СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ НАНОЧАСТИЦ БЕРЛИНСКОЙ ЛАЗУРИ И ИЗГОТОВЛЕНИЯ СЕНСОРОВ НА ИХ ОСНОВЕ Российский патент 2024 года по МПК C01G53/00 C09D5/00 C01G49/00 C01C3/12 B82Y40/00 

Область техники

Изобретение относится к аналитической химии, электрохимическим методам анализа, нанотехнологиям, сенсорам и тест-системам и может быть использовано для иммуноферментного анализа в качестве каталитической метки для замены природного фермента пероксидазы или для хроноамперометрического определения пероксида водорода в медицинской диагностике, промышленности и экологическом мониторинге. Создание биосенсорных систем на основе изобретения также позволит применять его в целях неинвазивной диагностики (определение глюкозы и лактата).

Уровень техники

Наночастицы Берлинской лазури представляют собой наноматериал, обладающий множеством уникальных свойств, таких как биосовместимость, легкость модификации, контролируемость структуры и селективная каталитическая активность в реакции восстановления пероксида водорода. В медицине наночастицы Берлинской лазури применяются в качестве диагностических и терапевтических препаратов, в том числе как контрастные вещества в магнитно-резонансной томографии, как адсорбент при отравлении ионами цезия и таллия и как антибактериальные средства [М.А. Busquets and J. Estelrich, Prussian blue nanoparticles: synthesis, surface modification, and biomedical applications // Drug Discovery Today, 2020, vol. 25(8) pp. 1431-1443]. Применение функционализированных наночастиц Берлинской лазури для лечения рака запатентовано в 2016 году Детским Национальным Медицинским Центром США [R. Fernandes et al., Functionalized prussian blue nanoparticles, combination prussian blue nanoparticle-based nano-immunotherapy and applications thereof // US 20200163899 А1].

Другим важным вариантом применения наночастиц Берлинской лазури является замена природного фермента пероксидазы в иммуноанализе и при конструировании электрохимичсеких (био)сенсоров. Использование пероксидазы осложнено особыми условиями хранения фермента и его неустойчивостью. Наиболее близким к заявляемому решению можно считать предложенную в 2018 году методику синтеза наночастиц Берлинской лазури в оптимальных условиях [М.А. Komkova et al., Catalytically Synthesized Prussian Blue Nanoparticles Defeating Natural Enzyme Peroxidase // Journal of the American Chemical Society, 2018, vol. 140(36) pp. 11302-11307.]. Полученные по данной методике наночастицы превосходят природный фермент пероксидазу не только по стабильности, но и по каталитической активности и при этом не уступают в специфичности катализа реакции восстановления пероксида водорода.

Однако все перечисленные варианты применения наночастиц ограничиваются низкой стабильностью Берлинской лазури в нейтральных и слабощелочных средах, что необходимо при работе с биологическими жидкостями. В большинстве работ увеличение стабильности наночастиц достигается заключением их в полимерные матрицы, однако такая стабилизация сужает круг возможных применений наночастиц. В работе [С. Lete t al., Sinusoidal voltage electrodeposition of PEDOT-Prussian blue nanoparticles composite and its application to amperometric sensing of H2O2 in human blood // Materials Science and Engineering, 2019, vol. 102 pp. 661-669] образование композита Берлинская лазурь -этилендиокситиофен (ПЭДОТ) происходит под действием синусоидального напряжения. Для более равномерного распределения наночастиц в композите применяется лимонная кислота. Сенсоры для определения пероксида водорода, полученные на основе такого композита демонстрируют некоторое увеличение стабильности и устойчивость к загрязнению в биологических жидкостях, но линейный диапазон определяемых концентраций снижается почти на порядок. Кроме ПЭДОТ могут применяться такие полимеры как поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), полиаллиламин гидрохлорид (ПАА), полидиаллилдиметилдиаммоний хлорид (полиДАДМАХ) и полистиролсульфонат (ПСС). Однако синтез композитных покрытий представляет собой трудоемкую и многостадийную процедуру, часто мешает дальнейшей модификации наночастиц и требует использования токсичных растворителей.

