Способ твердофазного каталитического анализа содержания аналита в образце с использованием серебряных нанопроволок Российский патент 2023 года по МПК G01N33/543 G01N33/553 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области клинической диагностики, а именно технологиям детекции различных аналитов в образце с помощью каталитического анализа содержания аналита в образце с использованием нанометок. Такие технологии полезны для проведения точных измерений в области диагностики заболеваний, мониторинга различных параметров и состояний организма, молекулярной и клеточной биологии, нанотехнологиях, химии и др.

Описание предшествующего уровня техники

Экспоненциальное развитие фундаментальных наук о жизни и биомедицинских технологий привело к потребности в современных методах точной диагностики различных молекул, состоящих в использовании высокопроизводительных анализов с миниатюрными метками, используемыми для детекции [1–3].

Различные ферменты обычно используются в качестве зондов для обнаружения в иммунобиологических анализах из-за ряда преимуществ, таких как высокая чувствительность, универсальность и высокая доступность. Среди них пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза являются наиболее распространенными ферментами, используемыми для получения сигнала в колориметрических иммуноанализах [4,5]. Эти ферменты катализируют окисление нескольких субстратов, таких как 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), о-фенилендиамин (ОФД) или диаминобензидин (ДАБ) во время хромогенной реакции вместе с H₂O₂ [6,7]. Однако белковые молекулы в качестве меток в иммуноанализах также имеют ряд недостатков [8,9]. В частности, их белковое происхождение делает их восприимчивыми к деградации под воздействием микроорганизмов, что требует использования криоконсервантов, таких как азид натрия, для увеличения срока хранения. В то же время использование дополнительных стабилизаторов и криоконсервантов, таких как различные сульфиды, цианиды и азиды, может значительно подавить активность фермента и/или исказить результаты анализа. Более того, дорогостоящие технологии выделения и очистки белков обусловливают необходимость производства новых меток для анализа, стабильных при комнатной температуре, не подверженных деградации и не требующих применения консервантов [10].

Перекись водорода – высокореактивный окислитель и его присутствие в растворах с белковыми и/или пептидными молекулами может оказывать значительное влияние на активность данных молекул. В частности, необратимая химическая модификация различных функциональных групп ферментов приводит к значительной потере стабильности и снижению эффективности работы ферментов различных групп. Так, в частности, Штадтман и Левин провели детальный анализ нарушения функциональной активности белков под воздействием перекиси водорода. Было показано, что среди процессов, в которые вовлечена активность перекиси водорода по отношению к белкам и их производным находятся гидроксилирование и нитрирование боковых цепей ароматических аминокислот, присоединение оксида азота к сульфгидрильным группам, превращение ряда аминогрупп в карбонильные производные, сульфоокисление серосодержащих аминокислот, а также хлорирование альфа- и эпсилон- аминогрупп белковых цепей.

Формирование продуктов окисления, в частности, перекиси водорода, зачастую существенно вредит биотехнологическому процессу и удаление перекиси водорода имеет важное биотехнологическое значение. Так, в различных биореакторах, содержащих оксидазу как активных компонент, необходимо удаление продуктов окисления – а именно, перекиси водорода посредством ее каталитического разложения из смеси в процессе реакции для предотвращения преждевременной инактивации фермента и тем самым увеличения срока службы биореакторов.

В последние десятилетия наноструктуры благородных металлов, таких как золото, серебро и платина, подверглись наиболее интенсивным исследованиям в качестве маркеров/меток в различных аналитических методах обнаружения, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA ИФА), флуоресцентная гибридизация in situ [11] – FISH [12], проточная цитометрия [13–16], латеральные иммуноанализы [17], фазочувствительные нанопреобразователи Фурье [18], методы анализа сборки/разборки коллоидных структур [19–23], хемилюминесцентные [24] и электрохимические [25] анализы и многие другие аналитические методы [26–36]. В частности, наночастицы серебра, Ag и золота, Au, обладающие необычными физическими и химическими свойствами, могут служить метками или усилителями сигналов в широком диапазоне биологических приложений и считаются эффективными инструментами для очень чувствительных, быстрых и экономичных приложений [37,38]. В частности, свойство локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР), присущее наночастицам благородных металлов, обуславливает интенсивную окраску и эффективное рассеяние света такими нанообъектами. ЛППР – это коллективные колебания электронов зоны проводимости на границе раздела металл-диэлектрик, которые находятся в резонансе с колеблющимся электрическим полем падающего света, что создает энергичные плазмонные электроны посредством безызлучательного возбуждения. Эти колебания зависят от свойств наночастиц, а именно от состава, формы, размера, покрытия поверхности, стадии агрегации и других параметров. Наночастицы, обладающие свойством ЛППР, являются эффективными инструментами для иммуноанализа [39,40] и других биомедицинских применений [18,41], и использование таких меток позволяет улучшить возможности детекции аналитов, которые реализуются стандартными флуоресцентными или колориметрическими методами.

Были разработаны многочисленные анализы с использованием сферических наночастиц, обладающих ЛППР, для обнаружения молекулярных соединений с высокой чувствительностью, особенно с использованием меток из золота и серебра [42]. Разница в относительных диэлектрических постоянных приводит к наиболее эффективному отношению рассеяния к поглощению Ag по сравнению с частицами Au [43,44]. Однако, хотя серебряные наноструктуры превосходят золотые по рассеянию и малым омическим потерям, обычно частицы Au предпочтительнее из-за их стабильности, стойкости к окислению и биосовместимости [45–47].

Тем не менее, при правильной стабилизации с помощью внешних покрытий из других благородных металлов или полимеров частицы Ag широко используются для биосенсоров. Например, был разработан метод иммуноферментного анализа на основе изменения интенсивности пика поглощения ЛППР, происходящему ввиду роста сферических наночастиц серебра, [48]. Также был разработан ИФА анализ на основе поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния основе агрегации функционализированных частиц серебра, позволяющих регистрировать сдвиг рамановского сигнала [49]. Было показано, что наряду со свойствами ЛППР, наночастицы серебра повышают активность пероксидазы хрена, используемую в тестах ИФА [50] или обладают собственной пероксидазоподобной активностью [51].

В то время как для иммуноферментного анализа (ИФА) чаще всего используются сферические плазмонные наноструктуры с собственной ферментативной активностью, использование анизотропных структур может быть более интересным с точки зрения использования других модальностей для детекции, а не только поглощения окрашенных субстратов. Например, использование катализируемого глюкозооксидазой окисления глюкозы серебряными треугольными призмами с образованием перекиси водорода приводит к изменению формы плазмонной структуры и сдвигу пика ППР [52]. При этом наночастицы серебра круглой формы обычно требуют различных стадий в процессе синтеза для модификации поверхности для получения стабильных во времени структур.

Из публикации RU2166751C1 известен наиболее близкий твердофазного иммуноанализа с использованием наночастиц, в котором в качестве детектируемые наночастиц используются магнитные наночастицы, сигнал от которых считывается с помощью специального магнетометра.

Однако известный способ имеет следующие ограничения: для считывания требуется использование дорогостоящего оборудования, в методе отсутствует амплификация сигнала, что может снижать возможный предел детекции системы.

Таким образом, требуемый технический результат заключается в более простом и более доступном (дешевом) измерении содержания аналита в образце без использования дорогостоящего оборудования, с возможностью амплификации сигнала за счет каталитической активности наночастиц, а также в использовании в качестве регистрируемых меток наноматериалов, позволяющих масштабно их синтезировать и отличающихся стабильностью при хранении.

Краткое содержание изобретения

Целью настоящего изобретения явилась разработка частиц – серебряных нанопроволок и реализация с их помощью: Способа твердофазного иммуноанализа с использованием серебряных нанопроволок.

Для решения перечисленных выше и других целей, которые очевидны для квалифицированного специалиста, был предложены следующий способ:

Способ детекции аналита в образце, включающий по крайней мере следующие стадии:

i) иммобилизация на поверхности твердой фазы рецептора против упомянутого аналита или молекулярного комплекса, включающего в себя аналог упомянутого аналита,

ii) инкубирование с упомянутой твердой фазой упомянутого образца,

iii) инкубирование с упомянутой твердой фазой суспензии серебряных нанопроволок, конъюгированных с антителом против упомянутого аналита,

iv) инкубирование с упомянутой твердой фазой раствора перекиси водорода и хромогенного субстрата, выбранного из группы: тетраметилбензидин, о-фенилендиамин, диаминобензидин;

v) измерение оптической плотности полученной смеси для определения содержания упомянутого аналита в упомянутом образце по калибровочной кривой.

Словарь

Если иное не определено, нижеследующие термины имеют следующие значения при интерпретации формулы и описания изобретения:

1) «иммунохроматографический тест» – помещение образца, в котором может находиться целевая нуклеотидная последовательность, на тест-полоску из хроматографичского материала с последующим латеральным перемещением образца по тест-полоске за счет капиллярных сил и его связывание с различными реагентами, размещенными на тест-полоске.

2) "тест-полоска" – хроматографическая среда, в которой может быть проведен анализ. Тест-полоска содержит «зону нанесения» для нанесения образца и «зону связывания» (тест-линия), содержащую иммобилизованный связывающий реагент или же связывающую нуклеотидный последовательность, способные к связыванию и иммобилизации детектируемой нуклеотидной последовательности. Зона связывания, как правило, обладает существенно меньшей площадью поверхности, чем тест-полоска и содержит иммобилизованный связывающий реагент или же иммобилизованную связывающую нуклеотидную последовательность. Зона связывания может иметь форму точки, линии, кривой, полосы или же паттерна из точек, линий, кривых, полос или же их комбинации. Как правило, направление перемещения образца по тест-полоске пересекает зону связывания. Для данного изобретения предпочтительным является формирование сигнала в зоне связывания в форме четко-очерченного паттерна, резко отличающегося от сигнала, формируемого в других частях тест-полоски. Например, зона связывания может иметь форму аббревиатуры названия или названий аналита или аналитов в исследуемом образце.

3) «комплементарность» или «комплементарный» используется в отношении нуклеиновых кислот (например, нуклеотидных последовательностей) и относится к известному правилу формирования парных комплексов азотистых оснований аденин-тимин и цитозин-гуанин. Например, для последовательности 5′-T-C-G-G-3′, комплементарной является последовательность 3′-A-G-C-C-5′. Если в последовательностях все нуклеотиды соответствуют принципу комплементарности, то говорят о полной комплементарности, как в приведенном примере. В случае, когда с принципом согласуются лишь часть нуклеотидов, то комплементарность называется частичной. Так, например, последовательность 5′-G-G-C-C-A-A-T-C-G-3′ частична комплементарна последовательности 3′-С-G-G-C-T-A-A-C-C-5′. Количество соответствующих принципу комплементарности нуклеотидов в последовательностях определяет степень их комплементарности, которая влияет на эффективность гибридизации нуклеиновых кислот. Термин «значительная комплементарность» относится к образцу, который может гибридизоваться с одной или более цепями целевой нуклеиновой кислоты в условиях повышенной жесткости (см. ниже), или, например, в буфере для ПЦР, нагретом до 95 ^оС и охлажденном до комнатной температуры.

4) Термин «партнер для связывания» относится к паре молекул и/или частиц, способным распознавать друг друга (целиком или частично) и образовывать как ковалентные, так и нековалентные связи. Существует ряд часто используемых пар для связывания, а также структур на основе таких пар. Среди них можно выделить системы, основанные на взаимодействии антиген/антитело, гаптен/антигаптен, диоксигенин/антидиоксигенин F(ab’)2, фолиевая кислота/фолат-связывающий белок, биотин/стрептавидин, биотин/авидин, протеин А(G)/иммуноглобулины, комплементарные сегменты нуклеиновых кислот, вирус/клеточный рецептор, лектин/карбогидрат, фермент/ингибитор, фермент/субстрат. Также, известны системы, в которых партеры по связыванию образовывают ковалентные связи за счет наличия у таких партнеров аминореакционных групп, таких как сукцинимидиловые эфиры, изотиоционат, сульфонил галиды, или сульфгидрильные реакционные группы, включая производные галоацетатов и малеимидов. Другими партнерами для связывания могут быть галогены, стероиды и 2,4 – динитрофенилы.

