КОНТРОЛЬ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ ВРЕДИТЕЛЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ МОЛЕКУЛ РНК Российский патент 2023 года по МПК A01H5/10 C12N15/82 C12N15/113 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] Перечень последовательностей в текстовом формате ASCII, предоставленный в соответствии с 37 C.F.R. § 1.821, под названием "81018 ST25.txt", размером 548 килобайт, созданный 27 июня 2017 года и поданный с помощью EFS-Web, представлен вместо бумажной копии. Данный перечень последовательностей тем самым включен посредством ссылки в описание данного документа для его раскрытия.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение относится, в целом, к контролю вредителей, которые вызывают повреждение сельскохозяйственных культур в ходе их пищевой активности, а конкретнее, к контролю жесткокрылых вредителей посредством композиций, содержащих молекулы интерферирующей РНК. Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям и способам применения таких композиций, содержащих молекулы интерферирующей РНК.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Виды насекомых рода Diabrotica (кукурузные корневые жуки и жуки-блошки) считаются одними из наиболее важных вредителей сельскохозяйственных культур. Например, виды кукурузного корневого жука, включая западного кукурузного корневого жука (WCR) Diabrotica virgifera virgifera; северного кукурузного корневого жука (NCR) D. barberi, южного кукурузного корневого жука (SCR) D. undecimpunctata howardi и мексиканского кукурузного корневого жука (MCR) D. virgifera zeae, являются наиболее губительными вредителями кукурузы в Северной Америке, приводящими к убыткам, составляющими по оценке более $1 миллиарда ежегодно. Западный кукурузный корневой жук также проник в Европу, и каждый год приносит ущерб, составляющий по оценке 0,5 миллиарда евро. Diabrotica speciosa (общепринятые названия включают, среди прочего, листоед, малый бразильский жук, тыквенный жук и диабротика особая) является важным вредителем кукурузы, сои и арахиса в Южной Америке.

[0004] Большая часть повреждений кукурузы вызвана питанием личинки корневого жука. Только что вышедшие из яиц личинки корневого жука находят в почве корни кукурузы и изначально начинают питаться на тонких корневых волосках и вгрызаются в кончики корня растения кукурузы. По мере роста личинок они питаются и проделывают ходы в главных корнях. Когда корневые жуки многочисленны, питание личинок и разрушение поврежденных корней возбудителями, вызывающими корневую гниль, могут приводить к тому, что корни становятся "подрезанными" у основания стебля. Тяжелое повреждение корней нарушает способность корней к транспорту воды и питательных веществ в растение, что замедляет рост растения и приводит к уменьшению продуцирования зерна. Тяжелое повреждение корней также может приводить к полеганию растений кукурузы, что делает механизированную уборку урожая более сложной или невозможной. Имаго кукурузного корневого жука питаются, главным образом, кукурузными рыльцами, пыльцой и зернами на раскрытых кончиках початков. Когда имаго кукурузного корневого жука начинают вылупляться до образования репродуктивных тканей кукурузы, тогда имаго могут питаться тканью листьев, соскабливая зеленую наружную ткань и оставляя листья, выглядящие как "витражные окна". Питание имаго рыльцами может приводить к подрезанию рылец на кончике початка, обычно называемому отсечением рылец. На кукурузном поле популяции жуков могут достигать уровня, достаточно высокого для того, чтобы вызвать массовое отсечение рылец во время выбрасывания пыльцы, что может препятствовать опылению и снижать урожайность. Таким образом, в отличие от чешуекрылых вредителей кукурузы, у которых повреждение вызывают только личиночные стадии, у кукурузного корневого жука и личиночная стадия, и стадия имаго способны наносить экономический ущерб кукурузе.

[0005] Насекомых-вредителей рода Diabrotica контролируют, главным образом, посредством интенсивного применения химических пестицидов, которые могут действовать как на личиночную стадию, так и на стадию имаго путем подавления роста насекомых, препятствования питанию или размножению, или вызывая гибель. Таким образом можно достигать надлежащего уровня контроля насекомых, но данные химические вещества иногда также могут воздействовать на других, полезных насекомых. Дополнительные проблемы возникают в зонах с интенсивным применением инсектицидов, в которых популяции кукурузных корневых жуков приобрели устойчивость к определенным инсектицидам. Это частично было ослаблено посредством различных практик управления устойчивостью, но существует растущая потребность в альтернативных средствах борьбы с вредителями.

[0006] Несколько нативных белков Cry из Bacillus thuringiensis или сконструированных белков Cry были экспрессированы в трансгенных сельскохозяйственных культурах и использовались в коммерческих целях для контроля определенных чешуекрылых и жесткокрылых насекомых-вредителей. Например, начиная с 2003 года, в США коммерчески доступны трансгенные гибриды кукурузы, которые контролируют кукурузного корневого жука посредством экспрессии белка Cry3Bb1, Cry34Ab1/Cry35Ab1 или модифицированного белка Cry3A (mCry3A) или Cry3Ab (eCry3.1Ab).

[0007] Специалисты в области промышленного семеноводства, университетские исследователи и Управление по охране окружающей среды США работали вместе над разработкой планов организационной деятельности, помогающих уменьшить возникновение устойчивости насекомых к трансгенным растениям, экспрессирующим инсектицидные белки. Планы основываются, в первую очередь, на стратегии "высокой дозы и рефугия". В случае кукурузы стратегия "высокой дозы" заключается в применении гибридов кукурузы, которые экспрессируют уровни инсектицидного белка, такого как белок Cry, достаточно высокие, чтобы уничтожать даже частично устойчивых насекомых. Гипотеза, лежащая в ее основе, заключается в том, что уничтожение частично устойчивых насекомых и предотвращение их спаривания значительно замедляет развитие устойчивости. Успех стратегии "высокой дозы" частично зависит от специфической активности инсектицидного белка в отношении конкретного вида насекомого и того, какое количество такого инсектицидного белка может экспрессироваться в трансгенном растении кукурузы. Чем выше специфическая активность инсектицидного белка в отношении вредителя, тем меньшее количество инсектицидного белка должно экспрессироваться в трансгенном растении для осуществления стратегии "высокой дозы". Например, гибриды кукурузы, экспрессирующие белок Cry, активный в отношении чешуекрылых, Cry1Ab, считаются характеризующимися высокой дозой в отношении основного целевого вредителя - кукурузного мотылька (Osthnia nubilalis). Поскольку Cry1Ab является очень токсичным для личинок кукурузного мотылька с LC50<10 нг/см² (т.е. он обладает высокой специфической активностью), уровни экспрессии Cry1Ab, которых можно достигать в трансгенных растениях, несомненно, помещают такие гибриды кукурузы в категорию "высокой дозы". Однако, в отличие от продуктов, активных в отношении чешуекрылых, существующие в настоящее время продукты, активные в отношении корневого жука, не считаются характеризующимися "высокой дозой". Белки, которые они экспрессируют, не активны в отношении имаго и характеризуются ограниченной активностью в отношении личинок старшего возраста. Следовательно, существующие в настоящее время трансгенные продукты, активные в отношении корневого жука, позволяют некоторым личинкам корневого жука выжить и превратиться в имаго.

[0008] Таким образом, экономически значимые уровни отсечения рылец имаго кукурузного корневого жука все еще могут иметь место даже на участках полей, засеянных трансгенным гибридом, устойчивым к кукурузному корневому жуку. Например, плотность популяций имаго западного кукурузного корневого жука может превышать экономически значимые уровни на участках полей, засаженных трансгенными гибридами кукурузы, устойчивыми к корневому жуку, вследствие миграции жуков, а также прямого вылупления имаго из корневой системы трансгенных растений. Было много сообщений, которые подтверждают случаи вылупления имаго западного кукурузного корневого жука у определенных трансгенных гибридов кукурузы, устойчивых к корневому жуку (Crowder et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:534-551). В другой публикации высказано предположение, что имаго западного кукурузного корневого жука будут проявлять аналогичные типы пищевого поведения при встрече с какими-либо трансгенными растениями кукурузы или нетрансгеиными растениями кукурузы в полевых условиях, и маловероятно, что определенные инсектицидные белки в трансгенных растениях будут оказывать существенное воздействие на имаго, которое могло бы оказать влияние на управление устойчивостью.

[0009] Следовательно, была бы полезна идентификация альтернативных средств для контроля насекомых с новыми механизмами действия. Особенно применимыми были бы новые средства для контроля насекомых, которые могут быть токсичными для нескольких стадий развития целевых насекомых-вредителей. Такие средства для контроля насекомых могут включать средства, которые целенаправленно воздействуют на генетические элементы, такие как гены, критически важные для роста и выживания целевых насекомых-вредителей.

[0010] РНК-интерференция (RNAi) происходит, когда организм распознает молекулы двухнитевой РНК (dsRNA) и гидролизует их. Полученные продукты гидролиза представляют собой небольшие фрагменты РНК длиной приблизительно 19-24 нуклеотидов, называемые малыми интерферирующими РНК (siRNA). Затем siRNA распространяются или разносятся по всему организму, в том числе через клеточные мембраны, где они гибридизируются с мРНК (или другими РНК) и вызывают гидролиз РНК. Интерферирующие РНК распознаются комплексом сайленсинга РНК-интерференции (RISC), в который вводится эффекторная нить (или "направляющая нить") РНК. Данная направляющая нить действует как матрица для распознавания и разрушения дуплексных последовательностей. Этот процесс повторяется каждый раз, когда siRNA гибридизируется с комплементарной ей целевой РНК, эффективно предотвращая трансляцию таких мРНК, и таким образом "сайленсингу" подвергается экспрессия специфических генов, с которых были транскрибированы мРНК. Для большинства растительных микроРНК (miRNA) показано активное спаривание оснований со своими целевыми мРНК и их направленное расщепление (Jones-Rhoades et al. (2006) Annu. Rev. Plant Biol. 57, 19-53; Llave et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13401-13406). В других случаях интерферирующие РНК могут связываться с молекулами целевых РНК, характеризующихся неполной комплементарностью, что вызывает подавление трансляции без разрушения мРНК. Большинство miRNA животных, изученных к настоящему времени, по-видимому, действуют подобным образом.

[0011] Было обнаружено, что RNAi применима для контроля насекомых в случае некоторых насекомых-вредителей. В стратегиях на основе RNAi, как правило, используют синтезированную, не встречающуюся в природе "интерферирующую РНК" или "молекулу интерферирующей РНК", которые, как правило, содержат по меньшей мере фрагмент РНК, соответствующий целевому гену, спейсерную последовательность и второй фрагмент РНК, который комплементарен первому, за счет чего может образовываться двухнитевая структура РНК. Данная не встречающаяся в природе двухнитевая РНК пользуется нативными путями RNAi у насекомого для запуска подавления экспрессии целевых генов, что может приводить к прекращению питания и/или роста и может приводить к гибели насекомого-вредителя.

[0012] Хотя из литературы известно, что стратегии RNAi, направленной на целевые гены, могут приводить к инсектицидному эффекту в отношении видов рода Diabrotica, также известно, что не каждая целевая последовательность обеспечивает нужный эффект, и что инсектицидный эффект нельзя предсказать. Подавляющееся большинство последовательностей, которые комплементарны ДНК кукурузных корневых жуков, не являются летальными для видов кукурузного корневого жука при применении в качестве dsRNA или siRNA. Например, Baum et al. ((2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326) описывают эффекты подавления некоторых целевых генов WCR посредством RNAi. Эти авторы сообщили, что 8 из 26 целевых генов, которые они тестировали, не смогли обеспечивать экспериментально значимую смертность жесткокрылых вредителей, даже при очень высокой концентрации iRNA (например, dsRNA), составляющей больше 520 нг/см². Кроме того, целевые гены, в отношении которых, как известно, молекула dsRNA обеспечивает сильный эффект RNAi у одного вида насекомых, могут не быть хорошей мишенью в случае другого вида насекомых. Whyard et al. ((2009) Insect Biochemistry and Molecular Biology 39:824-832) сообщили о почти 100-кратной разнице в эффективности при тестировании конспецифичных молекул dsRNA против гена V-АТФазы у четырех разных видов насекомых.

[0013] Существует постоянная потребность в композициях, содержащих инсектицидные активные ингредиенты, а также в способах применения таких композиций, например, для применения при защите культур или контроле болезней, опосредованных насекомыми. Необходимо, чтобы новые композиции обеспечили преодоление проблемы устойчивости к существующим инсектицидам и/или способствовали уменьшению развития устойчивости в случае подходов с применением существующих трансгенных растений. В идеале, такие композиции характеризуются высокой токсичностью и являются эффективными при пероральном поглощении целевым вредителем, а также применимы для применения в отношении как личиночной стадии, так и стадии имаго насекомого-вредителя. Таким образом, любое изобретение, которое обеспечивает композиции, в которых любое из данных свойств усилено, будет являться шагом вперед в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0014] Потребности, изложенные выше, удовлетворяются настоящим изобретением, в различных вариантах осуществления которого представлены новые способы контроля экономически важных насекомых-вредителей. Отчасти, настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии одного или нескольких целевых генов и белков у жесткокрылых насекомых-вредителей. Более конкретно, в настоящем изобретении предусмотрены способы модуляции экспрессии одного или нескольких целевых генов у видов рода Diabrotica, таких как Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), Diabrotica barberi (северный кукурузный корневой жук), Diabrotica undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), Diabrotica virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук), Diabrotica speciosa (диабротика особая) и родственные им виды, что вызывает прекращение питания, роста, развития и размножения и, в конечном итоге, приводит к гибели насекомого. Способ предусматривает введение молекулы интерферирующей РНК, содержащей двухнитевую РНК (dsRNA) или ее модифицированные формы, такие как последовательности малой интерферирующей РНК (siRNA), в клетки или во внеклеточное окружение, такое как средняя кишка, в пределах организма насекомого-вредителя, где данная dsRNA или siRNA проникает в клетки и ингибирует экспрессию по меньшей мере одного или нескольких целевых генов, и где подавление одного или нескольких целевых генов оказывает вредное воздействие на насекомого-вредителя. Молекула интерферирующей РНК не встречается в природе. Специально предусмотрено, что способы и композиции по настоящему изобретению будут применимы в ограничении или устранении заражения насекомыми-вредителями в каком-либо растении или на нем посредством обеспечения в рационе вредителя одной или нескольких композиций, содержащих молекулы интерферирующей РНК, содержащие молекулы dsRNA или siRNA. В настоящем изобретении также представлены молекулы интерферирующей РНК, которые при доставке в насекомого-вредителя подавляют, посредством токсического действия, способность насекомого-вредителя выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивают повреждение или потери сельскохозяйственных культур, связанные с насекомыми. Такую доставку можно осуществлять за счет продуцирования интерферирующей РНК в трансгенном растении, например кукурузе, или посредством местного применения композиции, содержащей интерферирующую РНК, в отношении растения или семени растения, например, растения кукурузы или семени кукурузы. Кроме того, доставку можно осуществлять за счет приведения насекомого в контакт с интерферирующей РНК, например, когда насекомое поедает растительный материал, который содержит интерферирующую РНК либо ввиду того, что растительный материал экспрессирует интерферирующую РНК за счет применения трансгенного подхода, либо ввиду того, что растительный материал покрыт композицией, содержащей интерферирующую РНК. Интерферирующую РНК также можно обеспечивать в искусственном рационе насекомого, с которым насекомое контактирует впоследствии при питании. Молекула интерферирующей РНК содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности мРНК, транскрибируемой с целевого гена, или части нуклеотидной последовательности мРНК, транскрибируемой с целевого гена насекомого-вредителя, и, следовательно, подавляет экспрессию целевого гена, что вызывает прекращение питания, роста, развития, размножения и, в конечном итоге, приводит к гибели насекомого. Кроме того, настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, молекулам нуклеиновой кислоты и рекомбинантным векторам, которые содержат или кодируют по меньшей мере фрагмент одной нити молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению. В настоящем изобретении также представлены химерные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие антисмысловую нить dsRNA из интерферирующей РНК, функционально связанную с молекулой-предшественником растительной микроРНК. В настоящем изобретении также представлены искусственные предшественники растительной микроРНК, содержащие антисмысловую нить dsRNA из интерферирующей РНК по настоящему изобретению.

[0015] Кроме того, в настоящем изобретении представлена молекула интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), где РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащий гибридизированные комплементарные нити, причем одна из этих нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена Diabrotica spp., и (i) на по меньшей мере 85% идентична фрагменту из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; или (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; или (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью; где молекула интерферирующей РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении жесткокрылого вредителя растений. В некоторых вариантах осуществления интерферирующая молекула может содержать по меньшей мере две dsRNA, где каждая dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена. В дополнительных вариантах осуществления каждая из dsRNA может содержать отдельную последовательность нуклеотидов, которая комплементарна отдельной целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена.

[0016] Кроме того, в настоящем изобретении представлены композиции, содержащие одну или несколько молекул интерферирующей РНК, содержащих две или более молекул dsRNA, где каждая из двух или более молекул РНК содержит отдельную антисмысловую нить, или содержащих две или более конструкций нуклеиновой кислоты, или молекул нуклеиновой кислоты, или искусственных предшественников растительной микроРНК по настоящему изобретению.

[0017] Кроме того, в настоящем изобретении представлена инсектицидная композицию для подавления экспрессии гена у жесткокрылого насекомого, которая содержит dsRNA по настоящему изобретению и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель. В одном варианте осуществления подавление экспрессии гена насекомого рода Diabrotica, описанное в данном документе, приводит к прекращению питания и роста и, в конечном итоге, приводит к гибели насекомого рода Diabrotica.

[0018] Настоящее изобретение дополнительно относится к трансгенным растениям, которые продуцируют одну или несколько молекул интерферирующей РНК по настоящему изобретению, характеризующимся самозащитой от повреждения, обусловленного питанием насекомого, и к способам применения растений отдельно или в сочетании с другими стратегиями контроля насекомых для обеспечения максимальных возможностей контроля насекомых. Растения и/или части растений, продуцирующие одну или несколько молекул интерферирующей РНК по настоящему изобретению, или обработанные композицией, содержащей одну или несколько молекул интерферирующей РНК по настоящему изобретению, являются высокоустойчивыми к заражению насекомыми-вредителями. Например, контроль важных в экономическом отношении жесткокрылых вредителей можно осуществлять посредством растения, которое продуцирует молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению, или посредством растения или семени растения, которые обработаны композицией, содержащей молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению.

[0019] В настоящем изобретении также представлен способ контроля жесткокрылого насекомого-вредителя растений, предусматривающий приведение жесткокрылого насекомого в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой интерферирующую РНК по настоящему изобретению для подавления экспрессии гена у жесткокрылого насекомого или которая способна обеспечить ее образование, вследствие чего обеспечивается контроль жесткокрылого насекомого.

[0020] В других аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения популяции насекомых рода Diabrotica на трансгенном растении, экспрессирующем второе инсектицидное средство, например инсектицидный белок, в дополнение к интерферирующей РНК по настоящему изобретению, способной подавлять экспрессию целевого гена у насекомого рода Diabrotica, вследствие чего осуществляется уменьшение популяции насекомых рода Diabrotica. Второе инсектицидное средство может представлять собой инсектицидный белок, полученный из Bacillus thuringiensis. Инсектицидный белок В. thuringiensis может представлять собой любой из целого ряда инсектицидных белков, в том числе без ограничения белок Cry1, белок Cry3, белок Cry7, белок Cry8, белок Cry11, белок Cry22, белок Cry23, белок Cry36, белок Cry37, белок Cry34 вместе с белком Cry35, бинарный инсектицидный белок CryET33 и CryET34, бинарный инсектицидный белок TIC100 и TIC101, бинарный инсектицидный белок PS149B1, VIP, TIC900 или родственный белок, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, модифицированный белок Cry3A, или гибридные белки, или химеры, полученные из любых предыдущих инсектицидных белков. В других вариантах осуществления инсектицидный белок В. thuringiensis выбран из группы, состоящей из Cry3Bb1, Cry34Ab1 вместе с Cry35Ab1, mCry3A и eCry3.1Ab.

