® (Broncho-Vaxom^®). Препарат бактериального экстракта BV находится в твердой форме, обычно в виде капсулы, которая вводится пациентам перорально в режимах дозирования – одна капсула с 7 мг лиофилизованного бактериального экстракта в сутки для лечения взрослых и одна капсула в 3,5 мг лиофилизованного бактериального экстракта в сутки для детей.

В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, симптомов, связанных с бронхообструкцией, расстройств, связанных с микробиотой, у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества бактериального экстракта BV через интраназальный или интратрахеальный путь. Настоящее изобретение относится также к бактериальному экстракту BV для использования в процессе лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, симптомов, связанных с бронхообструкцией, расстройств, связанных с микробиотой, у нуждающегося в этом субъекта, причем указанный бактериальный экстракт BV вводится указанному субъекту интраназально или интратрахеально.

Интраназальное или интратрахеальное введение бактериальных экстрактов BV особенно полезно для лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств и/или симптомов, связанные с бронхообструкцией, и/или расстройств, связанных с микробиотой, у людей, для перестройки защитной микробиоты у астматиков, а также для формирования микробиоты в направлении защитного иммунитета у здоровых людей.

Термин "микробиота" относится к совокупности комменсальных, симбиотических и/или патогенных микробов. Микробы или микрорганизмы живут практически во всех частях экосферы и обнаруживаются везде в теле человека и на нем, включая слизистые оболочки носовых ходов, полость рта, влагалище, кожу, желудочно-кишечный тракт и мочеполовой тракт. Термин "микробиом" относится к полной совокупности микробов и генетической информации об этих микробах в определенной области тела ("среда обитания") хозяина. Каждый тип микробов может производить разные эффекты в окружении, в каком рождаются микробы. Состав микробиоты, которая может проживать на и внутри организма, например млекопитающего, может влиять на иммунную функцию, переработку питательных веществ и другие аспекты физиологии. Состав микробиоты может изменяться со временем и может зависеть от возраста, диеты, действия антибиотиков и других факторов окружающей среды. Когда разные виды микробов производят по существу одинаковый эффект, говорят, что микробиота имеет некоторую функциональную избыточность. Добавление или утрата видов микробов, которые производят близкие эффекты, может иметь слабое влияние на суммарный эффект, который микробиота оказывает на физиологию системы млекопитающих. Однако добавление или утрата некоторых видов микробов, даже если они присутствуют в малых количествах, может оказать значительное влияние на физиологию млекопитающего.

Термин "дисбаланс микробиома" или "дисбактериоз" относится к состоянию, в котором система не сбалансирована по полезным и вредным микробам. Дисбактериоз может возникнуть, когда имеется низкое разнообразие полезных видов микробов и/или отсутствует функциональная избыточность полезных микробов в микробиоте. Когда микробных видов, которые оказывают на систему то, что считается полезным эффектом, меньше, чем микробных видов, которые, как считается, оказывают вредный эффект на систему, говорят, что возник микробный дисбаланс. Как правило, в случае дисбактериоза сигнатура микробиома показывает перестройку измененного микробиома и увеличение лактобациллярных таксонов.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения и профилактики у людей таких заболеваний и их доказанной связи с расстройствами, связанными с микробиотой, ограниченными перестройкой защитной микробиоты у астматиков, а также ее формированию в направлении защитного иммунитета у здоровых людей.

В последние несколько лет большие проекты международного сообщества, называемые Microbiome Project (HMP), поддерживаемые Национальными институтами здравоохранения, более широко известными как International Human Microbiome Consortium (IHMC), направлены на определение характеристик микробов, живущих в и на нашем организме (см. http://hmpdacc.org/data_browser.php). В толстой кишке живет, согласно оценкам, 100 триллионов микроорганизмов, которые, очевидно, играют существенную роль в метаболизации пищи, лекарств и пищевых добавок, которые не усваиваются верхними отделами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Кроме того, некоторые из этих микроорганизмов вырабатывают незаменимые питательные вещества и витамины, необходимые для поддержания здоровья. Такие микробные взаимодействия в кишечной среде играют критическую роль в передаче сигналов метаболической, поведенческой и иммунорегуляторной систем человека-хозяина.

Микробиомы содержат комменсальные, симбиотические и патогенные бактерии, грибки и вирусы, которые образуют экологическую целостность и взаимодействуют друг с другом и с их конкретным хозяином. Долгое время предполагалось, что колонизация микробиоты ограничена поверхностями тела, как кожа и желудочно-кишечный тракт. Однако в последние годы стало ясно, что микроорганизмы живут почти во всех тканях человека, включая молочные железы, яичники, матку и плаценту. Таким образом, человеческое тело заселено триллионами микробных жителей. Они составляют разнообразное и индивидуально изменяющееся экологическое сообщество, которое, помимо всего прочего, меняется с возрастом.

Различные микробиомы напрямую вовлечены в этиопатогенез ряда патологических состояний, таких разных как астма, обострение астмы, аллергические астматические расстройства и симптомы, связанные с бронхообструкцией.

Таким образом, бактериальные экстракты BV, описанные выше в вариантах осуществления, являются полезными в восстановления естественного микробиома и особенно полезны для лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, симптомов, связанных с бронхообструкцией, расстройств, связанных с микробиотой.