5) Термин «нуклеиновая кислота» обозначает полимер или олигомер, состоящий из нуклеотидов, или соединений, имитирующих их. Также термин относится к олигонуклеотидам, имеющим не встречающееся в природе участки цепи, но проявляющими такие же свойства, как и олигонуклеотиды природного происхождения. Для специалистов должно быть очевидно, что в соответствии с данным изобретением может быть осуществлено большое разнообразие анализов по детекции целевых последовательностей нуклеиновых кислот. Термин «нуклеотид» здесь относится к рибонуклеотидам, дезоксирибонуклеотидам, или аналогам нуклеотидов, имеющих химическую модификацию в одном или нескольких из строительных блоков нуклеотида (азотистых оснований - пурина или пиримидина, сахара, фосфатов). Модификации могут быть, например, проведены в пятой позиции пиримидина, или восьмой позиции пурина, в экзоциклической аминогруппе цитозина, путем замены урацила на 5-бром-урацил, замена гидроксигруппы в 2´-позиции сахара на галогруппу (либо на R, OR, SH, H, SR, NR₂, NH₂, NHR, CN). Термин также относится к рибонуклеиновым кислотам, встречающимся в живых организмах, либо с замененным основанием (ксантин, ионозин и т.д.) или сахаром (2´-метоксирибоза и т.п.). Также возможна модификация фосфодиэфирной связи, например, образование цепи с помощью фосфоротионатов, метилфосфонатов и пептидов. «Нуклеиновая кислота» может обозначать одно- или двуцепочечную молекулу, состоящую из мономеров (нуклеотидов), включающих в свой состав фрагменты сахаров, фосфатов и пуринов или пиримидинов. В растениях, животных, низших эукариотах и бактериях «рибонуклеиновая кислота» (РНК) выполняет функции трансляции, т.е. служит передатчиком хранящейся в «дезоксирибонуклеиновой кислоте» (ДНК) генетической информации. Термин «фрагмент» обозначает определенную часть последовательности ДНК.

6) Метод анализа и его аппаратурная реализация, относящийся к данному изобретению, может детектировать целевую нуклеиновую кислоту или другие вещества (собирательный термин – аналит), содержащиеся в различных образцах. Термин «образец» здесь относится к любой жидкости, потенциально содержащей аналиты. Образец может быть получен из человеческих или других животных тканей или жидкостей (кровь/сыворотка крови, моча, слюна, слеза, мокрота, пот, слизь, стул), из образцов культивирования клеток тканей, гистологических образцов, образцов биопсии и т.д. Образец также может быть получен из продуктов сельского хозяйства, бактерий, вирусов, либо их продуктов жизнедеятельности и обработки. Также образцом может служить различный мусор и отходы, продукты их переработки, питьевая и сточные воды, продукты питания в обработанном или сыром виде, воздух и т.д. В случае реализации данного изобретения для детектирования искомых последовательностей нуклеиновых кислот, оно может быть применено для анализа генетических отклонений и множества других заболеваний, служить для контроля протекания лечения инфекционных болезней, а также для множества других применений.

7) Термин «распознающий олигонуклеотид» обозначает НК, содержащую последовательность, комплементарную анализируемой (целевой) нуклеиновой кислоте (аналиту).

8) Термин «сигнал-генерирующий субстрат» обозначает вещество, способное взаимодействовать с сигнальным рецептором и генерировать детектируемый сигнал. Например, ABTS/TMB для пероксидазы, BCIP/MBT для щелочной фосфотазы, свет для флуоресцирующих соединений.

9) Термин «сигнальный рецептор», «сигнал-продуцируемый репортер», «репортер» обозначает вещество, способное детектировать искомый аналит через выделение энергии или путем ферментативной активности, например, флуоресцентные и хемилюминесцентные фрагменты, частицы, ферменты, радиоактивные метки, светоиспускающие домены или молекулы.

10) Термин «пористый материал» или «хроматографический материал» обозначает материал, имеющий поры не менее 0,1 мкм, предпочтительно не менее 10,0 мкм, достаточного размера для движения по нему жидкостных сред за счет капиллярных сил.

11) Термин «сигнал-продуцирующая система» обозначает совокупность реагентов необходимых для генерации детектируемого сигнала под действием внешнего воздействия. Как правило, такие системы генерируют сигнал, который может быть детектирован внешними средствами – например, путем измерения электромагнитного излучения, или путем визуального наблюдения. В основном, такие системы состоят из хромофорного субстрата и фермента, который превращает субстрат в краситель, поглощающий электромагнитное излучение определенного диапазона, фосфоресцирующие или флуоресцирующие вещества.

12) Расположение шпильки от первого или второго конца распознающего олигонуклеотида на расстоянии Х нуклеотидных оснований подразумевает собой, следующее. Местом связывания наночастицы или сигнального рецептора с распознающим олигонуклеотидом следует считать нуклеотид, с которым образована их связь (предпочтительно ковалентная). При этом, если этот нуклеотид является первым в шпильке (т.е. образовывает нековалентную связь с другим нуклеотидом), то расстояние Х=0. Если шпилька начинается с соседнего нуклеотида, то Х=1, и т.д.

13) Под первым/вторым концом одноцепочечного распознающего олигонуклеотида - имеется в виду не фактический конец молекулы, а одна или вторая его сторона. Т.е. нуклеотидное основание распознающего олигонуклеотида, соответствующее месту связи сигнального рецептора или наночастицы предпочтительно находится с краю олигонуклеотида, но может быть и не крайним основанием в олигонуклеотиде. Под нуклеотидным основанием распознающего олигонуклеотида, соответствующем месту связи сигнального рецептора (или наночастицы), подразумевается мономер нуклеиновой кислоты нуклеотид (в т.ч. нуклеозид, сахарид и остаток фосфорной кислоты), с которым связан сигнальный рецептор (или наночастица).

14) В данном описании, понятия «рецептор» и «лиганд» взаимозаменяемы и могут быть использованы для обозначения индивидуальных молекул в вышеописанном понятии «партнеров для связывания». Так, например, если часто в литературе в парах стрептавидин-биотин, антитело-антиген, под рецептором подразумевается стрептавидин и антитело, а под лигандом – биотин и антиген, то в описании данного изобретения под рецептором может подразумеваться и стрептавидин с антителом, и биотин с антигеном (при этом лигандом будет соответственно – биотин с антигеном и стрептавидин с антителом, соответственно).

15) Наночастица – подразумевает собой частицу в широком диапазоне – от 1 нм до 100 мкм, предпочтительнее от 1 нм до 10 мкм, предпочтительнее – от 1 нм до 1 мкм, предпочтительнее от 1 нм до 100 нм. При этом наночастицы могут быть металлическими, полимерными, структуры ядро-оболочка и т.п.

16) Термин «наночастицы» подразумевает надмолекулярные структуры, которые состоят из более, чем одной молекулы. При этом, хотя часто наночастицами обозначают объекты до 100 нм, в рамках описания данного изобретения подразумеваются и объекты большие чем 100 нм – предпочтительно до 5мкм, но в некоторых случаях допустим размер и до 100 мкм. Таким образом, под наночастицами подразумевают как наночастицы, так и микрочастицы, микросферы и т.п. Кроме того, подразумеваются частицы с упомянутыми размерами, как по всем измерениям, так и по хотя бы одному.

17) Терапевтические средства/молекулы/агенты. Под терапевтическими молекулами/агентами могут пониматься как вещества, субстанции, молекулы, надмолекулярные агенты, наночастицы, микрочастицы, наноагенты, микроагенты, формуляции, лекарственные формы, и т.п., которые используются как для терапии, так и диагностики различных заболеваний или состояний организма или пациента, в т.ч. включают в себя метки, контрастные агенты, компоненты с контролируемым высвобождением, парамагнитные и магнитные агенты, цитотоксические агенты, и т.п.

18) «Меткой» или «детектируемым элементом» является композиция, детектируемая спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, химическими или другими физическими средствами. Например, широко используемые метки включают в себя 32P, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, как обычно используются в ELISA), биотин, дигоксигенин или гаптены и белки или другие сущности, которые могут быть обнаружены, например, путем включения радиоактивной метки в пептид или антитело, специфически реагирующие с целевым пептидом. Любой метод, известный в данной области для конъюгирования антитела с меткой, может быть использован, например, с использованием методов, описанных в (Hermanson, G. T., Academic press, 2013).

19) Используемый здесь термин «фармацевтический» относится к композиции, которая полезна при лечении заболевания или симптома заболевания.

20) Термин «лечение» или «терапия» (treating, treatment, therapy) относятся к любым признакам успеха при лечении или улучшении заболевания, травм, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как уменьшение; ремиссия; уменьшение симптомов или замедление ухудшения состояния больного, патологии или состояния пациента; замедление темпов дегенерации; что делает финальную стадию заболевания менее мучительной; улучшение физического или психического благополучия пациента. Лечение или улучшение симптомов могут основываться на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физического обследования, нейропсихиатрических экзаменов и / или психиатрической оценки. Например, определенные методы, представленные здесь, могут успешно лечить рак, уменьшая заболеваемость раком и вызывая ремиссию рака. Термин «лечение» и его продолжения включают профилактику травмы, патологии, состояния или заболевания.

21) «Болезнь» или «состояние» относятся к состоянию здоровья пациента или субъекта, подлежащему лечению различными лекарственными средствами, дисперсиями, или другими методами, представленными в настоящем документе.

22) Используемый здесь термин «контрастный агент»/«контрастное средство» относится к композиции, которая при введении субъекту улучшает предел обнаружения или способность обнаружения физического метода, техники или устройства для медицинской визуализации (например, рентгенографический инструмент, рентген, КТ, ПЭТ, МРТ (MRI), ультразвук и другие методы). Контрастный агент может усилить величину сигналов, связанных с различными структурами или жидкостями внутри субъекта.

23) «Пациент» или «нуждающийся в этом субъект» относится к живому организму, страдающему или (возможно) склонному к заболеванию или состоянию, которое можно лечить путем введения лекарства, фармацевтической композиции или агента, как указано в настоящем документе. Неограничивающие примеры включают людей, других млекопитающих, быков, крыс, мышей, собак, обезьян, коз, овец, коров, оленей и других животных, не относящихся к млекопитающим. В частности, пациент может быть человеком.

24) Используемый здесь термин «компонент с контролируемым высвобождением» или «агент активируемый внешним воздействием» относится к соединению, которое в сочетании с композицией, описанной здесь (включая варианты осуществления), высвобождает в условиях применения (в пациенте) композицию с контролируемой скоростью. Такие соединения включают высокомолекулярные, анионные мукомиметические полимеры, гелеобразующие полисахариды и тонкодисперсные субстраты носителя лекарственного средства и другие. Эти компоненты более подробно обсуждаются в патентах США 4911920; 5403841; 5212162; и 4861760. Все содержание этих патентов включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей. В некоторых вариантах осуществление «компонента с контролируемым высвобождением» может представлять собой замедленное высвобождение, продолжительное действие, продолжительное высвобождение, высвобождение во времени, синхронизированное высвобождение, контролируемое высвобождение, модифицированное высвобождение или соединение с непрерывным высвобождением. В некоторых вариантах осуществления, соединение распадается в месте введения (например, подкожного, внутривенного) или внутри пищеварительного тракта (например, желудка, кишечника), если соединение и композицию вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления компонент с контролируемым высвобождением является полимером и может называться «полимер с контролируемым высвобождением». Кроме того, агент, активируемые внешним воздействием может активироваться (например, высвобождать терапевтический агент или связываться с мишенью) в результате воздействия внешним магнитным/электрическим полем, ультразвуком, светом, электронным пучком, в результате радиоактивного распада каких-либо атомов, в результате взаимодействия с химическими микроокружением и т.п.

