Блокатор ионотропных глутаматных рецепторов Российский патент 2023 года по МПК A61K31/551 A61P25/28 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, касается блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов, и может быть использовано для лечения заболеваний нервной системы, связанных с разбалансировкой работы глутаматергической системы.

L-Глутаминовая кислота в форме ее мононатриевой соли (глутамата) - основной и наиболее распространённый возбуждающий нейромедиатор центральной нервной системы [1]. Рецепторы к глутамату присутствуют и на постсинаптической, и на пресинаптической мембране химического синапса, а в меньшем количестве - также на внесинаптических участках плазматической мембраны нейронов и, собственно, опосредуют глутаматергическую трансмиссию [2, 3]. За счет этого регулируется широкий спектр процессов как в центральной нервной системе, так и в периферических тканях [4, 5]. После высвобождения из пресинаптических терминалей глутамат способен активировать два типа глутаматных рецепторов: ионотропные, являющиеся лиганд-управляемыми ионными каналами, и метаботропные, являющиеся рецепторами, связанными с G-белками. Последний тип глутаматных рецепторов, как правило, выполняет модулирующую функцию, а ионотропные глутаматные рецепторы за счет своей активации обеспечивают быстрое проведение сигналов [6]. Среди ионотропных глутаматных рецепторов можно в свою очередь выделить 3 основных подтипа, отличающиеся по своим биофизическим и фармакологическим свойствам, а также физиологической роли: NMDA рецепторы (NMDA-Р), кальций-проницаемые AMPA рецепторы (КП-AMPA-Р) и кальций-непроницаемые AMPA рецепторы (КН-AMPA-Р) [7].

Чрезмерная активация глутаматергической системы вовлечена во многие патологические состояния, включая эпилепсию, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона [8,9]. Поэтому одной из важнейших фармакологических задач является поиск новых, более эффективных и клинически толерантных блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов. При этом стоит отметить, что далеко не всегда самое активное вещество является самым безопасным и полезным для применения в клинической практике. Для клинической эффективности и толерантности важны и детали молекулярного механизма действия на мишень, и профиль селективности. Так, например, блокатор NMDA рецепторов MK-801 (дизоцилпин) примерно в 1000 раз активнее по отношению к NMDA рецепторам, чем мемантин, препарат применяемый для лечения болезни Альцгеймера. Но дизоцилпин не применяется в клинической практике из-за своих побочных эффектов, связанных именно с его слишком высокой активностью по отношению к NMDA рецепторам. Наиболее перспективными являются блокаторы, ингибирующие все три основных подтипа рецепторов, то есть, соотношения ингибирующих концентраций для которых близки к 1.

Известны DNQX и D-AP5 - селективные конкурентные антагонисты AMPA и NMDA рецепторов, соответственно. ИК₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация, которая указывает, какое количество ингибирующего вещества необходимо для ингибирования in vitro данного биологического компонента на 50%) для них находятся в микромолярных и субмикромолярных диапазонах [10, 11]. Индекс селективности (соотношение ИК₅₀ для разных рецепторов) составляет для них или >100 или < 0,03.

Известен также антагонист ионотропных глутаматных рецепторов ИЭМ-1460, являющийся селективным блокатором каналов кальций-проницаемых AMPA рецепторов. Его ИК₅₀ около 3 μM для кальций-проницаемых AMPA рецепторов и больше 100 μM для кальций-непроницаемых AMPA рецепторов, а также NMDA рецепторов [12]. Индекс селективности их составляет или порядка 1 или 30.

В клинической практике широко используется мемантин, применяемый для лечения болезни Альцгеймера и являющийся селективным блокатором каналов NMDA рецепторов с ИК₅₀ в примерном диапазоне 0.5 - 1 μM для разных подклассов NMDA рецепторов [13]. При этом AMPA рецепторы мемантин ингибирует лишь в существенно более высоких концентрациях. Индекс селективности составляет <0.01.