Терапевтически эффективным является такое количество бактериального экстракта BV, что сигнатура или профиль микробиома субъекта становится более близким к сигнатуре или профилю микробиома здорового субъекта, что позволяет лечить и/или предупреждать любые патологические состояния, связанные с дисбалансом микробиома. То, что считается более здоровой системой, можно установить или восстановить, ограничивая вредные микробы и одновременно способствуя росту полезных микробов. В этом случае улучшается состояние эубиоза, при котором полезные микробы в системе оказывают доминирующее действие, так как имеется большое разнообразие и/или функциональная избыточность полезных видов микробов в системе.

Бактериальные экстракты BV могут находиться в любых формах: жидких, газообразных или твердых, подходящих для интраназального и интратрахеального введения. Когда бактериальные экстракты BV находяся в форме жидкости или аэрозоля, они могут быть введены в состав спрея, капель, коллоидного раствора, миста, небул или распыленного пара. Альтернативно, они могут присутствовать в твердой форме и тогда готовятся как порошки или хрупкие таблетки.

Когда препараты бактериального экстракта BV вводят интраназальным путем, они предпочтительно находятся в форме, выбранной из эмульсии, суспензии, коллоидной формы, миста, небул, распыленного пара или спрея, капель, коллоида, миста, небул, распыленного пара, назальнго тампона, назальной эмульсии, порошка, мази, крема, лосьона, геля, пасты, бальзама, раствора, тинктуры, накладки, биоадгезивной полоски.

Когда препараты бактериального экстракта BV вводятся интратрахеальным путем, доставка требует аэрозолизации жидкости или твердого тела и доставки аэрозоля к легким через рот и горло. Частицы бактериальных экстрактов BV могут быть введены в легкие как аэрозоли сухого порошка или жидкие аэрозоли. Аэрозоли сухого порошка обычно вводят в легкие с помощью устройств для ингаляции, называемых порошковыми ингаляторами (DPI). Порошковые ингаляторы могут включать порошковые ингаляторы, активируемые вдохом, какие описаны в патенте US 7434579. Дозирующие ингаляторы содержат лекарственное средство, суспендированное в газе-вытеснителе (пропелленте), смеси пропеллентов или в смеси растворителей, пропеллентов и/или других наполнителей в компактных дозаторах аэрозолей под давлением. Дозирующие ингаляторы (MDI) могут выдавать до нескольких сотен отмеренных доз бактериального экстракта BV. Каждое срабатывание может содержать от нескольких микрограммов (мкг) до миллиграммов (мг) активных компонентов, выдаваемых в объеме, типично составляющем от 25 до 100 микролитров.

Другим типом устройства для распыления жидкого аэрозоля является небулайзер, который использует струю, вибрирующее сито или другие средства для аэрозолизации суспензии, содержащей частицы бактериального экстракта BV.

При приготовлении жидких, полутвердых, твердых и аэрозольных медикаментов бактериальные экстракты BV можно при желании составлять с любыми добавками, такими, как носители, связующие, отдушки, ароматизаторы, подсластители, красители, антисептики, антиоксиданты, стабилизаторы и ПАВы.

Чтобы получить вышеупомянутые фармацевтические композиции, бактериальные экстракты BV можно смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями, адъювантами и/или наполнителями, в соответствии с обычными фармацевтическими методами смешения компонентов. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в композициях по настоящему изобретению, охватывают любые стандартные фармацевтические носители, такие как забуференный фосфатом солевой раствор, вода и эмульсии, такие как эмульсия масло-в-воде или вода-в-масле, и различные типы смачивателей. Композиция может дополнительно содержать твердые фармацевтические наполнители, такие как крахмал, целлюлоза, тальк, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко и тому подобное. Жидкие и полутвердые наполнители могут быть выбраны из глицерина, пропиленгликоля, воды, этанола и различных масел, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.д. Жидкие носители, в частности, растворы для инъекций включают воду, солевой раствор, водную декстрозу и гликоли. Примеры носителей, стабилизаторов и адъювантов смотри в Remington's Pharmaceutical Sciences, под редакцией E.W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990). Препараты бактериального экстракта могут также включать стабилизаторы и консерванты.

В некоторых вариантах осуществления может быть желательным продлить время пребывания в носовой полости, например, чтобы повысить впитывание. Таким образом, бактериальный экстракт BV факультативно можно готовить с биоадгезивным полимером, смолой, такой как ксантановая смола, хитозаном (например, высокочистый катионный полисахарид), пектином или любым углеводом, который загущается как гель или превращается в эмульсию при нанесении на слизистую оболочку носа, с микросферами, такими как крахмал, альбумин, декстран, циклодекстрин или их производные, с желатином, липосомами, карбомером, поливиниловым спиртом, альгинатом, акацией, хитозанами и/или целлюлозой (например, метил- или пропил-; гидрокси- или карбокси-; карбоксиметил- или гидроксипропил-).