25) Используемый здесь термин «парамагнитный агент»/«парамагнитное средство» относится к парамагнитному соединению, полезному в диагностических методах визуализации (например, магнитно-резонансная томография) в качестве контрастного агента. В некоторых вариантах осуществления парамагнитный агент включает гадолиний, оксид железа, платину железа или марганец.

26) Варианты цитотоксических средств (агентов, токсинов) включают, но не ограничиваются следующими веществами: рицин, доксорубицин, даунорубицин, таксол, бромид этидия, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин D, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas (PE) A, PE40, абрин и глюкокортикоид и другие химиотерапевтические агенты, а также радиоизотопы. Подходящие детектируемые маркеры включают, но не ограничиваются следующими веществами, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент.

27) Неполный список иммунологических анализов включает в себя: конкурентные и неконкурентные форматы, иммуноферментные анализы в плашке (ELISA), микроточечные анализы, вестерн-блоты, гель-фильтрацию и хроматографию, иммунохроматографию, иммуногистохимию, проточную цитометрию или сортировку клеток, помеченных флуоресцентной меткой (FACS), микрочипов и т. д. Такие методы также могут быть использованы in situ, ex vivo, in vitro или in vivo, например, для диагностической визуализации.

Следует отметить, что во всей заявке альтернативы записаны в группах Маркуша, например, каждое положение терапевтического агента, может содержать более одного возможного терапевтического агента. В частности, предполагается, что каждый член группы Маркуша следует рассматривать отдельно, тем самым, содержащий другой вариант осуществления, и группа Маркуша не должна читаться как единое целое.

Подробное описание изобретения

Далее будут описаны варианты осуществления настоящего изобретения более полно со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых приведены лишь некоторые, но не все варианты осуществления изобретения.

В рамках данного изобретения предложен:

Способ детекции аналита в образце, включающий по крайней мере следующие стадии:

i) иммобилизация на поверхности твердой фазы рецептора против упомянутого аналита или молекулярного комплекса, включающего в себя аналог упомянутого аналита,

ii) инкубирование с упомянутой твердой фазой упомянутого образца,

iii) инкубирование с упомянутой твердой фазой суспензии серебряных нанопроволок, конъюгированных с антителом против упомянутого аналита,

iv) удаление из образца несвязавшихся серебряных нанопроволок,

v) инкубирование с упомянутой твердой фазой раствора перекиси водорода и хромогенного субстрата, выбранного из группы: тетраметилбензидин, о-фенилендиамин, диаминобензидин;

vi) измерение оптической плотности полученной смеси для определения содержания упомянутого аналита в упомянутом образце по калибровочной кривой.

Кроме того, способ, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют длину от 1 мкм до 20 мкм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют диаметр от 10 нм до 100 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые нанопроволоки обладают свойством локализованного поверхностного плазмонного резонанса.

Кроме того, способ, в котором упомянутые нанопроволоки обладают свойством коллоидной стабильности.

Кроме того, способ, в котором упомянутое инкубирование проводят от 1 до 150 мин.

Кроме того, способ, в котором упомянутое инкубирование проводят при температуре от 4 до 30 градусов цельсия.

Кроме того, способ, в котором упомянутая калибровочная кривая измеряется параллельно для образцов с известным значением рН.

Кроме того, способ, в котором концентрация перекиси водорода в упомянутой смеси составляет до 9 мкмоль/литр.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутого хромогенного субстрата в упомянутой смеси составляет от 1 до 10 ммоль/литре.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутых серебряных нанопроволок в упомянутой смеси составляет от 10 до 100 мг/литре.

Кроме того, способ, в котором упомянутое измерение оптической плотности смеси проводят на длине волны от 450 нм до 530 нм.

Кроме того, способ каталитического окисления хромогенных субстратов в образце для целей ин витро диагностики, включающий:

i) смешение раствора упомянутого образца с суспензией серебряных нанопроволок,

ii) добавление к полученной смеси раствора перекиси водорода.

Кроме того, способ, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют длину от 1 мкм до 3 мкм, от 3мкм до 6 мкм, от 6 мкм до 9 мкм, от 9 мкм до 12 мкм, от 12 мкм до 15 мкм, от 15 мкм до 20 мкм.

Кроме того, способ, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют диаметр от 10 нм до 20 нм, от 20 нм до 30 нм, от 30 нм до 40 нм, от 40 нм до 50 нм, от 50 нм до 60 нм, от 60 нм до 70 нм, от 70 нм до 80 нм, от 80 нм до 90 нм, от 90 нм до 100 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутое инкубирование проводят от 1 до 15 мин, от 15

мин до 30 мин, от 30 мин до 60 мин, от 60 мин до 120 мин, от 120 мин до 150 мин.

Кроме того, способ, в котором упомянутое инкубирование проводят при температуре от 4 до 10 градусов цельсия, от 10 до 15 градусов цельсия, от 15 до 30 градусов цельсия.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутого хромогенного субстрата в упомянутой смеси составляет от 1 ммоль/литре до 3 ммоль/литре, от 3 ммоль/литре до 6 ммоль/литре, от 6 ммоль/литре до 10 ммоль/литре.

Кроме того, способ, в котором концентрация упомянутых серебрянных нанопроволок в упомянутой смеси составляет от 10 мг/литре до 20 мг/литре, от 20 мг/литре до 30 мг/литре, от 30 мг/литре до 40 мг/литре, от 40 мг/литре до 50 мг/литре, от 50 мг/литре до 60 мг/литре, от 60 мг/литре до 70 мг/литре, от 70 мг/литре до 80 мг/литре, от 80 мг/литре до 90 мг/литре, от 90 мг/литре до 100 мг/литре.

Кроме того, способ, в котором упомянутое измерение оптической плотности смеси проводят на длине волны от 450 нм до 470 нм, от 470 нм до 490 нм, от 490 нм до 510 нм, от 510 нм до 530 нм.

Кроме того, способ, в котором упомянутая калибровочная кривая измеряется параллельно для образцов с известным содержанием молекул упомянутого аналита.

Кроме того, способ, в котором концентрация перекиси водорода в упомянутой смеси составляет от 0.2 мкмоль/литр до 300 мкмоль/литр.

Кроме того, способ, в котором используемое антитело отличается способностью к вытеснению с аффинной матрицы аналитом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый аналит является малой молекулой.

Кроме того, способ, в котором упомянутый аналит является белком.

Кроме того, способ, в котором упомянутый аналит является нуклеиновой кислотой.

Кроме того, способ, в котором упомянутая твердая фаза является многолуночным планшетом.

Кроме того, способ, в котором упомянутая тест-полоска содержит в себе нитроцеллюлозную мембрану.

Кроме того, способ, в котором упомянутую оценку яркости осуществляют при помощи оптических методов регистрации.

Кроме того, способ, в котором упомянутую оценку яркости осуществляют визуально.

Кроме того, способ, в котором детектирование количества задержавщихся на тест-линии наночастиц упомянутых серебряных нанопроволок осуществляют в течении менее чем 20 минут после начала анализа.

Кроме того, способ, в котором упомянутое антитело моноклональное.

Кроме того, способ, в котором упомянутое антитело поликлональное.

Кроме того, способ, в котором дополнительно оценивают прохождение реакции за счет измерения оптической плотности упомянутой смеси.

Кроме того, способ, в котором упомянутый аналог аналита представляет собой белок-носитель, конъюгированный с молекулами аналита.

Серебряные нанопроволоки (СНП, AgNW), синтезированные с помощью полиольного процесса, не требуют какой-либо стабилизации и могут использоваться как есть для различных приложений без каких-либо специальных консервантов или сложных буферных систем [53–56].

Здесь мы показываем, что серебряные нанопроволоки обладают рН-зависимой пероксидазоподобной активностью в отношении трех широко используемых пероксидазных субстратов – 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), о-фенилендиамин (ОФД) и 3,3'-диаминобензидин (ДАБ) как в преципитирующем, так и в непреципитирующем режимах. Свойства СНП как ферментоподобных меток для обнаружения были показаны в формате ИФА для обнаружения витамина – фолиевой кислоты (ФК). Более того, свойство ЛППР функционализированных серебряных нанопроволок (СНП) позволяют использовать СНП в качестве оптических меток в иммунохроматографии без добавления какого-либо хромогенного субстрата. Это оптическое свойство было продемонстрировано при обнаружении фолиевой кислоты иммунохроматографическом тесте в диапазоне рабочих концентраций 0,1 мкМ ÷ 100 мкМ.

Серебряные нанопроволоки были синтезированы из соли AgNO₃ с помощью глицерин-опосредованного полиольного процесса с использованием поливинилпирролидона (ПВП) и NaCl, как в [57], с некоторыми модификациями. В результате процесса синтеза были получены серебряные нанопроволоки (СНП).

Морфологию синтезированных СНП исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с in-beam детектором вторичных электронов при ускоряющем напряжении 15 кВ. СЭМ-изображения СНП представлены на фиг. 1a-в при разном увеличении. Было обнаружено, что длина исходного СНП составляет 5,5 ± 2,2 мкм, а диаметр равен 46 ± 8 нм в соответствии с обработкой изображений СЭМ с помощью программного обеспечения ImageJ (Фиг. 1г).

Следует подчеркнуть, что этот синтез полностью безопасен, поскольку не требует использования каких-либо токсичных восстановителей, таких как боргидрид натрия, ЦТАБ или обычно используемый этиленгликоль. Вместо этого используются биосовместимый глицерин, поливинилпирролидон и NaCl для обеспечения однореакторного синтеза с высоким выходом (14 г/л СНП) и получения стабильного в солевых растворах (например, 1 М NaCl) СНП.

Синтезированные СНП были стабильны более двух лет при комнатной температуре в воде без использования каких-либо специальных консервантов и какой-либо светозащиты, что делает эти структуры идеальными для разработки различных коммерческих анализов, которые накладывают существенные ограничения на условия хранения этикетки и другие компоненты иммуноанализов.

Пероксидазоподобная активность серебряных нанопроволок

Пероксидазоподобная активность серебряных нанопроволок была исследована с использованием стандартных хромогенных субстратов, а именно 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), о-фенилендиамина (ОФД) и 3,3'-диаминобензидина (ДАБ). AgNW инкубировали с TMB, OPD, DAB и H₂O₂, и было показано, что они данные субстраты продуцируют яркую окраску, соответствующие субстрату, используемому в анализе с умеренными концентрациями СНП (фиг. 2a).

Кроме того, следует отметить, что субстраты как TMB, так и ДАБ могут служить в качестве преципитирующих субстратов, например, для исследований вестерн-блоттинга, в то время как ОФД служит непреципитирующим растворимым субстратом для применений, например, в ИФА или клеточных анализах.

H₂O₂-зависимая пероксидазоподобная активность была исследована спектрофотометрически для СНП. Регистрировали поглощение при 450 нм для растворов с ОФД после 10, 30, 60, 90, 120, 150 мин инкубации (фиг. 2б).

