ФЕРМЕНТИРОВАННАЯ ФОРМУЛА С НЕПЕРЕВАРИВАЕМЫМИ ОЛИГОСАХАРИДАМИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ РОТАВИРУСОМ Российский патент 2023 года по МПК A23L33/135 A23L33/21 A23L33/00 A61K35/20 A61K31/702 A61K35/741 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области питания младенцев и детей раннего возраста, детских смесей для лечения или профилактики ротавирусной инфекции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Вирусные инфекции распространены среди людей всех возрастов, но часто, по-видимому, сконцентрированы у младенцев и детей. Многие вирусные инфекции приводят к лихорадке и болям в теле или дискомфорту и не являются настолько серьезными, и большинство детей с вирусными инфекциями поправляются без лечения. В частности, в младенчестве родителям трудно определить, болен ли их ребенок потенциально серьезной инфекцией и нуждается ли он в немедленной медицинской помощи. Ротавирус (РВ) является ведущим во всем мире этиологическим фактором тяжелой дегидратирующей диареи у детей в возрасте до 5 лет. РВ инфицирует и реплицируется в основном в неделящихся зрелых энтероцитах около кончиков ворсинок тонкого кишечника. В результате у младенцев развиваются диарея, рвота и лихорадка в течение от 3 дней до 1 недели, обычно с повторными инфекциями, которые, как правило, менее серьезны, чем первая инфекция. Наиболее распространенный способ лечения состоит из растворов для пероральной регидратации (РПР). Поскольку патогенез РВ у человека до сих пор неясен и вакцины в отношении РВ не применяются в глобальном масштабе, представляет интерес модуляция с помощью введения в рацион биологически активных компонентов.

Грудное молоко является предпочтительной пищей для младенцев. Грудное молоко содержит несколько биологически активных факторов, которые приносят пользу относительно незрелой иммунной системе новорожденных в раннем возрасте и могут предотвращать или уменьшать тяжесть ротавирусной инфекции, таких как лактоферрин и олигосахариды грудного молока. Однако кормить грудью младенца не всегда возможно или желательно. В таких случаях хорошей альтернативой являются молочные смеси первого уровня или молочные смеси второго уровня. Эти смеси должны иметь оптимальную композицию, чтобы как можно точнее имитировать благотворное воздействие грудного молока.

В последние годы было исследовано несколько введений в рацион биологически активных соединений. Среди этих соединений пробиотики были наиболее широко исследованы вследствие их известных иммуномодулирующих эффектов и прямого действия, часто на тонкий кишечник, который является первичной точкой РВ инфекции. В WO 00/53201 раскрыты штаммы молочнокислых бактерий, способные предотвращать диарею и предотвращать инфицирование ротавирусом. В WO 2004/2168 раскрыты бифидобактерии для лечения воспалительных заболеваний, включая связанную с ротавирусом диарею. В WO 02/39834 раскрыты пробиотические бактерии для профилактики или ингибирования ротавирусной диареи. В ЕР 2407532 раскрыто, что пробиотический штамм и его супернатант B. breve предотвращает рост in vitro ротавируса in vitro. В Rigo-Adrovers et al., 2017, British Journal of Nutrition, 117, 209-217 были исследованы две различные концепции. Первая представляет собой ферментированную смесь, инактивированную нагреванием, и вторая представляет собой особую смесь короткоцепочечных галактоолигосахаридов, длинноцепочечных фруктоолигосахаридов и полученных из пектина кислых олигосахаридов. Обе концепции питания вызвали улучшение клинических симптомов ротавирусной инфекции. В Rigo-Adrover et al 2018, Frontiers in Immunology, doi:10.3389/fimmu.2018.01318 исследование профилактической роли смеси короткоцепочечных галактоолигосахаридов, и длинноцепочечных фруктоолигосахаридов, и пробиотика Bifidobacterium breve M-16V, и комбинации смеси пребиотиков и пробиотика была описана на модели двойной РВ инфекции у крыс. Коррекция режима питания улучшила клинические симптомы после первой инфекции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения исследовали комбинацию ферментированной смеси и смеси неперевариваемых олигосахаридов в отношении эффектов ротавирусной инфекции. Неожиданно комбинация ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами привела к гораздо более высокому связыванию ротавирусных частиц по сравнению со связыванием с помощью отдельных компонентов ферментированной смеси или неперевариваемых олигосахаридов. Ротавирусную инфекцию и ее индуцированные симптомы исследовали с использованием модели с молодыми крысами. Ротавирусная инфекция вызывала потерю массы, которая в основном наблюдалась после периода диареи, и индуцированное ротавирусом влияние на массу органов улучшилось в группе, которая получала комбинацию ферментированной смеси и смеси неперевариваемых олигосахаридов. Введение ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами приводило к пониженной частоте возникновения, пониженной продолжительности и пониженной степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом. Кроме того, наблюдалось пониженное вирусовыделение. Кроме того, проницаемость кишечного барьера у животных, инфицированных ротавирусом, была наиболее снижена в группе, которой вводили комбинацию ферментированной смеси и неперевариваемых олигосахаридов, как определено с помощью альфа-1-антитрипсина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста, включающему введение пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды для младенца или ребенка раннего возраста.