[0021] В других вариантах осуществления второе инсектицидное средство может быть получено из источников, отличных от В. thuringiensis. Второе инсектицидное средство может представлять собой средство, выбранное из группы, содержащей пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, хитиназу, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела, инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp. (такой как X. nematophila или X. bovienii), инсектицидный белок Photorhabdus spp. (такой как P. luminescens или P. asymobiotica), инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysinibacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromobacterium spp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae, инсектицидный белок Clostridium spp. (такой как С. bifermentans), инсектицидный белок Alcaligenes ssp., инсектицидный белок Pseudomonas spp. и лигнин. В других вариантах осуществления второе средство может представлять собой по меньшей мере один инсектицидный белок, полученный из инсектицидного токсинового комплекса (Тс) из Photorhabdus, Xenorhabus, Serratia или Yersinia. В других вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой АДФ-рибозилтрансферазу, полученную из инсектицидной бактерии, такой как Photorhabdus spp. В других вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой белок VIP, такой как VIP1 или VIP2 из В. cereus. В еще одних вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой бинарный токсин, полученный из инсектицидной бактерии, такой как ISP1A и ISP2A из В. laterosporous или BinA и BinB из L. sphaericus. В еще одних вариантах осуществления инсектицидный белок может быть сконструированным, или может быть гибридным или химерой из любых предыдущих инсектицидных белков.

[0022] В других аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica в отношении интерферирующей РНК по настоящему изобретению, причем способ предусматривает обеспечение экспрессии в трансгенном растении, которым питается популяция насекомых рода Diabrotica, интерферирующей РНК по настоящему изобретению, способной подавлять экспрессию целевого гена у насекомого рода Diabrotica на стадии личинки и у взрослого насекомого, вследствие чего обеспечивается уменьшение развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica по сравнению с популяцией насекомых рода Diabrotica, подвергнутой воздействию интерферирующей РНК, способной подавлять экспрессию гена Diabrotica, описанного в данном документе, только на стадии личинки или у взрослого насекомого рода Diabrotica.

[0023] В других аспектах настоящее изобретение предусматривает способ снижения уровня целевой РНК, которая транскрибируется из гена Diabrotica, описываемого в настоящем документе,у насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с композицией, содержащей молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению, где молекула интерферирующей РНК снижает уровень целевой РНК в клетке насекомого рода Diabrotica.

[0024] В еще одних аспектах настоящего изобретения представлен способ придания растению или его части выносливости в отношении насекомого рода Diabrotica или выносливости в отношении жесткокрылого вредителя растений, предусматривающий введение в растение или его часть молекулы интерферирующей РНК, молекулы dsRNA, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается выносливость растения или его части в отношении насекомого рода Diabrotica или в отношении жесткокрылого вредителя растений.

[0025] В следующих аспектах настоящего изобретения представлен способ уменьшения повреждения корней у растения, которым питается насекомое рода Diabrotica, предусматривающий введение в клетки растения молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается уменьшение повреждения корней у растения, которым питается насекомое рода Diabrotica.

[0026] В других аспектах настоящего изобретения представлен способ получения трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для жесткокрылого насекомого, предусматривающий введение в растительную клетку молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается получение трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для жесткокрылого насекомого по сравнению с контрольной растительной клеткой.

[0027] В дополнительных аспектах настоящего изобретения представлен способ получения трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием жесткокрылого насекомого, предусматривающий введение в растение молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается получение трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием жесткокрылого насекомого, по сравнению с контрольным растением.

[0028] В других аспектах настоящего изобретения представлен способ повышения контроля популяции жесткокрылых насекомых, предусматривающий обеспечение трансгенного растения или трансгенного семени по настоящему изобретению и применение в отношении трансгенного растения или трансгенного семени химического пестицида, который является инсектицидным в отношении жесткокрылого насекомого, вследствие чего обеспечивается повышение контроля популяции жесткокрылых насекомых.

[0029] В других аспектах настоящего изобретения представлен способ обеспечения производителя кукурузы средствами контроля популяции жесткокрылых насекомых-вредителей, чтобы она не превышала экономически значимое пороговое значение для культуры кукурузы, предусматривающий (а) продажу трансгенного семени кукурузы, которое содержат dsRNA, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, химерную молекулу нуклеиновой кислоты, искусственную молекулу-предшественник растительной микроРНК и/или композицию по настоящему изобретению, или обеспечение производителя им; и (b) извещение производителя о том, что трансгенное семя кукурузы дает трансгенные растения кукурузы, способные обеспечивать контроль популяции жесткокрылых насекомых-вредителей.

[0030] В другом аспекте настоящего изобретения представлен способ идентификации ортологичного целевого гена для применения в качестве стратегии RNAi для контроля вредителя растений, причем указанный способ предусматривает стадии: а) получения пары праймеров, которые будут амплифицировать мишень, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 31-90, 397, 398 или их комплементарной последовательности; b) амплификации ортологичного целевого гена из образца нуклеиновой кислоты вредителя растений; с) идентификации последовательности ортологичного целевого гена; d) получения молекулы интерферирующей РНК, где РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна ортологичной целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена, и е) определения того, характеризуется ли молекула интерферирующей РНК из стадии (d) инсектицидной активностью в отношении вредителя растений. Если интерферирующая РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении целевого гена вредителя растений, то был идентифицирован ортологичный целевой ген для применения в контроле вредителя растений.

[0031] Эти и другие аспекты настоящего изобретения изложены более подробно в нижеследующем описании настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1-30 представляют собой фрагменты кодирующих последовательностей ДНК, применяемых для синтеза молекул интерферирующей РНК, чтобы осуществлять тестирование в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 31-90 и 397, 398 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты праймеров, применяемых для идентификации целевых генов из Diabrotica spp., чтобы осуществлять тестирование в отношении инсектицидной активности с применением стратегии RNAi.

SEQ ID NO: 91-120 представляют собой полные кодирующие последовательности ДНК для 30 целевых генов, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 121-150 представляют собой последовательности РНК для фрагментов кодирующих последовательностей ДНК, применяемых для синтеза молекул интерферирующей РНК, чтобы осуществлять тестирование в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 151-180 представляют собой последовательности РНК для полных кодирующих последовательностей ДНК для 30 целевых генов, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 181-210 представляют собой полные последовательности мРНК, включающие 5'- и 3'-UTR, для 30 целевых генов, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 211-240 представляют собой антисмысловые последовательности РНК для полных кодирующих последовательностей ДНК для 30 целевых генов, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 241-270 представляют собой аминокислотные последовательности белков, кодируемых 30 целевыми генами, идентифицированными в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности.

SEQ ID NO: 271-273 представляют собой кодирующие последовательности ДНК ортологов у SCR для трех выбранных целевых генов WCR, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности (ВРА_15366, BPA_71568 и BPA_16830).

SEQ ID NO: 274-276 представляют собой последовательности РНК для кодирующих последовательностей ДНК ортологов у NCR для трех выбранных целевых генов WCR, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности (ВРА_15366, ВРА_71568 и ВРА_16830).

SEQ ID NO: 277-279 представляют собой кодирующие последовательности ДНК ортологов у SCR для трех выбранных целевых генов WCR, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности (ВРА_15366, ВРА_71568 и ВРА_16830).

SEQ ID NO: 280-282 представляют собой последовательности РНК для кодирующих последовательностей ДНК ортологов у SCR для трех выбранных целевых генов WCR, идентифицированных в скрининге на основе RNAi в отношении инсектицидной активности (BPA_15366, BPA_71568 и BPA_16830).

SEQ ID NO: 283-287 и 399-400 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена ВРА_15366.

SEQ ID NO: 288-293 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена BPA_71568.

SEQ ID NO: 294-297 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена ВРА_16830.

SEQ ID NO: 298-302 и 401-402 представляют собой последовательности РНК фрагментов мРНК целевого гена BPA_15366.

SEQ ID NO: 303-308 представляют собой последовательности РНК фрагментов мРНК целевого гена ВРА_71568.

SEQ ID NO: 309-312 представляют собой последовательности РНК фрагментов мРНК целевого гена BPA_16830.

SEQ ID NO: 313-317 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена BPA_15366.

SEQ ID NO: 318-322 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена ВРА_15366, функционально связанные с последовательностью ДНК GFP.

SEQ ID NO: 323-344 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена ВРА_15366, функционально связанные на 5'- и 3'-концах последовательностью - "заполнителем" на основе ДНК GFP.

SEQ ID NO: 345-349 представляют собой последовательности РНК фрагментов мРНК целевого гена BPA_15366, функционально связанные с последовательностью РНК GFP.

SEQ ID NO: 350-371 представляют собой последовательности РНК фрагментов целевого гена BPA_15366, функционально связанные на 5'- и 3'-концах с последовательностью - "заполнителем" на основе РНК GFP.

SEQ ID NO: 372 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты кодирующей последовательности целевого гена ВРА_16372.

SEQ ID NO: 373 представляет собой последовательность РНК для SEQ ID NO: 372.

SEQ ID NO: 374 представляет собой последовательность мРНК целевого гена BPA_16372, включая 5'- и 3'-UTR.

SEQ ID NO: 375 представляет собой антисмысловые последовательности РНК для SEQ ID NO: 372.

SEQ ID NO: 376 представляет собой аминокислотную последовательность белка, кодируемого SEQ ID NO: 372.

SEQ ID NO: 377 представляет собой нуклеиновую кислоту кодирующей последовательность ортолога у NCR целевого гена ВРА_16372.

SEQ ID NO: 378 представляет собой последовательность РНК для SEQ ID NO: 377.

SEQ ID NO: 379 представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность ортолога у SCR целевого гена ВРА_16372.

SEQ ID NO: 380 представляет собой последовательность РНК для SEQ ID NO: 379.

SEQ ID NO: 381-388 представляют собой последовательности ДНК фрагментов целевого гена BPA_16372.

SEQ ID NO: 389-396 представляют собой последовательности РНК фрагментов мРНК целевого гена ВРА_16372.

SEQ ID NO: 403 представляет собой последовательность ДНК, которая кодирует РНК со шпильковой структурой для целевого гена.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0032] Ниже приводится подробное описание настоящего изобретения, предоставленного в помощь специалистам в данной области при осуществлении настоящего изобретения на практике. Не подразумевается, что настоящее описание является подробным перечнем всех различных способов, с помощью которых может быть реализовано настоящее изобретение, или всех признаков, которые можно добавить к настоящему изобретению. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одного варианта осуществления, могут быть включены в другие варианты осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретного варианта осуществления, могут быть удалены из этого варианта осуществления. Кроме того, многочисленные изменения и дополнения к различным вариантам осуществления настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области в свете настоящего раскрытия, которое не отступает от сути настоящего изобретения. Следовательно, следующие описания предназначены для иллюстрации некоторых конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, а не исчерпывающего определения всех их преобразований, комбинаций и вариаций. Рядовым специалистам в данной области будет понятно, что в вариантах осуществления, описанных в данном документе, могут быть выполнены модификации и изменения, без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.

[0033] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно рядовому специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Терминология, используемая в данном документе при описании настоящего изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничение настоящего изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

[0034] Во избежание сомнений, определенные термины, применяемые в настоящем описании, определены и представлены следующим образом.

[0035] Применяемые в данном документе формы единственного числа могут означать один или более одного. Например, "клетка" может означать одну клетку или множество клеток.

[0036] Применяемое в данном документе "и/или" относится к любой и всем возможным комбинациям одного или нескольких связанных перечисленных элементов и охватывает их, а также к отсутствию комбинаций при интерпретации в качестве альтернативы (или).

[0037] Кроме того, подразумевают, что термин "приблизительно", применяемый в данном документе в отношении измеряемой величины, такой как количество соединения или средства, доза, время, температура и т.п., охватывает вариации указанного количества на ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1%.

[0038] Применяемая в данном документе переходная фраза "состоящий главным образом из" означает, что объем пункта формулы изобретения следует интерпретировать как охватывающий указанные материалы или стадии, перечисленные в пункте формулы изобретения, а также таковые, которые существенно не влияют на основную(основные) и новую(новые) характеристику(характеристики) заявляемого изобретения. Таким образом, в случае применения термина "состоящий главным образом из" в пункте формулы настоящего изобретения, не подразумевается, что он интерпретируется как эквивалент термина "содержащий". "Кодирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в РНК, такую как мРНК, рРНК, тРНК, snRNA, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Предпочтительно РНК затем транслируется в организме с продуцированием белка.

[0039] Термины "сходство последовательностей" или "идентичность последовательностей" для нуклеотидных или аминокислотных последовательностей означают степень идентичности или сходства двух или более последовательностей, и их можно определять обычным способом с применением известного программного обеспечения или компьютерных программ, таких как программы для парного сравнения Best-Fit или Gap (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мадисон, Висконсин 53711). В BestFit используется алгоритм поиска локальной гомологии из Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), чтобы обнаружить сегмент с самыми лучшими идентичностью или сходством между двумя последовательностями. Сравнение последовательностей у двух или более полинуклеотидов или полипептидов обычно осуществляют путем сравнения частей двух последовательностей на протяжении окна сравнения для идентификации и сравнения локальных участков сходства последовательностей. Как правило, размер окна сравнения составляет от приблизительно 20 до 200 смежных нуклеотидов. Gap осуществляет глобальные выравнивания: всю одну последовательность со всей другой сходной последовательностью с применением способа из Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970). При применении программы выравнивания последовательностей, такой как BestFit, для определения степени гомологии, сходства или идентичности последовательностей ДНК можно применять установки по умолчанию, или для оптимизации оценок идентичности, сходства или гомологии можно выбрать соответствующую матрицу замен. Аналогично, при применении программы, такой как BestFit, для определения степени идентичности, сходства или гомологии последовательностей между двумя отдельными аминокислотными последовательностями можно применять установки по умолчанию, или для оптимизации оценок идентичности, сходства или гомологии можно выбрать соответствующую матрицу замен, такую как blosum45 или blosum80.

[0040] Фраза "в значительной степени идентичный" в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или двух аминокислотных последовательностей относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью по нуклеотидам или аминокислотным остаткам при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что определяют с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального осмотра. В определенных вариантах осуществления в значительной степени идентичные последовательности характеризуются по меньшей приблизительно 60%, или по меньшей мере приблизительно 70%, или по меньшей мере приблизительно 80%, или даже по меньшей мере приблизительно 90% или 95% идентичностью по нуклеотидам или аминокислотным остаткам. В определенных вариантах осуществления значительная степень идентичности существует на протяжении участка последовательностей, длина которого составляет по меньшей мере приблизительно 50 остатков, или на протяжении участка, состоящего из по меньшей мере приблизительно 100 остатков, или последовательности в значительной степени идентичны на протяжении по меньшей мере приблизительно 150 остатков. В дополнительных вариантах осуществления последовательности являются в значительной степени идентичными, когда они идентичны на протяжении всей длины кодирующих участков.

[0041] Термин "гомология" в контексте настоящего изобретения относится к уровню сходства между последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями с точки зрения идентичности или сходства нуклеотидов или аминокислот соответственно, т.е. сходства или идентичности последовательностей. Гомология, гомолог или гомологичный также относятся к представлению о сходных функциональных свойствах различных нуклеиновых кислот или белков. Гомологи включают гены, которые являются ортологичными или паралогичными. Гомологов можно определять с применением кодирующей последовательности гена, раскрытой в данном документе или находящейся в соответствующей базе данных (такой как NCBI или другие) с помощью одного или нескольких из следующих способов. В случае аминокислотной последовательности последовательности следует сравнивать с применением алгоритмов (например, см. раздел, касающийся "идентичности" или "значительной степени идентичности"). В случае нуклеотидных последовательностей последовательность одной молекулы ДНК можно сравнивать с последовательностью известного или предположительного гомолога приблизительно таким способом. Гомологи являются на по меньшей мере 20% идентичными, или на по меньшей мере 30% идентичными, или на по меньшей мере 40% идентичными, или на по меньшей мере 50% идентичными, или на по меньшей мере 60% идентичными, или на по меньшей мере 70% идентичными, или на по меньшей мере 80% идентичными, или на по меньшей мере 88% идентичными, или на по меньшей мере 90% идентичными, или на по меньшей мере 92% идентичными, или на по меньшей мере 95% идентичными в пределах любого значительного участка молекулы (молекулы ДНК, РНК или белка).

[0042] Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии из Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания областей гомологии из Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью способа поиска сходства из Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью программной реализации данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мадисон, Висконсин) или с помощью визуального осмотра (см. в общем Ausubel et al., ниже).

[0043] Одним примером алгоритма, который подходит для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul et at., J. Mol. Biol. 215. 403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST находится в открытом доступе благодаря Национальному центру биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Данный алгоритм предусматривает вначале идентификацию пар последовательностей с высоким показателем сходства (HSP) путем идентификации коротких "слов" длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому показателю Т при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговым значением показателя соседнего "слова" (Altschul et al, 1990). Эти первоначальные совпадения соседних "слов" выступают в качестве затравки, чтобы инициировать поиски для обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Совпадения "слов" затем продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться совокупный показатель выравнивания. В случае нуклеотидных последовательностей совокупные показатели рассчитывают с применением параметров М (балл-вознаграждение, начисляемый за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл, начисляемый за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для расчета совокупного показателя применяют матрицу замен. Продление совпадений "слов" в каждом направлении прекращается, когда совокупный показатель выравнивания снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения, при этом совокупный показатель падает до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными показателями, или при достижении конца одной из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используется длина "слова" (W), составляющая 11, ожидаемое значение (Е), составляющее 10, пороговое значение, составляющее 100, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. В случае аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину "слова" (W), составляющую 3, ожидаемое значение (Е), составляющее 10, а также матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 10915 (1989)).

[0044] В дополнение к расчету процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одной мерой сходства, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая является показателем того, что совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будут возникать случайным образом. Например, считается, что тестируемая последовательность нуклеиновой кислоты сходна с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой последовательности нуклеиновой кислоты с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты составляет менее приблизительно 0,1, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.

[0045] Другой широко применяемой и признанной компьютерной программой для осуществления выравниваний последовательностей является CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). Число совпадающих оснований или аминокислот делят на общее число оснований или аминокислот и умножают на 100 с получением процента идентичности. Например, если бы две последовательности из 580 пар оснований имели 145 совпавших оснований, то они были бы идентичны на 25 процентов. Если две сравниваемые последовательности имеют разную длину, то число совпадений делят на более короткую из двух длин. Например, если в белках из 200 и 400 аминокислот было 100 совпадавших аминокислот, то они идентичны на 50 процентов с учетом более короткой последовательности. Если длина более короткой последовательность составляет менее 150 оснований или 50 аминокислот, то число совпадений делят на 150 (в случае нуклеиновых оснований) или 50 (в случае аминокислот), и умножают на 100 с получением процента идентичности.

[0046] Две нуклеотидные последовательности также могут считаться в значительной степени идентичными, если две последовательности гибридизируются друг с другом при жестких условиях. В типичных вариантах осуществления две нуклеотидные последовательности, которые считаются в значительной степени идентичными, гибридизируются друг с другом при очень жестких условиях.