H₂O₂ варьировали от 0,8% до 0,00076%, таким образом охватывая три порядка величины концентрации. Аппроксимация кривой линейной регрессии показала, что зависимость поглощения при 450 нм от концентрации H₂O₂ представляет собой линейную функцию с R² = 0,9757 для 10-минутной кривой, R² = 0,9881 для 30-минутной кривой, R² = 0,9915 для 60-минутной кривой, R² = 0,9938 для 90-минутной кривой, R² = 0,9960 для 120-минутной кривой, R² = 0,9937 для 150-минутной кривой.

Cистема ОФД*СНП сохраняет линейную зависимость оптической плотности от концентрации H2O2 в течение 2,5 ч и не требует использования стоп-растворов в отличие от широко используемых систем TMB*пероксидаза или ОФД*пероксидаза. Таким образом, СНП вместе с ОФД может служить сенсором перекиси водорода (H₂O₂) для обнаружения, например, окислительного стресса в живых системах.

pH-зависимая пероксидазоподобная активность серебряных нанопроволок

СНП проявляют активность как сенсор pH. Используя цитратно-фосфатную буферную систему с различным рН в диапазоне от 2 до 9, мы показали, что пероксидазоподобная активность СНП линейно возрастает как с увеличением концентрации СНП, так и с уменьшением концентрации ионов водорода. ионы. Фиг. 3а, иллюстрирует часть 96-луночного планшета с данным экспериментом, а график на фиг. 3б, соответствующий абсорбции образцов после 30 мин инкубации, количественно подтверждает, что пероксидазоподобная активность СНП тем выше, чем выше pH. Соотсветстенно, СНП вместе с ОФД является надежным цветным сенсором pH для различных биологических применений.

Обнаружение фолиевой кислоты с помощью СНП в качестве оптических меток в конкурентном ИФА

Свойство собственной пероксидазоподобной активности было использовано для выявления витамина – фолиевой кислоты (ФК).

Детектирование осуществлялось в стандартном конкурентном ИФА анализе режиме. Белковый носитель (БСА), конъюгированный с ФК (БСА-ФК), сорбировали на поверхность 96-луночных планшетов для ИФА. Далее лунки отмывали от несвязанного БСА-ФК. В лунки наносили СНП, конъюгированные с анти-ФК IgG, смешанные с тестируемыми образцами с различной концентрацией ФК. После отмывки от несвязанного СНП-анти-ФК IgG в лунки добавляли хромогенный субстрат (ОФД) с последующим измерением поглощения при 450 нм. Когда концентрация ФК в тестируемых образцах достаточно высока, он конкурентно блокирует связывание СНП с БСА-ФК, что приводит к низкому поглощению. Когда концентрация ФК низкая, конкурентное связывание отсутствует, а поглощение при 450 нм высокое. По результатам ИФА предел обнаружения ФК, определенный по 2-сигма критерию, оказался равным 0,20 мкг/мл.

Обнаружение фолиевой кислоты с помощью СНП в качестве оптических меток в конкурентном иммуноанализе в формате иммунохроматографии на тест-полосках

СНП являются оптическими без добавления какого-либо хромогенного субстрата. Данная способность была показана в формате иммунохроматографии на нитроцеллюлозных тест-полосках. Этот метод позволяет изучить особенности специфического взаимодействия двух компонентов. Для демонстрации возможности использования СНП в качестве оптических меток реализован конкурентный иммуноанализ с выявлением витамина – фолиевой кислоты (ФК).

На поверхность нитроцеллюлозной иммунохроматографической тест-полоски наносили белок-носитель, конъюгированный с ФК, а именно бычий сывороточный альбумин с КАП (БСА-ФК). После высушивания хроматографическую тест-полоску помещали в раствор, содержащий СНП, конъюгированные с анти-ФК IgG, и исследуемый образец с различной концентрацией ФК. В случае, когда концентрация ФК низкая, возможно связывание СНП с БСА-ФК. В этом случае за счет эффективного светорассеяния и ЛППР-свойств проволок образуется цветная полоса. Когда концентрация ФК высока, он конкурентно блокирует связывание СНП с БСА-ФК, поэтому окрашенная полоса не образуется (фиг. 5а). Данные, представленные на фиг. 5б, свидетельствуют об эффективном использовании СНП в качестве оптических меток для качественного обнаружения ФК в конкурентном иммуноанализе на хроматографических тест-полосках. Предел обнаружения этого теста составляет 0,1 мкМ ФК. Следует отметить, что в диапазоне концентраций 0,04 ÷ 10 мкМ (около 3 порядков) можно наблюдать зависимый от концентрации способ связывания, что позволяет сравнивать разные образцы, например, в фундаментальных научных анализах или в разных испытания от партии к партии (рис. 5б).

Таким образом, серебряные нанопроволоки (СНП) обладают пероксидазоподобной активностью и могут быть использованы в колориметрических тестах для количественного анализа аналитов. Способ включает использование СНП в качестве меток в иммунологических исследованиях с последующей инкубацией с субстратом пероксидазы хрена – ТМБ или ДАБ в преципитирующем режиме или с ОФД в непреципитирующием режиме при комнатной температуре и регистрацией поглощения раствора при длине волны поглощения, соответствующей максимальному поглощению используемого субстрата.

Кроме того, СНП вместе с субстратом может служить надежным датчиком перекиси водорода и pH-сенсором: пероксидазоподобная активность СНП линейно возрастает с увеличением pH. Следует также отметить, что свойство ЛППР у СНП позволяет использовать их в качестве оптических меток для визуализации взаимодействия антитело-гаптен и для других типов взаимодействий.

Превосходная стабильность, воспроизводимый синтез и антибактериальная активность, а также пероксидазоподобная активность и свойства ЛППР делают СНП удобными метками для различных иммуноанализов, не требующими стерилизации и имеющими длительный срок хранения. Принимая во внимание их уникальную стабильность, СНП следует рассматривать как надежные, удобные и надежные оптические метки для различных коммерческих анализов для широкого спектра применений в биологии и медицине.

Данное изобретение широко применимо для быстрого детектирования нуклеиновых кислот и их фрагментов, а также для детекции иных аналитов, которые могут являться партнером для связывания с распознающим олигонуклеотидом. Среди возможных его приложений можно выделить медицину, ветеринарию, агротехнологии, пищевую промышленность. В особенности данный метод применим для обнаружения факторов этиологического характера, таких как бактерии и вирусы, для скрининга резистентных бактерий и для обнаружения злокачественных клеток.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы в практике или испытаниях настоящего изобретения, некоторые из подходящих способов и материалов описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящая спецификация, включая определения, будет контролироваться. Кроме того, материалы, методы и примеры являются иллюстративными и не ограничивают данное изобретение.

В частности, предлагаемый способ может быть использован для идентификации коротких специфических последовательностей нуклеиновых кислот, что представляет значительный интерес в связи с исследованием физиологических функций микроРНК, ранней диагностики злокачественных образований, выявления точечных мутаций и т.д. Причем роль и физиологически функции таких соединений в настоящее время переживает этап интенсивного изучения, что гарантирует дальнейшее значительное увеличение интереса к методам их детектирования.

Иммунохроматографический (или иной твердофазный) анализ в том числе проводили следующим образом. После короткой (10 мин) предварительной инкубации наночастиц серебряной со специфической или неспецифической входной ДНК (аналитом) в смесь погружали предварительно изготовленную тест-полоску ИХА со распознающим рецептором, нанесенным в виде тонкой линии в центре мембраны. Связывание аналита оценивалось при помощи оптической регистрации интенсивности окрашивания тестовой линии, вызванной образованием слоя наночастиц (частиц проволоки).

Различные аспекты

Методы иммобилизации связывающих рецепторов на мембране хорошо известны. Как правило, тестовый и контрольный связывающие рецепторы наносятся на мембрану параллельными линиями на расстоянии друг от друга. Растворы с необходимыми веществами в соответствующих буферах наносятся на тестовые полоски с помощью автоматизированных дозаторов. После высушивания на воздухе в течение необходимого времени, проводят блокировку мембраны в подходящем буфере и хранят в эксикаторе перед сборкой тест-полоски в единое целое.

Скорость проведения анализа с помощью предлагаемого изобретения значительно выше стандартных методов анализа при сохранении точности и достоверности результатов. На измерение в данном случае в среднем уходит от 10 до 300 сек. Тем не менее, возможно увеличить чувствительность, если использовать большее время проведения анализа. Кроме того, принцип данного изобретения позволяет проводить прямое измерение определяемого нуклеиновой кислоты в качестве аеалита без необходимости её амплификации при условии, что ее концентрация выше предела детекции, и связанный с ней сигнал может быть зафиксирован, например, невооруженным глазом.

Измерения с использованием метода в рамках данного изобретения могут проходить как в жестких, так и в мягких условиях. Под «жесткими» условиями подразумеваются такие значения температуры, ионной силы, а также наличие других соединений, при которых происходит гибридизация нуклеиновых кислот. В условиях «высокой жёсткости» гибридизация будет происходить только для нуклеиновых кислот, имеющих высокое содержание комплементарных азотистых оснований. Таким образом, мягкие условия требуются в том случае, когда необходима гибридизация или отжиг не полностью комплементарных нуклеиновых кислот. Специалистам известен целый ряд методов создания мягких условий для протекания гибридизации. Гибридизация же в жёстких условиях возможна только в случае полной комплементарности последовательностей. Гибридизация в менее жёстких условиях возможна для последовательностей с менее чем 100% идентичностью. Изменения условий среды, такие как снижение концентрации соли или повышение температуры, могут позволить уменьшить жёсткость условий гибридизации. Ужесточение условий гибридизации можно добиться за счет снижения ионной силы или повышения температуры гибридизации.

Таким образом, в одном из вариантов реализации данного изобретения возможно проводить одностадийное, полнофункциональное определение специфических молекул ДНК или РНК в иммунохроматографическом формате анализа, при котором все необходимые реактивы находятся на тест-полоске в безводном виде. С другой стороны, данное изобретение дает возможность прямого определения НК без необходимости их амплификации и предоставляет метод их быстрого обнаружения.

Кроме того, в своих альтернативных вариантах реализации изобретение применимо и для обнаружения НК в условиях повышенной температуры, что расширяет область его использования в различных областях, например, для проведения судебно-медицинской экспертизы. В дополнении к этим преимуществам описанный метод является простым способом детекции нуклеиновых кислот и не требует серьёзных подготовки в этой области, что может облегчить проникновение методов геномного экспресс-анализа в область диагностики у постели больного и по месту оказания медицинской помощи.

Аналиты

Настоящее изобретение позволяет детектировать широкий круг молекулярных аналитов, включая нуклеиновые кислоты и полинуклеотидные последовательности, в том числе фрагменты и целые молекулы ДНК, а также транспортные, матричные, рибосомальные, микро РНК; синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как пептидные НК, морфолиновые, закрытые, гликолевые и треозо-НК; а также, за счет использования особенных распознающих олигонуклеотидов (например, аптамеров) также молекулы ненуклеотидного состава, например, белки и пептиды, гормоны, низкомолекулярные физиологические регуляторы, иные гаптены, ионы металлов, и т.д.

Мультиплексность

Данный метод применим и для определения нескольких аналитов на одной мембране. В простейшем формате тестовая полоска может быть разделена на отдельные полоски, где будут нанесены отдельные зоны связывания для обнаружения различных аналитов. Кроме того, также возможно реализовать одновременную детекцию разных аналитов в одном образце. Для этого, например, отдельные зоны связывания могут быть нанесены на одну мембрану, но в её разных участках.

