СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА НА ОСНОВЕ НАНО- И/ИЛИ МИКРОЧАСТИЦ ZnO2 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОМ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОМ АНАЛИЗЕ С УЧАСТИЕМ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 2023 года по МПК C01B15/32 G01N21/75 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к аналитической химии, в частности, к композициям и комплектам для использования в спектрофотометрическом (в том числе колориметрическом) и люминесцентном (флуоресцентном, хемилюминесцентном, биолюминесцентном) анализе, в том числе биоаналитических, биосенсорных и медицинских технологиях. Область применения данной разработки - создание биоаналитических и биосенсорных систем, аналитические исследования, медицинская диагностика, иммуноферментный и ДНК анализ (в том числе за счёт маркирования метками на основе пероксидаз), определение фермент-зависимых биологически активных веществ. Изобретение может быть использовано также при создании биосенсоров на основе ферментов-оксидаз, требующих пероксид водорода в качестве субстрата.

Уровень техники

Генерация пероксида водорода внутри реакционной среды является важной задачей для разработки новых и усовершенствования существующих методов качественного и количественного анализа, основанных на использовании ферментов, в том числе в качестве метки, в биологии, медицине, а также клинической диагностике. Использование пероксида водорода позволяет эффективно совмещать биохимическую и физико-химическую реакции при создании биосенсоров на основе ферментов оксидаз, которые повсеместно применяют в ферментных биосенсорах, в том числе в качестве метки, и катализируемых ими реакциях для определения биологически активных веществ за счёт их связывания со специфическими лигандами.

Подобные методики основаны на способности биологических молекул (рецепторов, антител, нуклеиновых кислот, ферментов) связываться с высокой степенью специфичности с соответствующей ответной частью лиганда-партнёра. Они получили широкое распространение при определении биологически активных веществ, и стали одним из основных инструментов в биологических исследованиях и медицинской диагностике.

Сенсорные системы, основанные на ферментах как в качестве распознающего лиганда, так и в качестве метки получили наибольшее распространение в современном биохимическом анализе.

Одним из классов ферментов, получивших широкое коммерческое распространение, в частности, в иммунноферментом анализе (ИФА или ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), определении олигонуклеотидов, методах гибридизации нуклеиновых кислот - является пероксидаза, которая обладает специфичностью к широкой группе соединений с различными свойствами и структурами. Пероксидаза является двухсубстратным ферментом и катализирует 2 типа связанных реакций: (а) восстановление пероксида водорода до воды и (б) окисление второго субстрата, к которым относятся ароматические амины, фенольные соединения, а также другие вещества.

Содержание указанных выше соединений оценивают по активности фермента пероксидазы, которую, в свою очередь, определяют по накоплению поглощающих или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ - субстратов пероксидазы, например, таких как 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонновая кислота (АБТС) и о-фенилендиамин (ФДА), но при этом круг субстратов не ограничивается перечисленными примерами. Выбор субстратов зависит от способа детектирования (спектрофотометрического или люминесцентного), а также от требований к чувствительности анализа.

Несмотря на многочисленные преимущества и широкое применение пероксидазы в биосенсорных технологиях и биоаналитических приложениях системы на ее основе имеют ключевой недостаток. Они требуют добавления извне основного субстрата пероксидазы - пероксида водорода или H₂O₂, поскольку чрезвычайно сложно включить этот реагент в состав сенсорного устройства на стадии его изготовления. К тому же, пероксид водорода неустойчив при хранении, что требует применения различных методов его стабилизации: с помощью пероксида мочевины [Jones R.M. Stable peroxide substrate formulation // European Patent Office. Vol. 0 279 614], галогенидов олова , с использованием системы стабилизаторов, состоящей из хелатирующего агента фосфоновой кислоты, оловянного стабилизатора, и ароматического хелатирующего соединения [Wang X., Genco K.R. Stabilization of alkaline hydrogen peroxde // United States Patent. 2007. Vol. 2, №12]. При этом описанные методы стабилизации не обеспечивают необходимой для рутинного анализа стабильности сенсоров, а также отрицательно влияют на чувствительность и воспроизводимость аналитического сигнала [Kornienko V.L. et al. The Prospects of the in situ and ex situ Use of Aqueous Solutions of Hydrogen Peroxide Electrogenerated from Oxygen // Russ. J. Electrochem. © Pleiades Publishing, 2020. Vol. 56, №5. P. 427-441]. Альтернативным способом решения обозначенной проблемы может быть разработка способа генерация пероксида водорода непосредственно в реакционной смеси, в составе биоаналитической системы или сенсорного устройства.