[0047] Термины "жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" включают указание на условия, при которых полинуклеотид будет гибридизироваться со своей целевой последовательностью на заметно более высоком уровне, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза превышающем фоновый). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при разных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые полинуклеотиды, которые на 100% комплементарны с зондом (гомологичный зонд). В качестве альтернативы, жесткие условия можно корректировать для обеспечения возможность некоторого несовпадения в последовательностях, чтобы выявлять более низкие степени сходства (гетерологичный зонд). Как правило, жесткие условия будут представлять собой условия, при которых концентрация соли составляет меньше приблизительно 1,5 М ионов Na, как правило, приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут достигаться при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором, содержащим 30-35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (вес/объем; додецилсульфат натрия), при 37°С и отмывку в 1×-2×SSC (20×SSC=3,0 М NaCl/0,3 М тринатрийцитрат) при 50-55°С. При условиях умеренной жесткости выявляют последовательности, которые характеризуются по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей. Иллюстративные условия средней жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в 0,5×-1×SSC при 55-60°С. При условиях высокой жесткости выявляют последовательности, которые характеризуются по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в 0,1×SSC при 60-65°С. Специфичность, как правило, зависит от послегибридизационных отмывок, при этом определяющими факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для отмывки. Для гибридов ДНК-ДНК Tm можно приблизительно вычислить из уравнения Meinkoth и Wahl (Anal. Biochem., 138:267-284, 1984): Tm=81,5°C+16,6 (log M)+0,41 (% GC) - 0,61 (% форм.) - 500/л; где M представляет собой молярность одновалентных катионов, % GC представляет собой процентную долю гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм, представляет собой процентную долю формамида в растворе для гибридизации, a L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Tm представляет собой температуру (при заданных ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизируется с идеально совпадающим зондом. Tm снижается приблизительно на 1°С на каждый 1% несовпадения, таким образом, Tm, условия гибридизации и/или отмывки можно регулировать, чтобы обеспечить гибридизацию с последовательностями с требуемой идентичностью. Например, если осуществляют поиск последовательностей с идентичностью приблизительно 90%, Tm можно снизить на 10°С. В целом жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были на приблизительно 5°С ниже, чем температура точки плавления (Tm) для специфической последовательности и ее комплементарной последовательности при заданных ионной силе и рН. Однако, при очень жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или отмывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура точки плавления (Tm), при умеренно жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или отмывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура точки плавления (Tm); при условиях низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или отмывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура точки плавления (Tm). Рядовые специалисты в данной области будут понимать, что вариации в жесткости растворов для гибридизации и/или отмывания по сути описаны с помощью уравнения, составов композиций для гибридизации и отмывки и требуемой Tm. Если требуемая степень несовпадения приводит к Tm, составляющей менее 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), предпочтительно повысить концентрацию SSC для того, чтобы можно было применять более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. (1993); и Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Из уровня техники известны способы жесткой гибридизации, условия которых могут быть рассчитаны с помощью средств, известных из уровня техники. Они раскрыты в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, N.Y. и Current Protocols in Molecular Biology, Ausebel et al., eds., John Wiley and Sons, Inc., 2000. Из уровня техники известны способы определения процента идентичности последовательностей, примером которых является программное обеспечение для машинного анализа последовательностей GCG (GCG, Inc, Мадисон, Висконсин).

[0048] При этом нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом при жестких условиях, являются в значительной степени идентичными, если белки, которые они кодируют, являются в значительной степени идентичными (например, вследствие вырожденности генетического кода).

[0049] Еще одним показателем того, что две нуклеиновые кислоты или белка являются в значительной степени идентичными, является то, что белок, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, характеризуется иммунологической перекрестной реактивностью с белком, кодируемым второй нуклеиновой кислотой. Таким образом, белок, как правило, является в значительной степени идентичным второму белку, например, если два белка отличаются только консервативными заменами.

[0050] Последовательность нуклеиновой кислоты является "изокодонной с" эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты, когда последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты.

[0051] Применяемые в данном документе "комплементарные" полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды, которые способны к спариванию оснований в соответствии со стандартными правилами комплементарности Уотсона-Крика. В частности, пурины будут образовывать пару оснований с пиримидинами с образованием комбинации гуанин, спаренный с цитозином (G:C), и аденин, спаренный с тимином (А:Т) в случае ДНК, или аденин, спаренный с урацилом (A:U) в случае РНК. Например, последовательность "A-G-T" связывается с комплементарной последовательностью "Т-С-А". Понятно, что два полинуклеотида могут гибридизоваться друг с другом, даже если они не являются полностью комплементарными друг другу, при условии, что каждый из них имеет по меньшей мере один участок, который в значительной степени комплементарен другому.

[0052] Термины "комплементарный" или "комплементарность" относятся к естественному связыванию полинуклеотидов при условиях содержания солей и температуре, допускающих это, путем образования пар оснований. Комплементарность между двумя однонитевыми молекулами может быть "частичной", при этом связываются только некоторые нуклеотиды, или она может быть полной, когда существует полная комплементарность между однонитевыми молекулами. Степень комплементарности между нитями нуклеиновой кислоты значительно влияет на эффективность и прочность гибридизации между нитями нуклеиновой кислоты.

[0053] Применяемые в данном документе термины "в значительной степени комплементарный" или "частично комплементарный" означают, что две последовательности нуклеиновой кислоты комплементарны на по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80% или 90% своих нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления две последовательности нуклеиновых кислот могут быть комплементарны на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более своих нуклеотидов. Термины "в значительной степени комплементарный" и "частично комплементарный" также могут означать, что две последовательности нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться при условиях высокой жесткости, и такие условия хорошо известны из уровня техники.

[0054] Применяемые в данном документе "dsRNA" или "RNAi" относятся к полирибонуклеотидной структуре, образованной за счет либо одной самокомплементарной нити РНК, либо по меньшей мере двух комплементарных нитей РНК. Степень комплементарности, иными словами % идентичности, необязательно должна составлять 100%. Скорее, она должна быть достаточной для обеспечения возможности образования двухнитевой структуры при используемых условиях. Используемый в данном документе термин "полностью комплементарный" означает, что все основания нуклеотидной последовательности в dsRNA комплементарны основаниям целевой нуклеотидной последовательности или 'соответствуют' им. Термин "по меньшей мере частично комплементарный" означает, что соответствие между основаниями dsRNA и основаниями целевой нуклеотидной последовательности составляет менее 100%. Специалисту в данной области будет понятно, что для опосредования подавления экспрессии целевого гена dsRNA должна быть лишь по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности. Из уровня техники известно, что последовательности РНК со вставками, делециями и несовпадениями относительно целевой последовательности все равно могут быть эффективными при RNAi. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы dsRNA и целевая нуклеотидная последовательность целевого гена характеризовались по меньшей мере 80% или 85% идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90% или 95% идентичностью последовательностей, или более предпочтительно по меньшей мере 97% или 98% идентичностью последовательностей, и еще более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей. В качестве альтернативы, dsRNA может содержать 1, 2 или 3 несовпадения по сравнению с целевой нуклеотидной последовательностью на протяжении длине из 24 частично комплементарных нуклеотидов. Специалисту в данной области будет понятно, что степень комплементарности между dsRNA и целевой нуклеотидной последовательностью может варьироваться в зависимости от целевого гена, подлежащего подавлению экспрессии, или в зависимости от вида насекомых-вредителей, в которых следует контролировать экспрессию генов.

[0055] Будет понятно, что dsRNA может содержать участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей, смысловая нить, содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена, или состоять из такого участка.

[0056] Целевая нуклеотидная последовательность может быть выбрана из любого подходящего участка или нуклеотидной последовательности целевого гена или его РНК-транскрипта. Например, целевая нуклеотидная последовательность может быть расположена в пределах 5'-UTR или 3'-UTR целевого гена или РНК-транскрипта или в пределах экзонных или интронных участков гена. Специалисту в данной области будут известны способы идентификации наиболее подходящих целевых нуклеотидных последовательностей в рамках полноразмерного целевого гена. Например, можно синтезировать и протестировать несколько dsRNA, целенаправленно воздействующих на отдельные участки целевого гена. В качестве альтернативы, можно применять расщепление РНК-транскрипта ферментами, такими как РНКаза Н, чтобы определить сайтов РНК, которые находятся в конформации, восприимчивых к сайленсингу генов. Целевые сайты также можно идентифицировать с применением подходов in silico, например, применение компьютерных алгоритмов, разработанных для прогнозирования эффективности сайленсинга генов на основании целенаправленного воздействия на отдельные сайты в пределах полноразмерного гена.

[0057] Предпочтительно, % идентичности полирибонуклеотида определяют с помощью анализа GAP (программа GCG) (Needleman and Wunsch, 1970) с применением параметров по умолчанию, где длина запрашиваемой последовательности составляет от по меньшей мере приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере приблизительно 21 нуклеотид. В другом варианте осуществления длина запрашиваемой последовательность составляет по меньшей мере 150 нуклеотидов, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 150 нуклеотидов. В дополнительном варианте осуществления длина запрашиваемой последовательности составляет по меньшей мере 300 нуклеотидов, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении участка, составляющего по меньшей мере 300 нуклеотидов. В еще одном варианте осуществления запрашиваемая последовательность соответствует полной длины целевой РНК, например мРНК, и анализа GAP выравнивает две последовательности на протяжении полной длины целевой РНК.

[0058] В целях удобства dsRNA можно получать из одной открытой рамки считывания в рекомбинантной клетке-хозяине, где смысловая и антисмысловая последовательности фланкированы посторонней последовательностью, которая позволяет смысловой и антисмысловой последовательностям гибридизоваться с образованием молекулы dsRNA, при этом посторонняя последовательность образует петлевую структуру. В качестве альтернативы, смысловую нить и антисмысловую нить можно получать без применения открытой рамки считывания, чтобы гарантировать, что в трансгенной клетке-хозяине не будет образовываться белок. Две нити также могут экспрессироваться раздельно в виде двух транскриптов, один из которых кодирует смысловую нить, а другой кодирует антисмысловую нить.

[0059] Формирование дуплекса РНК можно инициировать либо внутри, либо вне клетки. dsRNA может быть частично или полностью двухнитевой. РНК можно синтезировать ферментативным или химическим путем либо in vitro, либо in vivo.

[0060] dsRNA не должна быть полноразмерной относительно либо первичного продукта транскрипции, либо полностью процессированной РНК. Из уровня техники хорошо известно, что малую dsRNA длиной приблизительно 19-23 п.о. можно применять для запуска сайленсинга генов в отношении целевого гена. Как правило, для компенсации применения более короткой последовательности можно использовать более высокую идентичность. Кроме того, dsRNA может содержать однонитевые участки, а также, например, dsRNA может быть частично или полностью двухнитевой. Длина двухнитевых участков dsRNA может составлять по меньшей мере от приблизительно 19 до приблизительно 23 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 19 до приблизительно 50 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 50 до приблизительно 100 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 100 до приблизительно 200 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 200 до приблизительно 500 и необязательно последовательность составляют от приблизительно 500 до приблизительно 1000 или более пар оснований, вплоть до молекулы, которая является двухнитевой по своей полной длине, соответствующей по размеру полноразмерной целевой молекуле РНК. Bolognesi et al (2012, PLOS One, 7(10): e47534, включена в данный документ посредством ссылки) показали, что в биоанализах с искусственной питательной средой для определения биологической активности в отношении южного кукурузного корневого жука (SCR; Diabrotica undecimpunctata howardii) требуются dsRNA, размер которых превышает или приблизительно равен 60 п.о.

[0061] Mao et al (2007, Nature Biotechnology, 35(11): 1307-1313) представили трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию dsRNA против целевого гена (CYP6AE14) насекомого-вредителя (совки хлопковой, Helicoverpa armigera). Насекомые, питающиеся на трансгенном растении, характеризовались наличием в средней кишке малых РНК, размер которых составлял приблизительно 19-23 п.о., соответствующих целевому гену, при этом наблюдалось соответствующее снижение уровней транскриптов и белка CYP6AE14. Это позволяет предположить, что малые РНК были эффективны в снижении экспрессии целевого гена у насекомого-вредителя. Таким образом, малые РНК, размер которых составляет приблизительно 19 п.о., приблизительно 20 п.о., приблизительно 21 п.о., приблизительно 22 п.о., приблизительно 23 п.о., приблизительно 24 п.о., приблизительно 25 п.о., приблизительно 26 п.о., приблизительно 27 п.о., приблизительно 28 п.о., приблизительно 29 п.о. или приблизительно 30 п.о., могут быть эффективными в снижении экспрессии целевого гена у насекомого-вредителя.

[0062] В качестве альтернативы, dsRNA может содержать целевую dsRNA, состоящую из по меньшей мере 19 пар оснований, и данная целевая dsRNA может находиться в пределах последовательности "носителя" или "заполнителя" для dsRNA. Например, Bolognesi et al (2012) показали, что dsRNA из 240 п.о., содержащая целевую dsRNA, которую составляла непрерывная последовательности из 21 п.о. со 100% идентичностью с целевой последовательностью, обладала биологической активностью в биоанализах с южным кукурузным корневым жуком. В настоящей заявке проиллюстрирован подобный подход в биоанализах с западным кукурузным корневым жуком. Длина целевой dsRNA может составлять от по меньшей мере 19 до приблизительно 25 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 19 до приблизительно 50 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 50 до приблизительно 100 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 100 до приблизительно 200 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 200 до приблизительно 500 и необязательно последовательность составляют от приблизительно 500 до приблизительно 1000 или больше пар оснований. При объединении с последовательностью dsRNA-носителя общая длина целевой последовательности dsRNA и dsRNA-носителя может составлять от по меньшей мере приблизительно 50 до приблизительно 100 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 100 до приблизительно 200 пар оснований, необязательно последовательность составляют от приблизительно 200 до приблизительно 500 и необязательно последовательность составляют от приблизительно 500 до приблизительно 1000 или больше пар оснований.

[0063] dsRNA могут содержать известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки остова или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе. Примеры таких аналогов включают без ограничения фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты и 2-О-метилрибонуклеотиды.

[0064] Применяемый в данном документе термин "специфически снижает уровень целевой РНК и/или продуцирование целевого белка, кодируемого данной РНК" и его варианты относятся к последовательности части одной нити dsRNA, которая в достаточной степени идентична целевой РНК, так что присутствие dsRNA в клетке снижает стационарные уровень и/или продуцирование указанной РНК. Во многих случаях целевая РНК будет представлять собой мРНК, и присутствие dsRNA в клетке, продуцирующей мРНК, будет приводить к снижению продуцирования указанного белка. Предпочтительно данное накопление или продуцирование снижаются на по меньшей мере 10%, более предпочтительно на по меньшей мере 50%, даже более предпочтительно на по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно на по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно на 100% по сравнению с клеткой дикого типа.

[0065] Результаты подавления можно подтвердить с помощью исследования внешних свойств клетки или организма или с помощью биохимических методик, таких как без ограничения нозерн-гибридизация, обратная транскрипция, контроль экспрессии генов с помощью микрочипа, связывание с антителами, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ (RIA) и другие иммунологические анализы.

[0066] Интерферирующие РНК по настоящему изобретению могут содержать одну dsRNA или несколько dsRNA, где каждая dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена и которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии указанного целевого гена, или состоит из нее. Конкатемерные конструкции РНК данного типа описаны в WO 2006/046148, который включен в данный документ посредством ссылки. В контексте настоящего изобретения термин "несколько" означает по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре и т.д., и вплоть до по меньшей мере 10, 15, 20 или по меньшей мере 30. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК содержит несколько копий одной dsRNA, т.е. повторов dsRNA, которая связывается с конкретной целевой нуклеотидной последовательностью в пределах конкретного целевого гена. В другом варианте осуществления dsRNA в пределах интерферирующей РНК содержат отдельные последовательности нуклеотидов, комплементарных отдельным целевым нуклеотидным последовательностям, или состоят из них. Следует понимать, что комбинации нескольких копий одной и той же dsRNA, объединенные с dsRNA, связывающимися с отдельными целевыми нуклеотидными последовательностями, находятся в пределах объема настоящего изобретения.

[0067] dsRNA могут быть расположены в виде одного непрерывного участка интерферирующей РНК или могут быть разделены присутствием линкерных последовательностей. Линкерная последовательность может содержать короткую произвольную нуклеотидную последовательность, которая не комплементарна никаким целевым нуклеотидным последовательностям или целевым генам. В одном варианте осуществления линкер представляет собой саморасщепляющуюся при определенных условиях последовательность РНК, предпочтительно линкер, чувствительный к рН, или линкер, чувствительный к гидрофобным условиям. В одном варианте осуществления линкер содержит последовательность нуклеотидов, эквивалентную интронной последовательности. Длина линкерных последовательностей по настоящему изобретению может варьироваться от приблизительно 1 пары оснований до приблизительно 10000 пар оснований, при условии, что линкер не нарушает способность интерферирующей РНК подавлять экспрессию целевого(целевых) гена(генов).

[0068] В дополнение к dsRNA и любым линкерным последовательностям интерферирующая РНК по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительная последовательность выбрана из (i) последовательности, способной защитить интерферирующую РНК от РНК-процессинга, (ii) последовательности, влияющей на стабильность интерферирующей РНК, (iii) последовательности, обеспечивающей возможность связывания белков, например, для облегчения поглощения интерферирующей РНК клетками вида насекомого-вредителя, (iv) последовательности, облегчающей крупномасштабное продуцирование интерферирующей РНК, (v) последовательности, которая является аптамером, связывающимся с рецептором или молекулой на поверхности клеток насекомого-вредителя для облегчения поглощения, или (v) последовательности, которая катализирует процессинг интерферирующей РНК внутри клеток насекомого-вредителя и вследствие этого обеспечивает повышение эффективности интерферирующей РНК. Структуры для повышения стабильности молекул РНК хорошо известны из уровня техники и описаны дополнительно в WO 2006/046148, который включен в данный документ посредством ссылки.

[0069] Интерферирующая РНК может содержать основания ДНК, не встречающиеся в природе основания или не встречающиеся в природе связи остова или модификации сахарофосфатного остова, например, для улучшения стабильности при хранении или для улучшения устойчивости в отношении расщепления нуклеазами. Кроме того, специалист в данной области может получать интерферирующую РНК химическим или ферментативным образом посредством реакций, выполняемых вручную или автоматически. В качестве альтернативы, интерферирующая РНК может транскрибироваться из полинуклеотида, кодирующего ее. Таким образом, в данном документе представлен выделенный полинуклеотид, кодирующий любую из интерферирующих РНК по настоящему изобретению.

[0070] МикроРНК (miRNA) представляют собой РНК, не кодирующие белок, как правило, длиной от приблизительно 18 до приблизительно 25 нуклеотидов (у растений их длина обычно составляет приблизительно 20-24 нуклеотидов). Такие miRNA, находясь в транс-положении, управляют расщеплением целевых транскриптов, отрицательно регулируя экспрессию генов, вовлеченных в различные пути регуляции и развития (Bartel, Cell, 116:281-297 (2004); Zhang et al. Dev. Biol. 289:3-16 (2006)). Таким образом, было показано, что miRNA вовлечены в различные аспекты роста и развития растений, а также в трансдукцию сигналов и разрушение белка. Кроме того, малые эндогенные мРНК, включая miRNA, также могут быть вовлечены в ответы на биотический стресс, такой как воздействие патогенов. С момента открытия первых miRNA в растениях (Reinhart et al. Genes Dev. 16:1616-1626 (2002), Park et al. Curr. Biol. 12:1484-1495 (2002)) было идентифицировано их много сотен. Кроме того, было показано, что многие растительные miRNA являются чрезвычайно консервативными у очень дивергентных таксонов. (Floyd et al. Nature 428:485-486 (2004); Zhang et al. Plant J. 46:243-259 (2006)). Множество генов, кодирующих микроРНК (гены MIR), было идентифицировано, и они находятся в открытом доступе в базе данных (miRBase, доступна через всемирную сеть Интернет). Также miRNA описаны в патентных публикациях США 2005/0120415 и 2005/144669 А1, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

[0071] Гены, кодирующие miRNA, обеспечивают образование первичных miRNA (называемых "pri-miRNA") длиной от 70 до 300 пар оснований, которые могут формировать несовершенные структуры "стебель-петля". Одна pri-miRNA может содержать от одного до нескольких предшественников miRNA. У животных pri-miRNA подвергаются процессингу в ядре до более коротких шпильковых РНК, длиной приблизительно 65 нуклеотидов (pre-miRNA), с помощью фермента РНКазы III Drosha и его кофактора DGCR8/Pasha. Затем pre-miRNA экспортируется в цитоплазму, где она далее подвергается процессингу с помощью другого фермента РНКазы III, Dicer, с высвобождением дуплекса miRNA/miRNA* размером приблизительно 22 нуклеотида. В отличие от животных у растений процессинг pri-miRNA в зрелые miRNA полностью происходит в ядре с помощью одного фермента РНКазы III, DCL1 (Dicer-подобный 1). (Zhu. Proc. Natl. Acad. Sci. 105:9851-9852 (2008)). Доступно множество обзоров биогенеза и функционирования микроРНК, например, см. Battel Cell 116:281-297 (2004), Murchison et al. Curr. Opin. Cell Biol. 16:223-229 (2004), Dugas et al. Curr. Opin. Plant Biol. 7:512-520 (2004), и Kim Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:376-385 (2005).

