КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АСТМЫ, СОДЕРЖАЩАЯ МОНОАЦЕТИЛДИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВОЕ СОЕДИНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА Российский патент 2017 года по МПК A61K31/22 A61K47/00 A61P11/06 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения астмы и к функциональному продукту лечебного питания для предотвращения или ослабления астмы, содержащим в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин.

Уровень техники

В последнее время быстрое развитие промышленности привело к изменениям среды, окружающей живые объекты, и характера их питания, в связи с чем возросла частота различных аллергических заболеваний. В частности, в числе аллергических расстройств значительно увеличилась заболеваемость астмой. Астма - это заболевание воздухоносных путей, характеризующееся их хроническим воспалением и гиперреактивностью, которое провоцируется загрязнениями воздуха, азиатскими пыльными бурями, аллергенами и другими факторами. Известно, что у детей астма встречается чаще, чем у взрослых; что частота этого заболевания связана с изменениями характера питания, который следует «западному» образцу. Механизмы развития астмы разнообразны. В них играют роль иммунологические реакции с участием хелперных Т-лимфоцитов типа 2 (Th2), обусловливающие усиление секреции интерлейкинов - 4, 5 и 13, что, вместе с указанными реакциями, в итоге приводит к миграции клеток воспаления, включая нейтрофилы, и их проникновению в ткань легких. Также множество клеток воспаления выделяют различные провоспалительные и хемотаксические факторы, усугубляющие воспалительную реакцию, усиливающие секрецию слизи бокаловидными клетками эпителия дыхательных путей и вызывающие гиперреактивность дыхательных путей. В результате этих процессов у больных астмой наблюдаются такие клинические симптомы, как затрудненность дыхания, цианоз и боль в груди.

В настоящее время для лечения астмы используются стероидные препараты, средства, расширяющие бронхи, или антибиотики. Стероидные соединения и антибиотики помогают при астме в силу того, что они подавляют иммунный ответ и воспалительную реакцию, а агенты, расширяющие бронхи, облегчают дыхание. Однако эти средства обладают побочными эффектами, например вызывают иммуносупрессию и устойчивость к антибиотикам, подавляют функцию костного мозга, а также становятся причиной негативных явлений при длительном применении; таким образом, использование указанных препаратов в качестве терапевтических агентов при астме весьма ограничено. Соответственно существует потребность в разработке природных материалов или новых соединений, не обладающих подобными побочными эффектами, менее токсичными и терапевтически более действенными.

Из оленьих рогов были выделены вещества, обозначаемые ЕС-18, которые представляют собой моноацетилглицеридные соединения. Известно, что они влияют на гемопоэз. Установлено, что ЕС-18 повышает выживаемость подопытных животных с экспериментальным сепсисом при перевязке и проколе слепой кишки и не обладает токсичностью при проверке по стандарту надлежащей лабораторной практики (GLP). Однако действие моноацетилдиацилглицеринов, включая ЕС-18, при аллергической астме не известно и не описано. Поэтому авторы этого изобретения предприняли значительные усилия с целью разработки агента для лечения астмы на основе природного материала или нового соединения. В результате работы, составившей данное изобретение, было обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины снижают гиперреактивность дыхательных путей и подавляют проникновение клеток воспаления в бронхи и что их можно с успехом использовать для предотвращения или лечения астмы.

Раскрытие изобретения

Задачи изобретения

Цель изобретения - предложить фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения астмы и функциональный продукт лечебного питания для предотвращения или ослабления астмы, содержащие в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-22 атомов углерода.

Другая цель изобретения - предложить способ предотвращения или лечения астмы, включающий введение фармацевтической композиции по изобретению индивиду, больному астмой или подверженному риску ее развития. Техническое решение поставленных задач

Для достижения указанных выше целей в одном из аспектов изобретения предлагается фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения астмы, содержащая в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют жирнокислотную группу из 14-22 атомов углерода. В настоящем документе термин «жирнокислотная группа» означает карбоксильную группу жирной кислоты без OH-группы.

Говоря конкретно, фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения астмы по изобретению включает моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1. По изобретению термин «моноацетилдиацилглицерин» означает производное глицерина, в котором имеются одна ацетильная группа и две ацильных группы и которое можно назвать моноацетилдиацилглицерином (MADG).

В моноацетилдиацилглицерине, представленном формулой 1, R1 и R2 независимо друг от друга представляют остаток жирной кислоты из 14-22 атомов углерода. Предпочтительно примеры R1 и R2, не имеющие ограничительного характера, включают пальмитоил, олеоил, линолеоил, линоленоил, стеароил, миристоил, арахидоноил и др. Предпочтительные комбинации R1 и R2 (R1/R2) включают олеоил/пальмитоил, пальмитоил/олеоил, пальмитоил/линолеоил, пальмитоил/линоленоил, пальмитоил/арахидоноил, пальмитоил/стеароил, пальмитоил/пальмитоил, олеоил/стеароил, линолеоил/пальмитоил, линолеоил/стеароил, стеароил/линолеоил, стеароил/олеоил, миристоил/линолеоил, миристоил/олеоил и др. В отношении оптической активности моноацетилдиацилглицерин, представленный формулой 1, может быть (R)-формой, (S)-формой или рацемической смесью.