Из уровня техники известен способ внутренней генерации пероксида водорода из кислорода на газодиффузионных электродах (ГДЭ) из технического углерода [V. L. Kornienko, G. A. Kolyagin, G. V. Kornienko and T. A. Kenova “The prospects of the in-situ and ex-situ use of aqueous solutions of hydrogen peroxide electrogenerated from oxygen”, Russian Journal of Electrochemistry, 2020, 56, 427-441]. Использование ГДЭ на основе технологического углерода А-437Е (ацетиленовая сажа) и мезоструктурированного углерода ЦМК-3 позволяет получить раствор Н₂О₂ с концентрацией выше 3 М, который может быть использован с высокой эффективностью как в косвенном электросинтезе важных органических и неорганических целевых продуктов, так и в разрушении органических и неорганических загрязнителей, присутствующих в сточных водах различного происхождения.

Однако известное решение предполагает использование углеродного черного электрода, что из-за окраски инструмента будет осложнять детектирование. При этом при электролизе возможно побочное окисление и разрушение молекул хромогенных субстратов, мешающее контролируемому процессу окисления сгенерированным пероксидом водорода. Наконец, генерация пероксида водорода с эффективностью 96% по данной методике занимает 30 мин, что ухудшает точность анализа, его воспроизводимость и экспрессность. Последнее ограничивает применение такой системы при определении нестабильных во времени аналитов.

Из уровня техники известен способ фотокаталитической внутренней генерации пероксида водорода из пероксосоединений [Lanchuk Y. v. et al. “Towards sustainable diagnostics: replacing unstable H₂O₂ by photoactive TiO₂ in testing systems for visible and tangible diagnostics for use by blind people”, RSC Advances, Royal Society of Chemistry, 2018. Vol. 8, № 66. P. 37735-37739]. Авторы работы предлагают заменить нестабильный H₂O₂ на стабильный TiO₂ в качестве альтернативного источника инициаторов радикальной полимеризации акриламида с целью создания визуального и тактильного портативного датчика для обнаружения биологически важных молекул (ДНК, РНК, АТФ). Пероксид водорода генерируется непосредственно в среде реакции путём восстановления растворённого в водном растворе кислорода воздуха фотогенерированными электронами, образующимися при УФ-облучении водного раствора наночастиц TiO₂. TiO₂ разрушает структуру воды под действием облучения, что приводит к образованию высокой концентрации активных форм кислорода, в том числе и пероксида водорода, а также свободных радикалов.

Однако данный способ неспецифичен и неселективен: процесс УФ-облучения будет приводить к окислению большинства компонентов системы, а не только требуемых аналитов. При этом УФ излучение также может приводить и к разрушению некоторых участвующих в процессе органических молекул. Кроме того, количество получаемого по данной методике пероксида водорода (на уровне единиц микромолярных концентраций) недостаточно для проведения реакции пероксидазного окисления индикаторных веществ - вторых субстратов фермента.

Из уровня техники известен способ электролиза воды для получения пероксида водорода по мере необходимости: водород и кислород смешиваются в электролизере, и затем их смесь в воде подается в реактор для получения целевого реагента [Патент KR20090014396A, 10.02.2009]. Раствор производится без необходимости добавления дополнительных реагентов. Настоящее изобретение обеспечивает производство водного раствора пероксида водорода в виде потока последовательно или параллельно стандартному водопроводу. Газообразный водород и кислород, полученные из водопроводной воды в электролитической ячейке, направляют в реактор, сообщающийся с электролизером и расположенном между электролизером и выпускным отверстием, где затем они реагируют в присутствии катализатора (на основе платины, палладия, рутения, родия, иридия, осмия и золота) с образованием перекиси водорода в водной фазе, которая затем выводится через выпускное отверстие. Датчики обнаружения пероксида водорода в данном изобретении включают спектроскопические методы, такие как методы ультрафиолетовой или инфракрасной спектроскопии, а также потенциометрические методы.

Тем не менее данный способ генерации пероксида водорода не подходит для создания компактных биосенсорных и биоаналитических систем. К тому же, как было показано выше, электрохимическая генерация требует определённого времени для накопления необходимого количества пероксида водорода и может сопровождаться разрушением органических молекул и биологических объектов.

Наиболее близким к заявляемому является способ генерации пероксида водорода с помощью пероксида кальция и магния [Waite, A. J., Bonner, J. S., Austenite, R. «Kinetics and stoichiometry of oxygen release from solid peroxides». Environ. Eng. Sci. 1999, 16, 187-199]. Данный способ заключается во внесении твёрдых частиц пероксида кальция и магния в водный раствор щелочей с рН от 8 до 10, в результате поверхностной реакции выделяется пероксид водорода в количестве до 50% от содержащегося в системе.