[0072] Термин "молекула-предшественник растительной микроРНК", применяемое в данном документе, описывает последовательность малой (~70-300 нуклеотидов) некодирующей РНК, которая процессируется под действием растительных ферментов с получением продукта из ~19-24 нуклеотидов, известного как зрелая последовательность микроРНК. Зрелые последовательности выполняют регуляторные функции вследствие комплементарности с матричной РНК (мРНК). Термин "искусственная молекула-предшественник растительной микроРНК" описывает последовательность предшественника некодирующей miRNA перед процессингом, которую используют в качестве последовательности-остова для доставки молекулы siRNA при замещении эндогенного нативного дуплекса miRNA/miRNA* молекулы-предшественника miRNA на дуплекс из ненативной, гетерологичной miRNA (amiRNA/amiRNA*; например, siRNA/siRNA*), которая затем процессируется в зрелую последовательность miRNA с последовательностью siRNA.

[0073] В контексте настоящего изобретения термин "токсичный", применяемый для описания dsRNA по настоящему изобретению, означает, что молекулы dsRNA по настоящему изобретению и комбинации таких молекул dsRNA функционируют как перорально активные средства для контроля насекомых, оказывающие отрицательное воздействие на насекомое. Когда композиция по настоящему изобретению доставляется в организм насекомого, как правило, результатом является гибель насекомого, или насекомое не может питаться на источнике, который делает композицию доступной для насекомого. Такой композицией может быть трансгенное растение, экспрессирующее dsRNA по настоящему изобретению.

[0074] "Контроль" или "обеспечение контроля" насекомых означает подавление, посредством токсического действия, способности одного или нескольких насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться, или ограничение повреждения или потерь сельскохозяйственных культур, связанные с насекомыми. "Контроль" насекомых может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя, предпочтительно, означает уничтожение насекомых. Композиция, которая контролирует целевое насекомое, характеризуется инсектицидной активностью в отношении целевого насекомого.

[0075] "Доставлять" или "доставка" композиции или dsRNA означает, что композиция или dsRNA вступает в контакт с насекомым, что приводит к токсическому действию и контролю насекомого. Композиция или dsRNA могут доставляться с помощью множества известных путей, например, путем перорального поглощения насекомым вследствие экспрессии в трансгенном растении, с помощью составленной композиции(композиций), распыляемой композиции(композиций), матрицы с приманкой или любой другой системы доставки токсичного вещества, известной из уровня техники.

[0076] Термин "насекомое", применяемый в данном документе, включает любой организм, известный на сегодняшний день или который будет идентифицирован позже, который относится к царству Животные, типу Arthropoda, классу Insecta, включая без ограничения насекомых из отрядов Coleoptera (жуки), Lepidoptera (моли, бабочки), Diptera (мухи), Protura, Collembola (ногохвостки), Diplura, Microcoryphia (махилиды), Thysanura (щетинохвостки, чешуйницы), Ephemeroptera (поденки), Odonata (стрекозы, равнокрылые стрекозы), Orthoptera (короткоусые прямокрылые, сверчки, длинноусые прямокрылые), Phasmatodea (палочники), Grylloblattodea (тараканосверчки), Mantophasmatodea, Dermaptera (уховертки), Plecoptera (веснянки), Embioptera (эмбии), Zoraptera, Isoptera (термиты), Mantodea (богомолы), Blattodea (тараканы), Hemiptera (клопы, цикады, цикадки, тли, щитовки), Thysanoptera (трипсы), Psocoptera (книжные и древесные вши), Phthiraptera (вши; включая без ограничения подотряды Amblycera, Ischnocera и Anoplura), Neuroptera (сетчатокрылые, аскалафы, мантиспы, муравьиные львы), Hymenoptera (пчелы, муравьи, осы), Trichoptera (ручейники), Siphonaptera (блохи), Mecoptera (скорпионовые мухи), Strepsiptera (веерокрылые паразиты) и любой их комбинации.

[0077] Применяемый в данном документе термин "жесткокрылое насекомое" относится к любому представителю отряда Coleoptera, в том числе к жесткокрылым вредителям растений. Насекомые в отряде Coleoptera включают без ограничения любое жесткокрылое насекомое, известное на сегодняшний день или которое будет идентифицировано позже, включая насекомых из подотрядов Archostemata, Myxophaga, Adephaga и Polyphaga, а также любой их комбинации.

[0078] "Diabrotica" представляет собой род жуков (из отряда Coleoptera), которых обычно называют "кукурузные корневые жуки" или "жуки-блошки". Насекомые рода Diabrotica, которые являются вредителями сельскохозяйственных культур, включают без ограничения Diabrotica barberi (северный кукурузный корневой жук; NCR), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук; WCR), D. undecimpunctata howardii (южный кукурузный корневой жук; SCR), D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук; MCR) и D. speciosa. В контексте настоящего изобретения термин "кукурузный корневой жук" или "жук-блошка" являются взаимозаменяемыми с термином "Diabrotica".

[0079] Другие неограничивающие примеры жесткокрылых насекомых-вредителей в соответствии с настоящим изобретением включают Leptinotarsa spp., таких как L. decemlineata (колорадский жук); Chrysomela spp., таких как С. scripta (листоед тополевый); Hypothenemus spp., такие как Н. hampei (жук кофейный); Sitophilus spp., таких как S. zeamais (кукурузный долгоносик); Epitrix spp., таких как E. hirtipennis (жук-блошка шершавая) и Е. cucumeris (блошка картофельная); Phyllotreta spp., таких как P. cruciferae (блошка крестоцветная) и P. pusilla (западная черная блошка); Anthonomus spp., таких как A. eugenii (перечный долгоносик); Hemicrepidus spp., таких как Н. memnonius (проволочники); Melanotics spp., таких как М. communis (проволочник); Ceutorhychus spp., таких как С.assimilis (рапсовый семенной скрытнохоботник); Phyllotreta spp., таких как P. cruciferae (блошка крестоцветная); Aeolus spp., таких как A. mellillus (проволочник); Aeolus spp., таких как A. mancus (пшеничный проволочник); Horistonotus spp., таких как Н. uhlerii (песчаный проволочник); Sphenophorus spp., таких как S. maidis (долгоносик кукурузный), S. zeae (долгоносик тимофеечный), S. parvulus (мятликовый долгоносик) и S. callosus (долгоносик клубеньковый эспарцетовый); Phyllophaga spp. (личинки хрущей); Chaetocnema spp., таких как С.pulicaria (блошка стеблевая хлебная); Popillia spp., таких как P. japonica (японский жук); Epilachna spp., таких как Е. varivestis (мексиканский бобовый жук); Cerotoma spp., таких как С. trifurcate (жук-листоед); Epicauta spp., таких как Е. pestifera и Е. lemniscata (шпанские мушки); а также любую комбинацию вышеупомянутого.

[0080] "Стадии развития Diabrotica" или "стадии развития кукурузного корневого жука" означают формы развития яйцо, личинка, куколка или имаго вида из рода Diabrotica.

[0081] "Эффективное для контроля насекомых количество" означает такую концентрацию dsRNA, которая подавляет, посредством токсического действия, способность насекомых выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивает повреждения или потери сельскохозяйственных культур, связанные с насекомыми. "Эффективное для контроля насекомых количество" может означать или может не означать концентрацию, которая уничтожает насекомых, хотя, предпочтительно, означает, что она уничтожает насекомых.

[0082] Термин "агрохимически активный ингредиент" относится к химическим веществам и биологическим композициям, таким как описанные в данном документе, которые эффективны в уничтожении, предупреждении или контроле роста нежелательных вредителей, таких как растения, насекомые, мыши, микроорганизмы, водоросли, грибы, бактерии и т.п. (в частности, пестицидно активным ингредиентам). Молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению представляет собой агрохимически активный ингредиент.

[0083] "Приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель" включает вспомогательные средства, компоненты смеси, усилители и т.д., полезные с точки зрения применения активного ингредиента, такого как молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению. Подходящие носители не должны быть фитотоксичными для ценных культур, в частности при концентрациях, используемых для применения композиций в присутствии культур, и не должны вступать в химическую реакцию с соединениями активного ингредиента, описываемого в данном документе, а именно интерферирующей РНК по настоящему изобретению, или другими ингредиентами композиции. Такие смеси могут быть разработаны для непосредственного применения в отношении культур или могут представлять собой концентраты или составы, которые обычно разбавляют дополнительными носителями и вспомогательными средствами перед применением. Они могут включать инертные или активные компоненты и могут представлять собой твердые вещества, такие как, например, дусты, гранулы, диспергируемые в воде гранулы или смачиваемые порошки, или жидкости, такие как, например, эмульгируемые концентраты, растворы, эмульсии или суспензии. Подходящие сельскохозяйственные носители могут включать жидкие носители, например, воду, толуол, ксилол, лигроин, растительное масло, ацетон, метилэтилкетон, циклогексанон, трихлорэтилен, перхлорэтилен, этилацетат, амилацетат, бутилацетат, монометиловый эфир пропиленгликоля и монометиловый эфир диэтиленгликоля, метанол, этанол, изопропанол, амиловый спирт, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин и т.п. В целом, наилучшим носителем для разведения концентратов является вода. Подходящие твердые носители могут включать тальк, пирофиллитовую глину, кремнезем, аттапульгитовую глину, кизельгур, мел, диатомовую землю, известь, карбонат кальция, бентонитовую глину, фуллерову землю, шелуху семян хлопчатника, пшеничную муку, соевую муку, пемзу, древесную муку, муку из скорлупы грецкого ореха, лигнин и т.п.

[0084] В случае настоящего изобретения приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель также может включать непатогенные, аттенуированнные штаммы микроорганизмов, которые несут средство контроля насекомых, а именно молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению. В этом случае микроорганизмов, несущих интерферирующую РНК, также можно относить к средствам контроля насекомых. Микроорганизмы могут быть сконструированы для экспрессии нуклеотидной последовательности целевого гена для продуцирования молекул интерферирующей РНК, содержащих последовательности РНК, гомологичные или комплементарные последовательностям РНК, как правило, встречающимся в клетках насекомого. Воздействие микроорганизмами на насекомых приводит к поглощению микроорганизмов и подавлению экспрессии целевых генов, опосредованному непосредственно или опосредованно молекулами интерферирующей РНК или их фрагментами или производными.

[0085] В другом варианте осуществления молекулы интерферирующей РНК могут быть инкапсулированы в синтетической матрице, такой как полимер, и нанесены на поверхность хозяина, такого как растение. Поглощение насекомым клеток-хозяев обеспечивает доставку средств контроля насекомых в насекомое и приводит к подавлению экспрессии целевого гена у хозяина.

[0086] Композицию по настоящему изобретению, например, композиция, содержащая молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель, можно применять в традиционных агротехнических способах. Например, композиции по настоящему изобретению можно смешивать с водой и/или удобрениями и можно применять в отношении требуемого места произрастания/обитания до появления всходов и/или после появления всходов любым способом, как, например, с помощью распылительных баков самолетов, оросительного оборудования, распылительного оборудования непосредственного впрыскивания, ранцевых распылительных баки, бочек для купания скота, фермерского оборудования, применяемого в наземном распылении (например, штанговые распылители, ручные распылители), и т.п. Требуемое место произрастания/обитания может представлять собой почву, растения и т.п.

[0087] Композицию по настоящему изобретению можно применять в отношении семени или части растения для вегетативного размножения в любом физиологическом состоянии, в любое время между сбором семян и посевом семян; во время или после посева; и/или после прорастания. Предпочтительно, чтобы семя или часть растения для вегетативного размножения находились в достаточно устойчивом состоянии, чтобы в процессе обработки они не подвергались или подвергались минимальному повреждению, включая физическое повреждение или биологическое повреждение. Состав можно применять в отношении семян или частей растения для вегетативного размножения с применением традиционных методик и устройств для нанесения покрытия, таких как методики псевдоожиженного слоя, метод вальцовой мельницы, ротостатические протравливатели семян и барабаны для нанесения покрытий.

[0088] "Кассета экспрессии", применяемая в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, способную управлять экспрессией конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в соответствующей клетке-хозяине, содержащую промотор, функционально связанный с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с последовательностями сигнала терминации. Она также, как правило, содержит последовательности, которые требуются для надлежащей трансляции последовательности нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии, содержащая представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из ее остальных компонентов. Кассета экспрессии может также представлять собой последовательность, которая встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии. Однако, как правило, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. конкретная последовательность нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии не встречается в клетке-хозяине в естественных условиях, и ее необходимо было ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью события трансформации. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии может находиться под контролем, например, конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию, только когда клетка-хозяин подвергается воздействию некоторого конкретного внешнего стимула. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным в отношении конкретной ткани, или органа, или стадии развития.

[0089] "Ген" представляет собой определенный участок, который расположен в пределах генома и который, кроме вышеупомянутой кодирующей последовательности, содержит другие, в первую очередь регуляторные, последовательности нуклеиновой кислоты, ответственные за контроль экспрессии, иными словами транскрипции и трансляции, кодирующего участка. Ген может также, содержать другие 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и последовательности терминации. Дополнительными элементами, которые могут присутствовать, являются, например, интроны.

[0090] Применяемый в данном документе термин "производитель" означает человека или компанию, которые занимаются сельским хозяйством, выращивая живые организмы, такие как сельскохозяйственные культуры, например кукурузу, в качестве пищевых, кормовых или сырьевых материалов.

[0091] "Гетерологичная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая в природных условиях не связана с клеткой-хозяином, в которую ее вводят, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты.

[0092] "Гомологичная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, в природных условиях связанную с клеткой-хозяином, в которую ее вводят.

[0093] "Инсектицидной" называют токсичную биологическую активность, способную осуществлять контролю насекомых, предпочтительно путем их уничтожения.

[0094] "Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, или нуклеотидная последовательность, или конструкция нуклеиновой кислоты, или молекула dsRNA, или белок по настоящему изобретению обычно находится вне своего нативного окружения и, таким образом, не является природным продуктом. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или нуклеотидная последовательность, или конструкция нуклеиновой кислоты, или молекула dsRNA, или белок могут находиться в очищенной форме или могут находиться в окружении, не являющимся нативным, таком как, например, рекомбинантные хозяин или клетка-хозяин, например, трансгенное растение или клетка трансгенного растения.

[0095] В контексте настоящего изобретения число перед суффиксом "мерная" означает указанное число субъединиц. Применительно к РНК или ДНК оно означает число оснований в молекуле. Например, 19-нуклеотидная субпоследовательность мРНК с последовательностью ACUGGUCGCGUUGCAUGCU является "19-мерной".

[0096] "Растение" представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности, семенное растение.

[0097] "Растительная клетка" представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, содержащую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может быть в виде выделенной одиночной клетки или культивируемой клетки или в качестве части более высокоорганизованной единицы, такой как, например, растительная ткань, орган растения или целое растение.

[0098] "Культура растительных клеток" означает культуры единиц растения, таких как, например, протопласты, клетки в клеточной культуре, клетки в растительных тканях, пыльца, пыльцевые трубки, семязачатки, зародышевые мешки, зиготы и зародыши на различных стадиях развития.

[0099] "Растительный материал" относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, черенкам, клеточным или тканевым культурам, или к любой другой части или продукту растения.

[0100] "Орган растения" представляет собой отдельную и визуально структурированную и дифференцированную часть растения, такую как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.

[0101] "Растительная ткань", применяемая в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Включена любая ткань растения in planta или в культуре. Данный термин включает без ограничения целые растения, органы растений, семена растений, тканевую культуру и любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Применение данного термина в сочетании с любым специфическим типом растительной ткани, приведенным выше или иным образом охваченным данным определением, или без такового, не предназначено для исключения любого другого типа растительной ткани.

[0102] "Транскриптом" кукурузного корневого жука представляет собой совокупность всех или почти всех транскриптов рибонуклеиновой кислоты (РНК) в клетке кукурузного корневого жука.

[0103] "Трансформация" представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку- или организм-хозяин. В частности, "трансформация" означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

[0104] "Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный" относится к организму-хозяину, такому как бактерия или растение, в который была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты. Молекулу нуклеиновой кислоты можно стабильно интегрировать в геном хозяина, или же молекула нуклеиновой кислоты также может присутствовать в виде внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть автореплицирующейся. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но также и их трансгенное потомство. "Нетрансформированный", "нетрансгенный" или "нерекомбинантный" хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0105] Номенклатура, применяемая в данном документе для оснований ДНК или РНК и аминокислот, является такой, как изложено в 37 C.F.R. §1.822.

[0106] Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что двухнитевая РНК (dsRNA) или малые интерферирующие РНК (siRNA), сконструированные для целенаправленного воздействия на мРНК, транскрибируемую с генов Diabrotica, описываемых в данном документе, являются токсичными в отношении насекомого-вредителя рода Diabrotica, и их можно применять для контроля заражения растения насекомым рода Diabrotica или жесткокрылым и придания трансгенному растению выносливости в отношении заражения Diabrotica или жесткокрылого. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена молекула двухнитевой РНК (dsRNA), содержащая смысловую нить и антисмысловую нить, где нуклеотидная последовательность антисмысловой нити комплементарна части полинуклеотида мРНК, транскрибируемого с гена насекомого рода Diabrotica, описываемого в настоящем раскрытии, где молекула dsRNA является токсичной для насекомого рода Diabrotica или жесткокрылого вредителя растений.

[0107] Из уровня техники известно, что молекулы dsRNA, которые не являются полностью комплементарными целевой последовательности (например, характеризуются только 95% идентичностью в отношении целевого гена), эффективны для контроля жесткокрылых вредителей (см., например, Narva et al., патент США №9012722). В настоящем изобретении представлена молекула интерферирующей РНК, содержащая по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные по меньшей мере частично комплементарные нити. Одна нить dsRNA содержит последовательность, которую составляют по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов, причем данная последовательность по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена Diabrotica spp. Молекула интерферирующей РНК (i) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью, по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 86% идентичностью, по меньшей мере 87% идентичностью, по меньшей мере 88% идентичностью, по меньшей мере 89% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 91% идентичностью, по меньшей мере 92% идентичностью, по меньшей мере 93% идентичностью, по меньшей мере 94% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 96% идентичностью, по меньшей мере 97% идентичностью, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью или 100% идентичностью по отношению к фрагменту из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO:121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110 по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью, или (iv) может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 и их комплементарных последовательностей, где молекула интерферирующей РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении жесткокрылого вредителя растений.

[0108] В некоторых вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК содержит по меньшей мере две dsRNA, где каждая dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена. В некоторых вариантах осуществления каждая из dsRNA может содержать отдельную последовательность нуклеотидов, которая комплементарна отдельной целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена. В других вариантах осуществления каждая из dsRNA содержит отдельную последовательность нуклеотидов, которая комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах двух разных целевых генов.

[0109] В некоторых вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК содержит dsRNA, которая может содержать, состоять главным образом или состоять из от по меньшей мере 18 - приблизительно 25 последовательных нуклеотидов (например, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) до по меньшей мере приблизительно 300 последовательных нуклеотидов. Дополнительные нуклеотиды могут добавляться к 3'-концу, 5'-концу или как к 3'-, так и к 5'-концу для облегчения манипуляций с молекулой dsRNA, но они не оказывают существенного влияния на основные характеристики или функцию молекулы dsRNA при РНК-интерференции (RNAi).