В одном из воплощений изобретения моноацетилдиацилглицерин является соединением, представленным формулой 2.

Соединение, представленное формулой 2, - это 1-пальмитоил-2-линолеоил-3-ацетилглицерин, который в настоящем документе иногда называется "ЕС-18". В соединении, представленном формулой 2, R1 и R2 представляют пальмитоил и линолеоил соответственно.

Моноацетилдиацилглицерины можно выделить из природного источника - рогов оленей или же их можно получить синтетическими методами, известными в органической химии (см. зарегистрированный патент Кореи №10-0789323). Конкретно, проделывается следующее. Материал оленьих рогов экстрагируют гексаном, затем остаток экстрагируют хлороформом и хлороформ удаляют, получая экстракт. Объем растворителей для экстракции берется таким, чтобы экстрагируемый материал был полностью погружен в растворитель, но не более. Как правило, на 1 кг оленьих рогов берут около 4-5 литров гексана и/или хлороформа (сказанное здесь не имеет ограничительного характера). Полученные этим способом экстракты далее фракционируют и очищают путем хроматографии на колонках с силикагелем и тонкослойной хроматографии, в результате чего выделяют моноацетилдиацилглицерин по изобретению. Растворитель для экстракции выбирают (не ограничиваясь перечисленным здесь) из хлороформа/метилового спирта, гексана/этилацетата/уксусной кислоты.

Способ химического синтеза для получения моноацетилдиацилглицеринов описан в зарегистрированных патентах Кореи №10-0789323. В частности, этот способ включает (а) этап получения соединения типа 1-R1-3-защитная группа-глицерин путем присоединения защитной группы в положении 3 1-R1-глицерина; (b) этап получения соединения типа 1-R1-2-R2-3-защитная группа-глицерин путем введения R2 в положение 2 соединения 1-R1-3-защитная группа-глицерин; и (с) этап получения желаемого соединения - моноацетилдиацилглицерина - путем проведения реакции депротекции и одновременно реакции ацетилирования соединения 1-R1-3-защитная группа-глицерин (I). При необходимости полученный моноацетилдиацилглицерин можно далее очистить. Или же моноацетилдиацилглицерины можно получить путем кислотного разложения фосфатидилхолина (ацетолиза); сказанное здесь не имеет ограничительного характера. В объем изобретения входят также стереоизомеры соединений, представленных формулой (I).

Согласно изобретению было обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины могут сокращать секрецию иммуноглобулинов типа E (IgE) или цитокинов, выбираемых из группы, состоящей из интерлейкинов 4, 5 и 13 (IL-4, IL-5 и IL-13), что свидетельствует о возможности их эффективного применения для предотвращения или лечения астмы.

В настоящем документе термин «астма» относится к состоянию, при котором имеет место воспаление бронхиального дерева легких. Он также означает заболевание, при котором бронхи сужены, что обусловливает такие симптомы, как одышка, слабость дыхания и тяжелый кашель. Кроме того, этот термин относится к аллергическому заболеванию, обусловленному аллергической воспалительной реакцией в бронхах. Типичные симптомы астмы включают затрудненность дыхания, кашель, хрипы и др.; для лечения астмы обычно используются средства, расширяющие бронхи (бронходилататоры), которые быстро купируют сужение просвета бронхов, или же препараты (противовоспалительные агенты, модуляторы лейкотриенов), предотвращающие астматический приступ путем подавления аллергического воспаления бронхов. По изобретению под астмой может подразумеваться (не ограничиваясь перечисленным здесь) бронхиальная астма, аллергическая астма, атопическая астма, не атопическая астма, астма, вызванная физическим усилием, сердечная астма или астма с альвеолярным отеком легких. В настоящем документе термин «предотвращение/профилактика» относится к мероприятиям, подавляющим или задерживающим развитие астмы путем введения композиции по изобретению, а термин «лечение» относится ко всем мероприятиям, которые ослабляют или положительным образом изменяют течение астмы путем введения композиции по изобретению.

Известно, что интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5) и интерлейкин-13 (IL-13), продуцируемые хелперными Т-клетками типа 2 (Th2) служат важными посредниками в механизме бронхиальной астмы (Coyle AJ. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13 (1): 54-9; Nakajima H. et al. 1992. Am. Rev. Respir. Dis. 146 (2): 374-7; Wills-Karp, M. et al. 1998. Sci. 282 (5397): 2258-61; Cohn et al., 2004; Medoff et al., 2008). В частности, как известно в данной области техники, вызывающий бронхиальную астму антиген в основном удаляется макрофагами, и когда активированные в результате этого альвеолярные макрофаги стимулируют В-клетки, чтобы те производили иммуноглобулины E (IgE), эти IgE активируют тучные клетки, которые вызывают первоначальную раннюю астматическую реакцию. Кроме того, В-клетки, контактировавшие с антигеном, вызывающим астму, стимулируют Т-лимфоциты типа CD4, которые в результате дифференцируются в клетки Th2, и дифференцированные клетки Th2 начинают секретировать цитокины - IL-4, IL-5 и IL-13 - в ткани легких, обнаруживающиеся в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже. Эти цитокины вызывают астматическую реакцию - гиперреактивность бронхов и обструкцию дыхательных путей. Таким образом, астматическая реакция может быть подавлена путем ингибирования секреции IgE или цитокина, выбираемого из группы, состоящей из IL-4, IL-5 и IL-13.