Альтернативно, препараты бактериального экстракта BV могут быть приготовлены в виде хрупкой таблетки. Таблетку можно принимать целиком или чуть раздавить, например, нажатием пальцем, и рассыпать по подходящему носителю. Хрупкую таблетку можно получить, применяя способы прямого прессования и используя наполнители, остерегаясь повредить в процессе покрытие отдельных субъединиц. Подходящие наполнители для приготовления хрупкой таблетки включают наполнители, обычно использующиеся для жевательных таблеток, включая моно- и дисахариды, сахарные спирты и т.п. или их комбинацию. Примеры наполнителей включают маннит, сорбит, ксилит, мальтит, лактозу, сахарозу, мальтозу или их комбинацию. Факультативные фармацевтические наполнители, такие, как разбавители, смазки, глиданты, ароматизаторы, красители и т.д. или комбинацию, содержащую по меньшей мере одно из вышеназванных соединений, также можно включить в прессованную матрицу. Хрупкие таблетки можно приготовить с применением известных в области фармацевтики способов таблетирования.

Далее, композиция бактериального экстракта BV может находиться в коллоидной форме, содержащей, например, галогенид металла, наиболее предпочтительно галогенид серебра. Бактериальные экстракты BV и адъювант можно ввести внутрь или инкапсулировать коллоидной частицей. Альтернативно или дополнительно, один или более бактериальных экстрактов и адъювант могут прикрепляться к поверхности коллоидной частицы. Например, белки легко адсорбируются гидрофобными частицами или прикрепляются к ним через гидрофобные взаимодействия с поверхностью частиц, и вытесняют часть нейтрального эмульгатора.

Подходящие дозировки бактериального экстракта BV будут меняться в зависимости от условий, возраста и типа субъекта и могут быть легко определены специалистами в данной области. Однако, согласно настоящему изобретению, полная суточная дозировка может составлять от 0,005 до 2 мг, предпочтительно от 0,05 до 1 мг, наиболее предпочтительно от 0,5 до 1 мг, и ее можно вводить в виде единичной дозы или в виде разделенных доз, кроме того, верхний предел может быть также повышен до 2 мг, если к этому будут найдены показания.

Бактериальные экстракты BV могут вводиться интраназально с помощью назального инсуффлятора, интраназального ингалятора, интраназального брызгательного устройства, атомайзера, назального аэрозольного баллончика, однодозовой упаковки, насоса, пипетки, нажимного флакона, небулайзера, дозирущего ингалятора (MDI), компрессорного дозирующего ингалятора, инсуффляторов, двунаправленных устройств, ампул с дозой, назальных подушечек, назальных губок и назальных капсул. Предусмотрено также устройство доставки для применения в процессе лечения и/или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств, симптомов, связанных с бронхообструкцией, расстройств, связанных с микробиотой, у нуждающегося в этом субъекта.

Такие устройства доставки могут быть выбраны из группы, содержащей назальный инсуффлятор, интраназальные ингаляторы, интраназальные распылители, атомайзеры, назальные аэрозольные баллончики, однодозовые упаковки, насосы, пипетки, нажимные флаконы, небулайзеры, дозирущие ингаляторы (MDI), компрессорные дозирующие ингаляторы, инсуффляторы, двунаправленные устройства, ампулы с дозой, назальные подушечки, назальные губки, назальные капсулы и т.п.

Назальные спреи могут быть жидкими, твердыми назальными спреями для введения в виде аэрозолей или в неаэрозольных формах. Устройство для назальной доставки может быть дозирующим для точного введения эффективной дозы бактериального экстракта BV в носовую полость. Устройство для назальной доставки может предназначаться для доставки единичной дозы или нескольких доз. Терапевтически эффективное количество бактериального экстракта BV как определено выше согласно изобретению, может выдаваться через трубку, катетер, шприц, пакетик с выводом, жгут, назальный тампон или путем вливания пол слизистую оболочку, как описано в патентных публикациях США US 2009/0326275, US 2009/0291894, US 2009/0281522 и US 2009/0317377.

Когда интраназальное или интратрахеальное введение осуществляется через аэрозоли, аэрозольные спреи можно создать, например, используя емкость под давлением с подходящим пропеллентом, таким, как, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, углеводороды, сжатый воздух, азот, диоксид углерода или другой подходящий газ. Единицу дозирования можно задать, предусмотрев клапан, чтобы выдавать дозированное количество. Дозировочные распылители с насосом могут выдавать отмеренную дозу или дозу, содержащую частицы или капли особого размера. Как используется здесь, термин "аэрозоль" может относиться к суспензии или дисперсии жидких капель или твердого порошка в воздухе (или в газе). Жидкие капли можно образовать из растворов, суспензий и дисперсий лекарственного средства в жидкости, такой как вода или неводный растворитель. Аэрозоль можно вдувать или вдыхать через нос. Аэрозоли можно получить в любом подходящем устройстве, таком как MDI, небулайзер или распылитель тумана.

Типично аэрозоль можно вдувать, используя подходящее механическое устройство. В некоторых вариантах осуществления это устройство может содержать резервуар и распылитель, являющийся устройством, подходящим для выброса фармацевтической дозы в форме спрея. В резервуаре может содержаться некоторое число подлежащих введению доз бактериального экстракта BV, факультативно в жидком растворе или суспензии, или в виде твердой дисперсной композиции, такой как смесь твердых частиц.

Альтернативно можно использовать небулайзеры. Эти устройства создают высокоскоростной поток воздуха, который вызывает распыление подлежащего введению бактериального экстракта BV в форме жидкости в виде тумана, такого как тонкодисперсные частицы, из которых 90% или больше имеют диаметр менее примерно 10 мкм.