Один из лучших способов стабилизации пленок Берлинской лазури подразумевает послойное осаждение более устойчивого гексацианоферрата никеля на поверхность Берлинской лазури. Его применение было продемонстрировано в работе [E.V. Karpova, et al., Iron-nickel hexacyanoferrate bilayer as an advanced electrocatalyst for H2O2 reduction // Rsc Advances, 2016, vol. 6(105) pp. 103328-103331] и позднее запатентовано [E.B. Карпова и др., Способ изготовления высокостабильного покрытия сенсора на пероксид водорода // RU 2018142226]. При использовании наночастиц изоструктурность гексацианоферратов переходных металлов позволяет осуществлять контролируемое осаждение солей с образованием структуры «ядро-оболочка». Возможность получения структур «ядро-оболочка» для аналогов Берлинской лазури была показана в работе [M.F. Dumont et al., Photoinduced Magnetism in Core/Shell Prussian Blue Analogue Heterostructures of KjNik[Cr(CN)6]l⋅nH2O with RbaCob[Fe(CN)6]c⋅mH2O // Inorganic Chemistry, 2011, vol. 50(10) pp. 4295-4300], предложенный синтез занимает несколько десятков часов, требует применение сложного оборудования и растворителей. Аналогичная возможность и возможность адсорбции наночастиц на поверхности продемонстрированы в заявке [Т. Kawamoto et al., Method of producing structural member having prussian blue-type metal complex nanoparticles, structural member obtained by the method, substrate, electrochromic device, rectifying device, and photo responding device, using the structural member // US 2011/0268963] однако данный способ ограничивается стабилизацией адсорбированных наночастиц, что не позволяет использовать их в виде суспензии.

Упрощение процедуры стабилизации возможно с применением гексаметафосфата натрия, который успешно применяется для формирования структуры «ядро-оболочка» для различных солей и поддержания размеров индивидуальных наночастиц гексацианоферрата никеля как в работе [N. Bagkar et al., Synthesis of surfactant encapsulated nickel hexacyanoferrate nanoparticles and deposition of their Langmuir-Blodgett film // Journal of Materials Chemistry, 2004, vol. 14(9), pp. 1430-1436].

Раскрытие изобретения

Техническая проблема, решаемая посредствам заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам, в частности низкой стабильности в растворах с рН больше 5, сложности процедуры стабилизации и ограниченности применения ввиду использования не биосовместимых реагентов. Проблема решается за счет разработки способа контролируемого (временем реакции и концентрациями реагентов) осаждения стабилизирующего покрытия гексацианоферрата никеля на поверхность каталитически синтезированных наночастиц Берлинской лазури с образованием структуры «ядро-оболочка».

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, главным образом заключается в расширении рабочего диапазона рН в нейтральную и слабощелочную область (до 7,4) с незначительным снижением каталитической активности наночастиц. Так, каталитическая константа стабилизированных наночастиц в реакции восстановления пероксида водорода с пирогаллолом всего в 2-2,5 (в зависимости от размера) раза меньше, чем для нестабилизированных наночастиц и при этом и в 25 раз больше активности природной пероксидазы хрена. Изобретение допускает использование стабилизированных наночастиц как в виде суспензии, так и в иммобилизованном на поверхности электрода состоянии. Технический результат был достигнут путем проведения оптимизации параметров синтеза стабилизирующего покрытия и применения гексаметафосфата натрия для стабилизации размеров наночастиц. Использование гексацианоферрата никеля в качестве стабилизирующего слоя позволяет избегать применения токсичных органических растворителей, что необходимо при стабилизации полимерами, кроме того, полимерные стабилизирующие матрицы ограничивают области применения наночастиц, поскольку чаще всего, образуют иммобилизованный композит, непригодный для применения в растворе.

Поставленная задача решается тем, что, согласно техническому решению, заявляемый способ стабилизации наночастиц Берлинской лазури осуществляется с помощью контролируемого осаждения гексацианоферрата никеля на поверхность наночастиц, последующего промывания суспензии от избытка реагентов и диспергировании наночастиц в растворе гексаметафосфата натрия. Варьирование условий синтеза позволяет получать стабилизированные наночастицы с различным гидродинамическим диаметром, подтверждаемым методом динамического светорассеяния, показывающие различную устойчивость к солюбилизации в нейтральных и слабощелочных средах. Использование гексаметафосфата натрия не влияет на каталитические и электрохимические свойства наночастиц. Также поставленная задача решается посредствам иммобилизации стабилизированных наночастиц на поверхности рабочего углеродсодержащего электрода, с последующей термической обработкой. Функционирование получаемых сенсоров достигается путем подключения их к потенциостату и установке на рабочем электроде потенциала 0,0 В (отн. Ag/AgCl электрода сравнения). При погружении сенсора в раствор, содержащий пероксид водорода, регистрируется изменение токового сигнала, обусловленное каталитическим процессом восстановления пероксида водорода. Для получения градуировочной зависимости сенсор помещают в буферный раствор и записывают фоновый сигнал, после чего постепенно вводят пробы с известной концентрацией пероксида водорода, при этом градуировочный график строят в координатах плотности тока от концентрации вводимого пероксида водорода.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими фигурами.