В примерах изобретения i) определяли ингибирующую активность моноацетилдиацилглицеринов в отношении индуцированной форболмиристатацетатом (РМА) экспрессии IL-4 в клетках Т-клеточной лимфомы мышей (EL-4), и было обнаружено, что ряд моноацетилдиацилглицеринов, в том числе ЕС-18, обладают значительной ингибирующей активностью (пример 2); и ii) определяли содержание IL-4, IL-5 и IL-13 в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже, у животных с экспериментальной астмой, и было показано, что у особей с индуцированной астмой образуется существенно больше IL-4, IL-5 и IL-13 по сравнению с контрольными животными, в то время как в группе особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, количество этих цитокинов была гораздо ниже (пример 6; см. фиг. 4); и iii) определяли секрецию (содержание в сыворотке) суммарного IgE и IgE, специфичного к овальбумину, и было показано, что у животных с индуцированной астмой секретировалось и, соответственно, содержалось в сыворотке крови значительно больше суммарного IgE и IgE, специфичного к овальбумину, чем у контрольных особей, тогда как в группе особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, их секреция была гораздо слабее (пример 7; см. фиг. 5). Эти результаты позволяют полагать, что моноацетилдиацилглицерины эффективны для лечения астмы.

Кроме того, в изобретении обнаружено, что моноацетилдиацилглицерины могут снижать количество клеток воспаления вокруг бронхов или кровеносных сосудов и сокращать секрецию слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов. Больным астмой делали бронхоальвеолярный лаваж и оценивали процесс воспаления дыхательных путей; в результате было обнаружено, что количество лимфоцитов, тучных клеток, эозинофилов и активированных макрофагов в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже. повышено. В целом известно, что астма представляет собой воспалительное поражение дыхательных путей и что различные клетки воспаления в большинстве своем активируются таким образом, что секретируют различные вещества-посредники, вызывающие астматическое состояние, так что снижение количества клеток воспаления связывается с лечением астмы (Haley KJ, et al., Am J Respir Crit Care Med, 1998; 158: 565-72). Помимо того, что при астме сужаются дыхательные пути и в бронхи проникают клетки воспаления, бокаловидные клетки эпителия бронхов секретируют слизь и появляются отложения коллагена. Усиление секреции слизи в бронхах тоже рассматривается как симптом астмы.

В примерах изобретения изучали воспаление в легочной ткани с помощью окрашивания гематоксилином-эозином (Н&Е) и секрецию слизи в бронхах с помощью окрашивания путем PAS-реакции (реактив Шиффа и йодная кислота). В результате было показано, что i) у животных с индуцированной астмой наблюдается интенсивное проникновение клеток воспаления в области вокруг бронхов и кровеносных сосудов, тогда как у всех групп особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, к бронхам и кровеносным сосудам проникало значительно меньше клеток воспаления (пример 8; см. фиг. 6); и ii) у животных с индуцированной астмой секреция слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов усилена, в то время как во всех группах особей, которым вводили моноацетилдиацилглицерин ЕС-18, секреция слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов значительно ниже (пример 8; см. фиг. 7). Эти результаты тоже свидетельствуют, что моноацетилдиацилглицерины эффективны для лечения астмы.

В состав фармацевтической композиции по изобретению, содержащей моноацетилдиацилглицерины, могут также входить обычно используемые фармацевтически приемлемые носители, разбавители или иные эксципиенты. Количество моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по изобретению может варьировать в широких пределах без каких-либо специфических ограничений; конкретно содержание моноацетилдиацилглицеринов в фармацевтической композиции по изобретению составляет от 0,0001% до 100,0% (масса/масса), предпочтительно от 0,001 до 50% (масса/масса), более предпочтительно от 0,01 до 20% (масса/масса) относительно общего количества композиции.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть представлена различными лекарственными формами для перорального и не перорального введения, например лекарственными формами, выбираемыми из группы, состоящей из таблеток, болюсов, порошков, гранул, капсул (например, мягких или жестких желатиновых капсул), эмульсий, суспензий, сиропов, эмульгируемых концентратов, стерилизованных водных растворов, неводных растворов, лиофилизованных препаратов, суппозиториев и др. При составлении композиции по изобретению могут использоваться обычно применяемые разбавители или иные эксципиенты, например наполнители, объемообразующие агенты, связующие вещества, увлажняющие агенты, дезинтегрирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Твердые препараты для перорального применения по изобретению включают таблетки, болюсы, порошки, гранулы, капсулы и проч.; эти твердые препараты могут быть получены путем смешивания одного или более активных компонентов и по меньшей мере одного из таких эксципиентов, как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза, желатин и др. Помимо указанных эксципиентов, можно использовать агенты, улучшающие скольжение, например стеарат магния и тальк. Жидкие препараты по изобретению для перорального применения включают эмульсии, суспензии, сиропы и проч.; они могут также содержать обычно используемые разбавители, например воду или жидкий парафин или различные агенты - увлажняющие, подслащивающие, ароматизирующие и консервирующие. Препараты для не перорального применения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворы, лиофилизованные препараты, суппозитории и проч.; растворители для таких растворов включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (например, оливковое масло) и эфиры для инъекций с помощью шприца, например этилолеат. Материалы для основы суппозиториев включают витепсол, макрогол, твин (Tween-61), масло какао, лаурин и глицериножелатин.