Эти твердые формы пероксидов широко используются для экологических целей благодаря их стабильности в водных растворах с высоким pH. Сообщается о стабильности пероксидов кальция и магния, которую можно сравнить с гидроксидом металла, который создает растущий барьер массопереноса, что замедляет дальнейшее высвобождение пероксида водорода, а также помогает сохранить высокий рН в слоях вблизи пероксосоединения.

Однако, транспортный барьер, образующийся при осаждении гидроксида в наночастицах, слишком тонок, чтобы заметно замедлить выделение пероксида водорода и позволить осуществлять процесс более контролируемо. Тем более в области, близкой к нейтральному рН, а также при кислом pH предпочтительно быстрое растворение за счет реакции MO_{2 (тв)} + 2H⁺ _(жидк) → M²⁺ _(жидк) + H₂O_{2 (жидк)}.

Кроме того, данный способ ограничен в применении только в щелочных условиях, так как пероксиды кальция и магния высвобождают пероксид водорода только при рН = 9, что не совместимо с областью максимальной активности пероксидазы из корней хрена (рН ~ 6) и не подходит для целей анализа, где она применяется.

Таким образом существует потребность в разработке способа генерации пероксида водорода, который, во-первых, основывается на недорогих материалах стабильных при длительном хранении (чистый пероксид водорода не стабилен), во-вторых, протекает при рН, близких к рН максимальной активности пероксидаз (улучшение кинетических параметров биохимических реакций), в-третьих, не имеет значительного поглощения и/или флуоресценции в ближней ультрафиолетовой и видимой части спектра (требования для спектрофотометрического и флуориметрического детектирования).

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа внутренней (in-situ) генерации H₂O₂ по требованию (on-demand) с помощью регулировки pH системы буферным раствором для непосредственного использования в сенсорных системах, требующих присутствия пероксида водорода для своей работы, в частности, в системах, которые содержат пероксидазу. Для решения данной задачи предлагается использовать наночастицы ZnO₂, стабильные как при хранении, так и при приготовлении раствора с рН выше 7.

Заявляемое изобретение устраняет вышеперечисленные недостатки аналогов.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является возможность экспресс-определения широкого круга биологически активных веществ, а также пероксидазы по активности фермента, которая контролируется по накоплению окрашенных или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ (ТМБ, АБТС, ФДА). При этом достигается воспроизводимость результатов не менее 99 % в случае спектрофотометрического метода анализа и не менее 98% в случае люминесцентого, а время единичного анализа составляет менее 7 мин, что в случае 96-луночного планшета эквивалентно времени анализа 1 пробы менее 5 с. Скорость протекания реакции ферментативного окисления индикаторных субстратов на 30% выше при использовании наночастиц ZnO₂, чем при внесении пероксида водорода извне.

При этом нано- и микрочастицы ZnO₂ стабильны в течение длительного времени (более года) при хранении на воздухе без доступа CO_2. В чистом виде пероксид водорода не стабилен при длительном хранении, поэтому для его стабилизации используют специальные вещества, которые, в том числе, могу влиять на протекание процессов пероксидазного окисления. Таким образом, использование стабильных при длительном хранении частиц ZnO₂ позволяет улучшить воспроизводимость получаемых результатов и повысить скорость протекания реакции пероксидазного оксиления.

Технический результат достигается применением нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов. Нано- и/или микрочастицы ZnO₂ используют в виде суспензии как в водных, так и не водных растворителях, на поверхности или в объёме полимерных плёнок.