Специфические пары рецептор/лиганд

В рамках данного изобретения могут быть использованы различные специфические пары типа «рецептор/лиганд», применимые для создания сигнальных (репортерных) конъюгатов и связывающих их рецепторов, а также распознающих олигонуклеотидов или белковых рецептором с их аналитом. Компоненты таких пар, применимые в данном изобретении, могут быть как иммунного, так и неиммунного типа. Примерами иммунного связывания могут быть системы, основанные на взаимодействии антиген/антитело или гаптен/антигаптен. Поликлональные, моноклональные антитела или их иммуно-активные фрагменты могут быть подготовлены стандартными методами, известные специалистам в данной области. Термины "иммуно-активный фрагмент антитела" или "иммуно-активный фрагмент" относятся к частям молекул антител, которые содержат область специфического связывания. Такие фрагменты могут быть фрагментами Fab, которые определяются как фрагменты, лишенные части Fc, например Fab, Fab' и F(ab)2 фрагменты, или могут быть так называемыми "полумолекулярными" фрагментами, полученными восстановительным расщеплением дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи исходного антитела. Если антиген, входящий в состав связывающейся пары, не является иммуногенным, например, гаптен, он может быть ковалентно связан с дополнительным белком-носителем, чтобы сделать его иммуногенным.

К неиммунным специфическим парам относятся системы, в которых два компонента проявляют естественную аффинность друг к другу, не являясь при этом антителом и антигеном. Среди известных примеров неиммунных пар можно назвать биотин и авидин, биотин и стрептавидин, фолиевая кислота и белки, связывающие фолаты, комплементарные нуклеиновые кислоты, белки А, G и иммуноглобулины и т.д. К ним также могут быть причислены пары, образующие ковалентные связи друг с другом: например, пары сульфгидрильные группы/ малеимиды и галоацетильные производные) и амино-группы/изотиоционаты, эфиры сукцинимида и сульфонилгалогениды и т.д. (M. N. Bobrow, et al., J. Immunol. Methods, 1989,125:279).

Иммунохроматографические (ИХА) тест-полоски

ИХА тест-полоска представляет собой окружение, в котором происходит анализ с помощью настоящего изобретения. Тест-полоска, как правило, состоит из хроматографического пористого материала и включает зону нанесения образца и зону связывания, как указано выше.

Хроматографические пористые материалы, из которых состоит полоска, как правило гидрофильны и/или принципиально могут быть превращены в таковые, и включают в себя следующие материалы, используемые либо по отдельности либо в сочетании с другими материалами - гранулы неорганической природы, например кремния, сульфата магния, алюминия; природные полимеры, в частности целлюлоза и материалы на ее основе (например, волокнистые полимеры - фильтровальная бумага, бумага для хроматографии и пр.); синтетические или модифицированные природные полимеры, такие как нитроцеллюлоза, ацетилцеллюлоза, поливинилхлорид, полиакриламид, кросс-сшитый декстран, агароза, полиакрилаты и др.; керамические материалы; стекло; и подобные материалы. Для описываемого изобретения предпочитаемым материалом является нитроцеллюлоза.

В предпочтительном варианте мембрана может быть как отдельной структурой в виде листа, нарезаемого на тест-полоски, либо может быть зафиксирована на подложке или твердой поверхности, как, например, при тонкослойной хроматографии.

Связывание рецепторов с поверхностью мембраны может достигаться при помощи хорошо известных методов, описанных в литературе. См. например Immobilized Enzymes, Inchiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) и Cuatrecasas, J. Bio. Chem., 1970, 245:3059.

Подготовка тест-полоски

При подготовке тест-полоски для проведения анализа сначала наносятся необходимые реагенты, а затем тест-полоска инкубируется в необходимых буферных растворах.

Буферные растворы и растворители, используемые для описываемого изобретения известны (см. например Weng et al. (Патент США 4,740,468). Как правило значения pH буфера для проведения иммунохроматографического анализа находятся в интервале 4-11, чаще 5-10, для настоящего изобретения предпочтительно 6-9. Значения pH выбираются так, чтобы поддерживать необходимый уровень аффинности между взаимодействующими парами молекул и быть оптимальным для формирования сигнала соответствующей системой. Для достижения желаемого значения pH и его поддержания во время анализа могут использоваться различные буферы. В качестве иллюстрации могут быть приведены боратный, фосфатный, карбонатный, Tris, диэтилбарбитуровый и др. Применение определённого буферного раствора не является значимым для изобретения в целом, однако, при проведении конкретных исследований использование специфичного буферного раствора может быть предпочтительным.

Для проведения анализа в рамках данного изобретения обычно используется постоянное значение температуры. Как правило, для проведения исследования и получения детектируемого сигнала используются значения температуры в интервале 4-50 °C., обычно в промежутке 10-40 °C., а еще чаще – температуры, близкие к температуре окружающей среды, т.е. 15-25 °C.

При использовании в одном из вариантов данного изобретения распознающего олигонуклеотида и ее связывания (гибридизации) с целевой нуклеотидной последовательностью требует условий, способствующих протеканию гибридизации НК. Гибридизация как правило проводится в буферном растворе Фиколла, который также может содержать поливинилпирролидин, БСА, дрожжевую тРНК, неспецифичную ДНК, сульфат декстрана, дитиотреитол и формамид. Гибридизация может происходить как в растворе, так и на твердой фазе, при этом одна нуклеотидная цепь иммобилизуется на тест-полоске в зоне связывания.

Использованная литература.

[1] M. Dietel, Molecular Pathology: A Requirement for Precision Medicine in Cancer, Oncol. Res. Treat. 39 (2016) 804–810. https://doi.org/10.1159/000453085.

[2] A. Ahmadivand, B. Gerislioglu, Photonic and Plasmonic Metasensors, Laser & Photonics Reviews 16 (2022) 2100328. https://doi.org/10.1002/lpor.202100328.

[3] C. Das Mukhopadhyay, P. Sharma, K. Sinha, K. Rajarshi, Recent trends in analytical and digital techniques for the detection of the SARS-Cov-2, Biophys. Chem. 270 (2021) 106538. https://doi.org/10.1016/j.bpc.2020.106538.

[4] B. Porstmann, T. Porstmann, E. Nugel, U. Evers, Which of the commonly used marker enzymes gives the best results in colorimetric and fluorimetric enzyme immunoassays: Horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or β-galactosidase?, Journal of Immunological Methods 79 (1985) 27–37. https://doi.org/10.1016/0022-1759(85)90388-6.

[5] H. Yang, C.S. Bever, H. Zhang, G.M. Mari, H. Li, X. Zhang, L. Guo, Z. Wang, P. Luo, Z. Wang, Comparison of soybean peroxidase with horseradish peroxidase and alkaline phosphatase used in immunoassays, Anal. Biochem. 581 (2019) 113336. https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.06.007.

[6] V.G. Panferov, I.V. Safenkova, A.V. Zherdev, B.B. Dzantiev, The steadfast Au@Pt soldier: Peroxide-tolerant nanozyme for signal enhancement in lateral flow immunoassay of peroxidase-containing samples, Talanta 225 (2021) 121961. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2020.121961.

[7] L. Zhang, D. Hu, M. Salmain, B. Liedberg, S. Boujday, Direct quantification of surface coverage of antibody in IgG-Gold nanoparticles conjugates, Talanta 204 (2019) 875–881. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.05.104.

[8] M. Besharati Vineh, A.A. Saboury, A.A. Poostchi, A.M. Rashidi, K. Parivar, Stability and activity improvement of horseradish peroxidase by covalent immobilization on functionalized reduced graphene oxide and biodegradation of high phenol concentration, Int. J. Biol. Macromol. 106 (2018) 1314–1322. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.08.133.

[9] B. Yu, H. Cheng, W. Zhuang, C. Zhu, J. Wu, H. Niu, D. Liu, Y. Chen, H. Ying, Stability and repeatability improvement of horseradish peroxidase by immobilization on amino-functionalized bacterial cellulose, Process Biochemistry 79 (2019) 40–48. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2018.12.024.

[10] F. Attar, M.G. Shahpar, B. Rasti, M. Sharifi, A.A. Saboury, S.M. Rezayat, M. Falahati, Nanozymes with intrinsic peroxidase-like activities, Journal of Molecular Liquids 278 (2019) 130–144. https://doi.org/10.1016/j.molliq.2018.12.011.

[11] A. Ambrosi, F. Airò, A. Merkoçi, Enhanced gold nanoparticle based ELISA for a breast cancer biomarker, Anal. Chem. 82 (2010) 1151–1156. https://doi.org/10.1021/ac902492c.

[12] E. Gérard, F. Guyot, P. Philippot, P. López-García, Fluorescence in situ hybridisation coupled to ultra small immunogold detection to identify prokaryotic cells using transmission and scanning electron microscopy, J. Microbiol. Methods 63 (2005) 20–28. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2005.02.018.

[13] S. Tanev, W. Sun, J. Pond, V.V. Tuchin, V.P. Zharov, Flow cytometry with gold nanoparticles and their clusters as scattering contrast agents: FDTD simulation of light-cell interaction, J. Biophotonics 2 (2009) 505–520. https://doi.org/10.1002/jbio.200910039.

[14] V.O. Shipunova, E.N. Komedchikova, P.A. Kotelnikova, I.V. Zelepukin, A.A. Schulga, G.M. Proshkina, E.I. Shramova, H.L. Kutscher, G.B. Telegin, A.V. Kabashin, P.N. Prasad, S.M. Deyev, Dual Regioselective Targeting the Same Receptor in Nanoparticle-Mediated Combination Immuno/Chemotherapy for Enhanced Image-Guided Cancer Treatment, ACS Nano 14 (2020) 12781–12795. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c03421.

[15] V.O. Shipunova, O.A. Kolesnikova, P.A. Kotelnikova, V.D. Soloviev, A.A. Popov, G.M. Proshkina, M.P. Nikitin, S.M. Deyev, Comparative Evaluation of Engineered Polypeptide Scaffolds in HER2-Targeting Magnetic Nanocarrier Delivery, ACS Omega 6 (2021) 16000–16008. https://doi.org/10.1021/acsomega.1c01811.

[16] V.O. Shipunova, M.M. Belova, P.A. Kotelnikova, O.N. Shilova, A.B. Mirkasymov, N.V. Danilova, E.N. Komedchikova, R. Popovtzer, S.M. Deyev, M.P. Nikitin, Photothermal Therapy with HER2-Targeted Silver Nanoparticles Leading to Cancer Remission, Pharmaceutics 14 (2022). https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14051013.

[17] V.O. Shipunova, M.P. Nikitin, I.V. Zelepukin, P.I. Nikitin, S.M. Deyev, R.V. Petrov, A comprehensive study of interactions between lectins and glycoproteins for the development of effective theranostic nanoagents, Dokl. Biochem. Biophys. 464 (2015) 315–318. https://doi.org/10.1134/S1607672915050117.

[18] A.V. Kabashin, V.G. Kravets, F. Wu, S. Imaizumi, V.O. Shipunova, S.M. Deyev, A.N. Grigorenko, Phase‐responsive fourier nanotransducers for probing 2D materials and functional interfaces, Adv. Funct. Mater. 29 (2019) 1902692. https://doi.org/10.1002/adfm.201902692.

[19] K.G. Shevchenko, V.R. Cherkasov, A.A. Tregubov, P.I. Nikitin, M.P. Nikitin, Surface plasmon resonance as a tool for investigation of non-covalent nanoparticle interactions in heterogeneous self-assembly & disassembly systems, Biosens. Bioelectron. 88 (2017) 3–8. https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.09.042.

[20] V.R. Cherkasov, E.N. Mochalova, A.V. Babenyshev, A.V. Vasilyeva, P.I. Nikitin, M.P. Nikitin, Nanoparticle beacons: supersensitive smart materials with on/off-switchable affinity to biomedical targets, ACS Nano 14 (2020) 1792–1803. https://doi.org/10.1021/acsnano.9b07569.