Композиция по изобретению вводится в организм в фармацевтически эффективном количестве. Термин «фармацевтически эффективное количество» в настоящем документе употребляется применительно к такому количеству композиции, которое достаточно для достижения желаемого результата при лечебных мероприятиях. Фармацевтически эффективное количество определяется соответственно типу, возрасту и полу индивида, характеру заболевания и степени его тяжести, активности взятого препарата, чувствительности к нему индивида, времени, продолжительности и пути введения, скорости выведения из организма и другим критериям, известным в области медицины. Композиция по изобретению может вводиться в организм в отдельности или же одновременно либо последовательно с другими лекарственными средствами; введение может быть однократным или многократным. В свете всех указанных выше факторов важно дозировать количество композиции так, чтобы достигался максимально возможный лечебный эффект при минимальных побочных явлениях или их отсутствии; дозировку композиции по изобретению вполне может определить специалист в данной области техники. Предпочтительное количество композиции по изобретению может варьировать соответственно состоянию индивида, его массе тела, степени тяжести заболевания, характеру препарата, пути и продолжительности введения. Нужное суммарное количество композиции, вводимое за сутки, определяет врач, специализирующийся в соответствующей области медицины; обычно оно составляет от 0,001 мг/кг массы тела до 1000 мг/кг, предпочтительно от 0,05 мг/кг до 200 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг и вводится в один прием или в несколько приемов на протяжении суток. Композицию по изобретению можно вводить любому индивиду, которому требуется подавление ракового заболевания крови или метастазирования рака. Например, композицию по изобретению моно вводить не только людям, но и животным (в частности, млекопитающим), например обезьянам, собакам, кошкам, кроликам, морским свинкам, крысам, мышам, коровам, овцам, козам и др. Композицию по изобретению можно вводить в организм различными обычно применяемыми для введения лекарственных средств способами, например перорально или ректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно или интрацеребрально.

В другом аспекте изобретения предлагается функциональный продукт лечебного питания для предотвращения или ослабления астмы, включающий в качестве активного компонента моноацетилдиацилглицерины, описываемые формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют (не ограничиваясь указанным здесь) жирнокислотную группу из 14-22 атомов углерода.

Подробнее, моноацетилдиацилглицерины по изобретению можно включать в состав функциональных продуктов лечебного питания для предотвращения или ослабления астмы. Эти соединения и заболевание подробно описаны ранее. Термин «улучшение» означает любое изменение, ослабляющее симптомы или положительным образом влияющее на проявления заболевания у индивида, у которого имеется или подозревается астма.

В состав функционального продукта лечебного питания композиция по изобретению включается в отдельности или вместе с другим активным компонентов. Количество соединений по изобретению в функциональном продукте лечебного питания определяют соответственно предполагаемому применению этого продукта. Как правило, при изготовлении функционального продукта (в том числе напитка) лечебного питания композиция по изобретению включается в его состав в количестве менее чем 15 массовых долей, предпочтительно менее 10 массовых долей. В случае продолжительного использования функционального продукта лечебного питания с целью поддержания здоровья индивида количество композиции в нем может быть уменьшено. Однако, поскольку активный компонент продукта не вызывает никаких негативных эффектов, количество композиции в продукте может быть больше указанного выше. Функциональный продукт лечебного питания, включающий композицию по изобретению, может представлять собой любой обычный пищевой продукт или напиток. Конкретные примеры включают мясные продукты, колбасные изделия, хлеб, шоколад, конфеты, чипсы и подобные продукты, печенье, пиццу, лапшу быстрого приготовления, макаронные изделия, жевательную резинку, мороженое, молочные продукты, супы, прохладительные безалкогольные напитки, чай, алкогольные напитки, витаминные комплексные препараты и др. При необходимости пищевой продукт по изобретению включает также корм для животных.

В том случае, когда функциональный продукт лечебного питания является напитком, он может включать обычно используемые в напитках подсластители, ароматизирующие агенты, природные углеводы и др. Примеры природных углеводов включают моносахариды, например глюкозу и фруктозу, дисахариды, например мальтозу и сахарозу, полисахариды, например декстрин и циклодекстрин, сахарные спирты, например ксилит, сорбит и эритрит. Предпочтительное количество природных углеводов в напитке по изобретению составляет от 0,01 г до 0, 04 г, более предпочтительно от 0,02 до 0,03 г на 100 мл. Примеры подсластителей включают природные агенты, например тауматин и экстракт стевии, и искусственные вещества, например сахарин и аспартам. Функциональный продукт лечебного питания по изобретению может также включать различные питательные добавки, витамины, электролиты, ароматизирующие агенты, красители, пектиновые кислоты и их соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоиды, загустители, агенты для подведения pH, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирты, соки и др.