Также технический результат достигается способом генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы, включающий добавление раствора фермента в буферном растворе с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления, внесении пробы, содержащей индикаторный субстрат, с последующим добавлением в полученную смесь заранее приготовленной суспензии наночастиц пероксида цинка, после чего проводят обнаружение и определение активности пероксидазы и/или содержания окисленных продуктов окисления индикаторных субстратов спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом в кювете и/или микропланшете. При этом качественное и количественное определение пероксидазы проводят спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом. В качестве индикаторного субстрата используют вещества - красители или биологически-активные вещества, являющиеся субстратами пероксидазы и изменяющие свою окраску в ходе реакции окисления, для их спектрофотометрического и/или флуорометрического определения, а в качестве красителя используют вещества, выбранные из группы, включающей ТМБ, ФДА, АБТС. В качестве биологически-активных веществ используют аскорбиновую кислоту, флавоноиды (такие как эпикатехин и кверцетин, но не ограничиваются ими), витамин В1 (тиамин), гидропероксиды различного строения, фенотиазины, катехоламины и их метаболиты. В качестве пероксидазы используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека. Пероксидазы содержится в количестве от 0,05 до 1 нМ. В качестве буферного раствора используют буфер с рН в диапазоне 5-6 единиц, в том числе фосфатный буфер, фталатный буферный раствор, ацетатный буферный раствор. Для определения пероксидазы от 5 до 7 минут регистрируют сигналы оптической плотности и интенсивности люминесценции, возбуждения люминесценции в пробе, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 3, 3',5, 5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в диапазоне 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) в диапазоне 410-420 нм в случае перекисного окисления АБТС с образованием катион-радикала. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции в спектрах испускания её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне от 560 до 580 нм. Для получения сигнала люминесценции (2,3-диаминофеназина, ДАФ) пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны 430 нм.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где:

На фиг. 1 представлено схематическое представление процесса добавления H₂O₂ извне (верхняя панель) и внутрисистемной генерации (нижняя панель) в объеме образца.

На фиг. 2 представлена схема реакции перекисного окисления рассматриваемых классических субстратов пероксидазы: ТМБ, ФДА и АБТС.

На фиг. 3 представлены рН-зависимости оптической плотности продуктов перекисного окисления указанных хромогенных субстратов, основанные на спектрофотометрических данных в УФ и видимом диапазонах. Проводилось сравнение эффективности окисления субстратов с помощью H₂O₂, полученным путём внутренней генерации и с помощью добавления H₂O₂ извне. Позициями на фигурах обозначены: 1 - зависимость оптической плотности от величины рН в случае образования ХДИ с максимумом поглощения при λ = 450 нм и мерихиноидного комплекса с максимумом поглощения при λ = 375/655 нм) при pH = 5,5, 8 и 10; 2 - зависимость оптической плотности от величины рН в случае образования ДАФ с максимумом поглощения при λ = 430 нм при pH = 5.5, 8, 10.

На фиг. 4 представлены данные сравнения кинетики окисления ФДА, катализируемого пероксидазой), при помощи H₂O₂, добавленным извне, и H₂O₂, полученного заявляемым способом внутренней генерации путем регулировки pH наночастиц ZnO₂. Кинетические кривые построены на основе данных спектров люминесценции при окислении ФДА.

На фиг. 5 представлены данные сравнения кинетики окисления АБТС катализируемого пероксидазой, при помощи H₂O₂, добавленным извне, и H₂O₂, полученного заявляемым способом внутренней генерации путем регулировки pH наночастиц ZnO₂. Кинетические кривые построены на основе данных спектров поглощения продуктов окисления АБТС.

На фиг. 6 представлены временные зависимости оптической плотности продуктов перекисного окисления субстратов от концентрации пероксидазы в условиях внутренней генерации пероксида водорода, основанные на спектрофотометрических данных в УФ и видимом диапазонах. Позициями на фигурах обозначены: 1 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования ХДИ с максимумом поглощения при λ = 450 нм; 2 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования ДАФ с максимумом поглощения при λ = 430 нм; 3 - зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в случае образования АБТС^•+ с максимумом поглощения при λ = 415 нм в период времени 0-10 мин.

На фиг. 7 представлена временная зависимость интенсивности люминесценции продукта перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода от концентрации пероксидазы в период времени 0-10 мин.

Осуществление изобретения

Замена добавляемой извне (ex-situ) H₂O₂ на наночастицы ZnO₂, генерирующих пероксид водорода непосредственно в тест-системе под действием буферного раствора с рН < 6 позволяет улучшить воспроизводимость результатов при определении фермент-зависимых биологически активных веществ и повысить скорость протекания реакции пероксидазного оксиления.

Способ внутренней генерации пероксида водорода с помощью наночастиц ZnO₂ для определения биологически активных веществ по активности пероксидазы включает смешение пробы, содержащей индикаторный субстрат, с раствором пероксидазы и коллоидным раствором наночастиц ZnO₂ с последующим добавлением буферного раствора с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления с образованием окрашенных и/или люминесцирующих продуктов.

Предпочтительно в качестве пероксидазы использовать пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека.