Еще одно лекарственное средство с антагонистической глутаматергической активностью - эскетамин, разрешенный в 2019 году управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве быстродействующего антидепрессанта для интраназального введения. Его ИК₅₀ составляет порядка 0,3-1 μM для разных подклассов NMDA рецепторов [13]. Аналогично мемантину AMPA рецепторы эскетамин ингибирует лишь в существенно более высоких концентрациях. Индекс селективности составляет <0.01.

В клинической практике широко используется также перампанел, являющийся селективным аллостерическим антагонистом AMPA рецепторов. Он примерно с одинаковой эффективностью ингибирует как кальций-проницаемые, так и кальций-непроницаемые AMPA рецепторы с ИК₅₀ около 60 нМ [14]. На NMDA рецепторы перампанел влияет, однако, лишь слабо, даже при концентрации 30 μM [15]. Индекс селективности составляет >1000.

Недостатком (в том числе, перампанела, как самого эффективного по полумаксимальной концентрации, необходимой для ингибирования in vitro биологического компонента) является проявление антагонистической активности по отношению не ко всем подтипам ионотропных глутаматных рецепторов в концентрациях до 20 μM.

В таблице 1 представлена сравнительная характеристика всех упомянутых агентов, где нндекс селективности 1 - соотношение ИК₅₀ NMDA-Р/ ИК₅₀ КН-AMPA-Р, нндекс селективности 2 - соотношение ИК₅₀ NMDA-Р/ ИК₅₀ КП-AMPA-Р

Таблиица 1 Шифр/
Название Клин. применение ИК₅₀ для NMDA-Р, μM ИК₅₀ для AMPA-Р, Индекс селективности 1 Индекс селективности 2 КН-AMPA-Р КП-AMPA-Р 1 Мемантин + 0,5 - 1 >100 >100 <0.01 <0.01 2 Перампанел + >100 0,063±0,008 0,06±0,006 >1000 >1000 3 Эскетамин + 0,3 - 1 >100 >100 <0.01 <0.01 4 ИЭМ-1460 - >100 >100 3±0,6 1 >30 5 DNQX - >100 0.2 - 0.3 >100 >100 6 D-AP5 - ~3 >100 <0.03 <0.03

Во всех случаях индексы селективности либо много больше единицы, либо много меньше единицы. Даже для ИЭМ-1460 индекс селективности 2 больше 30, что делает невозможным одновременное воздействие на все основные компоненты глутаматергической передачи.

Техническим результатом изобретения является возможность проявления антагонистической активности по отношению ко всем трём основным подтипам ионотропных глутаматных рецепторов с ИК₅₀ до 20 μM.

Технический результат достигается гидробромидом 11-(4-трет-бутилбензил)-2,4,5,11-тетрагидро-3Н-[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола формулы 1

Структура и синтез гидробромида 11-(4-трет-бутилбензил)-2,4,5,11-тетрагидро-3Н-[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола формулы 1 (ДАБ-19) описаны [16]. Известны также его фармацевтические свойства - анксиолитическая и противосудорожная активность [16], а также антиагрекантная [17].

В предлагаемом изобретении соединение проявляет антагонистические свойства в отношении ионотропных глутаматных рецепторов.

Исследования антагонистических свойств в отношении ионотропных глутаматных рецепторов.

Электрофизиологическая характеризация взаимодействия ДАБ-19 с ионотропными глутаматными рецепторами.