В другом аспекте изобретения предлагается способ для предотвращения или лечения астмы, включающий этап введения фармацевтической композиции по изобретению индивиду, у которого имеется или подозревается астма. Понятие «индивид, у которого имеется или подозревается астма» включает не только животных и людей, больных астмой, но и тех, у которых возможно ее развитие. Индивидов, у которых имеется или подозревается астма, можно эффективно лечить путем введения фармацевтической композиции по изобретению. Термин «введение» означает, что фармацевтическая композиция по изобретению каким-либо образом попадает в организм индивида, у которого имеется или подозревается астма. Путь введения может быть любым - пероральным или не пероральным. Способ лечения астмы по изобретению включает этап введения нуждающемуся в том индивиду эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей моноацетилдиацилглицерины, описываемые формулой I, или их фармацевтически приемлемые соли. Сколько нужно вводить препарата суммарно за сутки, определяет врач; обычно суточная доза составляет от около 0,001 мг/кг массы тела пациента до около 1000 мг/кг, предпочтительно от около 0,05 мг/кг до около 200 мг/кг, более предпочтительно от около 0,1 мг/кг до около 100 мг/кг. Суточная доза может быть введена в один прием (раз в день) или в несколько приемов на протяжении суток. Впрочем, конкретное терапевтически эффективное количество моноацетилдиацилглицеринов для индивида варьирует в зависимости от характера и выраженности желаемой реакции организма в ходе лечения, состава композиции, в том числе от присутствия в ней другого активного агента, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания индивида, времени и пути введения препарата, соотношения компонентов в композиции, продолжительности курса лечения, других препаратов, используемых параллельно с данным в ходе лечения, и различных других факторов, известных в области медицины.

Полезный эффект изобретения

Моноацетилдиацилглицерины по изобретению подавляют экспрессию интерлейкина-4 в клетках Т-клеточной лимфомы мышей (клетках EL-4); эти соединения снижают гиперреактивность дыхательных путей в экспериментах на животных моделях с индуцированной астмой и подавляют проникновение клеток воспаления в бронхи. Кроме того, соединения по изобретению существенно снижают уровень IgE в сыворотке и в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже, и подавляют экспрессию продуцируемых клетками Th2 цитокинов (IL-4, IL-5 и IL-13) в легких, не обладая побочными эффектами, свойственными существующими на сегодняшний день агентами для лечения астмы, не токсичны и оказывают выраженное терапевтическое действие. Таким образом, эти соединения можно с успехом использовать для предотвращения или лечения астмы и облегчения состояния больного.

Краткое описание иллюстраций

Фигура 1 схематически изображает постановку экспериментов с индуцированной астмой у мышей по изобретению.

Фигура 2 - графики, демонстрирующие влияние ЕС-18 на гиперреактивность воздухоносных путей. (NC - группа «нормальный контроль»; OVA - группа «индуцированная астма»; Mon - группа «контрольный лекарственный препарат»; ЕС 18-30 и ЕС18-60 группы мышей, которые получали препарат по изобретению ЕС-18 в дозе 30 мг/кг массы и 60 мг/кг массы тела соответственно.)

Фигура 3 - диаграмма, демонстрирующая влияние ЕС-18 на количество клеток воспаления в жидкости, получаемой путем бронхоальвеолярного лаважа.

Фигура 4 - диаграммы, демонстрирующие влияние ЕС-18 на содержание цитокинов в жидкости, получаемой путем бронхоальвеолярного лаважа.

Фигура 5 - диаграммы, демонстрирующие влияние ЕС-18 на секрецию (содержание в сыворотке крови) суммарного IgE и IgE, специфичного к овальбумину.

Фигура 6 - изображения гистологических препаратов, демонстрирующие влияние ЕС-18 на воспалительную реакцию в легочной ткани.

Фигура 7 - изображения гистологических препаратов, демонстрирующие влияние ЕС-18 на секрецию слизи в легочной ткани.

Осуществление изобретения

Более подробно изобретение будет описано с помощью прилагаемых иллюстраций. Ниже изобретение описывается в дальнейших подробностях с помощью примеров. Следует принять во внимание, что эти примеры служат сугубо иллюстративной цели и не должны ограничивать объем изобретения.

Пример 1. Определение цитотоксичности моноацетилдиацилглицеринов с использованием клеток EL-4

Клетки Т-клеточной лимфомы мышей (клетки EL-4) суспендировали в среде RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, в концентрации 5×10⁴ клеток/мл; по 100 мкл этой клеточной суспензии высевали в лунки 96-луночного планшета и культивировали в течение 12 часов. Затем культуру клеток обрабатывали моноацетилдиацилглицеринами (MADG), взятыми в концентрациях, представленных в приведенной ниже таблице 1, после чего культивировали в течение еще 24 часов. После этого, следуя инструкциям к набору для подсчета клеток ССК-8 (Dojino), в лунки планшета прибавляли по 10 мкл раствора ССК-8, давали реакции протекать в течение от 30 минут до 4 часов и измеряли поглощение (OD) на длине волны 570 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали с помощью приведенного ниже уравнения 1; полученные результаты представлены в таблице 1. В уравнении 1 группа «отрицательный контроль» - это культура клеток, обработанная 0,2%-ным диметилсульфоксидом (DMSO). В таблице 1 используются следующие сокращения: PL AG - 1-пальмитоил-2-линолеоил-3-ацетилглицерин; POAG - 1-пальмитоил-2-олеоил-3-ацетилглицерин; PSAG - 1-пальмитоил-2-стеароил-3-ацетилглицерин; PPAG - 1-пальмитоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; OPAG - 1-олеоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; OSAG - 1-олеоил-2-стеароил-3-ацетилглицерин; LPAG - 1-линоеоил-2-пальмитоил-3-ацетилглицерин; и LSAG - 1-линоеоил -2-стеароил-3-ацетилглицерин.