Среди стабильных пероксидов металлов пероксид цинка ZnO₂ перспективен в качестве источника пероксида водорода, поскольку его производство дешево, он имеет длительный срок хранения и количественно выделяет H₂O₂ при pH ниже 6, что соответствует диапазону pH максимальной активности пероксидазы, согласно реакции:

Таким образом, наночастицы ZnO₂ предлагается использовать в качестве материала для внутрисистемной генерации H₂O₂ как альтернатива добавлению H₂O₂ извне.

Наночастицы были синтезированы в соответствие с методикой, представленной в публикации [Wolanov Y. et al. Zinc Dioxide Nanoparticulates: A Hydrogen Peroxide Source at Moderate pH // Environ. Sci. Technol. 2013. Vol. 47. P. 8769−8774]: 1,0 г (4,6 ммоль) дигидрата ацетата цинка растворяли в 12 мл 1,1 масс. % раствора пероксида водорода. 25 мл 0,4M (10 ммоль) медленно добавляли до достижения pH = 8-9. В результате были получены сферические агрегаты пероксида цинка со средним диаметром 30-40 нм согласно результатам сканирующей электронной микроскопии.

В случае спектрофотометрического детектирования необходимо присутствие субстрата пероксидазы, в ходе реакции дающее окрашенное соединение. Для этого раствор пробы в кювете или прозрачном микропланшете помещают в спектрофотометр и регистрируют значения оптической плотности в диапазоне от 200 до 900 нм. Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума поглощения её окисленного субстрата в диапазоне: 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ); 410-420 нм в случае образования катион-радикала АБТС^•+, а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ).

В случае люминесцентного детектирования (на примере использования ФДА) пробу облучают монохроматическим излучением с длиной волны в диапазоне 420-450 нм (в нашем случае 430 нм). Вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции её окисленного субстрата 2,3-диаминофеназина в диапазоне от 560 до 580 нм (если быть точнее, то 570 нм). Кинетические данные были получены при измерении флюоресценции через 1, 2, 3, 5 и 10 мин после начала реакции.

Для определения количественного содержания аналитов в исследуемых образцах измеряют интенсивность полученного сигнала (спектрофотометрическое и люминесцентное определение), вывод о количественном содержании делают по предварительно рассчитанным градуировочным зависимостям.

Эффективность такого подхода была продемонстрирована на классических субстратах пероксидазы: 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) и 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) (спектрофотометрическое), а также о-фенилендиамин (ФДА) (спектрофотометрическое и люминесцентное определение). Система, использующая данный способ генерации пероксида водорода, характеризуется низким пределом обнаружения, высокой селективностью, широким линейным диапазоном определяемых содержаний (концентраций) субстратов пероксидазы, а также высокой воспроизводимостью и экспрессностью.

Получение поглощающих и люминесцирующих продуктов перекисного окисления субстратов пероксидазы как показатель эффективности внутренней генерации пероксида водорода (фиг. 1, 6, 7), включает окисление исходных соединений в присутствии биокатализатора - пероксидазы растительного происхождения, в частности пероксидазы из корней хрена. Для типичных хромо и флуорогенных субстратов пероксидазы (ТМБ, АБТС или ФДА) схемы таких реакций окисления представлены на фиг. 2.

Окисление исходных соединений проводят за счёт внутренней генерации пероксида водорода в биосенсорной и/или биоаналитической системах вместо внесения раствора пероксида водорода извне, при этом возрастает скорость реакции перекисного окисления. Данная схема изобретения существенно упрощает процедуру массового экспрессного анализа - 96 проб за 7 мин, т.е. около 5 с на одну пробу.

Данный способ генерации пероксида водорода может быть использован как при детектировании в кювете (пластиковой, стеклянной или кварцевой), стеклянной пластинке, оптоволокне, так и с любыми цельными или сборными полимерными (например, полистирольными, полипропиленовыми и др.) планшетами с любым количеством лунок, из которых наиболее применимыми являются 6, 12, 24, 48, 72, 96-луночные (но ими не ограничивается), подходящие для проведения спектрофотометрического и люминесцентного анализа. При этом их химическая и термическая устойчивости не имеют значения, поскольку анализ проводится в водной среде при комнатной температуре.

Способ определения продуктов перекисного окисления субстратов пероксидазы, описанного в заявляемом изобретении, включает в себя последовательное введение компонентов реакции: фосфатный буферный раствор (ФБР), раствор пероксидазы, раствор субстрата (ТМБ, АБТС или ФДА), раствор наночастиц ZnO₂.