[0110] В некоторых вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК содержит dsRNA, которая содержит антисмысловую нить, которая комплементарна по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 последовательным нуклеотидам из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности. В других вариантах осуществления часть dsRNA содержит, состоит главным образом или состоит из от по меньшей мере 19, 20 или 21 последовательных нуклеотидов до по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности.

[0111] В других вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 181-210, состоящей из N-N+20 нуклеотидов, или любой ее комплементарной последовательности. Например, молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 181, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 776 из SEQ ID NO: 181, или любой ее комплементарной последовательности. Иными словами, часть мРНК, на которую осуществляется нацеливание, содержит любую из 776 субпоследовательностей из 21 последовательного нуклеотида (т.е. 21-мерных) из SEQ ID NO: 181 или любую из их комплементарных последовательностей. Следует понимать, что эти 776 субпоследовательностей из 21 последовательного нуклеотида включают все возможные субпоследовательности из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 121 и из SEQ ID NO: 151, и их комплементарные последовательности, поскольку все из SEQ ID NO 121, 151 и 181 представляют собой одну и ту же мишень, а именно ВРА_15366. Аналогичным образом, следует понимать, что все 21-мерные субпоследовательности из SEQ ID NO: 181-210 и все их комплементарные субпоследовательности включают все возможные субпоследовательности из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 121-180 и их комплементарные субпоследовательности.

[0112] Аналогичным образом, молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 182, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 771 из SEQ ID NO: 182, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 183, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2907 из SEQ ID NO: 183, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 184, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1600 из SEQ ID NO: 184, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 185, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2410 из SEQ ID NO: 185, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 186, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2802 из SEQ ID NO: 186, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 187, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3681 из SEQ ID NO: 187, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 188, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 651 из SEQ ID NO: 188, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 189, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 673 из SEQ ID NO: 189, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 190, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2664 из SEQ ID NO: 190, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 191, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 438 из SEQ ID NO: 191, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 192, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2458 из SEQ ID NO: 192, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 193, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3254 из SEQ ID NO: 193, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 194, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3632 из SEQ ID NO: 194, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 195, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7611 из SEQ ID NO: 195, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 196, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1008 из SEQ ID NO: 196, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 197, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2992 из SEQ ID NO: 197, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 198, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1192 из SEQ ID NO: 198, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 199, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7626 из SEQ ID NO: 199, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 200, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2580 из SEQ ID NO: 200, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 201, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 4628 из SEQ ID NO: 201, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 202, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1557 из SEQ ID NO: 202, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 203, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1019 из SEQ ID NO: 203, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 204, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 677 из SEQ ID NO: 204, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 205, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 764 из SEQ ID NO: 205, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 206, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1830 из SEQ ID NO: 206, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 207, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3225 из SEQ ID NO: 207, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 208, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1003 из SEQ ID NO: 208, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 209, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1419 из SEQ ID NO: 209, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 210, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 5206 из SEQ ID NO: 210, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 374, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7112 из SEQ ID NO: 374, или любой ее комплементарной последовательности.

[0113] В еще одних вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности.

[0114] В других вариантах осуществления молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению нуклеотидная последовательность антисмысловой нити dsRNA по настоящему изобретению содержит, состоит главным образом из или состоит из нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375. В нуклеотидной последовательности антисмысловой нити dsRNA по настоящему изобретению может быть удален один нуклеотид либо на 3'-, либо на 5'-конце или могут быть добавлены вплоть до шести нуклеотидов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих в любой комбинации для достижения того, что антисмысловая нить состоит главным образом из любой 19-мерной, любой 20-мерной или любой 21-мерной нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, при этом следует понимать, что удаление одного нуклеотида или добавление вплоть до шести нуклеотидов не оказывают существенного влияния на основные характеристики или функцию молекулы двухнитевой РНК по настоящему изобретению. Такие дополнительные нуклеотиды могут представлять собой нуклеотиды, которые расширяют комплементарность антисмысловой нити вдоль целевой последовательности, и/или такие нуклеотиды могут представлять собой нуклеотиды, которые облегчают манипуляцию с молекулой РНК или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу РНК, как должно быть известно специалисту в данной области. Например, на 3'-конце может присутствовать липкий конец ТТ, который применяется для стабилизации дуплекса siRNA и не оказывает влияния на специфичность siRNA.

[0115] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антисмысловая нить двухнитевой РНК молекулы интерферирующей РНК может быть полностью комплементарной целевому полинуклеотиду РНК, или антисмысловая нить может быть в значительной степени комплементарна или частично комплементарна целевому полинуклеотиду РНК. dsRNA в молекуле интерферирующей РНК может содержать dsRNA, которая представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей в значительной степени комплементарные гибридизированные нити, или которая представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей полностью комплементарные гибридизированные нити. Под значительной степенью комплементарности или частичной комплементарностью подразумевается, что антисмысловая нить и целевой полинуклеотид РНК могут не совпадать по приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 парам нуклеотидов. Такие несовпадения могут вводиться в последовательность антисмысловой нити, например, возле 3'-конца, для улучшения процессирования молекулы двухнитевой РНК с помощью Dicer, для удвоения паттерна несовпадений в молекуле siRNA, вставленной в химерную молекулу нуклеиновой кислоты или искусственную молекулу-предшественник микроРНК по настоящему изобретению и т.п., как должно быть известно специалисту в данной области. Такая модификация будет ослаблять спаривание оснований на одном конце дуплекса и вызывать асимметрию нити, вследствие чего повышается вероятность того, что процессингу подвергнется антисмысловая нить, а не смысловая нить, и произойдет сайленсинг заданного гена (Geng and Ding "Double-mismatched siRNAs enhance selective gene silencing of a mutant ALS-causing Allelel" Acta Pharmacol. Sin. 29:211-216 (2008); Schwarz et al. "Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex" Cell 115:199-208 (2003)).

[0116] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения интерферирующая РНК содержит dsRNA, которая содержит молекулу короткой шпильковой РНК (shRNA). Экспрессия shRNA в клетках, как правило, осуществляется за счет доставки плазмид или рекомбинантных векторов, например, в трансгенные растения, такие как трансгенная кукуруза.

[0117] Настоящее изобретение охватывает конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую интерферирующую РНК по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну интерферирующую молекулу по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно охватывает конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну интерферирующую молекулу по настоящему изобретению или содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну интерферирующую молекулу по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно охватывает конструкцию нуклеиновой кислоты, где конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой вектор экспрессии. Настоящее изобретение дополнительно охватывает рекомбинантный вектор, содержащий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению. Регуляторная последовательность может относиться к промотору, энхансеру, сайту связывания фактора транскрипции, инсулятору, сайленсеру или любому другому элементу ДНК, вовлеченному в экспрессию гена.

[0118] Настоящее изобретение дополнительно охватывает химерные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие молекулу интерферирующей РНК с антисмысловой нитью dsRNA, функционально связанной с молекулой-предшественником растительной микроРНК. В некоторых вариантах осуществления химерная молекула нуклеиновой кислоты содержит антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность любой из 21-мерных субпоследовательностей из SEQ ID NO: 181-210, или любой ее комплементарной последовательности, функционально связанную с молекулой-предшественником растительной микроРНК. В некоторых вариантах осуществления молекула-предшественник растительной микроРНК представляет собой предшественник микроРНК маиса.

[0119] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает искусственную молекулу-предшественник растительной микроРНК, содержащую антисмысловую нить dsRNA из молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления искусственная молекула-предшественник растительной микроРНК содержит антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность любой из 19-мерных, 20-мерных или 21-мерных субпоследовательностей из SEQ ID NO: 211-240. Применение искусственных растительных микроРНК для доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, искусственной miRNA; siRNA/siRNA*) в растение известно из уровня техники (см., например, Schwab et al. 2006. The Plant Cell 18:1121-1133 и раздел Примеры в данном документе). В настоящем изобретении искусственные микроРНК представляют собой химерные или гибридные молекулы, которые имеют остов предшественника растительной микроРНК и вставленную в него последовательность siRNA насекомого. Как будет понятно рядовому специалисту в данной области, как правило, желательно сохранить несовпадения, которые в норме встречаются в последовательности предшественника растительной микроРНК, в любой нуклеотидной последовательности, которая подставлена в остов предшественника растительной микроРНК. В еще одних вариантах осуществления искусственный предшественник растительной микроРНК содержит части молекулы-предшественника микроРНК кукурузы. Любой предшественник микроРНК (miRNA) кукурузы подходит для композиций и способов по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры включают miR156, miR159, miR160, miR162, miR164, miR166, miR167, miR168, miR169, miR171, miR172, miR319, miR390, miR393, miR394, miR395, miR396, miR397, miR398, miR399, miR408, miR482, miR528, miR529, miR827, miR1432, а также любые другие предшественники растительных miRNA, известные в настоящее время или те, которые будут идентифицированы позднее.

[0120] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает молекулы интерферирующей РНК, конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы нуклеиновой кислоты или рекомбинантные векторы, содержащие по меньшей мере одну нить dsRNA из молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению, или содержащие химерную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, или содержащие искусственную растительную микроРНК по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой рекомбинантный вектор экспрессии.

[0121] В некоторых вариантах осуществления молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению характеризуются инсектицидной активностью в отношении насекомого рода Diabrotica. В некоторых вариантах осуществления насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из Diabrotica barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жука-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая), D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук), D. beniensis, D. cristata, D. curvipustulata, D. dissimilis, D. elegantula, D. emorsitans, D. graminea, D. hispanolae, D. lemniscata, D. linsleyi, D. milleri, D. nummularis, D. occlusa, D. porracea, D. scutellata, D. tibialis, D. trifasciata и D. viridula. В дополнительных вариантах осуществления насекомое рода Diabrotica представляет собой D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук) или D. barberi (северный кукурузный корневой жук). В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность целевого гена содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO: 91-120 и SEQ ID NO: 372.

[0122] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает композицию, содержащую одну или более, или две или более молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления молекулы интерферирующей РНК присутствуют в одной и той же конструкции нуклеиновой кислоты, в отдельных конструкциях нуклеиновой кислоты или в любой их комбинации. Например, одна молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению может присутствовать в конструкции нуклеиновой кислоты, а вторая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению может присутствовать в той же конструкции нуклеиновой кислоты или в отдельной, второй конструкции нуклеиновой кислоты. Вторая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению может соответствовать тому же целевому гену или отдельному целевому гену.

[0123] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает композицию, содержащую молекулу интерферирующей РНК, которая содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити. Одна нить dsRNA содержит последовательность, которую составляют по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов, причем данная последовательность по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена Diabrotica spp. Молекула интерферирующей РНК (i) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью, по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 86% идентичностью, по меньшей мере 87% идентичностью, по меньшей мере 88% идентичностью, по меньшей мере 89% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 91% идентичностью, по меньшей мере 92% идентичностью, по меньшей мере 93% идентичностью, по меньшей мере 94% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 96% идентичностью, по меньшей мере 97% идентичностью, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью или 100% идентичностью по отношению к фрагменту из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью, или (iv) может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 и их комплементарных последовательностей.

[0124] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает композиции, содержащие молекулу интерферирующей РНК, содержащую две или более dsRNA, где каждая из двух или более dsRNA содержит отдельную антисмысловую нить. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает композиции, содержащие по меньшей мере две или более молекулы интерферирующей РНК, где каждая из двух или более молекул интерферирующей РНК содержит dsRNA, содержащую отдельную антисмысловую нить. Две или более интерферирующих РНК могут присутствовать в одной и той же конструкции нуклеиновой кислоты, в отдельных конструкциях нуклеиновых кислот или в любой их комбинации. В других вариантах осуществления композиция содержит молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из второй нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из третьей нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из четвертой нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из пятой нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из шестой нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375, а в некоторых вариантах осуществления может дополнительно содержать молекулу РНК, содержащую антисмысловую нить, состоящую главным образом из седьмой нуклеотидной последовательности, содержащей фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 211-240 или SEQ ID NO: 375. В других вариантах осуществления композиция может содержать две или более молекулы нуклеиновой кислоты, где каждая из двух или более молекул нуклеиновой кислоты кодирует отдельную молекулу интерферирующей РНК. В других вариантах осуществления композиция может содержать две или более конструкций нуклеиновой кислоты, где каждая из двух или более конструкций нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую отдельную интерферирующую РНК.

[0125] В других вариантах осуществления композиция содержит две или более конструкций нуклеиновой кислоты, две или более молекул нуклеиновой кислоты, две или более химерных молекул нуклеиновой кислоты, два или более искусственных предшественников растительной микроРНК по настоящему изобретению, где каждая из двух или более конструкций нуклеиновой кислоты, двух или более молекул нуклеиновой кислоты, двух или более химерных молекул нуклеиновой кислоты или двух или более искусственных предшественников растительной микроРНК содержит отдельную антисмысловую нить.

[0126] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает инсектицидную композицию для подавления экспрессии гена насекомого рода Diabrotica, описанного в данном документе, которая содержит интерферирующую РНК по настоящему изобретению и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель. В некоторых вариантах осуществления приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель представляет собой трансгенный организм, экспрессирующий интерферирующую РНК по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансгенный организм может представлять собой трансгенное растение, экспрессирующее интерферирующую РНК по настоящему изобретению, так что после питания на нем целевого жесткокрылого вредителя растений происходит прекращение питания, остановка роста или размножения целевого жесткокрылого вредителя растений или целевой жесткокрылый вредитель растений гибнет.В других вариантах осуществления трансгенное растение представляет собой трансгенное растение кукурузы, а целевой вредитель представляет собой насекомого-вредителя рода Diabrotica. В еще одних вариантах осуществления насекомое-вредитель рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).

[0127] В других вариантах осуществления трансгенный организм выбран без ограничения из группы, состоящей из дрожжей, грибов, водорослей, бактерий, вируса или членистоногого, экспрессирующих молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансгенный организм представляет собой вирус, например бакуловирус насекомых, который экспрессирует молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению после инфицирования насекомого-хозяина. Такой бакуловирус, очевидно, является более вирулентным в отношении целевого насекомого по сравнению с нетрансформированным бакуловирусом дикого типа. В других вариантах осуществления трансгенный организм представляет собой трансгенную бактерию, которую применяют в отношении окружения, в котором встречается или, как известно, встречался целевой вредитель. В некоторых вариантах осуществления применяют непатогенные симбиотические бактерии, которые способны жить и реплицироваться внутри растительных тканей, так называемые эндофиты, или непатогенные симбиотические бактерии, которые способны колонизировать филлосферу или ризосферу, так называемые эпифиты. Такие бактерии включают бактерий родов Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces и Xanthomonas. Симбиотические грибы, например, родов Trichoderma и Gliocladium, также являются возможными хозяевами для экспрессии молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретения с такой же целью.

[0128] В некоторых вариантах осуществления приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель представляет собой состав, пригодный для применения композиции, содержащей молекулу интерферирующей РНК, в отношении растения или семени. В некоторых вариантах осуществления молекулы интерферирующей РНК являются стабилизированными против разрушения вследствие их двухнитевой природы и введения ингибиторов ДНКазы/РНКазы. Например, dsRNA или siRNA могут быть стабилизированы путем включения липких 3'-концов из тимидиновых или уридиновых нуклеотидов. dsRNA или siRNA, входящие в состав композиции по настоящему изобретению, можно получать путем химического синтеза в промышленном масштабе в больших количествах. Доступные способы получения будут осуществлять посредством химического синтеза или применения биологического средства.

[0129] В других вариантах осуществления состав средство, стимулирующее трансфекции. В других вариантах осуществления средство, стимулирующее трансфекцию, представляет собой липидсодержащее соединение. В дополнительных вариантах осуществления липидсодержащее соединение выбрано из группы, состоящей из липофектамина, целфектина, DMRIE-C, DOTAP и липофектина. В другом варианте осуществления липидсодержащее соединение представляет собой Tris-катионный липид.

[0130] В некоторых вариантах осуществления состав дополнительно содержит средство, конденсирующее нуклеиновые кислоты. Средство, конденсирующее нуклеиновые кислоты, может представлять собой любое такое соединение, известное из уровня техники. Примеры средств, конденсирующих нуклеиновые кислоты, включают без ограничений спермидин (N-[3-аминопропил]-1,4-бутандиамин), сульфат протамина, полилизин, а также другие положительно заряженные пептиды. В некоторых вариантах осуществления средство, конденсирующее нуклеиновые кислоты, представляет собой спермидин или сульфат протамина.

[0131] В дополнительных вариантах осуществления состав дополнительно содержит забуференный раствор сахарозы или фосфатно-солевой буфер.

[0132] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает трансгенные растения или их части, содержащие молекулу интерферирующей РНК, конструкцию нуклеиновой кислоты, химерную молекулу нуклеиновой кислоты, искусственную молекулу-предшественник растительной микроРНК и/или композицию по настоящему изобретению, где трансгенное растение характеризуется повышенной устойчивостью к жесткокрылому насекомому или насекомому рода Diabrotica по сравнению с контрольным растением. В других вариантах осуществления трансгенное растение или его часть представляет собой трансгенное растение кукурузы или его часть. Настоящее изобретение дополнительно охватывает трансгенное семя трансгенных растений по настоящему изобретению, где трансгенное семя содержит молекулу интерферирующей РНК, конструкцию нуклеиновой кислоты, химерную молекулу нуклеиновой кислоты, искусственную молекулу-предшественник растительной микроРНК и/или композицию по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления трансгенное семя представляет собой семя трансгенной кукурузы.

[0133] Трансгенные растения, экспрессирующие интерферирующую РНК по настоящему изобретению, являются выносливыми или стойкими к нападению целевых насекомых-вредителей. Когда насекомое начинает питаться на таком трансгенном растении, оно также поглощает экспрессируемые dsRNA или siRNA. Это может сдерживать насекомое от дальнейшего вгрызания в растительную ткань или даже может причинять вред насекомому или убивать его. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую dsRNA или siRNA по настоящему изобретению, вставляют в кассету экспрессии, которая затем, предпочтительно, стабильно интегрируется в геном растения. Последовательности нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии, вводимой в геном растения, являются гетерологичными по отношению к растению и не встречающимися в природе. Растения, трансформированные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть однодольными или двудольными растениями и включают без ограничения кукурузу, пшеницу, ячмень, рожь, сладкий картофель, фасоль, горох, цикорий, салат-латук, капусту, цветную капусту, брокколи, репу, редьку, шпинат, спаржу, лук, чеснок, перец, сельдерей, тыкву крупноплодную, тыкву, коноплю, цукини, яблоко, грушу, айву, дыню, сливу, вишню, персик, нектарин, абрикос, клубнику, виноград, малину, ежевику, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, томат, сорго, сахарный тростник, сахарную свеклу, подсолнечник, рапс, клевер, табак, морковь, хлопок, люцерну, рис, картофель, баклажан, огурец, арабидопсис и древесные растения, такие как хвойные и лиственные деревья. В дополнительных вариантах осуществления трансгенное растение представляет собой трансгенное растение кукурузы.

[0134] Экспрессия молекулы интерферирующей РНК в трансгенных растениях управляется регуляторными последовательностями, содержащими промоторы, которые функционируют в растениях. Выбор промотора будет меняться в зависимости от временных и пространственных требований для экспрессии, а также в зависимости от целевого вида насекомых. Таким образом, предусмотрена экспрессия интерферирующих РНК по настоящему изобретению в листьях, в черешках или стеблях, в колосьях, в соцветиях (например, колоски, метелки, початки и др.), в корнях и/или саженцах. Во многих случаях, однако, требуется защита от более чем одного типа насекомого-вредителя, и, следовательно, желательной является экспрессия в нескольких тканях. Хотя, как было показано, многие промоторы из двудольных растений функционируют у однодольных и наоборот, в идеальном случае для экспрессии в двудольных растениях выбирают промоторы двудольных, а для экспрессии в однодольных растениях выбирают промоторы однодольных. Однако не существует каких-либо ограничений в отношении происхождения выбранных промоторов, при этом достаточно того, что они являются функциональными для управления экспрессией dsRNA или siRNA в требуемой клетке.