На фиг. 1 приведена зависимость гидродинамического диаметра стабилизированных наночастиц от концентрации соли K₃[Fe(CN)₆] в ростовой смеси при синтезе стабилизирующей оболочки. Значения гидродинамического диаметра получены при помощи метода динамического светорассеяния.

На фиг. 2 приведены распределения по размерам стабилизированных наночастиц, полученные при помощи метода динамического светорассеяния и аппроксимированные в соответствии с логарифмически нормальным распределением. Составы ростовых смесей при синтезе стабилизирующих оболочек 0,6 мМ K₃[Fe(CN)₆], 1,0 мМ NiCl₂ и 1,2 мМ K₃[Fe(CN)₆], 2,0 мМ NiCl₂.

На фиг. 3 представлены зависимости оптических плотностей суспензий нестабилизированных (1) и стабилизированных (2, 3) наночастиц от времени, полученных спектрофотометрически при длине волны 700 нм (максимум поглощения Берлинской лазури) в цитрат-фосфатном буферном растворе с рН 7,4.

На фиг. 4 приведены циклические вольтамперограммы сенсоров на основе стабилизированных наночастиц с гидродинамическими диаметрами 45 и 95 нм, полученные в 0,1 М KCl в 0,1 М HCl со скоростью развертки потенциала 0,02 В⋅с^-1.

На фиг. 5 приведена зависимость плотности тока от времени при постепенном увеличении концентрации пероксида водорода, полученная с использованием сенсора на основе стабилизированных наночастиц (1) и зависимость плотности тока от времени, полученная с использованием сенсора на основе стабилизированных наночастиц при концентрации пероксида водорода 1 мМ (2). И в том, и в другом случае зависимости получены в режиме хроноамперометрии при потенциале на рабочем электроде 0,0 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения, в фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Чувствительность, определяемая как тангенс угла наклона градуировочного графика, составляет 763±18 мА⋅М^-1⋅см^-2.

Осуществление изобретения

Для реализации заявляемого способа стабилизации проводят однократное осаждение гексацианоферрата никеля на поверхность наночастиц Берлинской лазури с последующим диспергированием получаемых наночастиц в растворе гексаметафосфата натрия.

Синтез наночастиц Берлинской лазури осуществляют по упомянутой ранее методике. Используют реакционную смесь, содержащую 75 мМ FeCl₃ и 75 мМ K₃[Fe(CN)₆] в фоновом электролите 0,1 М KCl в 0,1 М HCl. Реакцию образования Берлинской лазури инициируют, добавляя 50 мМ Н₂О₂ при перемешивании в ультразвуковой ванне. Время синтеза составляет 30 секунд, по истечению которых реакционную смесь центрифугируют в течение 30 секунд при скорости не менее 13000 оборотов в минуту. Осадок наночастиц редиспергируют в фоновом электролите, после чего повторяют процедуру центрифугирования-редиспергирования 5 раз для удаления избытка реагентов.

Для синтеза стабилизирующей оболочки полученные наночастицы переносят в раствор 0,3-2,1 мМ K₃[Fe(CN)₆] в фоновом электролите 0,5 М KCl в 0,1 М HCl. При постоянном перемешивании и обработке в ультразвуковой ванне добавляют раствор NiCl₂ до достижения концентрации 0,5-3,5 мМ. При этом концентрация наночастиц Берлинской лазури составляет 5-10 нМ. Синтез проводят в течение 20 секунд, полученные суспензии центрифугируют в течение 30-60 секунд при скорости не менее 13000 оборотов в минуту. После чего удаляют надосадочную жидкость с избытком реагентов и редиспергируют осадок наночастиц в 7 мМ гексаметафосфате натрия с 0,5 М KCl и 0,1 М HCl. При необходимости, стабилизированные наночастицы хранят в виде коллоидного раствора с гексаметафосфатом натрия в фоновом электролите (рН=1,2). Концентрации солей в ростовой смеси при синтезе стабилизирующей оболочки пропорциональны итоговому гидродинамическому диаметру наночастиц что продемонстрировано на фиг. 1.

