СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМИТАТОРОВ ПАТОГЕННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 G01N33/531 

Изобретение относится к способам получения имитаторов патогенных биологических агентов (ПБА), содержащих инактивированные бактерии возбудителей опасных инфекционных заболеваний, в частности к способам приготовления имитационных средств, предназначенных для учебных, тренировочных, научно-исследовательских целей (обучение методам специфической индикации ПБА, подготовка проб, индикация и идентификация возбудителей опасных инфекционных заболеваний), и может быть использовано специалистами учреждений Роспотребнадзора и Министерства обороны России.

В качестве имитаторов ПБА возможно использование: вакцин на основе живых и убитых бактерий, диагностикумов, содержащих клеточные антигены, а также микроорганизмов, не имеющих патогенных свойств, но относящихся к тому же виду, что и возбудители опасных инфекционных заболеваний [МУ 4.2.1103-02. Приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов: Методические указания. Утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, 27.01.2002 г.].

Известен способ получения имитатора возбудителя холеры (Vibrio cholerae), в качестве которого используется убитая корпускулярная (цельно клеточная) вакцина, состоящий в приготовлении взвеси холерных вибрионов в физиологическом растворе, убитых при 58°С, с последующим добавлением 0,5% фенола и 0,5% формалина [Е.И. Коробкова. Микробиология и эпидемиология холеры. - М.: Медгиз, 1959]. Общим с заявленным способом является температурное инактивирующее воздействие на клетки. К недостаткам этого способа относится снижение чувствительности методов специфической индикации возбудителя из-за наличия в составе имитатора свободного формальдегида.

Также известен способ получения имитатора возбудителя сибирской язвы в виде сибиреязвенной вакцины [Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины, патент РФ 2181294], состоящий в приготовлении жидкого полуфабриката из равных объемов двух компонентов. Первый компонент - разведенная физиологическим раствором споровая суспензия Bacillus anthracis штамма СТИ-1 до концентрации от 0,8 до 1,2 спор/см³, смешанная со стерильным 40% раствором сахарозы в объемных соотношениях 1:1. Второй компонент - разведенный физиологическим раствором до содержания 400 среднеэффективных иммунизационных доз в см³ концентрат сорбированного протективного антигена, полученного из микробной культуры В. anthracis штамма 55/5. Последующее лиофильное высушивание жидкого полуфабриката в камерных сушильных установках в режиме: температура полуфабриката при замораживании от минус 35 до минус 40°С; время замораживания от 3 до 4 часов; разрежение в сублиматоре от 20 до 25 Па; температура полуфабриката при досушивании от 30 до 32°С; время досушивания от 10 до 12 часов.

Общим с заявленным способом является использование защитной среды, а также высушивание жидкого полуфабриката для получения сухой формы препарата. Недостатками данного способа получения имитатора являются многостадийность и длительность приготовления; обязательный контроль качества сырья, вспомогательных материалов, а также конечного и промежуточных продуктов; невозможность получения имитаторов других возбудителей опасных инфекционных заболеваний.

В качестве прототипа выбран способ приготовления имитатора возбудителя сапа (Burkholderia mallei) [МУ 4.2.1103-02], заключающийся в обеззараживании формалином, в конечной концентрации 1%, смешанной взвеси бактерий В. mallei штаммов 10230, Р-1 и 712, выращенных при 37°С в течение 1-2 суток на мясопептонном агаре с 5% глицерина. К недостаткам данного способа следует отнести помимо снижения чувствительности специфической индикации из-за с наличия в пробах формалина ограниченный срок годности препарата, связанный с лизисом клеток в жидкой среде имитатора, и отсутствие контроля полноты инактивации и безвредности имитатора.

Задачей изобретения является разработка способа получения сухих имитаторов ПБА, обладающих индикационными характеристиками, присущими бактериальным возбудителям опасных инфекционных заболеваний, длительно сохраняющих свои свойства в условиях хранения.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе приготовления имитаторов ПБА, включающем получение бактериальной суспензии с последующим ее обеззараживанием, предусмотрены следующие отличия: тепловая инактивация (стерилизация) бактерий с помощью СВЧ-излучения; использование защитной (стабилизирующей) среды высушивания; сублимационное обезвоживание и получение имитатора путем смешения с наполнителем и дезагрегантом.

Способ осуществляется следующим образом.

Суспензию, содержащую бактерии возбудителя, помещают в емкость из термостойкого стекла. Инактивацию микробной суспензии проводят в микроволновой печи с частотой СВЧ-излучения 2450 кГц. Режим инактивации:

- удельная мощность СВЧ-излучения - 6 Вт/см³;

- продолжительность - 5 минут, двукратно с промежуточным охлаждением до 20°С.

Стерильность инактивированной суспензии контролируют культуральным способом [Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990] путем посева на плотную питательную среду для культивирования бактерий и инкубирования посевов в условиях, определяемых видом возбудителя. Взвеси признают стерильными при отсутствии на поверхности плотной питательной среды как характерных, так и нехарактерных колоний.

Инактивированную суспензию бактерий в объемном соотношении 2:1 стабилизируют защитной средой следующего состава, процент (по массе):

- лактоза - 3;

- тиомочевина - 3;

- аскорбиновая кислота - 3;

- дистиллированная вода - 91.

Использование среды указанного состава позволяет предохранить белково-липидные и нуклеиновые структуры бактерий от повреждений при обезвоживании и последующем хранении.

Высушивание жидкого полуфабриката проводят на сублимационной камерной установке согласно инструкции по эксплуатации в режиме, обеспечивающем получение сухой инактивированной культуры с остаточной влажностью от 2 до 5%.