[0135] Промоторы, применимые в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничений промоторы, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности конститутивно, промоторы, которые управляют экспрессией при индукции, и промоторы, которые управляют экспрессией тканеспецифическим образом или специфическим образом по отношению к стадии развития. Эти различные типы промоторов хорошо известны из уровня техники.

[0136] В некоторых вариантах осуществления можно применять тканеспецифические/тканепредпочтительные промоторы. Образцы тканеспецифической или тканепредпочтительной экспрессии включают без ограничения экспрессию, специфическую или предпочтительную в отношении зеленых тканей, специфическую или предпочтительную в отношении корня, специфическую или предпочтительную в отношении стебля и специфическую или предпочтительную в отношении цветка. Кроме того, можно применять промоторы, функционирующие в пластидах. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять индуцируемые промоторы. В дополнительных аспектах нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть функционально связанными с промотором, индуцируемым нанесением ранения или индуцируемым инфицированием вредителями или патогенами (например, насекомым или нематодой-вредителем растения).

[0137] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяют "минимальный промотор" или "основной промотор". Минимальный промотор может привлекать и связывать комплекс РНК-полимеразы II и ее вспомогательных белков для обеспечения инициации транскрипции и элонгации. В некоторых вариантах осуществления минимальный промотор конструируют таким образом, что он содержит только нуклеотиды/нуклеотидные последовательности из выбранного промотора, которые требуются для связывания транскрипционных факторов и транскрипции представляющей интерес нуклеотидной последовательности, которая функционально связана с минимальным промотором, включая без ограничения последовательности ТАТА-бокса. В других вариантах осуществления в минимальном промоторе отсутствуют действующие в цис-положении последовательности, которые привлекают и связывают транскрипционные факторы, которые модулируют транскрипцию (например, усиливают, подавляют, придают тканеспецифичность, придают способность к индуцированию или способность к подавлению). Минимальный промотор, как правило, помещают выше (т.е. в направлении 5') нуклеотидной последовательности, подлежащей экспрессии. Следовательно, для применения в качестве минимального промотора можно выбирать нуклеотиды/нуклеотидные последовательности из любого промотора, который можно применять в соответствии с настоящим изобретением.

[0138] В некоторых вариантах осуществления молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой "кассету экспрессии". Применяемая в данном документе "кассета экспрессии" означает молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению), где нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере контрольной последовательностью (например, промотором). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены кассеты экспрессии, сконструированные для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих dsRNA или siRNA по настоящему изобретению. Таким образом, например, в кассетах экспрессии для экспрессии в растении, части растения и/или растительной клетке кукурузы предусмотрены один или несколько растительных промоторов, функционально связанных с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению.

[0139] Кассета экспрессии, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность может быть химерной, это означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из ее остальных компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой таковую, которая содержит нативный промотор, управляющий ее нативным геном, однако, она была получена в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии. Такое использование кассеты экспрессии обеспечивает то, что она является не встречающейся в природе в клетке, в которую была введена.

[0140] Кассета экспрессии также необязательно может содержать участок терминации транскрипции и/или трансляции (т.е. участок терминации), функционирующий у растений. Разнообразные терминаторы транскрипции доступны для применения в кассетах экспрессии, и они отвечают за терминацию транскрипции за пределами представляющей интерес гетерологичной нуклеотидной последовательности и правильное полиаденилирование мРНК. Участок терминации может быть нативным по отношению к участку инициации транскрипции, может быть нативным по отношению к функционально связанной представляющей интерес нуклеотидной последовательности, может быть нативным по отношению к растению-хозяину или может быть получен из другого источника (т.е. быть чужеродным или гетерологичным по отношению к промотору, представляющей интерес нуклеотидной последовательности, растению-хозяину или любой их комбинации). Соответствующие терминаторы транскрипции включают без ограничения терминатор 35S CaMV, терминатор гена tml, терминатор гена нопалинсинтазы и/или терминатор гена rbcs-E9 гороха. Их можно применять как у однодольных, так и у двудольных растений. В дополнение, можно применять нативный терминатор транскрипции кодирующей последовательности.

[0141] Кассета экспрессии по настоящему изобретению также может включать нуклеотидную последовательность для селектируемого маркера, который можно применять для отбора трансформированного растения, части растения или растительной клетки. Применяемый в данном документе термин "селектируемый маркер" означает нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии приводит к отличительному фенотипу растения, части растения и/или растительной клетки, экспрессирующих маркер, и, таким образом, обеспечивает возможность отличать такие трансформированные растения, части растений и/или растительные клетки от тех, которые не имеют маркера. Такая нуклеотидная последовательность может кодировать либо селектируемый, либо поддающийся скринингу маркер в зависимости от того, обеспечивает ли маркер признак, по которому можно проводить отбор с помощью химических средств, например, с помощью селективного средства (например, антибиотика, гербицида и т.п.), или от того, является ли маркер просто признаком, который можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, например, путем скрининга (например, признак, определяемый R-локусом). Разумеется, существует много примеров подходящих селектируемых маркеров, которые известны из уровня техники и могут применяться в кассетах экспрессии, описанных в данном документе.

[0142] Примеры селектируемых маркеров включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую neo или nptII, которые придают устойчивость к канамицину, G418 и т.п. (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); нуклеотидную последовательность, кодирующую bar, который придает устойчивость к фосфинотрицину; нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSP), которая придает устойчивость к глифосату (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); нуклеотидную последовательность, кодирующую нитрилазу, такую как bxn от Klebsiella ozaenae, которая придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную ацетолактатсинтазу (ALS), которая придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим химическим веществам, ингибирующим ALS (европейская патентная заявка №154204); нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивую к метотрексату дигидрофолатредуктазу (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); нуклеотидную последовательность, кодирующую далапондегалогеназу, которая придает устойчивость к далапону; нуклеотидную последовательность, кодирующую маннозо-6-фосфатизомеразу (также называемую фосфоманнозоизомеразой (PMI)), которая придает способность к метаболизму маннозы (патенты США №5767378 и №5994629); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную антранилатсинтазу, которая придает устойчивость к 5-метилтриптофану; и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую hph, который придает устойчивость к гигромицину. Специалист в данной области может выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.

[0143] Кассета экспрессии по настоящему изобретению также может включать полинуклеотиды, которые кодируют другие требуемые признаки. Такие требуемые признаки могут кодироваться другими полинуклеотидами, которые придают устойчивость к насекомым, или которые придают устойчивость к нематодам, или другие признаки, являющиеся желательными с точки зрения сельского хозяйства. Такие полинуклеотиды можно "пакетировать" с любой комбинацией нуклеотидных последовательностей для создания растений, частей растений или растительных клеток, имеющих требуемый фенотип. "Пакетированные" комбинации можно создавать с помощью любого способа, включая без ограничения скрещивание растений с помощью любой традиционной методики или генетическую трансформацию. При "пакетировании" путем генетической трансформации растений нуклеотидные последовательности, кодирующие дополнительные требуемые признаки, можно объединять в любой момент времени и в любом порядке. Например, один трансген может содержаться в нескольких кассетах экспрессии, вследствие чего несколько кассет экспрессии вводятся в геном трансформируемой клетки в одно местоположение в геноме. В качестве альтернативы, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков путем последующей трансформации. Дополнительные нуклеотидные последовательности можно вводить одновременно в протоколе совместной трансформации с нуклеотидной последовательностью, молекулой нуклеиновой кислоты, конструкцией нуклеиновой кислоты и/или другой композицией по настоящему изобретению, который обеспечивается любой комбинацией кассет экспрессии. Например, если будут вводиться две нуклеотидные последовательности, то их можно встроить в отдельные кассеты (транс-положение), или их можно встроить в одну кассету (цис-положение). Экспрессией нуклеотидных последовательностей может управлять один и тот же промотор или разные промоторы. Нужно также понимать, что нуклеотидные последовательности можно "пакетировать" в требуемом местоположении в геноме с применением системы сайт-специфической рекомбинации. См., например, публикации международных заявок на патенты №№ WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853.

[0144] Таким образом, кассета экспрессии может содержать кодирующую последовательность для одного или нескольких полипептидов, обеспечивающих агрономические признаки, которые в первую очередь приносят пользу семенной компании, производителю или переработчику зерна. Представляющий интерес полипептид может представлять собой любой полипептид, кодируемый представляющей интерес полинуклеотидной последовательностью. Неограничивающие примеры представляющих интерес полипептидов, которые подходят для продуцирования в растениях, включают полипептиды, приводящие к важным с агрономической точки зрения признакам, таким как устойчивость к гербицидам (также иногда называется "выносливость в отношении гербицидов"), устойчивость к вирусам, устойчивость к патогенным бактериям, устойчивость к насекомым, устойчивость к нематодам и/или устойчивость к грибам. См., например, патенты США №№5569823; 5304730; 5495071; 6329504 и 6337431.

[0145] Векторы, пригодные для трансформации растений, описаны в другом месте в настоящем описании. Для опосредованной Agrobacterium трансформации применимы бинарные векторы или векторы, несущие по меньшей мере одну граничную последовательность Т-ДНК, тогда как для прямого переноса генов применим любой вектор, и предпочтительной может быть линейная ДНК, содержащая только представляющую интерес конструкцию. В случае прямого переноса генов можно применять трансформацию с помощью одного вида ДНК или совместную трансформацию (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Как в случае прямого переноса генов, так и в случае опосредованного Agrobacterium переноса, трансформацию обычно (но не обязательно) осуществляют с селектируемым маркером, который может обеспечивать устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или метотрексату) или гербициду (баста). Векторы трансформации растений по настоящему изобретению также могут содержать гены других селектируемых маркеров, например, ген фосфоманнозоизомеразы (pmi), который обеспечивает положительную селекцию трансгенных растений, раскрытую в патентах США №№5767378 и 5994629, включенных в данный документ посредством ссылки, или ген фосфинотрицинацетилтрансферазы (pat), которая обеспечивает выносливость в отношении гербицида фосфинотрицина (глюфосината). Выбор селективного маркера не является, однако, определяющим для настоящего изобретения.

[0146] В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению трансформируют напрямую в геном пластид. Технология трансформации пластид подробно описана в патентах США №№5451513, 5545817 и 5545818, в заявке согласно РСТ № WO 95/16783 и в McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Основная методика трансформации хлоропластов предусматривает введение участков клонированной пластидной ДНК, фланкирующих селектируемый маркер, вместе с представляющим интерес геном в подходящую целевую ткань, например, с применением биолистики или трансформации протопласта (например, трансформации, опосредованной хлоридом кальция или PEG). Фланкирующие участки размером 1-1,5 т.о., называемые нацеливающими последовательностями, содействуют гомологичной рекомбинации с геномом пластид и, таким образом, обеспечивают возможность замещения или модификации специфических участков пластома. Изначально в качестве селектируемых маркеров для трансформации используют точечные мутации в 16S рРНК и генах rps12 хлоропластов, придающие устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M., и Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Это приводило к получению стабильных гомоплазмических трансформантов с частотой, составляющей приблизительно одна трансформация на 100 бомбардировок целевых листьев. Присутствие сайтов клонирования между данными маркерами обеспечило возможность создания нацеливающегося на пластиды вектора для введения чужеродных генов (Staub, J. М., and Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Существенного повышения частоты трансформации достигали путем замещения рецессивных генов рРНК или r-белка, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, на доминантный селектируемый маркер, бактериальный ген aadA, кодирующий фермент аминогликозид-3'-аденилтрансферазу, обезвреживающий спектиномицин (Svab, Z., and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Ранее данный маркер успешно применялся для трансформации пластидного генома зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с высокой частотой (Goldschmidt-Clermont, М. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Другие селектируемые маркеры, применимые для трансформации пластид, известны из уровня техники и включены в объем настоящего изобретения. Как правило, для достижения гомопластидного состояния требуется около 15-20 циклов клеточного деления после трансформации. Экспрессия в пластидах, при которой за счет гомологической рекомбинации гены встроены во все несколько тысяч копий кольцевого генома пластид, присутствующих в каждой растительной клетке, использует преимущество огромного числа копий в сравнении с генами, экспрессируемыми в ядре, с обеспечением уровней экспрессии, которые легко могут превышать 10% от общего количества растворимого растительного белка. В предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению встроена в вектор, нацеливающийся на пластиду, и трансформируют в пластидный геном у требуемого растения-хозяина. Получают растения, гомопластические в отношении пластидных геномов, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и они предпочтительно способны к высокой экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты.

[0147] Трансгенные растения или семена, содержащие интерферирующую РНК по настоящему изобретению, также можно обрабатывать инсектицидом или инсектицидным покрытием для семян, описанным в патентах США №№5849320 и 5876739, включенных в данный документ посредством ссылки. Если и инсектицид или инсектицидное покрытие для семян, и трансгенное растение или семя по настоящему изобретению активны в отношении одного целевого насекомого, например, жесткокрылого вредителя или целевого вредителя рода Diabrotica, то данная комбинация применима (i) в способе дополнительного усиления активности композиции по настоящему изобретению в отношении целевого насекомого, а также (ii) в способе предупреждения развития устойчивости к композиции по настоящему изобретению путем обеспечения еще одного механизма действия против целевого насекомого. Таким образом, в настоящем изобретении представлен способ повышения контроля популяции насекомых рода Diabrotica, предусматривающий обеспечение трансгенного растения или семени по настоящему изобретению и применение в отношении растения или семени инсектицида или инсектицидного покрытия для семян, предназначенного для трансгенного растения или семени по настоящему изобретению. Примеры таких инсектицидов и/или инсектицидных покрытий для семян включают без ограничения карбамат, пиретроид, фосфорорганическое соединение, фрипрол, неоникотиноид, хлорорганическое соединение, нереистоксин или их комбинацию. В другом варианте осуществления инсектицид или инсектицидное покрытие для семян выбраны из группы, состоящей из карбофурана, карбарила, метомила, бифентрина, тефлутрина, перметрина, цифлутрина, лямбда-цигалотрина, циперметрина, дельтаметрина, хлорпирифоса, хлорэтоксифоса, диметоата, этопрофоса, малатиона, метил-паратиона, фората, тербуфоса, тебупиримифоса, фипронила, ацетамиприда, имидаклоприда, тиаклоприда, тиаметоксама, эндосульфана, и их комбинации. Коммерческие продукты, содержащие такие инсектициды и инсектицидные покрытия для семян, включают без ограничения Furadan® (карбофуран), Lanate® (мезомил, метомил, месомил), Sevin® (карбарил), Talstar® (бифентрин), Force® (тефлутрин), Ammo® (киперметрин), Cymbush® (циперметрин), Delta Gold® (дельтаметрин), Karate® (лямбда-циталотрин), Ambush® (перметрин), Pounce® (перметрин), Brigade® (бифентрин), Capture® (бифентрин), ProShield® (тефлутрин), Warrior® (лямбда-цигалотрин), Dursban® (хлорпирифос), Fortress® (хорэтоксифос), Мосар® (этопроп), Thimet® (форат), AAstar® (форат, флуцитинат), Rampart® (форат), Counter® (тербуфос), Cygon® (диметоат), Dicapthon, Regent® (фипронил), Cruiser® (тиаметоксам), Gaucho® (имидаклоприд), Prescribe® (имидаклоприд), Poncho® (клотианидин) и Aztec® (цифлутрин, тебупиримфос).

[0148] Композиции по настоящему изобретению также можно объединять с другими средствами биологического контроля для повышения контроля популяции жесткокрылых насекомых или популяции насекомых рода Diabrotica. Таким образом, в настоящем изобретении представлен способ повышения контроля популяции жесткокрылых насекомых или популяции насекомых рода Diabrotica путем обеспечения трансгенного растения, которое продуцирует интерферирующую РНК по настоящему изобретению и дополнительно содержит полинуклеотид, который кодирует второе инсектицидное средство. Второе инсектицидное средство может представлять собой инсектицидный белок, полученный из Bacillus thuringiensis. Инсектицидный белок В. thuringiensis может представлять собой любой из целого ряда инсектицидных белков, в том числе без ограничения белок Cry1, белок Cry3, белок Cry7, белок Cry8, белок Cry11, белок Cry22, белок Cry23, белок Cry36, белок Cry37, белок Cry34 вместе с белком Cry35, бинарный инсектицидный белок CryET33 и CryET34, бинарный инсектицидный белок TIC100 и TIC101, бинарный инсектицидный белок PS149B1, VIP, TIC900 или родственный белок, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, модифицированный белок Cry3A, или гибридные белки, или химеры, полученные из любых предыдущих инсектицидных белков. В других вариантах осуществления инсектицидный белок В. thuringiensis выбран из группы, состоящей из Cry3Bb1, Cry34Ab1 вместе с Cry35Ab1, mCry3A и eCry3.1Ab.

[0149] В других вариантах осуществления трансгенное растение может продуцировать интерферирующую РНК по настоящему изобретению и второе инсектицидной средство, полученное из источников, отличных от В. thuringiensis. Второе инсектицидное средство может представлять собой средство, выбранное из группы, содержащей пататин, протеазу, ингибитор протеазы, хитиназу, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела, инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp. (такой как Х. nematophila или Х. bovienii), инсектицидный белок Photorhabdus spp.(такой как P. luminescens или P. asymobiotica), инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysinibacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromobacterium spp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae, инсектицидный белок Clostridium spp.(такой как С. bifermentans) и лигнин. В других вариантах осуществления второе средство может представлять собой по меньшей мере один инсектицидный белок, полученный из инсектицидного токсинового комплекса (Тс) из Photorhabdus, Xenorhabus, Serratia или Yersinia. В других вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой АДФ-рибозилтрансферазу, полученную из инсектицидной бактерии, такой как Photorhabdus spp. В других вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой белок VIP, такой как VIP1 или VIP2 из В. cereus. В еще одних вариантах осуществления инсектицидный белок может представлять собой бинарный токсин, полученный из инсектицидной бактерии, такой как ISP1A и ISP2A из В. laterosporous или BinA и BinB из L. sphaericus. В еще одних вариантах осуществления инсектицидный белок может быть сконструированным, или может быть гибридным или химерой из любых предыдущих инсектицидных белков.

[0150] В другом варианте осуществления трансгенное растение и трансгенное семя представляет собой растение кукурузы или семя кукурузы. В другом варианте осуществления трансгенное растение кукурузы получают путем скрещивания первого трансгенного растения кукурузы, содержащего dsRNA по настоящему изобретению, с трансгенным растением кукурузы, содержащим трансгенный объект, выбранный из группы, состоящей из MIR604, Event 5307, DAS51922-7, MON863 и MON88017.

[0151] Даже если инсектицид или инсектицидное покрытие для семян активны в отношении другого насекомого, то инсектицид или инсектицидное покрытие для семян являются применимыми для расширения диапазона контроля насекомых, например, путем добавления инсектицида или инсектицидного покрытия для семян, которые характеризуются активностью в отношении чешуекрылых насекомых, на трансгенное растение или семя по настоящему изобретению, которые характеризуются активностью в отношении жесткокрылых насекомых, при этом обработанное растение или трансгенное семя с нанесенным покрытием контролируют как чешуекрылых, так и жесткокрылых насекомых-вредителей.