Изобретение также может быть составлено как применение ферментированной композиции и неперевариваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, для применения при лечении и/или профилактике ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста.

Изобретение также может быть составлено как пищевая композиция, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, для применения при лечении и/или профилактике ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста.

В одном варианте осуществления лечение и/или профилактика ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, представляет собой

а. снижение частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

b. снижение продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

c. снижение степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

d. профилактика вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития,

е. усиление блокировки ротавирусных частиц,

f. снижение ротавирусной нагрузки, и/или

g. усиление барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции.

Настоящее изобретение также относится к способу

а. снижения частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

b. снижения продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

c. снижения степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

d. профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития,

е. увеличения блокировки ротавирусных частиц,

f. снижения ротавирусной нагрузки, и/или

g. увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции

у младенца или ребенка раннего возраста, включающий введение младенцу или ребенку раннего возраста пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды.

Изобретение также может быть составлено как применение ферментированной композиции и неперевариваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, при применении для

а. снижения частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

b. снижения продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

c. снижения степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

d. профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития,

е. увеличения блокировки ротавирусных частиц,

f. снижения ротавирусной нагрузки, и/или

g. увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции

у младенца или ребенка раннего возраста.

Изобретение также может быть составлено как пищевая композиция, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, при применении для

а. снижения частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

b. снижения продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

c. снижения степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции,

d. профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития,

е. увеличения блокировки ротавирусных частиц,

f. снижения ротавирусной нагрузки, и/или

g. увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции

у младенца или ребенка раннего возраста.

Ферментированная композиция

Пищевая композиция в способах или применениях в соответствии с настоящим изобретением, далее также называемая настоящей пищевой композицией, или пищевой композицией изобретения, или конечной пищевой композицией, по меньшей мере частично ферментируется. Частично ферментированная пищевая композиция включает, по меньшей мере, часть композиции, которая была ферментирована бактериями, продуцирующими молочную кислоту. Следовательно, в контексте настоящего изобретения пищевая композиция, которая, по меньшей мере, частично ферментируется, относится к пищевой композиции, которая содержит молочный субстрат, который ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту. Было показано, что присутствие ферментированной композиции в конечной пищевой композиции приводит после введения к действию в отношении ротавирусной диареи и ее симптомов.

Ферментация предпочтительно происходит в процессе получения пищевой композиции. Предпочтительно, что пищевая композиция не содержит в конечном продукте значительных количеств жизнеспособных бактерий, и этого можно достичь с помощью тепловой инактивации после ферментации или инактивации другими способами. Предпочтительно ферментированная композиция представляет собой продукт, полученный из молока, который представляет собой молочный субстрат, который ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, в котором молочный субстрат содержит, по меньшей мере, один, выбранный из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина или их смеси. Соответственно, пищевые композиции, содержащие ферментированные композиции и неперевариваемый олигосахарид, и их способ получения описаны в WO 2009/151330, WO 2009/151331 и WO 2013/187764.