Все экспериментальные процедуры были одобрены комитетом по биологической этике ИЭФБ РАН. Линия крыс Wistar (самцы) 13-18 дней жизни массой 25-35 грамм, получены из экспериментально-биологической клинки ИЭФБ РАН. Были приложены максимальные усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и минимизировать дискомфорт во время проводимых процедур. Крыс анестезировали под уретановым наркозом и затем декапитировали. Производилась быстрая экстракция мозга с последующим охлаждением до 2-4°C. Корональные срезы гиппокампа и стриатума получены с использованием вибротома (Campden Instr.) с последующим выделением пирамидальных клеток и интернейронов с помощью метода вибродиссоциации [18]. Все эксперименты проводились при комнатной температуре. Использовался метод фиксации потенциала в конфигурации «Целая клетка» для записи мембранных токов при аппликации агонистов и исследуемых блокаторов. Последовательное сопротивление около 20 MΩ было компенсировано на 70-80 %. Мембранные токи записаны с использованием усилителя EPC-8 (HEKA Electronics). Сигнал фильтровался в полосе частот 0-5 кГц и оцифровывался с частотой дискретизации 1 кГц. Подача растворов осуществлялась с использованием системы мультиканальной перфузии RSC-200 (BioLogic). Контроль поддерживаемого на мембране потенциала, управление системой аппликации, регистрацию и анализ данных осуществляли с помощью персонального компьютера. Состав внеклеточного раствора (миллимоль): NaCl 143, KCl 5, CaCl2 2.5, D-glucose 18, HEPES 10 (pH был подведен до физиологических значений (7.4) с использованием гидроксида натрия. Микропипетки заполнялись раствором (миллимоль): CsF 100, CsCl 40, NaCl 5, CaCl2 0.5, EGTA 5, HEPES 10 (pH подведен до физиологических значений и соответствует внутриклеточной среде (7.2) с использованием гидроксида цезия. Эксперименты по действию ДАБ-19 на NMDA и кальций-непроницаемые AMPA рецепторы проводились на пирамидальных нейронах гиппокампа (СА1 зона), по действию на кальций-проницаемые AMPA рецепторы - на гигантских холинергических интернейронах стриатума. Для идентификации типа клеток помимо морфологического использовали фармакологический критерий - чувствительность к избирательному блокатору кальций-проницаемых AMPA рецепторов ИЭМ-1925. NMDA рецепторы активировались 100 μM NMDA и 10 μM глицина. AMPA рецепторы активировались 100 μM каината. Процент блокады ионных токов измерялся при потенциале фиксации -80 мВ. Значения ИК₅₀ (аббревиатура в кириллице полумаксимальной ингибирующей концентрации, указывающей, какое количество ингибирующего вещества необходимо для ингибирования in vitro биологического компонента на 50%) рассчитывались с помощью уравнения Хилла. Концентрация предполагаемых антагонистов для построения дозозависимых кривых варьировала в пределах 1-100 µM. Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение на основе как минимум пяти экспериментов.

Результаты исследования

Исследование концентрационной зависимости действия ДАБ-19 на NMDA, кальций-непроницаемые и кальций-проницаемые AMPA-рецепторы.

Аппликация агонистов вызывала возникновение входящих токов в пирамидных нейронах гиппокампа и гигантских интернейронах стриатума при потенциале на мембране -80 мВ. Для определения процента ингибирования этих токов ДАБ-19 использован следующий протокол: аппликация агониста - коапликация агониста с блокатором - отмыв агонистом. Использовались следующие концентрации ДАБ-19:

- NMDA рецепторы - 1, 3, 10, 30, 45, 60, 100 μM

- Кальций-непроницаемые AMPA рецепторы - 1, 3, 10, 30, 100 μM

- Кальций-проницаемые AMPA рецепторы - 1, 3, 10, 15, 30 μM

Полученные данные по действию вышеуказанных концентраций ДАБ-19 на NMDA, кальций-непроницаемые и кальций-проницаемые AMPA рецепторы представлены на фиг. 1, где по оси абсцисс показаны значения исследованных концентраций ДАБ-19 в микромолях, а по оси ординат - степень ингибирующего эффекта в процентах.

Концентрационные зависимости действия ДАБ-19 на NMDA, кальций-непроницаемые и кальций-проницаемые AMPA рецепторы, представленные на фиг. 1, показывают, что ДАБ-19 является антагонистом всех трёх основных подтипов ионотропных глутаматных рецепторов.