Предпочтительно компоненты реакции вводить поочередно в следующем порядке:

• Наночастицы ZnO₂ (100 - 1000 мкМ, растворенные в буферном растворе)

• ФБР (фосфатный буферный раствор; 0,1 - 1 М, pH 4.0 - 5.9)

• Пероксидаза (0.5 - 1 нМ, растворенная в буферном растворе)

После добавления всех перечисленных компонентов реакционную смесь тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность или интенсивность люминесценции (в случае образования люминесцирующего продукта) по истечении 7 мин, так как это соответствует выходу кинетической кривой процесса окисления на плато (фиг. 4, 5).

Фигура 3 представляет сравнение рН-зависимости сигнала (спектрофотометрического и люминесцентного) при добавлении пероксида водорода извне и его внутренней генерации с помощью наночастиц ZnO₂.

Исходные зарегистрированные спектры люминесценции представляли собой зависимость интенсивности (I) испускания от длины волны (λ). Для построения кинетической кривой окисления ФДА была использована дополнительная математическая обработка интенсивности люминесцентного сигнала: для описания кинетический кривых ферментативно-катализируемого процесса перекисного окисления использовался алгоритм интегрирования с экспоненциальной моделью.

Предлагаемое изобретение также позволяет сократить время проведения единичного анализа на 30%, что может быть использовано в аналитических исследованиях, массовых анализах биологических жидкостей в целях медицинской диагностики, иммуноферментном и ДНК анализе, биохимических исследованиях для определения широкого круга аналитов.

Качественное и количественное определение и вывод о присутствии того или иного субстрата пероксидазы делают по наличию максимумов в спектрах поглощения и испускания и их интенсивности, как было описано выше.

В настоящем изобретении приняты следующие обозначения и термины:

R - коэффициент корреляции,

λ_em - длина волны испускания (эмиссии),

λ_ex - длина волны возбуждения люминесценции,

ПКХ - пероксидаза из корней хрена,

ФБР - фосфатный буферный раствор,

ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин,

ФДА - о-фенилендиамин,

ХДИ - хинондиимин,

ДАФ -2,3-диаминофеназин,

АБТС - 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновая кислота),

АБТС^•+ - катион-радикал АБТС.

Химические символы / сокращения имеют свои обычные значения: °С (градус (градусы) Цельсия), нм (нанометр (нанометры)), мм (миллиметр (миллиметры)), мин (минута (минуты)), с (секунда (секунды)), мкл (микролитр (микролитры)), М (моль (моли) в литре), л (литр (литры)), мкл (микролитр (микролитры)), мг (миллиграмм (миллиграммы)), нмоль (наномоль (наномоли)), нМ (наномоль (наномоли) в литре), мкМ (микромоль (микромоли) в литре), мМ (миллимоль (миллимоли) в литре), В (вольт (вольты)).

Наночастицы - частицы материала размером от 0.1 до 100 нм, микрочастицы - частицы размером от 100 нм и до 100 микрометров.

Индикаторный субстрат - вещество, являющиеся субстратом пероксидазы и способное изменять свою окраску в ходе реакции окисления, что делает возможным спектрофотометрическое и/или флуорометрическое обнаружение и/или определение данного вещества. Примерами индикаторных субстратов являются ТМБ, ФДА, АБТС, но ими не ограничиваются.

Представленные ниже примеры конкретного осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам в данной области техники полного описания проведения и применения анализа по изобретению, но не ограничивают предполагаемый авторами изобретения объем изобретения.

Все приведенные ниже реагенты, кюветы и планшеты являются коммерчески доступными. Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°C; в ходе всех экспериментов для приготовления водных растворов использовали деионизированную воду высокой чистоты, очищенную с использованием установки «Milli-Q», «Millipore»; измерение рН буферного раствора проводили на рН - милливольтметре «Hanna Instruments» (Германия); для фиксирования времени проведения индикаторных реакций применяли секундомер фирмы «Агат» (Россия) с погрешностью ±0.2 с. Спектры поглощения в УФ и видимой областях регистрировали с использованием спектрофотометра SPECTROstar Nano («BMG Labtech», Германия) с точностью ±0.003 опт. ед. Сбор данных и обработку спектров проводили с помощью програмного обеспечения SPECTROstar Nano MARS («BMG Labtech», Германия); интенсивность люминесценции и спектры испускания регистрировали на спектрофлуориметре Cary Eclipce («Agilent Technologies», США); для измерений в растворе использовали 96-луночный полистирольном планшет белого цвета («Costar», США) (объем ячейки 300 мкл); ультразвуковую обработку проводили с использованием ультразвуковой ванны «Сапфир 680» (ПКФ Сапфир, Россия); взвешивание препаратов проводили с точностью ±0.02 мг на аналитических весах «Discovery», «OHAUS»; точные объемы жидкостей отбирали с использованием автоматических дозаторов «Eppendorf» с диапазонами объемов: 2 - 20, 10 - 100, 20 - 200, 100 - 1 000 и 500 - 5 000 мкл.