Имитатор получают после смешения сухой инактивированной культуры (91,5%) с наполнителем - тальком (8,0%) и дезагрегантом - гидрофобизированным аэросилом (0,5%). Использование указанных веществ снижает силы адгезии и препятствует слеживаемости частиц в препарате. Агрегатно-устойчивая структура имитатора позволяет хранить его при температуре от 0 до 4°С в течение 2 лет.

Безвредность имитатора контролируют постановкой биологических проб на токсичность с использованием лабораторных животных [МУК 4.1/4.2.588-96. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998]. Имитатор считают безвредным, если все животные остались живы, не имели признаков заболевания, не уменьшили массу тела.

Индикационные характеристики имитаторов оценивают по результатам специфической индикации методами экспресс-анализа ИФА, РИГА, ПЦР [Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко. - М.: МП «Гигиена», 2006].

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существующих признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.

Изобретение позволяет получать безвредные для человека и животных имитаторы на основе инактивированных бактерий, обладающие индикационными характеристиками соответствующих ПБА, сохраняющимися в течение 2 лет. Единый подход к созданию сухой формы препарата позволяет получить имитаторы на основе возбудителей чумы, холеры, сапа, туляремии, сибирской язвы, мелиоидоза, бруцеллеза и т.п. и использовать их для конструирования проб.

Возможность осуществления заявленного изобретения показана следующими примерами.

Пример 1

Приготовление имитатора возбудителя сибирской язвы

Получали культуру В. anthracis штамма СТИ-1, культивируя в матрацах со скошенным агаром Хоттингера, содержащим (0,5±0,1) г/дм аминного азота при температуре от 33 до 35°С в течение 48 часов [Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. Г.Г. Онищенко. - М.: МП «Гигиена», 2006]. Типичный рост на поверхности представляет собой толстую шероховатую пленку серого цвета. В стерильных условиях смывали культуру с поверхности агара физиологическим раствором. Смытую с матрацев культуру разводили физиологическим раствором до концентрации 50 млрд кл./см³ по стандарту мутности. 100 см³ микробной суспензии помещали в емкость из термостойкого стекла и обрабатывали в микроволновой печи при мощности облучении 600 Вт двукратно по 5 минут с охлаждением между нагревами до 20°С. Полноту инактивации оценивали культуральным способом после высева цельного разведения суспензии на плотную питательную среду, инкубации при температуре от 33 до 35°С в течение 48 часов. Отсутствие роста на поверхности среды свидетельствовало о полной инактивации клеток.

Взвесь инактивированных бактерий в соотношении 2 части к 1 стабилизировали защитной средой, состоящей из 3% лактозы, 3% тиомочевины, 3% аскорбиновой кислоты и 91% дистиллированной воды.

Высушивание полученного жидкого полуфабриката проводили в установке МАСС-5-02 при температуре инактивированной суспензии от минус 36°С до минус 26°С, температуре конденсатора-вымораживателя от минус 60°С до минус 48°С и общей продолжительностью 38 часов. Получили сухую культуру инактивированных спор с остаточной влажностью 3,5%.

Готовили имитатор возбудителя сибирской язвы, смешивая 91,5% сухой культуры инактивированных клеток В.anthracis, 8% талька и 0,5% аэросила. Безвредность имитатора оценивали после постановки биопробы на белых мышах обоего пола, массой 18-20 г и морских свинках обоего пола, массой 250-350 г. Имитатор посчитали безвредным по отсутствию у лабораторных животных клинических симптомов интоксикации и характерных признаков местно-раздражительного действия.

Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя сибирской язвы представлены в таблице 2.

Пример 2

Приготовление имитатора возбудителя сапа

Получали культуру В. mallei штамма Ц-5, культивируя на мясопептонном агаре с 5% глицерина при температуре 37°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя сапа представлены в таблице 2.

Пример 3

Приготовление имитатора возбудителя холеры

Получали культуру V. cholerae штамма МО-45, культивируя на питательной среде для выделения и культивирования холерного вибриона при температуре от 35 до 37°С в течение 18 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя холеры представлены в таблице 2.

Пример 4

Приготовление имитатора возбудителя туляремии

Получали культуру Francisella tularensis штамма 15 НИИЭГ, культивируя на питательной среде для культивирования и выделения туляремийного микроба (FT) при температуре от 36 до 38°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя туляремии представлены в таблице 2.

Пример 5

Приготовление имитатора возбудителя чумы

Получали культуру Yersinia pestis штамма 926 (Otten), культивируя на агаре Хоттингера с 0,025% сульфацила натрия при температуре от 28 до 30°С в течение 48 часов. Дальнейшее приготовление и контроль проводили, как описано в примере 1. Результаты оценки качества и индикационные характеристики имитатора возбудителя чумы представлены в таблице 2.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см³ двукратно по 5 минут. Инактивированные бактерии стабилизировали защитной средой и высушивали в сублимационной камерной установке до остаточной влажности 2-5%. Целевой продукт состоит из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%). Способ обеспечивает получение безопасного при использовании и длительно сохраняющего свои индикационные свойства имитатора патогенного биологического агента. 2 табл., 5 пр.

Способ получения имитаторов патогенных биологических агентов, включающий обработку суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания инактивирующим воздействием, отличающийся тем, что суспензию клеток подвергают СВЧ-облучению с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см³, двукратно по 5 минут, смешивают в соотношении 2:1 с защитной средой, состоящей из дистиллированной воды (91%), лактозы (3%), тиомочевины (3%), аскорбиновой кислоты (3%), высушивают в сублимационной камерной установке с получением целевого продукта, состоящего из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%) с остаточной влажностью 2-5%.