Результаты аппроксимации полученных данных с помощью уравнения Хилла представлены в таблице 2:

Таблица 2 Подтип рецепторов ИК₅₀, μM Коэффициент Хилла NMDA рецепторы 11,0±1,6 1,03±0,14 Кальций-непроницаемые AMPA рецепторы 15,5±1,5 1,42±0,17 Кальций-проницаемые AMPA рецепторы 4,8±0,9 1,3±0,3

Полученные значения ИК₅₀ для трёх основных подтипов ионотропных глутаматных рецепторов расположены в диапазоне 5-16 μM. (NMDA) ИК₅₀ = 11,0±1,6 μM, (кальций-непроницаемых AMPA) ИК₅₀ = 15,5±1,5 μM, (кальций-проницаемых AMPA) ИК₅₀ = 4,8±0,9 μM. Наиболее активно ДАБ-19 ингибирует кальций-проницаемые AMPA рецепторы.

Данные о его селективности представлены в таблице 3.

Таблица 3 Название соединения Индекс селективности 1
ИК₅₀ NMDA-Р/ ИК₅₀ КН-AMPA-Р Индекс селективности 2
ИК₅₀ NMDA-Р/ ИК₅₀ КП-AMPA-Р ДАБ-19 0,71 2,3

Как следует из таблицы, оба индекса селективности находятся в диапазоне 0.3 - 3, в отличие от аналогов, в том числе, и наиболее близкого, для которых индексы селективности либо много больше единицы, либо много меньше единицы (табл.1).

Таким образом, предлагаемый блокатор ионотропных глутаматных рецепторов гидробромид 11-(4-трет-бутилбензил)-2,4,5,11-тетрагидро-3Н-[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола (ДАБ-19) является антагонистом всех трёх основных подтипов ионотропных глутаматных рецепторов (NMDA, кальций-непроницаемых и кальций-проницаемых AMPA) в диапазоне ИК₅₀ 5-16 μM, в отличие от известных антагонистов, в том числе от наиболее эффективного по концентрации, который является антагонистом в отношении только кальций-непроницаемых и кальций-проницаемых AMPA рецепторов (табл.1).

Cписок цитируемой литературы

1. Collingridge GL, Singer W. Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity. Trends Pharmacol Sci. 1990 Jul;11(7):290-6. doi: 10.1016/0165-6147(90)90011-v. PMID: 2167544.

2. Pinheiro PS, Mulle C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 2008 Jun;9(6):423-36. doi: 10.1038/nrn2379. Epub 2008 May 9. PMID: 18464791.

3. Platt SR. The role of glutamate in central nervous system health and disease--a review. Vet J. 2007 Mar;173(2):278-86. doi: 10.1016/j.tvjl.2005.11.007. Epub 2005 Dec 22. PMID: 16376594.

4. Reiner A, Levitz J. Glutamatergic Signaling in the Central Nervous System: Ionotropic and Metabotropic Receptors in Concert. Neuron. 2018 Jun 27;98(6):1080-1098. doi: 10.1016/j.neuron.2018.05.018. PMID: 29953871; PMCID: PMC6484838.

5. Du J, Li XH, Li YJ. Glutamate in peripheral organs: Biology and pharmacology. Eur J Pharmacol. 2016 Aug 5;784:42-8. doi: 10.1016/j.ejphar.2016.05.009. Epub 2016 May 7. PMID: 27164423.

6. Watkins JC, Jane DE. The glutamate story. Br J Pharmacol. 2006 Jan;147 Suppl 1(Suppl 1):S100-8. doi: 10.1038/sj.bjp.0706444. PMID: 16402093; PMCID: PMC1760733.

7. Hansen KB, Wollmuth LP, Bowie D, Furukawa H, Menniti FS, Sobolevsky AI, Swanson GT, Swanger SA, Greger IH, Nakagawa T, McBain CJ, Jayaraman V, Low CM, Dell'Acqua ML, Diamond JS, Camp CR, Perszyk RE, Yuan H, Traynelis SF. Structure, Function, and Pharmacology of Glutamate Receptor Ion Channels. Pharmacol Rev. 2021 Oct;73(4):298-487. doi: 10.1124/pharmrev.120.000131. PMID: 34753794; PMCID: PMC8626789.

