ПРОТЕКТИВНАЯ СРЕДА ДЛЯ СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ КЛЕТОК Y. PESTIS ШТАММА EV Российский патент 2023 года по МПК C12N1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к составам лабораторных прописей стабилизирующих и защитных сред, применяемых при лиофилизации бактериальных клеток с целью сохранения их жизнеспособности. Изобретение может быть использовано для получения сухих культур и препаратов, а также в коллекционной работе.

Ввиду того, что бактериальные клетки вакцинного штамма чумного микроба являются слабоустойчивыми к экстремальным воздействиям лиофилизации и хранения, продолжается поиск путей, позволяющих получать сухие высоко активные препараты, длительно сохраняющие свои биологические свойства.

Одним из таких путей является оптимизация состава сложных защитных сред, а в частности включение в состав природных высокомолекулярных, нетоксичных для микробных клеток, структурообразующих компонентов, таких, например, как желатин, агар-агар, карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпироллидон, картофельный крахмал и т.п.

Известна защитная среда, используемая для лиофилизации клеток Lactobacillus acidophilus. [Патент РФ №2169574. Способ получения биопрепарата и сухой биопрепарат. Кубатов А.А., Добролеж О.В. и др., опубл. 27.06.2021 г.]. В состав защитной среды входят: сахароза, желатин, ОСМ, а также специальные добавки полиглюкин и альгинат натрия. Структурообразователи альгинат натрия и полиглюкин, по мнению авторов, создает в водной среде сетчатую пространственную структуру, в узлах которой располагаются микроорганизмы в оболочке из защитных веществ. Такая структура обеспечивает более эффективную защиту биоматериала на стадиях обезвоживания.

Наиболее близкой к заявляемой протективной среде является пропись для высушивания клеток вакцинного штамма чумного микроба [Патент РФ №2510825. Способ получения биопрепарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Тетерин В.В., Ежов А.В. и др., опубл. 10.04.2014 г.]. Среда высушивания содержит: 300 г/л лактозы, 30 г/л тиомочевины, 30 г/л аскорбиновой кислоты, 30 г/л полиглюкин и дистиллированную воду - до расчетного объема. Среда позволяет получать сухие препараты с содержание живых бактерий не более 30%. К недостаткам прототипа можно отнести низкий удельный вес клеток, в получаемых сухих препаратах.

Задачей, на решение которой направлено предполагаемое изобретение, является разработка более эффективной протективной защитной среды, позволяющей снизить потери концентрации жизнеспособных клеток Y. pestis при сублимационном высушивании и повысить стабильность биопрепаратов при разнотемпературном хранении.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в состав защитной среды вводится гуаровая камедь, являющаяся структурообразователем, придающая водной фазе вязкую длинную текстуру. При замораживании гуаровая камедь увеличивает вязкость сконцентрированных замораживанием внеклеточных растворов, что ограничивает подвижность молекул воды и влияет на количество и структуру образующегося льда. Преимуществом гуаровой камеди является то, что ее рабочая концентрация не превышает 0,5%.

В сочетании с лактозой и тиомочевинной гуаровая камедь составляет эффективный протективный комплекс с повышенной криозащитной активностью.

Состав протективной защитной среды, процент (по массе):

лактоза - 11,

полиглюкин - 3,

гуаровая камедь - 0,2,

тиомочевина - 3,

аскорбиновая кислота - 3,

вода - 79,8.

Среду готовят в следующем порядке. Навески полиглюкина и гуаровой камеди замачивают в 1/6 части расчетного объема воды в течение 3-4 часов, затем хорошо перемешивают до полного растворения. Навеску аскорбиновой кислоты растворяют в 1/6 части расчетного объема воды при нагревании на водяной бане при температуре не более 30°С и перемешивании. Полученный раствор аскорбиновой кислоты охлаждают на воздухе до температуры 20-25°С и с помощью 40% раствора едкого натрия подводят величину рН до значений 6,9-7,2 ед. рН.

Навеску лактозы растворяют в оставшейся дистиллированной воде при нагревании на водяной бане до температуры не более 80°С и перемешивании. Затем раствор лактозы охлаждают на воздухе до температуры 40°С и растворяют в нем навеску тиомочевины.