[21] L.-J. Zhao, R.-J. Yu, W. Ma, H.-X. Han, H. Tian, R.-C. Qian, Y.-T. Long, Sensitive detection of protein biomarkers using silver nanoparticles enhanced immunofluorescence assay, Theranostics 7 (2017) 876–883. https://doi.org/10.7150/thno.17575.

[22] V.O. Shipunova, P.A. Kotelnikova, U.F. Aghayeva, O.A. Stremovskiy, I.A. Novikov, A.A. Schulga, M.P. Nikitin, S.M. Deyev, Self-assembling nanoparticles biofunctionalized with magnetite-binding protein for the targeted delivery to HER2/neu overexpressing cancer cells, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 469 (2019) 450–455. https://doi.org/10.1016/j.jmmm.2018.09.015.

[23] A. Ringaci, K.G. Shevchenko, I.V. Zelepukin, A.V. Popova, M.P. Nikitin, Phage-mimicking nanoagents for rapid depolymerase specificity screening against multidrug resistant bacteria, Biosens. Bioelectron. 213 (2022) 114444. https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114444.

[24] X. Chen, C. Wang, X. Tan, J. Wang, Determination of bisphenol A in water via inhibition of silver nanoparticles-enhanced chemiluminescence, Anal. Chim. Acta 689 (2011) 92–96. https://doi.org/10.1016/j.aca.2011.01.031.

[25] Z.-P. Chen, Z.-F. Peng, Y. Luo, B. Qu, J.-H. Jiang, X.-B. Zhang, G.-L. Shen, R.-Q. Yu, Successively amplified electrochemical immunoassay based on biocatalytic deposition of silver nanoparticles and silver enhancement, Biosens. Bioelectron. 23 (2007) 485–491. https://doi.org/10.1016/j.bios.2007.06.005.

[26] H. Li, D. Xu, Silver nanoparticles as labels for applications in bioassays, TrAC Trends in Analytical Chemistry 61 (2014) 67–73. https://doi.org/10.1016/j.trac.2014.05.003.

[27] D.D. Evanoff, G. Chumanov, Synthesis and optical properties of silver nanoparticles and arrays, Chemphyschem 6 (2005) 1221–1231. https://doi.org/10.1002/cphc.200500113.

[28] W. Zhou, Y. Ma, H. Yang, Y. Ding, X. Luo, A label-free biosensor based on silver nanoparticles array for clinical detection of serum p53 in head and neck squamous cell carcinoma, Int. J. Nanomedicine 6 (2011) 381–386. https://doi.org/10.2147/IJN.S13249.

[29] S. Shrivastava, D. Dash, Label-free colorimetric estimation of proteins using nanoparticles of silver, Nano-Micro Lett 2 (2010). https://doi.org/10.5101/nml.v2i3.p164-168.

[30] M. Seydack, Nanoparticle labels in immunosensing using optical detection methods, Biosens. Bioelectron. 20 (2005) 2454–2469. https://doi.org/10.1016/j.bios.2004.11.003.

[31] W. Gao, B. Li, R. Yao, Z. Li, X. Wang, X. Dong, H. Qu, Q. Li, N. Li, H. Chi, B. Zhou, Z. Xia, Intuitive label-free SERS detection of bacteria using aptamer-based in situ silver nanoparticles Synthesis, Anal. Chem. 89 (2017) 9836–9842. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b01813.

[32] K.D. Dukes, K.A. Christensen, G. Chumanov, Core-shell silver nanoparticles for optical labeling of cells, Anal. Biochem. 458 (2014) 43–48. https://doi.org/10.1016/j.ab.2014.04.015.

[33] V.O. Shipunova, A.S. Sogomonyan, I.V. Zelepukin, M.P. Nikitin, S.M. Deyev, PLGA Nanoparticles Decorated with Anti-HER2 Affibody for Targeted Delivery and Photoinduced Cell Death, Molecules 26 (2021). https://doi.org/10.3390/molecules26133955.

[34] V.O. Shipunova, E.I. Shramova, A.A. Schulga, M.V. Shilova, S.M. Deyev, G.M. Proshkina, Delivery of Barnase to Cells in Liposomes Functionalized by Her2-Specific DARPin Module, Russ J Bioorg Chem 46 (2020) 1156–1161. https://doi.org/10.1134/S1068162020060308.

[35] M.P. Nikitin, I.V. Zelepukin, V.O. Shipunova, I.L. Sokolov, S.M. Deyev, P.I. Nikitin, Enhancement of the blood-circulation time and performance of nanomedicines via the forced clearance of erythrocytes, Nat. Biomed. Eng. 4 (2020) 717–731. https://doi.org/10.1038/s41551-020-0581-2.

[36] I.V. Zelepukin, V.O. Shipunova, A.B. Mirkasymov, P.I. Nikitin, M.P. Nikitin, S.M. Deyev, Synthesis of luminescent magnetic nanoparticles with controllable surface properties, in: 2018 International Conference Laser Optics (ICLO), St. Petersburg, IEEE, 6/4/2018 - 6/8/2018, p. 576.

[37] Y. Shkryl, T. Rusapetova, Y. Yugay, A. Egorova, V. Silant'ev, V. Grigorchuk, A. Karabtsov, Y. Timofeeva, E. Vasyutkina, O. Kudinova, V. Ivanov, V. Kumeiko, V. Bulgakov, Biosynthesis and Cytotoxic Properties of Ag, Au, and Bimetallic Nanoparticles Synthesized Using Lithospermum erythrorhizon Callus Culture Extract, Int. J. Mol. Sci. 22 (2021). https://doi.org/10.3390/ijms22179305.

[38] M. Dulski, R. Gawecki, S. Sułowicz, M. Cichomski, A. Kazek-Kęsik, M. Wala, K. Leśniak-Ziółkowska, W. Simka, A. Mrozek-Wilczkiewicz, M. Gawęda, M. Sitarz, K. Dudek, Key Properties of a Bioactive Ag-SiO2/TiO2 Coating on NiTi Shape Memory Alloy as Necessary at the Development of a New Class of Biomedical Materials, Int. J. Mol. Sci. 22 (2021). https://doi.org/10.3390/ijms22020507.

[39] M.M. Belova, V.O. Shipunova, P.A. Kotelnikova, A.V. Babenyshev, E.A. Rogozhin, M.Y. Cherednichenko, S.M. Deyev, "Green" synthesis of cytotoxic silver nanoparticles dased on secondary metabolites of Lavandula Angustifolia Mill, Acta Naturae 11 (2019) 47–53. https://doi.org/10.32607/20758251-2019-11-2-47-53.

[40] M. Larguinho, P.V. Baptista, Gold and silver nanoparticles for clinical diagnostics - From genomics to proteomics, J. Proteomics 75 (2012) 2811–2823. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2011.11.007.

[41] I.V. Zelepukin, A.A. Popov, V.O. Shipunova, G.V. Tikhonowski, A.B. Mirkasymov, E.A. Popova-Kuznetsova, S.M. Klimentov, A.V. Kabashin, S.M. Deyev, Laser-synthesized TiN nanoparticles for biomedical applications: Evaluation of safety, biodistribution and pharmacokinetics, Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 120 (2021) 111717. https://doi.org/10.1016/j.msec.2020.111717.

[42] B. Seong, J. Kim, W. Kim, S.H. Lee, X.-H. Pham, B.-H. Jun, Synthesis of Finely Controllable Sizes of Au Nanoparticles on a Silica Template and Their Nanozyme Properties, Int. J. Mol. Sci. 22 (2021). https://doi.org/10.3390/ijms221910382.

[43] R.J. Stokes, A. Macaskill, P.J. Lundahl, W.E. Smith, K. Faulds, D. Graham, Quantitative enhanced Raman scattering of labeled DNA from gold and silver nanoparticles, Small 3 (2007) 1593–1601. https://doi.org/10.1002/smll.200600662.

[44] Le Chang, L.V. Besteiro, J. Sun, E.Y. Santiago, S.K. Gray, Z. Wang, A.O. Govorov, Electronic Structure of the Plasmons in Metal Nanocrystals: Fundamental Limitations for the Energy Efficiency of Hot Electron Generation, ACS Energy Lett. 4 (2019) 2552–2568. https://doi.org/10.1021/acsenergylett.9b01617.

[45] H. Guan, B. Liu, D. Gong, B. Peng, B. Han, N. Zhang, Direct electrochemical enhanced detection of dopamine based on peroxidase-like activity of Fe3O4@Au composite nanoparticles, Microchemical Journal 164 (2021) 105943. https://doi.org/10.1016/j.microc.2021.105943.

[46] W. Song, M. Chi, M. Gao, B. Zhao, C. Wang, X. Lu, Self-assembly directed synthesis of Au nanorices induced by polyaniline and their enhanced peroxidase-like catalytic properties, J. Mater. Chem. C 5 (2017) 7465–7471. https://doi.org/10.1039/C7TC01761H.

[47] D. Zhou, K. Zeng, M. Yang, Gold nanoparticle-loaded hollow Prussian Blue nanoparticles with peroxidase-like activity for colorimetric determination of L-lactic acid, Mikrochim. Acta 186 (2019) 121. https://doi.org/10.1007/s00604-018-3214-7.

[48] Z. Xuan, M. Li, P. Rong, W. Wang, Y. Li, D. Liu, Plasmonic ELISA based on the controlled growth of silver nanoparticles, Nanoscale 8 (2016) 17271–17277. https://doi.org/10.1039/C6NR06079J.

[49] J. Liang, H. Liu, C. Huang, C. Yao, Q. Fu, X. Li, D. Cao, Z. Luo, Y. Tang, Aggregated silver nanoparticles based surface-enhanced Raman scattering enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive detection of protein biomarkers and small molecules, Anal. Chem. 87 (2015) 5790–5796. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b01011.

[50] Z. Karim, R. Adnan, M.S. Ansari, Low concentration of silver nanoparticles not only enhances the activity of horseradish peroxidase but alter the structure also, PLoS One 7 (2012) e41422. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041422.

[51] J. Li, W. Liu, X. Wu, X. Gao, Mechanism of pH-switchable peroxidase and catalase-like activities of gold, silver, platinum and palladium, Biomaterials 48 (2015) 37–44. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.01.012.

[52] J. Liang, C. Yao, X. Li, Z. Wu, C. Huang, Q. Fu, C. Lan, D. Cao, Y. Tang, Silver nanoprism etching-based plasmonic ELISA for the high sensitive detection of prostate-specific antigen, Biosens. Bioelectron. 69 (2015) 128–134. https://doi.org/10.1016/j.bios.2015.02.026.

[53] M. Gorji, S. Mazinani, A.-R. Faramarzi, S. Ghadimi, M. Kalaee, A. Sadeghianmaryan, L.D. Wilson, Coating Cellulosic Material with Ag Nanowires to Fabricate Wearable IR-Reflective Device for Personal Thermal Management: The Role of Coating Method and Loading Level, Molecules 26 (2021). https://doi.org/10.3390/molecules26123570.

[54] J. Junaidi, M.W. Saputra, R. Marjunus, S. Sembiring, S. Hadi, The Quenching and Sonication Effect on the Mechanical Strength of Silver Nanowires Synthesized Using the Polyol Method, Molecules 26 (2021). https://doi.org/10.3390/molecules26082167.

[55] C. Yang, H. Gu, W. Lin, M.M. Yuen, C.P. Wong, M. Xiong, B. Gao, Silver nanowires: from scalable synthesis to recyclable foldable electronics, Adv. Mater. 23 (2011) 3052–3056. https://doi.org/10.1002/adma.201100530.

[56] X.-Z. Xiang, W.-Y. Gong, M.-S. Kuang, L. Wang, Progress in application and preparation of silver nanowires, Rare Met. 35 (2016) 289–298. https://doi.org/10.1007/s12598-016-0695-6.