Другим устройством доставки для интраназального или интратрахеального введения бактериальных экстрактов BV согласно настоящему изобретению могут быть DPI-устройства, которые, как правило, вводят терапевтически эффективное количество в форме свободно сыпучего порошка, который можно рассеять в создаваемый пациентом воздушный поток во время вдоха. В настоящем изобретении можно также применять DPI-устройств, которые используют внешний источник энергии. Чтобы получить свободно сыпучий порошок, бактериальный экстракт BV можно приготовить с подходящим наполнителем, таким, например, как лактоза. Сухую порошковую композицию можно приготовить, например, соединяя сухую лактозу, имеющую размер частиц от примерно 1 мкм до 100 мкм, с тонкодисперсными частицами бактериального экстракта BV и осуществляя сухое смешение. Альтернативно, бактериальный экстракт BV можно составлять без наполнителей. Композицию загружают в дозатор сухого порошка или в картриджи или капсулы для ингаляции для применения с устройством доставки сухого порошка. Примеры DPI-устройств, имеющихся в продаже, включают Diskhaler (линия GlaxoSmith, Research Triangle Park, N.C.) (патент US 5035237); Diskus (патент US 6378519; Turbuhaler (патент US 4524769) и Rotahaler (патент US 4353365). Другие примеры подходящих DPI-устройств подробнее описаны в патентах US 5415162, US 5239993 и US 5715810.

MDI-устройства типично выдают терапевтически эффективное количество бактериального экстракта BV, используя сжатый газ-вытеснитель. Композиции для введения с помощью MDI включают раствор или суспензию активного компонента в сжиженном пропелленте. Композицию помещают в аэрозольный баллончик, который является частью MDI-устройства. Примеры пропеллентов включают гидрофторалканы (HFA), такие как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134a) и 1,1,1,2,3,3,3-гептафтор-н-пропан (HFA 227) и хлорфторуглероды, такие как CC1₃F. Дополнительные компоненты HFA-композиций для введения посредством MDI-устройства включают сорастворители, такие, как этанол, пентан, вода, и ПАВы, такие как сорбитан триолеат, олеиновая кислота, лецитин и глицерин. MDI-устройства были описаны, в частности, в патенте US 5225183 и международной публикации WO92/22286.

Когда бактериальные экстракты BV находятся в форме порошков, их можно вводить интраназальным или интратрахеальным путем согласно настоящему изобретению, используя назальные инсуффляторы. Как правило, они могут абсорбироваться твердой поверхностью, например, носителем и, таким образом, доставляться в носовую полость как порошок, например, в форме микросфер. Порошок или микросферы можно хранить в емкости инсуффлятора и затем вводить в сухой раздаваемой воздухом форме. Альтернативно, порошок или микросферы можно поместить в капсулу, как желатиновая капсула, или в другую единичную стандартную дозу, подходящую для назального введения.

Когда бактериальные экстракты BV по настоящему изобретению доставляются через распылитель назального спрея, они могут быть помещены в дозатор для интраназального спрея или распылитель и могут наноситься путем распыления в ноздри субъекта для доставки до слизистой оболочки ноздрей. В случае интраназального спрея можно применять до примерно 200 микролитров, от примерно 50 до примерно 150 микролитров или от примерно 75 до примерно 120 микролитров. Дозирование можно осуществлять в одну или обе ноздри, и нанесение можно применять так часто, как это желательно или как необходимо. Первые микролитры дозы можно ввести в одну ноздрю. После подходящего периода времени, когда количество жидкости впитается, можно последовательно ввести вторую дозу в ту же ноздрю или ее можно ввести в другую ноздрю. Можно использовать дополнительные дозированные спреи, чередуя ноздри, пока пациент не получит полную целевую терапевтическую дозу. Между введениями бензодиазепинового препарата в одну и ту же ноздрю может быть промежуток продолжительностью от нескольких секунд до 5 минут, предпочтительно от примерно 10 секунд до примерно 1 минуты. Это дает время лекарству пересечь слизистую оболочку носа и войти в кровоток. Несколько нанесений дозированных спреев в каждую ноздрю, факультативно разделенных временным интервалом, позволяют ввести полную терапевтическую дозу достаточно малыми шагами, чтобы обеспечить полное всасывание композиции в кровоток и избежать потери лекарственного средства в нижнюю часть горла.

Кроме того, бактериальные экстракты BV могут содержать адъюванты, фармацевтически приемлемые растворители и усилители проницаемости. Например, для интраназальной доставки усилитель проницаемости может повышать проникновение композиции через слизистую оболочку носа. В некоторых вариантах осуществления в качестве усилителя проницаемости можно использовать соединения, содержащие одну или более одной гидроксильной группы. Некоторые из этих содержащих гидроксильную группу соединений могут также служить растворителями в композиции. Неограничивающие примеры соединений, содержащих гидроксильную группу, которые можно использовать в качестве усилителей проницаемости, включают спирты (такие, как этанол), диолы (такие, как пропиленгликоль, известный также как 1,2-пропандиол; 1,3-пропандиол; бутиленгликоли, в том числе 1,3-бутандиол, 1,2-бутандиол, 2,3-бутандиол и 1,4 бутандиол; гексиленгликоль; дипропиленгликоль, 1,5-пентандиол, 1,2-пентандиол, 1,8-октандиол, этогексадиол, п-ментан-3,8-диол, 2-метил-2,4-пентандиол), триолы (такие как глицерин), полиолы (такие как подходящие полимеры, содержащие несколько гидроксильных групп, в том числе полиэтиленгликоли, или PEG, полипропиленгликоли, полисорбаты и сложные эфиры сорбита; а также подходящие сахарные спирты), циклитолы (такие как пинитол, инозитол), циклические диолы (такие как циклогександиол), ароматические диолы (такие как гидрохинон, бисфенол A, резорцин и катехол).