Пример 1. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ТМБ в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.

Способ определения концентрации пероксидазы, при которой достигается наибольшая эффективность перекисного окисления ТМБ, подразумевает получение оптического сигнала при образовании окрашенного продукта (ХДИ).

В 96-луночный прозрачный полистирольный планшет последовательно вводят 204 мкл 0,1 М ФБР с рН = 5.5, 36 мкл 50 мкМ спиртового раствора ТМБ и 30 мкл 100 мкМ раствора наночастиц пероксида цинка в ФБР. Затем вводили от 12 до 60 мкл раствора ПКХ в ФБР, что позволяло варьировать концентрации в диапазоне 0,05 - 1 нМ (фиг. 6). После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность регулярно каждую минуту до 10 мин. Контрольный опыт проводили аналогично вышеописанной методике за исключением того, что вместо ПКХ вводили ФБР (табл. 1).

Пример 2. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.

Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в систему добавляли 32 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА (фиг. 6, табл. 1).

Пример 3. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления АБТС в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью спектрофотометрического детектирования.

Анализ проводился аналогично примеру 1 с отличием в том, что в систему добавляли 48 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА (фиг. 6, табл. 1).

Пример 4. Определение пероксидазы из корней хрена по реакции перекисного окисления ФДА в условиях внутренней генерации пероксида водорода с помощью люминесцентного детектирования

Способ определения концентрации пероксидазы, при которой достигается наибольшая эффективность перекисного окисления ФДА, подразумевает получение сигнала флюоресценции и его дальнейшей оценки при образовании окрашенного продукта (ДАФ).

В 96-луночный белый полистирольный планшет последовательно вводят 207 мкл 0,1 М ФБР с рН = 5.5, 32 мкл 50 мкМ водного раствора ФДА и 30 мкл 100 мкМ раствора наночастиц пероксида цинка в ФБР. Затем вводили от 12 до 60 мкл раствора ПКХ в ФБР, что позволяло варьировать концентрации в диапазоне 0,05 - 1 нМ (фиг. 7). После чего реакционную смесь тщательно перемешивали и измеряли интенсивность люминесценции регулярно в течение 10 мин. Контрольный опыт проводили аналогично вышеописанной методике за исключением того, что вместо ПКХ вводили ФБР (табл. 2).

Таблица 1. Временная зависимость оптической плотности от концентрации пероксидазы в реакциях перекисного окисления рассматриваемых хромогенных субстратов (ТМБ, ФДА, АБТС) с образованием окрашенных продуктов хинондиимина (ХДИ), 2,3-диаминофеназина (ДАФ), катион-радикала АБТС (АБТС^•+) С_ПКХ, нМ Оптическая плотность
(ТМБ, λ = 450 нм) Оптическая плотность
(ФДА, λ = 430 нм) Оптическая плотность
(АБТС, λ = 415 нм) 0 мин 3 мин 5 мин 7 мин 10 мин 0 мин 3 мин 5 мин 7 мин 10 мин 0 мин 3 мин 5 мин 7 мин 10 мин 1,00 0,77 1,81 2,13 2,35 2,51 0,19 0,31 0,37 0,41 0,43 0,13 0,22 0,28 0,33 0,34 0,50 0,36 0,74 0,86 0,94 0,99 0,16 0,22 0,27 0,30 0,32 0,10 0,14 0,17 0,20 0,21 0,10 0,08 0,10 0,09 0,08 0,09 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,05 0,07 0,08 0,08 0,08 0,08 0,07 0,07 0,08 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07

Таблица 2. Временная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации пероксидазы в реакции перекисного окисления ФДА с образованием 2,3-диаминофеназина (ДАФ)

С_ПКХ, нМ Интенсивность флуоресценции, о. е.
(ФДА λ_em = 570 нм: λ_ex = 430 нм) 0 мин 3 мин 5 мин 7 мин 10 мин 1,00 0,19 0,31 0,37 0,41 0,43 0,50 0,16 0,22 0,27 0,30 0,32 0,10 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,05 0,07 0,07 0,08 0,07 0,07