[57] L.R. Shobin, S. Manivannan, One pot rapid synthesis of silver nanowires using NaCl assisted glycerol mediated polyol process, Electron. Mater. Lett. 10 (2014) 1027–1031. https://doi.org/10.1007/s13391-014-4013-x.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет подробно описано в сочетании со следующими примерами, чтобы специалисты в данной области могли лучше понять настоящее изобретение, при этом, настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Синтез СНП

Серебряные нанопроволоки были синтезированы из AgNO₃ с помощью глицерин-опосредованного полиолового процесса с использованием поливинилпирролидона (ПВП) и NaCl, как описано в разделе [57] с модификациями. 12,5 мл глицерина с 0,5 мМ ПВП (молекулярная масса 58 000 Да) и 8 мМ NaCl нагревали до 80 °С и перемешивали для растворения ПВП в круглодонной колбе на 50 мл. Смесь перемешивали и нагревали до тех пор, пока раствор не становился прозрачным, а затем раствор охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 50 мМ AgNO₃ и перемешивали до полного растворения AgNO₃. Затем смесь нагревали до 200 °С в колбонагревателе с круглым дном. Наблюдалось последовательное изменение цвета (розовый – алый – красно-кирпичный непрозрачный – коричневый непрозрачный – черно-коричневый – серо-зеленый) раствора. Реакцию продолжали до появления серо-зеленой окраски, затем смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли в 100 мл воды. Нанопроволоки центрифугировали при 25 °С при 8000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 3 мл H₂O.

Полученные частицы охарактеризованы методами оптической спектроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Концентрацию наночастиц определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на масс-спектрометре NexION 2000 (Perkin Elmer, США) путем растворения СНП в 5% HNO₃ и измерения концентрации ионов Ag по калибровочной кривой, полученной по серии последовательно разбавленных образцов AgNO₃.

Пример 2. Измерение параметров СНП с помощью СЭМ

Изображения СНП методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) получали на микроскопе MAIA3 Tescan (Tescan, Чехия) при ускоряющем напряжении 15 кВ. Образцы СНП в воде в концентрации 10 мкг/мл высушивали на воздухе на кремниевой подложке на углеродном скотче и немедленно анализировали. СЭМ-изображения обрабатывали с использованием программного обеспечения ImageJ для получения распределения частиц по размерам. Показано, что полученные частицы имеют форму проволок (фиг. 1 а-в).

Пример 3. Ферментоподобная активность СНП.

20 мкг СНП добавляли в пробирку на 0,6 мл в 200 мкл (40 мМ лимонной кислоты, 40 мМ Na₂HPO₄ ·2H₂O, pH 5), затем добавляли 20 мкл 0,3% H₂O₂ и 5 мкл ОФД, ТМБ или ДАБ с концентрацией 10 г/л. Растворы инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре и фотографировали с помощью камеры смартфона. Изображения на фиг. 2а подтверждают формирование окрашенного раствора только в случае добавления субстрата – причем в случае ОФД субстрат не преципитирует, а в случае ТМБ и ДАБ – преципитирует.

Пример 4. Обнаружение перекиси водорода с использованием СНП

H₂O₂-зависимую ферментоподобную активность СНП изучали следующим образом. 10 мкг СНП в 50 мкл буфера (40 мМ лимонной кислоты, 40 мМ Na₂HPO₄ 2H₂O, pH 5) смешивали с 50 мкл H₂O₂ в различных концентрациях. Затем добавляли 50 мкл 0,08% субстрата ОФД. Оптическую плотность каждой лунки измеряли с помощью микропланшентного анализатора Infinite 1000 Pro (Tecan, Австрия) при длине волны λ = 450 нм через 10, 30, 60, 90, 120 и 150 мин инкубации. Фиг. 2б подтверждает зависимость изменения поглощения образцов при повышении концентрации перекиси водорода: чем больше концентрация перекиси водорода, тем выше поглощение раствора, причем развитие окраски формируется уже через 30 минут инкубации.

Пример 5. Детекция pH с использованием СНП

pH растворов с помощью ферментоподобной активности СНП исследовали следующим образом. 20 мкл СНП разных концентраций смешивали со 100 мкл 0,04% субстрата ОФД и 0,03% H₂O₂ в буферах с разным pH – от pH 2 до pH 9. Оптическую плотность каждой лунки измеряли с помощью микропланшентного анализатора Infinite 1000 Pro (Tecan, Австрия) при длине волны λ = 450 нм после 15 мин инкубации. Данные на фиг. 3 а,б свидетельствуют о pH-зависимом окрашивании раствора в диапазоне pH от 2 до 9 и концентрации нанопроволок от 0.3 до 233 мкг/мл. С использованием данного метода и калибровочной прямой, построенной для концентрации нанопроволок 78 мкг/мл, было проведено измерение pH буферов с неизвестными до теста значения, которые совпали со значениями, измеренными pH-метром.

Пример 6. Химическая конъюгация

Бычий сывороточный альбумин, меченный фолиевой кислотой (БСА-ФК), готовили следующим образом. Фолиевую кислоту (ФК) с гидрохлоридом 1-этил-3-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) растворяли в буфере, содержащем 50 % ДМСО и 50 % 0,1 М морфолиноэтансульфоновой кислоты при конечной концентрации ФК 10 г/л при массовом соотношении ФК:EDC:NHS = 10:6,5:4,8. Полученную смесь инкубировали 40 мин при +20 °С, затем к этой смеси добавляли 400 мкл БСА в концентрации 6,7 г/л в воде. Смесь инкубировали 8 ч при комнатной температуре. Затем полученный конъюгат очищали от побочных продуктов реакции на колонках NAP-5 (GE Healthcare Life Sciences, США) и измеряли концентрацию конъюгата с помощью BCA-теста.

БСА, меченный ФИТЦ (БСА-ФИТЦ), готовили путем быстрого смешивания 100 мкл БСА в концентрации 20 г/л в фосфатном буфере, рН 7,4, с 10 мкл ФИТЦ в концентрации 9,4 г/л в ДМСО. Раствор инкубировали в течение 4 ч, избыток непрореагировавших молекул ФИТЦ удаляли с помощью колонок Zeba Spin Desalting Columns (MWCO 7 кДа) в соответствии с рекомендациями производителя.

СНП, модифицированные ФИТЦ (СНП-ФИТЦ), получали путем химической конъюгации СНП с БСА-ФИТЦ. 420 мкг СНП инкубировали с 10 мг гидрохлорида 1-этил-3-карбодиимида и 10 мг N-гидроксисульфосукцинимида в 150 мкл 0,1 М MES (морфолиноэтансульфокислота), рН 5, в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее центрифугированием удаляли избыток непрореагировавших веществ, к СНП добавляли 200 мкг БСА-ФИТЦ 2 г/л и смесь тщательно обрабатывали ультразвуком. Образец инкубировали в течение 8 ч при комнатной температуре и отмывали от несвязанного БСА-ФИТЦ центрифугированием.

СНП, модифицированные анти-ФК IgG (СНП-анти-ФК IgG), получали путем химической конъюгации СНП с анти-ФК IgG, клон FA1. 500 мкг СНП инкубировали с 5 мг гидрохлорида 1-этил-3-карбодиимида (Sigma) и 5 мг N-гидроксисульфосукцинимида в 200 мкл 0,1 М MES (морфолиноэтансульфоновой кислоты), рН 5,0, в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее центрифугированием удаляли избыток непрореагировавших веществ, к СНП добавляли 200 мкг анти-ФК IgG 1 г/л и смесь тщательно обрабатывали ультразвуком. Образец инкубировали в течение 8 ч при комнатной температуре и отмывали от несвязанных анти-ФК IgG тройным центрифугированием.

СНП, модифицированные анти-биотин IgG (СНП-анти-биотин IgG), получали путем химической конъюгации СНП с анти-биотин IgG, клон B25. 500 мкг СНП инкубировали с 5 мг гидрохлорида 1-этил-3-карбодиимида и 5 мг N-гидроксисульфосукцинимида в 200 мкл 0,1 М MES (морфолиноэтансульфоновой кислоты), рН 5,0, в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее центрифугированием удаляли избыток непрореагировавших веществ, к СНП добавляли 200 мкг анти-биотин IgG 1 г/л и смесь тщательно обрабатывали ультразвуком. Образец инкубировали в течение 8 ч при комнатной температуре и отмывали от несвязанных анти-биотин IgG тройным центрифугированием.

Пример 7. Использование СНП в качестве меток в иммунохроматографии на тест-полосках

Использование СНП в качестве оптических маркеров изучали с помощью иммунохроматографии на нитроцеллюлозных тест-полосках (UniSart CN 140 Membrane (Sartorius)). 1 мкл анти-ФИТЦ IgG в концентрации 1 г/л локально сорбировали на мембрану тест-полоски шириной 2,5 мм. СНП, модифицированный ФИТЦ, в коллоидной форме вносили в пробирку в 20 мкл Трис-буфера с 1% БСА и 0,05% Твин-20. Нижний конец тест-полоски помещали в пробирку, и СНП вместе с растворителем начинали мигрировать вверх по полоске. Когда вся жидкость была поглощена тест-полоской, в пробирку дважды последовательно добавляли 20 мкл Трис с 1% БСА и 0,05% Твин-20, чтобы дать возможность всем частицам мигрировать по тест-полоске и отмыть несвязавшиеся, если таковые имеются. В случае специфического взаимодействия первого и второго компонентов в области локализации IgG обнаруживались видимые СНП, что выявлялось визуально по образованию линии коричневого цвета на полоске. Данные на фиг. 4 а-в свидетельствуют об эффективном использовании СНП в формате меток для иммунохромагорафии.

Пример 8. Обнаружение фолиевой кислоты в иммунохроматографии на тест-полосках

Возможность использования СНП в качестве оптических маркеров изучали с помощью иммунохроматографии на нитроцеллюлозных тест-полосках (UniSart CN 140 Membrane, Sartorius). 1 мкл БСА-ФК в концентрации 1 г/л локально сорбировали на мембрану тест-полоски шириной 2,0 мм.

Модифицированные анти-ФК IgG СНП в коллоидной форме вносили в пробирку в 20 мкл 0,1 М Трис-буфера с 1% БСА и 0,05% Твин-20 с разными концентрациями фолиевой кислоты (ФК). Нижний конец тест-полоски помещали в пробирку, и СНП вместе с растворителем начинали мигрировать вверх по полоске. Когда вся жидкость была поглощена тест-полоской, в пробирку дважды последовательно добавляли 20 мкл Трис с 1% БСА и 0,05% Твин-20, чтобы дать возможность всем частицам мигрировать вдоль тест-полоски и отмыть несвязавшиеся, если таковые имеются. В случае, когда первый и второй компоненты взаимодействовали специфически, в области локализации БСА-ФК обнаруживались видимые СНП, что выявлялось визуально по формированию цветной линии на тест-полоске. Данные, представленные на фиг. 5а, б свидетельствуют об эффективной детекции фолиевой кислоты в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 100 мкМ.

Пример 9. Обнаружение биотина в иммунохроматографии на тест-полосках

Свойство СНП как оптических маркеров показали с помощью иммунохроматографии на нитроцеллюлозных тест-полосках (UniSart CN 140 Membrane, Sartorius). 1 мкл БСА-биотин в концентрации 1 г/л локально сорбировали на мембрану тест-полоски шириной 2,0 мм.