Специалисту среднего уровня в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение также применимо к другим усилителям проницаемости. Они могут включать простые алифатические, ненасыщенные или насыщенные сложные эфиры. Неограничивающие примеры таких сложных эфиров включают изопропилмиристат, миристилмиристат, октилпальмитат и тому подобное. Неограничивающие примеры других усилителей проницаемости включают спирты включают спирты (например, коротко- и длинноцепочечные спирты), полиспирты, амины и амиды, мочевину, аминокислоты и их сложные эфиры, амиды, азоны или пирролидон и его производные, терпены, жирные кислоты и их сложные эфиры, макроциклические соединения, сульфоксиды, ПАВы, хлорид бензилдиметиламмония, бромид цетилтриметиламмония, синеол, кокамидопропил бетаин, кокамидопропил гидроксисултаин, додецилпиридинийхлорид, додециламин, гексадецил триметиламмониопропансульфонат, лимонен, линолевая кислота (OA), линоленовая кислота (LA), ментол, метиллаурат, метилпирролидон, N-децил-2-пирролидон, NLS, никотинсульфат, нонил-1,3-диоксолан, октилтриметиламмонийбромид, олеилбетаин, ПП, полиэтиленгликоля додециловый эфир, полиоксиэтилен сорбитан монолаурат (Tween 20, или полисорбат 20), SLA, олеат натрия, лаурилсульфат натрия, октилсульфат натрия (SOS), сорбитан монолаурат (S20), тетракаин и Triton X-100.

Примеры фармацевтически приемлемых растворителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, можно найти в справочниках, таких Руководстве по фармацевтическим эксципиентам (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition, Pharmaceutical Press, London & American Pharmacists Association, Washington, 2006). Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых растворителей, которые могут быть использованы в композиции по настоящему изобретению, включают, без ограничений, пропиленгликоль, такой как 1,2-дигидроксипропан, 2-гидроксипропанол, метилэтиленгликоль, метилгликоль или пропан-1,2-диол, этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, глицерин, полиэтиленгликоль (PEG), гликоль, Cremophor EL или любые формы полиэтоксилированного касторового масла, дипропиленгликоль, диметилизосорбид, пропиленкарбонат, N-метилпирролидон, гликофурол, тетраэтиленгликоль, сложные эфиры пропиленгликоля и жирной кислоты, а также их смеси.

Настоящее изобретение относится также к наборам, содержащим описанные выше бактериальные экстракты BV, или к устройству доставки для вмещения бактериального экстракта BV и к вкладышу в упаковку, содержащему инструкции по применению.

Первая серия экспериментов: защита от астмы

Пример 1

Влияние различных дозировок бактериальных экстрактов BV на модели астмы, вызванной OVA

Группы из четырех мышей, получавших 6 доз бактериального экстракта BV (ниже BV) исследовали в двух раздельных экспериментах с использованием интраназального пути после анестезии:

- исследование 1: 5-50-1000 мкг/обработка x 14 обработок,

- исследование 2: 1-10-100 мкг BV/обработка x 14 обработок.

Режим выбирали из результатов предыдущих исследований, выполненных во время разработки модели астмы, вызываемой яичным альбумином (OVA), с использованием другого течения болезни с пылью амишей. Дозы BV были взяты из предшествующих оптимизированных исследований с использованием моделей вирусной инфекции и были расширены в данной экспериментальной схеме до 1 и 2,2 мг на дозу.

Для этого в фазе 1 были разработаны эксперименты зависимости доза-ответ, в которых иммунизированные OVA мыши обрабатывались интраназально (i.n.) каждые 2-3 дня, начиная со дня 0 до дня 32 (всего 14 раз) с увеличивающимися дозами бактериального экстракта BV (1, 5, 10, 50, 100 или 1000 мкг/мышь/обработка). Доза 1 мг/мышь была предложена в качестве исследовательской.

В фазе 2 этот же протокол был принят для дальнейшего исследования концентрации BV, которая демонстрировала оптимальные эффекты (1000 мкг/мышь/обработка), и добавляли более высокую дозу (2250 мкг/мышь/обработка), чтобы оценить, можно ли достичь плато максимальной защиты.

Модель астмы животных, индуцированной OVA

Самцы мышей BALB/c возрастом 7-8 недель закупали у Envigo (США) и содержали в условиях, не содержащих специфического патогена, в виварии Института BIO5. Животных кормили стандартной гипоаллергенной диетой.