Уравнение 1

Жизнеспособность клеток (%) = [(Значение OD при 570 нм для группы с обработкой МАОС) / (Значение OD при 570 нм для группы «отрицательный контроль»)] × 100

Как представлено в приведенной выше таблице 1, определяли жизнеспособность клеток EL-4 при различных концентрациях моноацетилдиацилглицеринов (MADG), и было показано, что агент ЕС-18 не проявляет цитотоксичности при концентрации 200 мкг/мл или менее, а другие испытанные соединения не проявляли цитотоксичность при концентрации 20 мкг/мл или менее.

Пример 2. Подавление экспрессии мРНК в клетках EL-4 под действием моноацетилдиацилглицеринов

На основании результатов, описанных в примере 1, каждый из испытываемых моноацетилдиацилглицеринов добавляли к клеткам EL-4 в концентрации 20 мкг/мл и определяли его влияние на индуцированную форболмиристатацетатом (РМА) экспрессию мРНК интерлейкина-4 (IL-4) в клетках EL-4. А именно, уровень экспрессии мРНК IL-4, индуцированной РМА (1 нг/мл), определяли с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (rtPCR) и количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qPCR). Клетки EL-4 высевали на 6-луночный планшет в концентрации 1×10⁶ клеток на лунку и культивировали в течение 12 часов; затем клетки обрабатывали тем или иным из испытываемых моноацетилдиацилглицеринов в концентрации 20 мкг/мл в течение 1 часа и РМА в концентрации 1 нг/мл, после чего культивировали в течение 12 часов. Из клеток выделяли суммарную РНК с помощью тризола (Trizol В, Invitrogen, США) и определяли ее количество. Затем по суммарной РНК синтезировали кДНК, используя набор Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Хилден, Германия). Синтезированную кДНК в качестве матрицы смешивали с праймерами для IL-4 и GAPDH, представленными в приведенной ниже таблице 2, и проводили полимеразную цепную реакцию, используя готовую реакционную смесь для ПЦР PCR Master Mix (Bioneer, Корея), при следующих условиях: денатурация при температуре 94°C в течение 5 минут, затем 30 циклов, каждый из которых включает 30 секунд при 95°C, 45 секунд при 60°C и 45 секунд при 72°C; затем инактивация фермента при 72°C в течение 10 минут. Результаты определения степени подавления экспрессии мРНК IL-4 в клетках EL-4, как описано выше, представлены в таблице 3, приведенной ниже. Обозначения образцов в таблице 3 те же, что и в таблице 1.

Как представлено в приведенной выше таблице 3, уровень экспрессии IL-4 в группе с обработкой РМА повышен, а моноацетилдиацилглицерины подавляют экспрессию IL-4 на 20-50% по сравнению с группой, в которой была обработка РМА (100%).

Пример 3. Модели астмы, индуцированной овальбумином, и введение испытываемого агента

Самок беспатогенных (статус SPF) мышей линии Balb/c возрастом 6 недель с массой тела в среднем 20 г получали от компании Samtako (Корея). Животным давали в достаточном количестве твердый корм (не содержащий антибиотиков, производство Samyang Feed Со.) и воду вплоть до момента начала эксперимента; перед экспериментом их для акклиматизации содержали в течение недели в следующих условиях: температура 22±2°C, влажность 55±15%, режим освещения 12 часов свет/12 часов темнота. По истечении этой недели мышей сенсибилизировали с двухнедельным интервалом путем внутрибрюшинного введения суспензии 2 мг оксида алюминия (А8222, Sigma-Aldrich, МО, США) и 20 мкг овальбумина (А5503, Sigma-Aldrich) в 200 мкл физиологического раствора, забуференного фосфатом (PBS). В период с 21-го по 23-й день после первого внутрибрюшинного введения овальбумина животным давали вдыхать 1%-ный раствор овальбумина в течение 30 минут с помощью ультразвукового небулайзера (NE-U12, Omron Corp., Япония). Через 24 часа после последнего воздействия овальбумином у подопытных животных определяли гиперреактивность дыхательных путей; через 48 часов им делали анестезию путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала (Entobal, Hanil, Корея) в дозе 50 мг/кг массы тела. Затем у мышей брали кровь из большой подкожной вены конечности и производили трахеостомию. Каждой особи делали бронхоальвеолярный лаваж PBS общим объемом 1,4 мл, получая таким образом образец для анализа. В эксперименте были следующие группы мышей численностью 7 особей каждая: «нормальный контроль» (NC) - животным не вводили и не ингалировали овальбумин; «индуцированная астма» (OVA) - животным вводили и ингалировали овальбумин; «контрольный лекарственный препарат» (Mon) - животным вводили монтелукаст в дозе 30 мг/кг массы тела, а также вводили и ингалировали овальбумин; «образец» - животным вводили ЕС18 в дозе 30 мг/кг массы тела (группа «ЕС-18-30») либо 60 мг/кг массы тела (группа «ЕС-18-60»), а также вводили и ингалировали овальбумин. Монтелукаст и испытываемый агент вводили перорально в период с 18-го по 23-й день после первого воздействия овальбумином (см. фиг. 1).