Модифицированные анти-биотин IgG СНП в коллоидной форме вносили в пробирку в 20 мкл 0,1 М Трис-буфера с 1% БСА и 0,05% Твин-20 с разными концентрациями биотина. Нижний конец тест-полоски помещали в пробирку, и СНП вместе с растворителем начинали мигрировать вверх по полоске. Когда вся жидкость была поглощена тест-полоской, в пробирку дважды последовательно добавляли 20 мкл Трис с 1% БСА и 0,05% Твин-20, чтобы дать возможность всем частицам мигрировать вдоль тест-полоски и отмыть несвязавшиеся, если таковые имеются. В случае, когда первый и второй компоненты взаимодействовали специфически, в области локализации БСА-биотин обнаруживались видимые СНП, что выявлялось визуально по формированию цветной линии на тест-полоске. С использованием данного метода была проведена детекция биотина в диапазоне концентраций от 0.5 мкМ до 100 мкМ.

Пример 10. Обнаружение олигонуклеотидов на тест-полосках.

Свойство СНП как оптических маркеров показали с помощью иммунохроматографии на нитроцеллюлозных тест-полосках (UniSart CN 140 Membrane, Sartorius). 1 мкл захватывающего 20-членного олигонуклеотида в концентрации 1 мкмол/л локально сорбировали на мембрану тест-полоски в зоне тест-линии шириной 2,0 мм и облучали ультрафиолетом для иммобилизации.

Модифицированные распознающим 20-мерным олигонуклеотидом СНП (методом солевого состаривания) в коллоидной форме вносили в пробирку в 20 мкл в 0,1 М Трис-буфера с 0,05% Твин-20 и концетрацией NaCl от 150 мМ до 1М и/или концентрацией MgCl2 с концентрацией от 1мМ до 3 мМ с разными концентрациями олигонуклеотида-аналита (комлементарного с одного конца захватывающему олигонуклеотиду, а с другого – распознающему, для образования сэндвича). Нижний конец тест-полоски помещали в пробирку, и СНП вместе с растворителем начинали мигрировать вверх по полоске. Когда вся жидкость была поглощена тест-полоской, в пробирку дважды последовательно добавляли 20 мкл буфера, чтобы дать возможность всем частицам мигрировать вдоль тест-полоски и отмыть несвязавшиеся, если таковые имеются (этот шаг был необязательным). В случае, когда первый и второй компоненты взаимодействовали специфически, на тест-линии обнаруживались видимые СНП, что выявлялось визуально по формированию цветной линии на тест-полоске. С использованием данного метода была проведена детекция различных олигонуклеоидов в диапазоне концентраций от 1 нМ до 10 мкМ.

Пример 11. Обнаружение флуоресцеинизиотиоционата (ФИТЦ) в режиме иммуноферментного анализа

0,3 мкг бычьего сывороточного альбумина, химически связанного с ФИТЦ (БСА-ФИТЦ), сорбировали в лунки 96-луночных микропланшетов с использованием 100 мкл карбонатно-бикарбонатного буфера, рН 9,2, в течение ночи при комнатной температуре. Далее содержимое лунок удаляли и добавляли в лунки по 200 мкл воды с 3% обезжиренным молоком. Через 1 ч раствор удаляли, а микропланшет однократно промывали водой. Далее 3 мкг СНП, модифицированных антителоми против ФИТЦ, клон FC11, смешивали с различными концентрациями ФИТЦ в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) с 1% БСА и добавляли в лунки. Раствор инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании с последующей трехкратной промывкой 200 мкл воды. Далее в лунки добавляли по 185 мкл цитратно-фосфатного буфера, рН 6,0 и 15 мкл 1,075% перекиси водорода в воде и 15 мкл 1,72% о-фенилендиамина (ОФД). Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного анализитора ClarioStar (BMG LABTECH, Ортенберг, Германия) при длине волны 450 нм. С использованием данного метода была выполнена детекция ФИТЦ с пределом обнаружения 0.1 мкг/мл.

Сущность изобретения поясняется чертежами фиг. 1-6.

На фиг. 1 представлены: СЭМ-изображения СНП; шкалы: 1 мкм (а), 2 мкм (б), 5 мкм (в). (г) Распределение СНП по размерам (диаметрам), полученное с помощью обработки изображений СЭМ, средний диаметр составляет 46 ± 8 нм. (д) UV-Vis-IR cпектр поглощения СНП. Образец СНП имеет два пика поглощения при длинах волн 352 и 377 нм, вызванные свойством локализованного поверхностного плазмонного резонанса синтезированных наночастиц.

На фиг. 2 представлены: (а) Изображения цветной реакции окисления различных субстратов – ТМБ, ОФД и ДАБ H₂O₂ с СНП (слева направо, СНП без субстрата, СНП в присутствии TMB, ОФД и ДАБ). (б) Пероксидазоподобная активность СНП зависит от концентрации H₂O₂ в линейном диапазоне на 3 порядка. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

На фиг. 3 представлена рН-зависимая ферментоподобная активность СНП. (а) Пероксидазоподобная активность СНП зависит от pH и концентрации СНП. (б) Поглощение OPD, окисленного H₂O₂ с СНП, с поправкой на исходный уровень поглощения (поглощение СНП). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

На фиг. 4 представлена схема и результаты использования СНП в качестве оптических меток для анализа в формате иммунохроматографии, в частности, продемонстрировано взаимодействие антител, связывающих флуоресцеинизотиоционат (ФИТЦ) с серебряными нанопроволоками, покрытыми белком-носителем с флуоресцеинизотиоционатом. (а) Схема анализа. (б) Интенсивность флуоресценции исходных серебряных нанопроволок СНП и серебряных нанопроволок СНП, модифицированных флуоресцеинизотиоционатом, ФИТЦ. Анализ проведён методом флуоресцентной спектроскопии при длине волны возбуждения = 492 нм, и длине волны испускания флуоресценции = 518 нм. (c) Репрезентативные изображения иммунохроматографического анализа на нитроцеллюлозной мембране: отрицательный контроль (без антител против ФИТЦ) и положительный анализ с визуализацией тест-полоски результаты.

На фиг. 5 представлена схема и результаты обнаружения витамина – фолиевой кислоты с помощью СНП в качестве оптических меток в анализе латерального потока. (а) Схема анализа. Белковый носитель (БСА), конъюгированный с фолиевой кислотой (ФК), наносят на поверхность иммунохроматографической тест-полоски. Затем полоску погружают в раствор, содержащий исследуемый образец, к которому добавляют СНП, конъюгированные с анти-ФК IgG. Когда концентрация ФК достаточно высока, она блокирует антитела на СНП, и СНП не связываются с белком-носителем на тест-полоске. Когда концентрация ФК низкая, СНП связываются с белком-носителем. Благодаря свойству локализованного поверхностного плазмонного резонанса СНП обладают цветом и поэтому являются эффективными оптическими метками, образуя окрашенную полосу в случае связывания в зависимости от концентрации CAP. (б) Результат иммунологического анализа. Интенсивность полосообразования на тесте полосы обратно пропорциональна концентрации фолиевой кислоты: чем выше концентрация ФК, тем ниже сигнал.

На фиг. 6 представлена схема обнаружения низкомолекулярных аналитов (например, флуоресцеинизотиоционат, ФИТЦ) с использованием пероксидазоподобных свойств СНП в формате иммуноферментного анализа. (а) Схема анализа. Белковый носитель (БСА), конъюгированный с аналитом (ФИТЦ), адсорбирован на твердой фазе – поверхности 96-луночного планшета. Далее на поверхность наносят СНП, конъюгированные с анти-ФИТЦ IgG, и смешивают с тестируемым образцом. Когда концентрация ФИТЦ достаточно высока, он блокирует антитела на СНП, и СНП не связываются с белком-носителем. Когда концентрация ФИТЦ низкая, СНП связываются с белком-носителем. После добавления хромогенного субстрата появляется окраска раствора из-за пероксидазоподобных свойств СНП. Измерение оптической плотности раствора позволяет отслеживать концентрацию ФИТЦ.

Изобретение относится к области клинической диагностики. Раскрыт способ детекции аналита в образце, включающий по крайней мере следующие стадии: i) иммобилизация на поверхности твердой фазы рецептора против упомянутого аналита или молекулярного комплекса, включающего в себя аналог упомянутого аналита, ii) инкубирование с упомянутой твердой фазой упомянутого образца, iii) инкубирование с упомянутой твердой фазой суспензии серебряных нанопроволок, конъюгированных с антителом против упомянутого аналита, iv) удаление из образца несвязавшихся серебряных нанопроволок, v) инкубирование с упомянутой твердой фазой раствора перекиси водорода и хромогенного субстрата, выбранного из группы: тетраметилбензидин, о-фенилендиамин, диаминобензидин; vi) измерение оптической плотности для определения содержания упомянутого аналита в упомянутом образце по калибровочной кривой. Изобретение обеспечивает более простое и более доступное измерение содержания аналита в образце без использования дорогостоящего оборудования с возможностью амплификации сигнала за счет каталитической активности наночастиц, а также в использовании в качестве регистрируемых меток наноматериалов, позволяющих масштабно их синтезировать и отличающихся стабильностью при хранении. 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 пр.

1. Способ детекции аналита в образце, включающий по крайней мере следующие стадии:

i) иммобилизация на поверхности твердой фазы рецептора против упомянутого аналита или молекулярного комплекса, включающего в себя аналог упомянутого аналита,

ii) инкубирование с упомянутой твердой фазой упомянутого образца,

iii) инкубирование с упомянутой твердой фазой суспензии серебряных нанопроволок, конъюгированных с антителом против упомянутого аналита,

iv) удаление из образца несвязавшихся серебряных нанопроволок,

v) инкубирование с упомянутой твердой фазой раствора перекиси водорода и хромогенного субстрата, выбранного из группы: тетраметилбензидин, о-фенилендиамин, диаминобензидин;

vi) измерение оптической плотности для определения содержания упомянутого аналита в упомянутом образце по калибровочной кривой.

2. Способ по п.1, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют длину от 1 до 15 мкм.

3. Способ по п.1, в котором упомянутые серебряные нанопроволоки имеют диаметр от 10 до 100 нм.

4. Способ по п.1, в котором упомянутое инкубирование проводят от 1 до 150 мин.

5. Способ по п.1, в котором упомянутое инкубирование проводят при температуре от 4 до 30 градусов цельсия.

6. Способ по п.1, в котором упомянутая калибровочная кривая измеряется параллельно для образцов с известным содержанием молекул упомянутого аналита.

7. Способ по п.1, в котором концентрация перекиси водорода в упомянутом растворе составляет от 0.2 до 300 мкмоль/литр.

8. Способ по п.1, в котором концентрация упомянутого хромогенного субстрата в упомянутом растворе составляет от 1 до 10 ммоль/литре.

9. Способ по п.1, в котором концентрация упомянутых серебряных нанопроволок в упомянутом растворе составляет от 10 до 100 мг/литре.

10. Способ по п.1, в котором упомянутое измерение оптической плотности упомянутого раствора проводят на длине волны от 450 до 530 нм.

11. Способ по п.1, в котором упомянутый аналит является малой молекулой.

12. Способ по п.1, в котором упомянутый аналит является белком.

13. Способ по п.1, в котором упомянутый аналит является нуклеиновой кислотой.

14. Способ по п.1, в котором упомянутая твердая фаза является многолуночным планшетом.

15. Способ по п.1, в котором упомянутая твердая фаза является тест-полоской.

16. Способ по п.15, в котором упомянутая тест-полоска содержит в себе нитроцеллюлозную мембрану.

17. Способ по п.1, в котором упомянутое измерение оптической плотности осуществляют при помощи оптических методов регистрации.

18. Способ по п.15, в котором детектирование количества задержавшихся на тест-линии упомянутой тест-полоски наночастиц упомянутых серебряных нанопроволок осуществляют в течении менее чем 20 минут после начала анализа.

19. Способ по п.1, в котором упомянутое антитело моноклональное.

20. Способ по п.1, в котором упомянутое антитело поликлональное.