В примере схемы с фигуры 1 концентрат бактериального экстракта BV разбавляли в 0,9%-ном солевом растворе. Была принята модель OVA из ссылки Stein M et al. В двух словах, бактериальный экстракт BV (1, 5, 10, 50, 100, 1000 мкг/мышь/обработка в 50 мкл (микрлитров) солевого раствора) закапывали интраназально (i.n.) под легкой анестезией изофлураном равномерно в две ноздри каждые 2-3 дня (всего 14 раз), начиная с дня 0 до дня 32 7-8 недельным мышам BAKB/c (Envigo), которые были сенсибилизированы внутрибрюшинно (i.p.) яичным альбумином (OVA: сорт V, Sigma, 20 мкг)- Alum (Pierce) в дни 0 и 14, и заражали i.n. OVA (50 мкг) в дни 28 и 38. Одна группа мышей получала солевой раствор во время обработки, сенсибилизации и заражения. В эксперименте 3 одну группу мышей подвергали имитации обработки.

Окончательные оценки в день 39 включали использование показаний, не являющихся исчерпывающими: 1) инвазивные измерения AHR; 2) насыщенность клетками бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) с подсчетом различных видов клеток; 3) уровни цитокинов РНК и белка в легких; 4) анализ выбранных популяций клеток легких; 5) измерение сывороточных OVA-специфических уровней IgE.

В начальных исследовательских экспериментах (исследование 1 и исследование 2) оценивали сопротивление дыхательных путей в ответ на повышение концентраций распыленного метахолина (0-40 и 0-60 мг/мл) на животных, анестезированных кетамином и ксилазином (100 и 10 мг/кг, соответственно) и парализованных бромидом панкурония (4 мкг/г). Трахеи широко рассекали и канюлировали с помощью канюли 20-го калибра (BD), удерживаемой на месте с помощью единственного связующего шва. Затем мышей подключали к маленькому вентилятору (FlexiVent FX, SCIREQ, Inc.) и вентилировали с дыхательным объемом 10 мл/кг, отношением вдох/выдох 66,67%, интенсивностью дыхания 150 мин^-1 и максимальным давлением 30 см H₂O. В последнем эксперименте с оптимальной концентрацией бактериального экстракта BV (1000 мкг/мышь/обработка, исследование 3), измеряли сопротивление дыхательных путей в ответ на увеличение доз ацетилхолина (0-1 мкг/мышь), вводимых внутривенно. БАЛ получали, вводя холодный 1%-ный BSA в PBS (2 мл) в дыхательные пути через трахеальную канюлю и осторожно отсасывая жидкость. Клетки подсчитывали, используя автоматизированный счетчик клеток Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) и подсчет различных видов клеток проводился оператором, работающим с обезличенными данными по ID/группировке мышей после окрашивания Hema 3 (Fischer), исследуя по меньшей мере 400 клеток на предметное стекло. Цитокины в БАЛ (IL-5, IL-13, IL-17) измеряли посредством ELISA (R&D).

Статистический анализ: Статистические различия всех параметров оценивали, используя непарный двусторонний t-критерий Стьюдента. Значения p <0,05 считались статистически значимыми.

Пример 2

Пример, иллюстрирующий эффекты интраназального введения бактериального экстракта BV в модели астмы, вызванной OVA.

Мониторинг эффективности на основе эозинофилии БАЛ, выраженной в процентах, согласно экспериментальной схеме, описанной в примере 1. Чтобы оценить эффективность бактериального экстракта BV в снижении эозинофилии, что связано с защитой гиперчувствительности дыхательных путей легких (AHR), было проведено два отдельных эксперимента с разными дозами BV. Наилучшая эффективность в отношении снижения эозинофилии (ось Y) достигалась со значительным ингибированием при дозе 1 мг BV.

Пример 3

Идентичен примеру 2, но происходит из другого эксперимента, при этом содержание эозинофилов в БАЛ было выражено как содержание клеток. Как и в примере 2, бактериальный экстракт BV вызывал ингибирование эозинофилии БАЛ со значительным ингибированием при дозе 1 мг. Учитывая высокую индукцию эозинофилии яичным альбумином, что характеризуется числом клеток в БАЛ (> 120000 клеток), полное или значительное устранение содержания эозинофилов в БАЛ для такого класса продукта было неожиданным.

Пример 4

Репрезентативный пример двух групповых экспериментов, демонстрирующий защиту бактериальным экстрактом BV от AHR, причем наилучшие защитные эффекты достигались при дозе 1 мг. Сопутствующее устранение эозинофилии, показанное на фигурах 2 и 3, вместе с функциональным отключением AHR легкого демонстрирует и подтверждает способность вводимого интраназально бактериального экстракта BV обеспечивать защиту в хорошо известной модели аллергической астмы и показывает, что доза 1 мг /день/мышь x 14 обработок достаточна для обеспечения оптимальной защиты от аллергического AHR и воспаления дыхательных путей. Защита, достигаемая с помощью этого режима, была глубокой, даже несмотря на то, что BV вводили взрослым, а не новорожденным или молодым мышам, и его введение начинали одновременно с воздействием аллергена, а не раньше.

Пример 5

Схема, показывающая экспериментальные параметры введенного интраназально (i.n.) бактериального экстракта BV в модели аллергической астмы, вызванной альтернарией, с использованием суточной дозы 1 мг, в соответствии с режимом 14 введений.