8. Lee K, Goodman L, Fourie C, Schenk S, Leitch B, Montgomery JM. AMPA Receptors as Therapeutic Targets for Neurological Disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 2016;103:203-61. doi: 10.1016/bs.apcsb.2015.10.004. Epub 2015 Nov 19. PMID: 26920691.

9. Liu J, Chang L, Song Y, Li H, Wu Y. The Role of NMDA Receptors in Alzheimer's Disease. Front Neurosci. 2019 Feb 8;13:43. doi: 10.3389/fnins.2019.00043. PMID: 30800052; PMCID: PMC6375899.

10. Benveniste M, Mayer ML. Structure-activity analysis of binding kinetics for NMDA receptor competitive antagonists: the influence of conformational restriction. Br J Pharmacol. 1991 Sep;104(1):207-21. doi: 10.1111/j.1476-5381.1991.tb12409.x. PMID: 1686203; PMCID: PMC1908275.

11. Dron MY, Zhigulin AS, Tikhonov DB, Barygin OI. Screening for Activity Against AMPA Receptors Among Anticonvulsants-Focus on Phenytoin. Front Pharmacol. 2021 Dec 7;12:775040. doi: 10.3389/fphar.2021.775040. PMID: 34950035; PMCID: PMC8688955.

12. Bolshakov KV, Kim KH, Potapjeva NN, Gmiro VE, Tikhonov DB, Usherwood PN, Mellor IR, Magazanik LG. Design of antagonists for NMDA and AMPA receptors. Neuropharmacology. 2005 Aug;49(2):144-55. doi: 10.1016/j.neuropharm.2005.02.007. PMID: 15996563.

13. Kotermanski SE, Johnson JW. Mg2+ imparts NMDA receptor subtype selectivity to the Alzheimer's drug memantine. J Neurosci. 2009 Mar 4;29(9):2774-9. doi: 10.1523/JNEUROSCI.3703-08.2009. PMID: 19261873; PMCID: PMC2679254.

14. Barygin OI. Inhibition of calcium-permeable and calcium-impermeable AMPA receptors by perampanel in rat brain neurons. Neurosci Lett. 2016 Oct 28;633:146-151. doi: 10.1016/j.neulet.2016.09.028. Epub 2016 Sep 20. PMID: 27663136.

15. Hanada T, Hashizume Y, Tokuhara N, Takenaka O, Kohmura N, Ogasawara A, Hatakeyama S, Ohgoh M, Ueno M, Nishizawa Y. Perampanel: a novel, orally active, noncompetitive AMPA-receptor antagonist that reduces seizure activity in rodent models of epilepsy. Epilepsia. 2011 Jul;52(7):1331-40. doi: 10.1111/j.1528-1167.2011.03109.x. Epub 2011 Jun 2. PMID: 21635236.

16. Патент РФ 2662242, МПК C07D 487/04, A61K 31/55, 2018 г.

17. Патент РФ 2582618, МПК C07D 487/04, A61K 31/55, 2016 г.

18. Vorobjev VS. Vibrodissociation of sliced mammalian nervous tissue. J Neurosci Methods. 1991 Jul;38(2-3):145-50. doi: 10.1016/0165-0270(91)90164-u. PMID: 1784118.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии. Применение гидробромида 11-(4-трет-бутилбензил)-2,4,5,11-тетрагидро-3Н-[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола формулы 1 в качестве блокатора ионотропных глутаматных рецепторов и может быть использовано для лечения заболеваний нервной системы, связанных с разбалансировкой работы глутаматергической системы. Технический результат антагонистическая активность по отношению ко всем трём основным подтипам ионотропных глутаматных рецепторов с ИК₅₀ до 20 μM. 1 ил., 3 табл.

Применение гидробромида 11-(4-трет-бутилбензил)-2,4,5,11-тетрагидро-3Н-[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола формулы 1

в качестве блокатора ионотропных глутаматных рецепторов.