В охлажденный раствор лактозы и тиомочевины вносят растворы полиглюкина, гуаровой камеди и аскорбиновой кислоты, перемешивают и определяют величину рН. При необходимости величину рН среды корректируют 5% раствором едкого натрия до значений 7,0-7,2 ед. рН.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутым техническим результатом показано в таблице 1.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показано следующими примерами.

Пример 1 Контроль (защитная среда - прототип)

Контрольную среду готовили по прописи, представленной в таблице 2.

В соотношении две части к одной части концентрированную суспензию чумного микроба смешивали со средой высушивания. Смесь тщательно перемешивали. Затем стабилизированную суспензию расфасовывали во флаконы. Сублимационное высушивание проводили на установке TG -16 по режиму: температура конденсатора - минус 60°С, температура замораживания материала - минус 40°С, продолжительность выдержки материала при температуре замораживания до начала создания разрежения - 2 часа, величина рабочего вакуума в сублимационной камере - не более 100 мкм рт.ст. (13-15 Па), скорость повышения температуры материала - 3°С/ч, температура досушивания - 25-30°С, продолжительность досушивания - 6 часов.

В результате получали сухой препарат серии 1. Устойчивость клеток к лиофилизации оценивали по показателю жизнеспособности (процент живых клеток), качество процесса высушивания оценивали по показателю остаточной влажности. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Пример 2

Готовили три среды высушивания в соответствии с прописями, представленными в таблице 2. Среды отличались от прототипа сниженным расходом лактозы и различным содержанием гуаровой камеди.

К двум частям концентрированной суспензии клеток Y. pestis штамма EV добавляли одну часть защитной среды, тщательно перемешивали. Смесь охлаждали до температуры 10-15°С. Смесь еще раз перемешивали с помощью миксера со скоростью вращения 1800-2000 об/мин в течение 10-15 секунд. Стабилизированную суспензию клеток разливали во флаконы. Сублимационное высушивание проводили по режимам, указанным в примере 1. Результаты оценки свойств полученных сухих препаратов серий 2, 3, 4, представлены в таблице 2.

Из представленных в таблице 2 данных видно, что заявляемая протективная среда для сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV, среда 3, оказалась наиболее эффективной, обладала большей криозащитной активностью, что позволило получить препарат с большим выходом жизнеспособных клеток. Среда 4 была самой гидрофильной, вязкость среды превышала вязкость прототипа на 35%. Вязкость 2 среды была на уровне прототипа, а вязкость 3 среды на 15% выше, чем у прототипа.

Известно, что при существенном увеличении вязкости растворов, увеличивается время высушивания (время достижения равновесной влажности) за счет снижения скорости и интенсивности влагоотдачи [Взаимосвязь между вязкостью раствора, кинетикой процесса сублимационного высушивания и структурой сухого материала. Виноградов Е.Л., Кобатов А.И. и др. Биотехнология, №6,1990, с. 55-57]. Это привело к получению сухого препарата (4 серия) с некондиционным, высоким уровнем остаточной влажности.

Пример 3

Полученные сухие препараты, 1-4 серий, хранили в герметизировонных флаконах в стационарных условиях в трех температурно-временных режимах:

температура от минус 15 до минус 9°С в течение 6 месяцев;

температура от 0 до 4°С в течение 3 месяца;

температура от 18 до 22°С в течение 3 суток.

По завершению указанных сроков хранения оценивали выживаемость бактерий при хранении. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, заявляемый состав защитной среды позволяет повысить термостабильность клеток чумного микроба при хранении в широком диапазоне температур.

Изобретение относится к области биотехнологии и относится к протективной среде, разработанной и оптимизированной для процесса сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV. Эффективный стабилизирующий защитный комплекс, состоящий из лактозы, полиглюкина и гуаровой камеди, обеспечивает снижение потерь биологической активности клеток в процессе лиофилизации, а также при хранении сухих препаратов. 3 табл., 3 пр.

Протективная среда для сублимационного высушивания клеток Y. pestis штамма EV, представляющая собой водный раствор лактозы, полиглюкина, аскорбиновой кислоты и тиомочевины, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гуаровую камедь при следующем содержании исходных компонентов, мас.%:

лактоза 11 полиглюкин 3 аскорбиновая кислота 3 тиомочевина 3 гуаровая камедь 0,2 вода 79,8