Концентрацию наночастиц определяют спектрофотометрически при длине волны 700 нм (максимум поглощения Берлинской лазури), ε=12250. Гидродинамический диаметр определяют методом динамического светорассеяния с коэффициентом преломления 1,56 и коэффициентом поглощения 0,9. Распределение по размерам аппроксимируют в соответствии с логарифмически нормальным распределением.

При изготовлении сенсоров для определения пероксида водорода заявляемым способом на поверхность рабочего электрода планарной трехэлектродной структуры наносят 2 мкл суспензии стабилизированных наночастиц (5-10 нМ). Далее электроды сушат при комнатной температуре (25°С) в течение 24 часов, после чего подвергают термической обработке при 100°С в течение 60 минут. В целях контроля качества каталитического покрытия и его насыщения ионами калия снимают циклическую вольтамперограмму в 0,1 М KCl и 0,1 М HCl в диапазоне потенциалов от -0,05 до 0,85 В в течение 3-5 циклов.

Осуществление заявляемого способа стабилизации наночастиц Берлинской лазури гексацианоферратом никеля и применение последних в качестве модифицирующего покрытия трехэлектродных планарных структур показано на следующих примерах.

Пример 1. Синтез стабилизированных наночастиц и исследование стабильности наночастиц в нейтральных рН.

Для стабилизации синтезировали наночастицы Берлинской лазури, гидродинамический диаметр которых составлял 37 нм в соответствии с аппроксимацией данных, полученных методом динамического светорассеяния. Далее на поверхность наночастиц осаждали гексацианоферрат никеля с концентрацией солей в ростовых смесях 0,6 мМ K₃[Fe(CN)₆], 1,0 мМ NiCl₂ и 1,2 мМ K₃[Fe(CN)₆], 2,0 мМ NiCl₂.

Распределения по размерам стабилизированных наночастиц, аппроксимированные в соответствии с логарифмически нормальным распределением представлены на фиг. 2. Гидродинамический диаметр стабилизированных наночастиц увеличивался пропорционально концентрации солей в реакционной смеси. Количественную характеристику суспензий наночастиц, а именно концентрацию наночастиц в суспензии, рассчитывали из спектрофотометрических данных с учетом того, что ε (БЛ,700 нм)=4.85⋅10⁴ М^-1⋅см^-1 - на элементарную ячейку, ребро элементарной ячейки а=10.2 Å и на одну ячейку приходится 4 атома железа.

Исследование стабильности полученных наночастиц проводили в цитрат-фосфатном буферном растворе с рН 7,4. Стабилизированные и нестабилизированные наночастицы помещали в стеклянные спектрофотометрические кюветы, содержащие буферный раствор, и наблюдали изменение оптической плотности. На фиг. 3 видно, что нестабилизированные наночастицы солюбилизируются в буферном растворе значительно активнее, чем наночастицы стабилизированные с использованием обоих составов ростовых смесей.

Таким образом, оболочка гексацианоферрата никеля на поверхности наночастиц Берлинской лазури улучшает эксплуатационные характеристики последних и позволяет использовать их в более широком диапазоне рН, в том числе рН соответствующим биологическим жидкостям (кровь, пот, слеза).

Пример 2. Изготовление сенсоров на пероксид водорода на основе стабилизированных наночастиц и исследование их чувствительности и стабильности.

Для изготовления сенсоров на пероксид водорода на поверхность рабочего углеродсодержащего электрода трехэлектродной планарной структуры наносили 2 мкл суспензии с концентрацией стабилизированных наночастиц 5-10 нМ (используемые концентрации солей при синтезе стабилизирующей оболочки 0,6 мМ K₃[Fe(CN)₆], 1,0 мМ NiCl₂) и выдерживали их в течение 24 часов при 25°С, после чего проводили термическую обработку в течение 1 часа при 100°С. Циклическая вольтамперограмма, полученная после охлаждения сенсоров при комнатной температуре представлена на фигуре 4. На вольтамперограмме пики при потенциале ≈0,15 В соответствуют переходу Берлинская лазурь - Берлинский белый, а при потенциале ≈0,6 В пики характерные для окисления железа внутренней сферы комплекса никеля.