Пример 4. Определение гиперреактивности воздухоносных путей

Для определения гиперреактивности воздухоносных путей, являющейся одним из основных проявлений астмы, применяли метод общей плетизмографии в герметичной камере (All Medicus, Korea). Степень сопротивления воздухоносных путей оценивали по индексу Pehn - произведению длительности паузы и отношения максимальных давлений на выдохе и вдохе; исходное значение измеряли при нормальном дыхании, затем ингалировали PBS в течение 3 мин с помощью ультразвукового небулайзера, после чего измеряли Pehn за 3 мин. Затем животным ингалировали метахолин (А2251, Sigma-Aldrich), постепенно увеличивая его концентрацию с 12 мг/мл до 25 и 50 мг/мл, после чего измеряли Pehn. Полученные результаты представлены в таблице 4, приведенной ниже.

Как показано на фиг. 4, в группе «индуцированная астма» значение Pehn значительно выше, чем в группе «нормальный контроль», а в группе «контрольный лекарственный препарат», в которой мыши получали монтелукаст, значительно ниже, чем в группе «индуцированная астма». В тех группах, в которых животным вводили ЕС-18 в дозах 30 мг/кг массы тела и 60 мг/кг массы тела, гиперреактивность воздухоносных путей была сходной с той, что наблюдалась в группе, получавшей монтелукаст, и значительно ниже, чем в группе «индуцированная астма» (см. фиг. 2).

Пример 5. Получение жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и подсчет клеток

Одним из основных проявлений астмы является возрастание численности эозинофилов. Для определения количества эозинофилов проделывали следующее. Жидкость, полученную путем бронхоальвеолярного лаважа, от каждой подопытной мыши тотчас после сбора окрашивали трипановым синим и с помощью гемоцитометра определяли общее число клеток (исключая мертвые клетки). Затем клетки наносили на предметные стекла с помощью центрифуги Cytospin (Hanil, Корея) и окрашивали реагентом Diff-Quik (Sysmex, Швейцария), после чего смотрели эозинофилы и другие клетки воспаления с помощью микроскопа. В каждом образце подсчитывали количество клеток воспаления; полученные результаты представлены в таблице 5 ниже.

Как видно из таблицы 5, приведенной выше, общее число клеток воспаления в группе «индуцированная астма» значительно выше, чем в группе «нормальный контроль», в частности характерно увеличение количества эозинофилов. А в группах особей, получавших ЕС-18, общее число клеток воспаления и количество эозинофилов значительно ниже, чем в группе «индуцированная астма» (см. фиг. 3).

Пример 6. Анализ цитокинов в жидкости, полученной при бронхоальвеолярном лаваже

В жидкости, полученной путем бронхоальвеолярного лаважа, от каждой мыши определяли содержание интерлейкинов (IL-4, IL-5 и IL-13) с помощью готового набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA kit, R&D System, США). Определение указанных цитокинов осуществляли согласно инструкциям производителя, измеряя поглощение на длине волны 450 нм при помощи ELISA-ридера (Molecular Devices, США). Полученные результаты представлены в таблице 6 ниже.

Как видно из таблицы 6, приведенной выше, в группе «индуцированная астма» секреция клетками Th2 цитокина IL-4 значительно выше, чем в группе «нормальный контроль», тогда как в группе «контрольный лекарственный препарат», в которой мыши получали монтелукаст, секреция IL-4 гораздо ниже, чем в группе «индуцированная астма». Кроме того, секреция IL-4 в группах, в которых животным вводили ЕС-18, значительно ниже, чем в группе «индуцированная астма». Также секреция IL-5 и IL-13 в группах, в которых животным вводили ЕС-18, значительно ниже, чем в группе «индуцированная астма» (см. фиг. 4).

Пример 7. Определение в сыворотке крови общего иммуноглобулина E (IgE) и IgE, специфичного к овальбумину

Кровь подопытных мышей, взятую из большой подкожной вены конечности, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут и затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут, чтобы получить сыворотку. Для определения в сыворотке суммарного иммуноглобулина E (IgE) и IgE, специфичного к овальбумину, применяли метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). IgE определяли с помощью имеющегося в продаже IgE (Biolegend Ins., США). Для определения IgE, специфичного к овальбумину, в 96-луночном планшете с плоским дном для иммуноферментного анализа овальбумин, растворенный в буферном растворе NaHCO₃ (0,1 М; pH 8,3) в концентрации 20 мкг/мл, инкубировали при температуре 4°C в течение 16 часов. После этого прибавляли PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), для подавления неспецифичных реакций. Образцы сыворотки разбавляли 1:400, давали реакции протекать в течение 2 часов при комнатной температуре, затем промывали PBS, содержащим 0,05% твина (Tween 20). Поликлональные козьи антикрысиные IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена, разбавляли в 4000 раз и давали реакции протекать при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего окрашивали с помощью 3,3'5,5'-тетраметилбензидина в качестве субстрата пероксидазы и измеряли поглощение на длине волны 450 нм. Полученные результаты представлены в приведенной ниже таблице 7.