Пример 6

Эффекты интраназального введения бактериального экстракта BV в модели аллергической астмы, вызванной альтернарией, отслеживали по разнице БАЛ. Как показано на фигуре 6, бактериальный экстракт BV, использующийся в дозе 1 мг (14 раз) позволил достичь ингибирования эозинофилии в содержимом БАЛ примерно на 40%. Учитывая высокую значимость этой переносимой на людей модели астмы (тот же путь сенсибилизации и заражения), эти результаты четко показывают способность бактериального экстракта BV обеспечивать защиту при астме, вызванной аллергией.

Мыши линии BALB/c (4-6 на группу) сенсибилизировали Alternaria (Greer Labs: 50 мг сухого веса, 10 мг белка в 50 мл PBS) интраназально в дни 0 и 1 и заражали интраназально Alternaria (25 мг сухого веса, 5 мг белка в 50 мл) в дни 17, 18 и 19.

BV (концентрат, 1 мг в 50 мл) вводили каждые два 2 дня 14 раз, начиная с дня -10. Окончательную оценку проводили на двадцатый день. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа получали, вводя холодный 1%-ный BSA в PBS (2 мл) в дыхательные пути через трахеальную канюлю и осторожно отсасывая жидкость. Клетки подсчитывали, используя автоматизированный счетчик клеток Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) и подсчет различных видов клеток проводился оператором, работающим с обезличенными данными по ID/группировке мышей после окрашивания Hema 3 (Fischer), с исследованием по меньшей мере 400 клеток на предметное стекло.

Пример 7

Показан репрезентативный пример корреляции функциональной эффективности, показанной на фигуре 7, проиллюстрированный здесь с функцией легких в качестве снимаемых показаний. Реакция сопротивления дыхательной системы (Rrs) в значительной степени предотвращалась бактериальным экстрактом BV с наилучшей эффективностью при дозе 1 мг во всех контрольных точках. Проявилось значительное снижение AHR по отношению к Alternaria.

Сопротивление дыхательных путей в ответ на повышение концентраций ацетилхолина (0-2 мг/г мышь), вводимого внутривенно, оценивали на животных, анестезированных кетамином и ксилазином (100 и 10 мг/кг, соответственно) и парализованных бромидом панкурония (4 мкг/г). Трахею широко рассекали и канюлировали с помощью канюли 20-го калибра (BD), удерживаемой на месте с помощью единственного связующего шва. Затем мышей подключали к маленькому вентилятору (FlexiVent FX, SCIREQ, Inc.) и вентилировали с дыхательным объемом 10 мл/кг, отношением вдох/выдох 66,67%, интенсивностью дыхания 150 мин^-1 и максимальным давлением 30 см H₂O. Как показано на фигуре 6, снижение эозинофилии в БАЛ на 30-40% полностью коррелирует с функциональными показаниями легких, где BV подтверждал почти полную защиту от AHR в этой модели экстремально острой аллергической астмы.

Пример 8

Фигура 8 показывает репрезентативный пример схемы, показанной на фигуре 1, но с изменениями в OVA-индуцированной астме. В модели снова используется превентивный режим BV, но теперь сокращенный до 8 введений (обработки T1-T8), после которых опять следовали две последовательные сенсибилизации, вызываемые OVA, и заражение, при сокращении времени оценки (окончательная оценка не на 39й, а на 19й день).

Пример 9

Показаны эффекты BV на эозинофилию бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), как на фигуре 2, выраженные в данном примере в процентах, а также в числе клеток, но полученные из модифицированной схемы OVA-индуцированной астмы, показанной на фигуре 9. Ингибирование эозинофилии бактериальным экстрактом BV было значительным, сопровождаясь значительным пополнением популяции нейтрофилов в БАЛ. Количество мышей составляло 4 мыши/группу, использовалось 1 мк/50 мкл.

Пример 10

Оценка OVA-индуцированной астмы на другом штамме мышей.

Фигура 10 показывает репрезентативный пример схемы, использованной на фигуре 1, но с изменениями в отношении OVA-индуцированной астмы. В модели снова использовался превентивный режим бактериального экстракта BV: использование 14 введений (обработки T1-T14) с последующими двумя сенсибилизациями, индуцированными OVA, и тремя заражениями OVA. Окончательная оценка проводилась на 30-ый день.

Пример 11

Этот пример иллюстрирует эффекты интраназального введения бактериального экстракта BV в модели астмы, индуцированной OVA, с использованием схемы, показанной на фигуре 10 и адаптированной к мышам C57 BL6. Мониторинг эффективности базировался на эозинофилии БАЛ, выраженной на фигуре 11 как проценты от полного содержания клеток БАЛ (ось Y). Результаты показали эффективность BV в снижении эозинофилии, что ассоциируется с защитой гиперчувствительности дыхательных путей легких (AHR). Наилучшая эффективность снижения эозинофилии достигалась при дозе 1 мг BV.

Вторая серия экспериментов: изменения мкробиоты

Пример 12

Влияние интраназального или интратрахеального введения бактериального экстракта BV на микробиом кишечника мышей

В этих экспериментах подтверждали защитные эффекты, напрямую вызываемые бактериальным экстрактом BV. Этот защитный эффект активировался изменениями в микробиоте кишечника исследуемых мышей. В частности, на модели астмы мышей было показано, что интраназальное и интратрахеальное введение бактериального экстракта BV вызывает изменения в микробиоме кишечника, которые, как полагают, способствуют снижению аллергических реакций.