Настоящее изобретение относится к аналитической химии, в частности, к композициям и комплектам для использования в спектрофотометрическом (в том числе колориметрическом) и люминесцентном (флуоресцентном, хемилюминесцентном, биолюминесцентном) анализе, в том числе биоаналитических, биосенсорных и медицинских технологиях. Раскрывается применение нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов. Также в изобретении описан способ генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы. Техническим результатом изобретения является возможность экспресс-определения широкого круга биологически активных веществ, а также пероксидазы по активности фермента, которая контролируется по накоплению окрашенных или люминесцирующих продуктов окисления индикаторных веществ (ТМБ, АБТС, ФДА). При этом достигается воспроизводимость результатов не менее 99 % в случае спектрофотометрического метода анализа и не менее 98% в случае люминесцентого, а время единичного анализа составляет менее 7 мин, что в случае 96-луночного планшета эквивалентно времени анализа 1 пробы менее 5 с. Скорость протекания реакции ферментативного окисления индикаторных субстратов на 30% выше при использовании наночастиц ZnO₂, чем при внесении пероксида водорода извне. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Применение нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для генерации пероксида водорода для использования в системах с пероксидазой для спектрофотометрического и люминесцентного обнаружения и/или определения как самой пероксидазы, так и её субстратов.

2. Применение по п.1, характеризующееся тем, что нано- и/или микрочастицы ZnO₂ используют в виде суспензии как в водных, так и не водных растворителях, на поверхности или в объёме полимерных плёнок.

3. Способ генерации пероксида водорода на основе нано- и/или микрочастиц ZnO₂ для применения в спектрофотометрическом и люминесцентном анализе с участием пероксидазы, включающий добавление раствора фермента в буферном растворе с рН < 6 в количестве, обеспечивающем проведения реакции перекисного окисления, внесении пробы, содержащей индикаторный субстрат, с последующим добавлением в полученную смесь заранее приготовленной суспензии наночастиц пероксида цинка, после чего проводят обнаружение и определение активности пероксидазы и/или содержания окисленных продуктов окисления индикаторных субстратов спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом в кювете и/или микропланшете.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что качественное и количественное определение пероксидазы проводят спектрофотометрическим и/или флуориметрическим методом.

5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве индикаторного субстрата используют вещества - красители или биологически-активные вещества, являющиеся субстратами пероксидазы и изменяющие свою окраску в ходе реакции окисления, для их спектрофотометрического и/или флуорометрического определения.

6. Способ по п.5, характеризующийся тем, что в качестве красителя используют вещества, выбранные из группы, включающей ТМБ, ФДА, АБТС.

7. Способ по п.5, характеризующийся тем, что в качестве биологически-активных веществ используют аскорбиновую кислоту, флавоноиды - такие как эпикатехин и кверцетин, витамин В1, гидропероксиды различного строения, фенотиазины, катехоламины и их метаболиты.

8. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве пероксидазы используют пероксидазу из корней хрена, соевых бобов, арахиса, листьев табака, клубней батата и листьев масличных пальм, при этом это не ограничивает применение пероксидаз грибов и животного происхождения, в том числе человека.

9. Способ по п.3, характеризующийся тем, что пероксидазы содержится в количестве от 0,05 до 1 нМ.

10. Способ по п.3, характеризующийся тем, что в качестве буферного раствора используют фосфатный буфер, фталатный буферный раствор, ацетатный буферный раствор.

11. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для определения пероксидазы от 5 до 7 минут регистрируют сигналы оптической плотности и интенсивности люминесценции, возбуждения люминесценции в пробе, и при выявлении максимума в характерном диапазоне для определяемого аналита делают вывод о его наличии в образце.

12. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 3, 3’,5, 5’-тетраметилбензидина (ТМБ) в диапазоне 370-380 нм и 650-660 нм в случае образования промежуточного продукта окисления ТМБ (мерихиноидный комплекс); 450-460 нм в случае полного окисления ТМБ до конечного продукта (хинондиимин, ХДИ).

13. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне а также 420-450 нм в случае перекисного окисления ФДА до финального продукта (2,3-диаминофеназин, ДАФ).

14. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума в спектрах поглощения её окисленного субстрата 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) в диапазоне 410-420 нм в случае перекисного окисления АБТС с образованием катион-радикала.

15. Способ по п.6, характеризующийся тем, что вывод о наличии и количестве в образце пероксидазы, в том числе в качестве метки, делают при выявлении максимума интенсивности люминесценции в спектрах испускания её окисленного субстрата о-фенилендиамина (ФДА) в диапазоне от 560 до 580 нм.

16. Способ по п.13, характеризующийся тем, что для получения сигнала люминесценции (2,3-диаминофеназина, ДАФ) пробу облучают монохроматичным излучением с длиной волны 430 нм.