Как видно из таблицы 7, в группе «индуцированная астма» уровень IgE в сыворотке крови значительно выше, чем в группе «нормальный контроль», тогда как в группе «контрольный лекарственный препарат», в которой мыши получали монтелукаст, содержание IgE в сыворотке крови существенно ниже, чем в группе «индуцированная астма». Также во всех группах, в которых животные получали ЕС-18, уровень IgE в сыворотке крови значительно более низкий, чем в группе «индуцированная астма», и близок к таковому в группе животных, получавших монтелукаст. Кроме того, в группе «индуцированная астма» уровень IgE, специфичного к овальбумину, гораздо выше, чем в группе «нормальный контроль», тогда как во всех группах, в которых животные получали ЕС-18, уровень IgE, специфичного к овальбумину, значительно более низкий, чем в группе «индуцированная астма» (см. фиг. 5).

Пример 8. Гистопатологическое исследование

У каждой подопытной мыши извлекали легкие, немедленно фиксировали 10%-ным раствором формальдегида, делали тонкие срезы и промывали проточной водой в течение 8 часов. Затем заливали эпоксидной смолой и делали срезы микротомом. Полученные срезы окрашивали гематоксилином-эозином, чтобы выявить воспаление в легочной ткани. Также, поскольку при индуцированной астме секреция слизи в бронхах значительно усилена, проводили окрашивание путем PAS-реакции (реактив Шиффа и йодная кислота; PAS, IMEB Inc., США), чтобы выявить секрецию слизи. Патологические изменения в легочной ткани наблюдали с помощью оптического микроскопа.

(1) При изучении воспалительной реакции в легочной ткани наблюдалась выраженная инфильтрация области вокруг бронхов и кровеносных сосудов клетками воспаления. Однако в группе «контрольный лекарственный препарат», в которой мышам вводили монтелукаст, клеток воспаления в указанных областях было меньше. Во всех группах, в которых животные получали ЕС-18, также отмечалась более слабая инфильтрация областей вокруг бронхов и кровеносных сосудов клетками воспаления, причем это ослабление было сходно с таковым у особей, получавших монтелукаст (см. фиг. 6).

(2) При изучении секреции слизи в бронхах в группе «индуцированная астма» наблюдалась усиленная секреция слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов. А в группе, в которой мышам вводили монтелукаст, секреция слизи была слабее, и во всех группах, в которых животные получали ЕС-18, также отмечалась более слабая секреция слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов (см. фиг. 7).

Хотя изобретение описано в настоящем документе на примере конкретных иллюстративных воплощений, специалистам в данной области техники, к которым обращено это изобретение, понятно, что оно может быть воплощено и в других конкретных вариантах без отклонения от технической сущности или существенных признаков изобретения. Таким образом, описанные выше воплощения изобретения следует рассматривать как во всех отношениях иллюстративные и не имеющие ограничительного характера. Также объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не подробным описанием, и следует принять во внимание, что все модификации или варианты, проистекающие из смыслового содержания и объема изобретения, и эквивалентные им утверждения входят в объем изобретения.

Изобретение относится к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения астмы, содержащей в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин и фармацевтически приемлемый эксципиент. Моноацетилдиацилглицерин по изобретению является природным веществом, выделенным из оленьих рогов. Моноацетилдиацилглицерины по изобретению подавляют экспрессию интерлейкина-4 (IL-4) в клетках Т-клеточной лимфомы мышей (EL-4), снижают гиперреактивность воздухоносных путей при экспериментальной индуцированной астме у животных и подавляют проникновение клеток воспаления в бронхиальное дерево. Кроме того, соединения по изобретению снижают содержание иммуноглобулина E (IgE) в сыворотке крови и в жидкости, получаемой при бронхоальвеолярном лаваже; обладают выраженным эффектом подавления экспрессии цитокинов, продуцируемых клетками Th2 (IL-4, IL-5 и IL-13) в легких, и не имеют побочных эффектов, не токсичны и отличаются эффективным терапевтическим действием. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 8 пр.

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения астмы, содержащая в качестве активного ингредиента моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1,

где R1 и R2 независимо друг от друга представляют жирнокислотную группу из 14-20 атомов углерода

и фармацевтически приемлемый эксципиент.

2. Композиция по п. 1, в которой R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из пальмитоила, олеоила, линолеоила, линоленоила, стеароила, миристоила и арахидоноила.

3. Композиция по п. 1, в которой R1 и R2 (R1/R2) выбирают из группы, состоящей из олеоила/пальмитоила, пальмитоила/олеоила, пальмитоила/линолеоила, пальмитоила/линоленоила, пальмитоила/арахидоноила, пальмитоила/стеароила, пальмитоила/пальмитоила, олеоила/стеароила, линолеоила/пальмитоила, линолеоила/стеароила, стеароила/линолеоила, стеароила/олеоила, миристоила/линолеоила, миристоила/олеоила.

4. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин является соединением, описываемым формулой 2:

5. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин, описываемый формулой 1, является природным веществом, выделенным из оленьих рогов.

6. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин ослабляет секрецию цитокинов. выбираемых из группы, состоящей из интерлейкинов IL-4, IL-5 и IL-13.

7. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин ослабляет секрецию иммуноглобулина Е (IgE).

8. Композиция по п. 1, в которой моноацетилдиацилглицерин уменьшает количество клеток воспаления вокруг бронхов или сосудов или ослабляет секрецию слизи бокаловидными клетками эпителия бронхов.

9. Способ предотвращения или лечения астмы, включающий введение пациенту, не являющемуся человеком, композиции по любому из пп. 1-8.