Чувствительность и стабильность полученных сенсоров определяли в режиме хроноамперометрии (потенциал на рабочем электроде 0 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения), в фосфатном буферном растворе - 0,05 М KH₂PO₄/K₂HPO₄, 0,1 М KCl с рН=7,4. На фиг. 5а приведена зависимость плотности тока от концентрации пероксида водорода при постепенном увеличении концентрации последнего и при постоянном перемешивании. Под чувствительностью понимали тангенс угла наклона градуировочного графика и для данного сенсора она составляет 763 ±18 мА⋅М^-1⋅см^-2. На фиг. 5б показана зависимость плотности тока от времени для сенсоров модифицированных стабилизированными наночастицами Берлинской лазури при добавлении 1 мМ пероксида водорода при перемешивании. Как видно, сенсоры на основе стабилизированных наночастиц сохраняют 75% токового отклика в течение 15 минут в жестких для Берлинской лазури условиях (рН=7,4).

Иными словами, модификация электродов стабилизированными наночастицами Берлинской лазури позволяет получать сенсоры на пероксид водорода, характеризующиеся высокой чувствительностью и превосходящие по стабильности сенсоры на основе нестабилизированных наночастиц.

Изобретение относится к аналитической химии, электрохимическим методам анализа, нанотехнологиям, медицинской диагностике, промышленному и экологическому мониторингу и может быть использовано при изготовлении биосенсорных систем, а также каталитических меток и сенсорных покрытий для определения пероксида водорода. На поверхность наночастиц Берлинской лазури осаждают гексацианоферрат никеля с образованием структуры «ядро-оболочка», используя ростовую смесь, содержащую 0,3-2,1 мМ K₃(Fe(CN)₆] и 0,5-3,5 мМ NiCl₂, в фоновом электролите, содержащем 0,5 М KCl и 0,1 М HCl. Осаждение проводят при непрерывном перемешивании в ультразвуковой ванне в течение 20 с и концентрации наночастиц Берлинской лазури 5-50 нМ. Полученные суспензии центрифугируют 30-60 с при скорости не менее 13000 об/мин. Стабилизированные наночастицы Берлинской лазури диспергируют и хранят в виде суспензии в 7 мМ гексаметафосфате натрия в фоновом электролите, содержащем 0,5 М KCl и 0,1 М HCl, что позволяет повысить их стабильность в нейтральных средах. На поверхность углеродсодержащего электрода наносят 2 мкл суспензии указанных стабилизированных наночастиц Берлинской лазури, выдерживают на поверхности электрода в течение 24 ч, после чего проводят термическую обработку при 100°С в течение 1 ч. Изобретение обеспечивает продление срока службы полученного сенсорного покрытия углеродсодержащего электрода, предназначенного для определения пероксида водорода. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Способ стабилизации наночастиц Берлинской лазури, отличающийся тем, что на их поверхность осаждают гексацианоферрат никеля с образованием структуры «ядро-оболочка», для чего используют ростовую смесь, содержащую 0,3-2,1 мМ K₃(Fe(CN)₆] и 0,5-3,5 мМ NiCl₂, в фоновом электролите, содержащем 0,5 М KCl и 0,1 М HCl, причем осаждение проводят при непрерывном перемешивании в ультразвуковой ванне в течение 20 с и концентрации наночастиц Берлинской лазури 5-50 нМ, полученные суспензии центрифугируют 30-60 с при скорости не менее 13000 об/мин, а стабилизированные наночастицы диспергируют и хранят в виде суспензии в 7 мМ гексаметафосфате натрия в фоновом электролите, содержащем 0,5 М KCl и 0,1 М HCl.

2. Способ изготовления сенсорного покрытия электрода, предназначенного для определения пероксида водорода, включающий нанесение на его поверхность стабилизированных наночастиц Берлинской лазури, отличающийся тем, что используют углеродсодержащий электрод и 2 мкл суспензии стабилизированных наночастиц Берлинской лазури, полученных способом по п. 1, выдерживают суспензию на поверхности электрода в течение 24 ч, после чего проводят термическую обработку при 100°С в течение 1 ч.