[0152] В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает биологический образец от трансгенного растения, семени или их частей по настоящему изобретению, где образец содержит нуклеиновую кислоту, которая представляет собой по меньшей мере одну нить dsRNA по настоящему изобретению или кодирует ее. В других вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает товарный продукт, полученный из трансгенного растения, семени или их частей по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления товарный продукт выбран из группы, состоящей из цельных или переработанных семян, бобов, зерен, косточек, оболочек, разновидностей муки грубого помола, круп, разновидностей муки, Сахаров, разновидностей крахмала, белковых концентратов, белковых изолятов, восков, масел, экстрактов, соков, концентратов, жидкостей, сиропов, корма, силоса, волокна, бумаги или других пищевых продуктов или продуктов, получаемых из растений. В других вариантах осуществления биологический образец или товарный продукт является токсичным для насекомых. В других вариантах осуществления трансгенное растение представляет собой трансгенное растение кукурузы.

[0153] Настоящее изобретение также охватывает способ контроля жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой интерферирующую РНК по настоящему изобретению для подавления экспрессии целевого гена у насекомого или которая способна обеспечить ее образование, вследствие чего обеспечивается контроль жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica. В некоторых вариантах осуществления целевой ген содержит кодирующую последовательность, (i) характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью, по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 86% идентичностью, по меньшей мере 87% идентичностью, по меньшей мере 88% идентичностью, по меньшей мере 89% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 91% идентичностью, по меньшей мере 92% идентичностью, по меньшей мере 93% идентичностью, по меньшей мере 94% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 96% идентичностью, по меньшей мере 97% идентичностью, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью или 100% идентичностью по отношению к фрагменту из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400; (ii) содержащую фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400; (iii) содержащую фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере а 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290, или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400, или (iv) которая может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400 и их комплементарных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность целевого гена содержит SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400. В других вариантах осуществления молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению комплементарна части полинуклеотида мРНК, транскрибируемого с целевых генов Diabrotica, описанных в данном документе.

[0154] В некоторых вариантах осуществления способа контроля жесткокрылого насекомого-вредителя или насекомого-вредителя рода Diabrotica молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая (i) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью, по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 86% идентичностью, по меньшей мере 87% идентичностью, по меньшей мере 88% идентичностью, по меньшей мере 89% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 91% идентичностью, по меньшей мере 92% идентичностью, по меньшей мере 93% идентичностью, по меньшей мере 94% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 96% идентичностью, по меньшей мере 97% идентичностью, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью или 100% идентичностью по отношению к фрагменту из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью, или (iv) может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 и их комплементарных последовательностей.

[0155] В некоторых вариантах осуществления способа контроля жесткокрылого насекомого-вредителя или насекомого-вредителя рода Diabrotica молекула интерферирующей РНК содержит, состоит главным образом из или состоит из от 18, 19, 20 или 21 смежных нуклеотидов до по меньшей мере приблизительно 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 181-210. В других вариантах осуществления интерферирующая РНК по настоящему изобретению содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 181-210, состоящей из N-N+20 нуклеотидов, или любой ее комплементарной последовательности. Например, молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 181, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 776 из SEQ ID NO: 181, или любой ее комплементарной последовательности. Иными словами, часть мРНК, на которую осуществляется нацеливание, содержит любую из 776 субпоследовательностей из 21 последовательного нуклеотида (т.е. 21-мерных) из SEQ ID NO: 181 или любую из их комплементарных последовательностей. Следует понимать, что эти 776 субпоследовательностей из 21 последовательного нуклеотида включают все возможные субпоследовательности из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 121 и из SEQ ID NO: 151, и их комплементарные последовательности, поскольку все из SEQ ID NO 121, 151 и 181 представляют собой одну и ту же мишень, а именно ВРА_15366. Аналогичным образом, следует понимать, что все 21-мерные субпоследовательности из SEQ ID NO: 181-210 и все их комплементарные субпоследовательности включают все возможные субпоследовательности из 21 последовательного нуклеотида из SEQ ID NO: 121-180 и SEQ ID NO: 373 и их комплементарные субпоследовательности.

[0156] Аналогичным образом, молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 182, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 771 из SEQ ID NO: 182, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 183, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2907 из SEQ ID NO: 183, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 184, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1600 из SEQ ID NO: 184, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 185, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2410 из SEQ ID NO: 185, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 186, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2802 из SEQ ID NO: 186, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 187, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3681 из SEQ ID NO: 187, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 188, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 651 из SEQ ID NO: 188, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 189, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 673 из SEQ ID NO: 189, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 190, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2664 из SEQ ID NO: 190, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 191, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 438 из SEQ ID NO: 191, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 192, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2458 из SEQ ID NO: 192, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 193, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3254 из SEQ ID NO: 193, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 194, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3632 из SEQ ID NO: 194, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 195, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7611 из SEQ ID NO: 195, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 196, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1008 из SEQ ID NO: 196, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 197, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2992 из SEQ ID NO: 197, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 198, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1192 из SEQ ID NO: 198, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 199, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7626 из SEQ ID NO: 199, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 200, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 2580 из SEQ ID NO: 200, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 201, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 4628 из SEQ ID NO: 201, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 202, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1557 из SEQ ID NO: 202, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 203, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1019 из SEQ ID NO: 203, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 204, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 677 из SEQ ID NO: 204, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 205, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 764 из SEQ ID NO: 205, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 206, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1830 из SEQ ID NO: 206, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 207, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 3225 из SEQ ID NO: 207, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 208, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1003 из SEQ ID NO: 208, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 209, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 1419 из SEQ ID NO: 209, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 210, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 5206 из SEQ ID NO: 210, или любой ее комплементарной последовательности. Другая молекула интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержит dsRNA, которая содержит, состоит главным образом из или состоит из любой 21-мерной субпоследовательности из SEQ ID NO: 374, где N представляет собой нуклеотид 1 - нуклеотид 7112 из SEQ ID NO: 374, или любой ее комплементарной последовательности.

[0157] В некоторых вариантах осуществления способа контроля насекомого-вредителя рода Diabrotica насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).

[0158] В других вариантах осуществления способа контроля жесткокрылого насекомого-вредителя или насекомого-вредителя рода Diabrotica приведение в контакт предусматривает (а) посев трансгенного семени, из которого можно получить трансгенное растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты, где насекомое питается трансгенным растением или его частью; или (b) применение композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, в отношении семени или растения или их части, где насекомое питается семенем, растении или их частью. В других вариантах осуществления трансгенное семя и трансгенное растение представляет собой семя кукурузы и растение кукурузы. В других вариантах осуществления семя или растение представляют собой семя кукурузы или растение кукурузы.

[0159] Настоящее изобретение также охватывает способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению или которая способна обеспечить ее образование, для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica и приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с по меньшей мере вторым инсектицидным средством для контроля Diabrotica, где указанное второе инсектицидное средство предусматривает инсектицидный белок В. thuringiensis, вследствие чего обеспечивается контроль насекомого рода Diabrotica. Настоящее изобретение также охватывает способ контроля насекомых-вредителей рода Diabrotica на растении, предусматривающий местное применение в отношении растения пестицидной композиции, содержащей интерферирующую РНК по настоящему изобретению и по меньшей мере второе инсектицидное средство для контроля Diabrotica, где указанное второе инсектицидное средство не предусматривает инсектицидный белок В. thuringiensis, и обеспечение указанного растения в рационе указанного насекомого рода Diabrotica. Настоящее изобретение также охватывает способ, где второе инсектицидное средство предусматривает пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий поры, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела или хитиназу. Второе инсектицидное средство также может представлять собой инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp., инсектицидный белок Photorhabdus spp., инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysinibacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromobacterium ssp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae или инсектицидный белок Clostridium spp.

[0160] Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения популяции взрослых жесткокрылых насекомых или популяции взрослых насекомых рода Diabrotica на трансгенном растении, экспрессирующем белок Cry, гибридный белок Cry или модифицированный белок Cry, предусматривающему обеспечение экспрессии в трансгенном растении молекулы нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или из которой можно получить интерферирующую РНК по настоящему изобретению, способную ингибировать экспрессию целевого гена, описываемого в настоящем документе, у взрослого насекомого с уменьшением тем самым популяции взрослых жесткокрылых насекомых или популяции взрослых насекомых рода Diabrotica.

[0161] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ снижения уровня целевой РНК, которая транскрибируется с целевого гена, описываемого в данном документе, у жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого в контакт с композицией, содержащей молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению, где молекула интерферирующей РНК снижает уровень целевой мРНК в клетке насекомого. В некоторых вариантах осуществления интерферирующая РНК из данного способа содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая (i) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью, по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 86% идентичностью, по меньшей мере 87% идентичностью, по меньшей мере 88% идентичностью, по меньшей мере 89% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 91% идентичностью, по меньшей мере 92% идентичностью, по меньшей мере 93% идентичностью, по меньшей мере 94% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 96% идентичностью, по меньшей мере 97% идентичностью, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью или 100% идентичностью по отношению к фрагменту из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, по меньшей мере 140, по меньшей мере 150, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170, по меньшей мере 180, по меньшей мере 190, по меньшей мере 200, по меньшей мере 210, по меньшей мере 220, по меньшей мере 230, по меньшей мере 240, по меньшей мере 250, по меньшей мере 260, по меньшей мере 270, по меньшей мере 280, по меньшей мере 290 или по меньшей мере 300 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью, или (iv) может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 и их комплементарных последовательностей, где молекула интерферирующей РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении целевого жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica. В другом варианте осуществления контакт достигается за счет питания целевого насекомого композицией. В других вариантах осуществления продуцирование белка, кодируемого целевой мРНК, снижается. В других вариантах осуществления целевой белок содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к SEQ ID NO: 241-270 или SEQ ID NO: 376. В других вариантах осуществления целевой белок содержит SEQ ID NO: 241-270 или SEQ ID NO: 376. В других вариантах осуществления интерферирующую РНК приводят в контакт с жесткокрылым насекомым или насекомым рода Diabrotica с помощью трансгенного организма, экспрессирующего интерферирующую РНК. В других вариантах осуществления трансгенный организм представляет собой трансгенное растение, трансгенный микроорганизм, трансгенную бактерию или трансгенный эндофит. В других вариантах осуществления интерферирующую РНК приводят в контакт с жесткокрылым насекомым или насекомым рода Diabrotica путем местного применения интерферирующей РНК в приемлемом с точки зрения сельского хозяйства носителе в отношении растения или части растения, которыми питается насекомое. В некоторых вариантах осуществления интерферирующая РНК, которая снижает уровень целевой мРНК, транскрибируемой с целевого гена, описанного в данном документе, обладает летальным действием в отношении жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica. В некоторых вариантах осуществления насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).

[0162] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ придания растению или его части выносливости в отношении жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение или его часть молекулы интерферирующей РНК, молекулы dsRNA, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, где молекула dsRNA, конструкция нуклеиновой кислоты, химерная молекула нуклеиновой кислоты, искусственная молекула-предшественник растительной микроРНК и/или композиция по настоящему изобретению являются токсичными для насекомого, вследствие чего обеспечивается выносливость растения или его части в отношении жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica. В других вариантах осуществления стадию введения осуществляют посредством трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. В еще одних вариантах осуществления стадию введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.

[0163] В других вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ уменьшения повреждения корней у растения, которым питается насекомое рода Diabrotica, предусматривающий введение в клетки растения молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, где dsRNA, молекула нуклеиновой кислоты, конструкция нуклеиновой кислоты, химерная молекула нуклеиновой кислоты, искусственная молекула-предшественник растительной микроРНК и/или композиция по настоящему изобретению являются токсичными для насекомого рода Diabrotica, вследствие чего обеспечивается уменьшение повреждения корней у растения. В других вариантах осуществления стадию введения осуществляют посредством трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. В еще одних вариантах осуществления стадию введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.

[0164] В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ получения трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растительную клетку молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается получение трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для насекомого по сравнению с контрольной растительной клеткой. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает совокупность трансгенных растительных клеток, полученных посредством данного способа. В других вариантах осуществления совокупность трансгенных растительных клеток выращена в условиях, которые включают естественный солнечный свет. В других вариантах осуществления стадию введения осуществляют посредством трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. В еще одних вариантах осуществления стадию введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.

[0165] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ получения трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение молекулы интерферирующей РНК, dsRNA, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, химерной молекулы нуклеиновой кислоты, искусственной молекулы-предшественника растительной микроРНК и/или композиции по настоящему изобретению, вследствие чего обеспечивается получение трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием жесткокрылого насекомого или насекомого рода Diabrotica, по сравнению с контрольным растением. В других вариантах осуществления стадию введения осуществляют посредством трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки. В еще одних вариантах осуществления стадию введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.

[0166] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ обеспечения производителя кукурузы средствами контроля популяции жесткокрылых насекомых-вредителей или популяции насекомых-вредителей рода Diabrotica в культуре кукурузы, предусматривающий (а) продажу трансгенного семени кукурузы, которое содержат интерферирующую РНК, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, химерную молекулу нуклеиновой кислоты, искусственную молекулу-предшественник растительной микроРНК и/или композицию по настоящему изобретению, или обеспечение производителя им; и (b) извещение производителя о том, что трансгенное семя кукурузы дает трансгенные растения кукурузы, обеспечивающие контроль популяции жесткокрылых вредителей или вредителей роди Diabrotica.

[0167] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает способ идентификации целевого гена для применения в качестве стратегии RNAi для контроля вредителя растений, для осуществления RNAi у жесткокрылого вредителя растений, причем указанный способ предусматривает стадии: а) получения пары праймеров с последовательностями, выбранными из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 31-90, 397, 398 или их комплементарной последовательности; b) амплификации ортологичной цели из образца нуклеиновой кислоты вредителя растений; с) идентификации последовательности ортологичного целевого гена; d) получения молекулы интерферирующей РНК, где РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена жесткокрылого; и е) определения того, характеризуется ли молекула интерферирующей РНК инсектицидной активностью в отношении вредителя растений. Если интерферирующая РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении жесткокрылого вредителя, то был идентифицирован целевой ген для применения в контроле вредителя растений. В некоторых вариантах осуществления вредитель растений представляет собой жесткокрылого вредителя растений.

ПРИМЕРЫ

[0168] Настоящее изобретение далее будет описано посредством ссылки на следующие подробные примеры. Эти примеры предоставлены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное.

Пример 1. Идентификация генов-мишеней для RNAi у Diabrotica virgifera virgifera

[0169] В данном примере описывается клонирование и секвенирование целевых генов для RNAi и кодирующих последовательностей насекомых рода. Diabrotica.

Получение и секвенирование библиотеки Diabrotica virgifera virgifera с помощью пиросеквенирования

[0170] Транскриптом полного организма новорожденных особей Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук (WCR)) секвенировали с помощью пиросеквенирования на платформе 454 (454 Life Sciences, Брэнфорд, Коннектикут), главным образом, согласно инструкциям производителя. Полученные риды (т.е. короткие фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты) обрезали и собирали в контиги с применением программы сборки MIRA (см., например, Chevreux et al. 2004. Genome Res. 14:1147-1159, включенный в данный документ посредством ссылки).

Идентификация ведущих целевых генов из Diabrotica spp.

[0171] Собранные контиги сравнивали с помощью BLAST с известными летальными генами и аллелями в других организмах, которые идентифицировали на основании опубликованных раскрытий, в том числе на вебсайте WormBase (wormbase.org) и в Boutros et al (2004, Science 303: 832-835). С помощью данного анализа идентифицировали 4608 целевых генов. Каждый из этих целевых генов является не избыточным и, как известно, имеет аллель(и), который является летальным или, как известно, приводит к летальности при целенаправленном воздействии посредством RNAi у одного из С. elegans, Drosophila или у них обоих. Поэтому, каждая из этих мишеней считалась существенно важной. Ожидалось, что значительная большая процентная доля этих целевых генов будет характеризоваться инсектицидным эффектом в отношении WCR. Удивительно, что это было не так.

[0172] Из данных 4608 мишеней получили dsRNA на 384-луночной автоматизированной платформе для синтеза библиотек. Все тестируемые образцы dsRNA конструировали автоматически с применением инструмента для конструирования праймеров Primer3, чтобы осуществлять синтез фрагмента dsRNA длиной приблизительно 500-600 п.о. на основании кодирующей последовательности каждого целевого гена. Более короткие фрагменты конструировали, если размер кодирующей последовательности не обеспечивал получение фрагмента длиной 500 п.о. Данные образцы подвергали скринингу в 24-луночном анализе с WCR при одной концентрации (100 нг dsRNA/см², т.е. 190 нг dsRNA/лунка) с 10 личинками WCR L2 на лунку. Смертность оценивали через 10 дней. Пороговым значением для кандидатных попаданий была 69% смертность. Из 4608 кандидатных dsRNA-мишеней идентифицировали 183 целевых гена. Эти результаты являются удивительными, поскольку специалист в данной области мог бы ожидать, что большее число из данных 4608 кандидатных мишеней будет обеспечивать токсичность в биоанализах.

[0173] В первом анализе 7 мишеней тестировали в лабораторных биоанализах при 10-кратных серийных разведениях, начиная с 1 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 1 мкг, 0,1 мкг, 0,01 мкг и 0,001 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С с фотопериодом свет:темнота 16 часов: 8 часов. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 6 и 7 сутки после заражения. Во всех биоанализах в качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на зеленый флуоресцентный белок (GFP), а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина WCR. На основании данного анализа в качестве положительного был подтвержден ВРА_46378 (альфа-SNAP). Четыре кандидата не были подтверждены в качестве положительных.

[0174] Остальные 176 целевых генов тестировали одновременно в подтверждающем скрининге. На автоматизированной платформе для синтеза библиотек получали dsRNA для 176 мишеней, а также dsRNA для положительных и отрицательных контролей. В данном скрининге также тестировали ВРА_46378. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 0,5 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на тестируемую dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 7 сутки после обработки.

[0175] Результаты, представленные в таблице 1, показали, что 29 молекул dsRNA из исходных 176 идентифицированных молекул dsRNA подтвердились как высокотоксичные для Diabrotica virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), в дополнение к мишени альфа-SNAP, которая была подтверждена повторно. SEQ ID NO: 1-30 представляют собой нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты каждого токсичного целевого гена, идентифицированного при скрининге. SEQ ID NO: 31-90, 397, 398 или их комплементарные последовательности представляют собой нуклеотидные последовательности пар праймеров, применяемых для синтеза фрагментов нуклеиновой кислоты каждого целевого гена, идентифицированного при скрининге. SEQ ID NO: 91-120 представляют собой нуклеотидные последовательности полноразмерных кодирующих последовательностей каждого целевого гена, идентифицированного при скрининге.

[0176] Ранее было высказано предположение, что некоторые гены Diabrotica spp.могут быть использованы для опосредованного RNAi контроля насекомых. См. патентную публикацию США №2007/0124836, в которой раскрыты 906 последовательностей, и патент США №7612194, в котором раскрыты 9112 последовательностей. Однако, как показано в данном документе, способность любого данного гена-мишени обеспечивать токсичность посредством подхода RNAi невозможно предсказать, а можно определить только эмпирически Аналогичные заключения получили Narva et al. (патентная публикация США №2015/0322456). В настоящем изобретении идентифицировали 30 целевых генов, каждый из которых обеспечивает удивительный и неожиданный превосходный контроль Diabrotica.

Пример 2. Активность dsRNA в отношении Diabrotica virgifera virgifera - 4 концентрации DRC

[0177] В данном примере описано тестирование биологической активности dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica virgifera virgifera (WCR).

[0178] 30 молекул dsRNA, описанных выше, тестировали на токсичность в отношении WCR в лабораторных биоанализах при 10-кратных серийных разведениях, начиная с 1 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 1 мкг, 0,1 мкг, 0. 01 мкг и 0,001 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 6 и 7 сутки после заражения. В качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина WCR.