Мышей обрабатывали интраназально бактериальным экстрактом BV (5, 50, 1000 или 2500 микрограмм на обработку каждые 2 дня) или PBS, и сенсибилизировали и заражали OVA или PBS. Образцы фекалий собирали для анализа микробиома.

По сравнению с контролем "только PBS" наблюдались существенные изменения в структуре микробного сообщества кишечника у мышей, получавших бактериальный экстракт BV в дозе 1000 или 2500 мкг на обработку, как с OVA, так и с PBS (т.е. при любой высокой дозе бактериального экстракта BV), на что указывает анализ бета-разнообразия (невзвешенный UniFrac) (смотри фигуру 12). Кроме того, при любой высокой дозе бактериального экстракта BV значительно повышалось содержание Lactobacillus по сравнению с мышами, обрабатываемыми только PBS.

Эти данные четко показывают, что бактериальный экстракт BV вызывал значительные изменения в микробиоте кишечника мышей.

Пример 13

Влияние на микробиомные профили кишечника мышей, обработанных интраназально низкими и высокими дозами бактериального экстракта BV.

Мышам вводили 14 интраназальных доз (0,005 мг, 1 мг или 2,25 мг) бактериального экстракта BV. Сенсибилизацию OVA проводили в дни 0 и 15, а заражение OVA в дни 28, 38 и 39. Контрольным мышам вводили не OVA, а PBS. По окончании эксперимента (день 39) собирали фекальные комочки.

Мышей, зараженных PBS или OVA, обрабатывали дозами BV5=доза бактериального экстракта BV 0,005 мг (BV.низкая), или BV1000=доза 1 мг (BV.высокая), или BV2250=доза 2,25 мг (BV.высокая).

Обработки сведены в следующей таблице 1.

Таблица 1

Эксперименты Лечение Группа 1 PBS/BV5
PBS/BV1000
PBS/BV2250 Группа 2 OVA/BV5
OVA/BV1000
OVA/BV2250 Группа 3 OVA/PBS
PBS/PBS

ДНК экстрагировали из фекальных комочков, характеризующих микробиом кишечника. Экстрагированную ДНК отправляли в Аргоннскую национальную лабораторию для секвенирования ампликона 16S рРНК на Illumina MiSeq. Данные о последовательностях анализировали с использованием QIIME2 и R.

Эти данные четко демонстрируют, что интраназальный бактериальный экстракт BV был способен защищать от эозинофилии, и AHR также ведет к значительной перестройке микробиома кишечника (фигуры 13 и 14) у защищенных мышей, с увеличением таксонов (в частности, Lactobacilli, фигура 14A), что, как известно, дает короткоцепочечные жирные кислоты и должно ассоциироваться с иммунной регуляторной системой/переносимостью. Действительно, считается, что распространение этих бактерий способствует индукции регуляторных T-клеток, какие авторы обнаружили у защищенных от астмы мышей, обработанных BV. Кроме того, результаты экспериментов по секвенированию 16s рРНК четко показали связь между интраназальным или интратрахеальным введением бактериального экстракта BV и иммуномодуляцией.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу лечения или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств или симптомов, связанных с бронхообструкцией. Способ лечения или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств или симптомов, связанных с бронхообструкцией, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества бактериального экстракта, получаемого из грамположительных или грамотрицательных видов бактерий, выбранных из Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и/или Streptococcus sanguinis, причем указанный бактериальный экстракт может быть получен щелочным лизисом и причем указанный бактериальный экстракт вводится интраназальным или интратрахеальным путем. Вышеуказанное изобретение обеспечивает эффективный и надежный подход к предотвращению аллергического воспаления в дыхательных путях, в то же время восстанавливая здоровый микробиом хозяина, страдающего от астмы и вызванных аллергией обострений, связанных с дисбалансом микробиоты. 6 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 13 пр.

1. Способ лечения или профилактики астмы, обострения астмы, аллергических астматических расстройств или симптомов, связанных с бронхообструкцией, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества бактериального экстракта, получаемого из грамположительных или грамотрицательных видов бактерий, выбранных из Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и/или Streptococcus sanguinis, причем указанный бактериальный экстракт может быть получен щелочным лизисом и причем указанный бактериальный экстракт вводится интраназальным или интратрахеальным путем.

2. Способ по п. 1, причем указанный щелочной лизис проводят при pH 10,1.

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем указанный бактериальный экстракт вводится указанному субъекту в суточных дозах от 0,05 до 2 мг, от 0,1 до 1 мг, от 0,5 до 1 мг или 1 мг.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем указанный бактериальный экстракт вводят в форме твердой, жидкой или аэрозольной композиции.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем указанный бактериальный экстракт является жидкостью или аэрозолем и готовится в форме спрея, капель, коллоида, миста, небул или распыленного пара.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем указанный бактериальный экстракт вводится в твердой форме и готовится в виде порошка.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем указанный бактериальный экстракт вводится посредством устройства доставки, выбранного из группы, содержащей назальный инсуффлятор, интраназальный ингалятор, интраназальное брызгательное устройство, пульверизатор, назальный аэрозольный баллончик, однодозовую упаковку, насос, пипетку, нажимной флакон, небулайзер, дозирующий ингалятор (MDI), компрессорный дозирующий ингалятор, инсуффляторы, двунаправленные устройства, ампулы с дозой, назальные подушечки, назальные губки и назальные капсулы.