[0179] Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что 30 молекул dsRNA, сконструированных для нацеливания на мРНК, транскрибируемую с генов WCR, являются токсичными - высокотоксичными для WCR. После внесения поправки на контрольную смертность, вызванную dsRNA для GFP, рассчитывали оцениваемые LT₅₀ и LC₅₀ с помощью анализа с аппроксимацией кривой. LT₅₀ означает летальное время, требуемое для обеспечения 50% смертности у тестируемых насекомых. LC₅₀ означает концентрацию dsRNA, которая вызывает гибель 50% тестируемых насекомых. В таблице 2% смертности на сутки 7 приведен на основании дозы 1 мкг dsRNA/лунка. LT₅₀ приведен на основании применения 1 мкг dsRNA/сутки и измеряется в сутках. LC₅₀ измеряется в мкг dsRNA/лунка.

[0180] На основании данных результатов определяли приоритет в подгруппе мишеней для дальнейшего исследования. Результаты для таких мишеней показаны ниже.

Пример 3. Активность dsRNA в отношении Diabrotica virgifera virgifera

[0181] В данном примере описывается тестирование биологической активности подгруппы идентифицированных целевых dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica virgifera virgifera (WCR).

[0182] Молекулы dsRNA, описанные выше, тестировали на токсичность в отношении WCR в лабораторных биоанализах при 3-кратных серийных разведениях, начиная с 0,5 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 0,5 мкг, 0,16 мкг, 0,05 мкг, 0,02 мкг, 0,006 мкг, 0,002 мкг, 0,0007 мкг и 0,0002 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 6 и 7 сутки после заражения. В качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина WCR.

[0183] Результаты, представленные в таблице 3, показывают, что молекулы dsRNA, сконструированные для нацеливания на мРНК, транскрибируемую с генов WCR, являются токсичными - высокотоксичными для WCR. После внесения поправки на контрольную смертность, вызванную dsRNA для GFP, рассчитывали оцениваемые LT₅₀ и LC₅₀ с помощью анализа с аппроксимацией кривой. LT₅₀ означает летальное время, требуемое для обеспечения 50% смертности у тестируемых насекомых. LC₅₀ означает концентрацию dsRNA, которая вызывает гибель 50% тестируемых насекомых. В таблице 3% смертности на сутки 7 приведен на основании дозы 0,5 мкг dsRNA/лунка. LT₅₀ приведен на основании применения 0,5 мкг dsRNA/сутки и измеряется в сутках. LC₅₀ измеряется в мкг dsRNA/лунка. Эти результаты подтверждают токсичность кандидатных мишеней.

Пример 4. Активность dsRNA в отношении Diabrotica undecimpunctata howardi

[0184] В данном примере описывается тестирование биологической активности dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук (SCR)).

[0185] Молекулы dsRNA, описанные выше, тестировали на токсичность в отношении SCR в лабораторных биоанализах при 10-кратных серийных разведениях, начиная с 0,5 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующих концентраций таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность среды в каждой лунке при серии конечных концентраций верхнего слоя из 8 концентраций, понижающихся от 0,5 мкг/лунка до 0,00022 мкг/лунка в виде стадий 3х разбавления. В каждую лунку добавляли одну или две личинки SCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 14 сутки после заражения. В качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина Diabrotica virgifera virgifera (Dv) и ген убиквитина Diabrotica undecimpunctata howardi (Du).

[0186] После внесения поправки на контрольную смертность, вызванную dsRNA для GFP, рассчитывали оцениваемые LT₅₀ и LC₅₀ с помощью анализа с аппроксимацией кривой. LT₅₀ означает летальное время, требуемое для обеспечения 50% смертности у тестируемых насекомых. LC₅₀ означает концентрацию dsRNA, которая вызывает гибель 50% тестируемых насекомых. В таблице 4% смертности на сутки 14 приведен на основании дозы 0,5 мкг dsRNA/лунка. LT₅₀ приведен на основании применения 0,5 мкг dsRNA/сутки и измеряется в сутках. LC₅₀ измеряется в мкг dsRNA/лунка. Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что молекулы dsRNA, сконструированные для нацеливания на мРНК, транскрибируемую с генов Diabrotica virgifera virgifera (WCR), также являются токсичными для Diabrotica undecimpunctata howardi (SCR). Это показывает то, что мишени по настоящему изобретению представляют собой подходящие мишени в случае SCR, а также то, что молекулы dsRNA на основе нативных мРНК SCR также будут токсичны для SCR и других Diabrotica spp.

Пример 5. Активность dsRNA в отношении Diabrotica barberi

[0187] В данном примере описывается тестирование биологической активности dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica barberi (северный кукурузный корневой жук (NCR)).

[0188] Молекулы dsRNA, описанные выше, тестировали на токсичность в отношении NCR в лабораторных биоанализах. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 0,5 мкг dsRNA на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки NCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на тестируемую dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 7 сутки после заражения. Во всех биоанализах в качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина Diabrotica barberi (Dr).

[0189] Результаты, представленные в таблице 5, показывают, что молекулы dsRNA, сконструированные для нацеливания на мРНК, транскрибируемую с генов Diabrotica virgifera virgifera, также являются токсичными для Diabrotica barberi. Это показывает то, что мишени по настоящему изобретению представляют собой подходящие мишени в случае NCR, а также то, что молекулы dsRNA на основе нативных мРНК NCR также будут токсичны для NCR и других Diabrotica spp.

Пример 6. Анализы размера фрагментов на WCR

[0190] Все образцы dsRNA, протестированные в предыдущих примерах, конструировали автоматически с применением инструмента для конструирования праймеров Primer3, чтобы осуществлять синтез фрагмента dsRNA длиной приблизительно 500 п.о. на основании кодирующей последовательности каждого целевого гена. Более короткие фрагменты конструировали, если размер кодирующей последовательности не обеспечивал получение фрагмента длиной 500 п.о.

[0191] В экспериментах по исследованию размера фрагментов конструировали разные фрагменты dsRNA на основании полной кодирующей последовательности каждого целевого гена. Полную кодирующую последовательность тестировали целиком, если она была доступна, и если она не превышала 1000 п.о. Кодирующую последовательность также делили на фрагменты с некоторым перекрыванием длиной 25-30 п.о. между последовательными фрагментами. Для каждого фрагмента конструировали новые праймеры и dsRNA синтезировали на автоматизированной платформе для синтеза библиотек. Кроме того, также тестировали с разными фрагментами dsRNA целевой ген ВРА_16372, синтезированные молекулы dsRNA которого, как обнаружили при отдельном скрининге, обладают инсектицидной активностью в отношении WCR. Все фрагменты dsRNA тестировали в биоанализе с WCR при двух разных концентрациях (0,1 мкг dsRNA и 0,01 мкг dsRNA на лунку) и смертность оценивали на сутки 7.

[0192] Молекулы dsRNA, описанные выше, тестировали на токсичность в отношении Diabrotica virgifera virgifera в лабораторных биоанализах. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 0,1 мкг dsRNA или 0,01 мкг dsRNA на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки Diabrotica virgifera virgifera таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на тестируемую dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 7 сутки после заражения. Во всех биоанализах в качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на ген убиквитина Diabrotica virgifera virgifera.

[0193] Результаты, представленные в таблице 6, показывают, что фрагменты dsRNA, сконструированные для нацеливания на мРНК, транскрибируемую с генов Diabrotica virgifera virgifera, являются высокотоксичными для Diabrotica virgifera virgifera.

Пример 7. Корреляция размера dsRNA с активностью в отношении Diabrotica virgifera virgifera

[0194] В данном примере описано тестирование биологической активности dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica virgifera virgifera (WCR).

[0195] В данном примере основное внимание уделяется различным субфрагментам dsRNA для ВРА_15366 5 длиной 42-46 п.o. (SEQ ID NO: 313-317). ДНК, кодирующую субфрагменты, функционально связывали с последовательностью GFP длиной 89 нуклеотидов, которая действовала в качестве по следовательности - "заполнителя", с получением последовательности длиной 133 п.о. для тестирования (SEQ ID NO: 318-322). Каждую из SEQ ID NO: 318-322 тестировали на токсичность в отношении WCR в лабораторных биоанализах при 10-кратных серийных разведениях, начиная с 1 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 1 мкг, 0,1 мкг, 0,01 мкг и 0,001 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8 часов. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 сутки после заражения. В качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, а в качестве положительного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на более крупный фрагмент гена тропонина WCR длиной 133 нуклеотидов.

[0196] Результаты, представленные в таблице 7, показывают, что пять фрагментов dsRNA длиной 42-46 п.о., функционально связанные с последовательностью - "заполнителем" на основе GFP (закодированы в SEQ ID NO: 318-322), с образованием последовательности длиной 133 п.о., являются почти такими же токсичными, как и фрагмент dsRNA для ВРА_15366 5 длиной 133 п.о. (закодирован в SEQ ID NO: 315). % смертности на сутки 7 приведен на основании концентрации 1 мкг dsRNA/лунка. После внесения поправки на контрольную смертность, вызванную dsRNA для GFP, рассчитывали оцениваемые LT₅₀ и LC₅₀ с помощью анализа с аппроксимацией кривой. LT₅₀ приведен на основании применения 1 мкг dsRNA/сутки и измеряется в сутках. LC₅₀ измеряется в мкг dsRNA/лунка.

Пример 8. Идентификация 21-меров с активностью в отношении Diabrotica virgifera virgifera

[0197] В данном примере описано тестирование биологической активности dsRNA по настоящему изобретению в отношении Diabrotica virgifera virgifera (WCR).

[0198] В данном примере основное внимание уделяется 21-мерным siRNA из активного фрагмента dsRNA длиной 42 п.о., кодируемого ВРА_15366_16 (SEQ ID NO: 321). Субфрагменты, описываемые выше, встраивали в последовательность - "заполнитель" на основе GFP с получением последовательности с общей длиной 145 п.о. Каждый из встроенных 21-меров тестировали на токсичность в отношении WCR в лабораторных биоанализах при 10-кратных серийных разведениях, начиная с 1 мкг dsRNA/лунка. Биоанализы проводили с применением способа с применением искусственной питательной среды, обработанной РНК. Вкратце, расплавленные искусственные среды, представляющие собой модификацию среды из Marrone et al. 1985 (J. Econ. Entomol. 78:290-293), наливали в каждую лунку 48-луночных планшетов и давали им застыть. Синтезированные молекулы dsRNA разбавляли до соответствующей концентрации таким образом, чтобы добавить по 20 мкл раствора на поверхность питательной среды в половине лунок 48-луночного планшете при конечной концентрации верхнего слоя, составляющей 1 мкг, 0,1 мкг, 0,01 мкг и 0,001 мкг на лунку. В каждую лунку добавляли одну или две личинки WCR таким образом, чтобы иметь от 24 до 48 повторов в виде личинок на одну концентрацию тестируемой dsRNA. Каждый 48-луночный планшет выдерживали при приблизительно 26°С и фотопериоде свет:темнота 16:8. Смертность регистрировали на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 сутки после заражения. В качестве отрицательного контроля применяли dsRNA, сконструированную для нацеливания на GFP, a dsRNA, сконструированную для нацеливания на более крупный фрагмент ВРА_15366 5 длиной 133 п.о. (SEQ ID NO: 287) и фрагмент ВРА_15366 16 длиной 42 п.о., встроенный в последовательность - "заполнитель" на основе GFP (SEQ ID NO: 321), применяли в качестве положительного контроля.

[0199] Результаты, представленные в таблице 8, показывают, что большинство встроенных 21-мерных фрагментов dsRNA, сконструированных для нацеливания на мРНК, транскрибируемую из целевого гена ВРА_15366 WCR, демонстрировали токсичность в отношении WCR.

Пример 9. Экспрессия молекулы интерферирующей РНК, содержащей целевую dsRNA, в растениях кукурузы

[0200] В данном примере описано введение конструкции, которая экспрессирует молекулу интерферирующей РНК, в растительные клетки. Конструирование вектора

[0201] Векторы экспрессии, сконструированные для получения шпильковых РНК (hpRNA), состояли из кассеты, содержащей промотор, смысловую нить, интрон, функционирующий в виде петлевой последовательности, антисмысловую нить и терминатор. Бинарный вектор 23130 содержит кассету экспрессии, содержащую последовательность ДНК, сконструированную для получения hpRNA, нацеливающейся на фрагмент из 133 нуклеотидов из ВРА_15366 (SEQ ID NO: 403). Каждый бинарный вектор также содержал вторую кассету между левой и правой границами, сконструированную для экспрессии фосфоманнозоизомеразы (PMI), которая обеспечивает способность метаболизировать маннозу (патенты США №№5767378 и 5994629, которые включены в настоящий документ посредством ссылки), в качестве селективного маркера во время трансформации растения. Данные векторы также содержали селектируемые маркеры для отбора бактерий.

Опосредованная Agrobacterium трансформация

[0202] Полученную плазмиду, содержащую кассету со шпильковой структурой, трансформировали в Agrobacterium tumefaciens с применением стандартных методик молекулярной биологии, известных специалистам в данной области. Чтобы получить агробактерий для трансформации, клетки культивировали в жидкой среде YPC при 28°С и 220 об./мин. на протяжении ночи. Векторы, описанные выше, трансформировали в маис. Опосредованную Agrobacterium трансформацию незрелых зародышей маиса выполняли, главным образом, как описано в Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803. В случае данного примера все компоненты среды представляли собой компоненты, главным образом описываемые в Negrotto et al., выше. Однако их можно заменять различными компонентами среды, известными из уровня техники. После трансформации, отбора и регенерации растения тестировали на присутствие гена pmi и молекулы интерферирующей РНК в виде шпильковой dsRNA. Растения с положительными результатами в ПЦР-анализе переносили в теплицу и обеспечивали завязывание семян.

Анализ насекомых на трансгенном маисе

[0203] Осуществляли полевые испытания с высаживанием 7 разных трансгенных объектов с положительными и отрицательными контролями в четырех местоположениях. Для каждого объекта использовали делянки в трех повторностях на местоположение, и каждая делянка содержала 12 растений. Расположение делянок определяли с применением рандомизированной полноблочной схемы. При полевых испытаниях использовались естественные популяции кукурузного корневого жука. Когда растения маиса достигали ранней стадии R2, корни 5 растений на делянку выкапывали, промывали для удаления почвы и оценивали с применением шкалы повреждения узлов от 0 до 3 (Oleson et al., 2005, J. Econ. Entomol. 98: 1-8). Данные повреждения корней анализировали с применением скорректированных средних значений, полученных с помощью пакета программ статистической обработки данных SAS JMP (JMPSAS Institute 2010). Результаты показаны в таблице 9. В состав растений положительного контроля входил объект 5307 (WO-публикация WO 2010/077816, включенная в данный документ посредством ссылки), а также объект MIR604 (WO-публикация WO 2005/103301, включенная в данный документ посредством ссылки). "RDR" представляет собой скорректированное среднее значение оценки питания на 1,5-дюймовых корнях во всех оцениваемых образцах.

[0204] Все объекты, содержащие молекулу интерферирующей РНК, экспрессируемую с трансгена из вектора 23130, характеризовались повышенной выносливостью в отношении насекомых-вредителей по сравнению с нетрансгенными контрольными растениями. Это иллюстрирует то, что трансгенное растение, содержащее молекулу интерферирующей РНК по настоящему изобретению, характеризуется повышенной устойчивостью к насекомому-вредителю по сравнению с нетрансгенным контрольным растением.

Пример 10. Биоанализы молекул интерферирующей РНК со вторым инсектицидным средством

[0205] В этом примере проиллюстрирована токсичность молекул интерферирующей РНК по настоящему изобретению в комбинации со вторым инсектицидным средством.

[0206] Получали молекулы двухнитевой РНК, нацеливающиеся на мишень ВРА_15366. Кроме того, получали второе инсектицидное средство. Как РНК, так и второе инсектицидное средство тестировали в комбинации на токсичность в отношении WCR в лабораторных биоанализах.

[0207] Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения с учетом данного описания будут предполагаться специалистами в данной области, и подлежат включению в сущность и содержание данной заявки и объем прилагаемой формулы изобретения.

[0208] Все публикации и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, показывают уровень компетентности специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка конкретно и отдельно включена посредством ссылки.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены молекулы интерферирующей РНК, способные интерферировать с целевыми генами вредителей и являющиеся токсичными для целевого вредителя. Кроме того, раскрыты способы получения и применения интерферирующих РНК, например, в трансгенных растениях или в качестве активного ингредиента в композиции, для обеспечения защиты от повреждения, вызванного насекомым. Группа изобретений используется для эффективной защиты растений от повреждения жесткокрылыми насекомыми. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 табл., 9 пр.

1. Молекула интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), где молекула РНК содержит участок двухцепочечной РНК (дцРНК), где участок дцРНК включает гибридизованные комплементарные цепи, одна цепь которой содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в гене-мишени Diabrotica spp, где ген-мишень состоит из SEQ ID NO: 390, и где последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов по меньшей мере на 85% идентична фрагменту из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 390, и где интерферирующая молекула РНК обладает инсектицидной активностью в отношении насекомого Diabrotica virgifera.

2. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где участок дцРНК содержит по существу комплементарные гибридизированные нити.

3. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где участок дцРНК содержит полностью комплементарные гибридизированные нити.

4. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-3.

5. Трансгенное растение, содержащее молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-3, где трансгенное растение обладает повышенной устойчивостью к насекомому Diabrotica virgifera по сравнению с контрольным растением, где контрольное растение не содержит молекулу интерферирующей РНК.

6. Часть трансгенного растения, содержащая молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-3, где часть трансгенного растения обладает повышенной устойчивостью к насекомому Diabrotica virgifera по сравнению с контрольным растением, где контрольное растение не содержит молекулу интерферирующей РНК.

7. Трансгенное растение по п. 5 или часть трансгенного растения по п. 6, где трансгенное растение или часть трансгенного растения содержит по меньшей мере второй инсектицидный агент для борьбы с насекомыми Diabrotica.

8. Трансгенное растение или часть трансгенного растения по п. 7, где второй инсектицидный агент представляет собой инсектицидный белок Bacillus thuringiensis.

9. Трансгенное растение или часть трансгенного растения по п. 7, где второй инсектицидный агент представляет собой пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, лектин, сконструированное антитело или фрагмент антитела или хитиназу.

10. Трансгенное растение или часть трансгенного растения по п. 7, где второй инсектицидный агент представляет собой или получен из инсектицидного белка Bacillus cereus, инсектицидного белка Xenorhabdus spp., инсектицидного белка Photorhabdus spp., инсектицидного белка Brevibacillus laterosporous, инсектицидного белка Lysinibacillus sphearicus, инсектицидного белка Chromobacterium spp., инсектицидного белка Yersinia entomophaga, инсектицидного белка Paenibacillus popiliae или инсектицидного белка Clostridium spp.

11. Трансгенное растение по любому из пп. 5-10 или часть трансгенного растения по любому из пп. 6-10, где трансгенное растение представляет собой растение кукурузы или часть трансгенного растения представляет собой часть растения кукурузы.

12. Трансгенное семя для получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к насекомому Diabrotica virgifera, где семя содержит молекулу нуклеиновой кислоты, интегрированную в геном семени, где молекула нуклеиновой кислоты кодирует молекулу инерферирующей рибонуклеиновой кислоты (иРНК) по любому из пп. 1-3.

13. Способ уничтожения насекомого Diabrotica virgifera, включающий контактирование насекомого Diabrotica virgifera с молекулой нуклеиновой кислоты, которая продуцирует молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-3, для ингибирования экспрессии целевого гена у насекомого Diabrotica virgifera, тем самым убивая насекомое Diabrotica virgifera.

14. Способ по п. 13, где молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 382.

15. Способ по п. 13, в котором приведение в контакт включает:

а) посев трансгенного семени, способного продуцировать трансгенное растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты, при этом насекомое Diabrotica virgifera питается трансгенным растением или его частью; или же

б) нанесение композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, на семя, или растение, или их часть, при этом насекомое Diabrotica virgifera питается семенем, растением или их частью.

16. Способ по п. 15, где трансгенное семя и трансгенное растение представляют собой семена кукурузы и растение кукурузы.