Ферментированная композиция предпочтительно содержит фрагменты бактериальных клеток, такие как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (ЛТК), липопротеины, нуклеотиды и/или капсульные полисахариды. Предпочтительно использовать ферментированную композицию, содержащую инактивированные бактерии и/или фрагменты клеток, непосредственно как часть конечного пищевого продукта, поскольку это приведет к более высокой концентрации фрагментов бактериальных клеток. Когда используются коммерческие препараты бактерий, продуцирующих молочную кислоту, их обычно промывают, и материал отделяют от водной питательной среды, содержащей фрагменты бактериальных клеток, тем самым уменьшая или устраняя присутствие фрагментов бактериальных клеток. Кроме того, при ферментации и/или других взаимодействиях бактерий, продуцирующих молочную кислоту, с молочным субстратом могут образовываться дополнительные биологически активные соединения, такие как жирные кислоты с короткой цепью, биологически активные пептиды и/или олигосахариды и другие метаболиты, что также может приводить к функции кишечной микробиоты, больше похожей на функцию кишечной микробиоты у младенцев, находящихся на грудном вскармливании. Такие биологически активные соединения, которые продуцируются во время ферментации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, также могут называться постбиотиками. Считается, что композиция, содержащая такие постбиотики, преимущественно ближе к грудному молоку, поскольку грудное молоко не является чистой синтетической смесью, но содержит метаболиты, бактериальные клетки, фрагменты клеток и подобные. Следовательно, ферментированная композиция, в частности продукт, полученный из ферментированного молока, как полагают, имеет улучшенный эффект по сравнению с продуктом, полученным из неферментированного молока, без или только с бактериями, продуцирующими молочную кислоту, в отношении антиротавирусного действия.

Предпочтительно, конечная пищевая композиция содержит от 5 до 97,5 масc.% ферментированной композиции в пересчете на сухую массу, более предпочтительно от 10 до 90 масс.%, более предпочтительно от 20 до 80 масс.%, еще более предпочтительно от 25 до 60 масс.%. В качестве способа указать, что конечная пищевая композиция содержит, по меньшей мере, частично ферментированную композицию и для определения степени ферментации может быть взят уровень суммы молочной кислоты и лактата в конечной пищевой композиции, поскольку это представляет собой метаболический конечный продукт, продуцируемый бактериями, продуцирующими молочную кислоту, при ферментации. Настоящая конечная пищевая композиция предпочтительно содержит от 0,02 до 1,5 масc.% суммы молочной кислоты и лактата в пересчете на сухую массу композиции, более предпочтительно от 0,05 до 1,0 масc.%, еще более предпочтительно от 0,2 до 0,5 масc.%. Предпочтительно, по меньшей мере, 50 масс.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90 масс.% суммы молочной кислоты и лактата находится в форме L(+)-изомера. Таким образом, в одном варианте осуществления сумма L(+)-молочной кислоты и L(+)-лактата составляет более 50 масс.%, более предпочтительно более 90 масс.% в пересчете на сумму общей молочной кислоты и лактата. В настоящем описании L(+)-лактат и L(+)-молочная кислота также упоминаются как L-лактат и L-молочная кислота.

Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для получения ферментированной композиции

Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для приготовления ферментированной композиции, в частности для ферментации молочного субстрата, предпочтительно представлены в виде моно- или смешанной культуры. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, состоят из родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weissella. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают бактерии рода Bifidobacterium и/или Streptococcus.

Предпочтительно Streptococcus представляет собой штамм S. thermophilus. Выбор подходящего штамма S. thermophilus описан в примере 2 EP 778885 и в примере 1 FR 2723960. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением пищевая композиция содержит 10²-10⁵ КОЕ живых бактерий S. thermophilus на г сухой массы конечной пищевой композиции, предпочтительно конечная пищевая композиция содержит 10³-10⁴ живых бактерий S. thermophilus на г сухой массы.

Предпочтительные штаммы S. thermophilus для получения ферментированной композиции для целей настоящего изобретения были депонированы компанией Жерве Данон в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM), находящейся в ведении Института Пастера, улица Доктора Ру, 25, Париж, Франция 23 августа 1995 года под номером доступа I-1620 и 25 августа 1994 года под номером доступа I-1470. Другие штаммы S. thermophilus являются коммерчески доступными.

Bifidobacteria представляют собой грамположительные анаэробные палочковидные бактерии. Предпочтительные виды Bifidobacterium для получения ферментированной композиции для целей настоящего изобретения предпочтительно имеют, по меньшей мере, на 95% идентичность последовательности 16 S рРНК по сравнению с типовым штаммом соответствующих видов Bifidobacterium, более предпочтительно, по меньшей мере, на 97% идентичность, как определено в справочниках по этому вопросу, например, Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (N.Y.) Laboratory Press. Предпочтительно используемые Bifidobacteria также описаны Scardovi, V. Genus Bifidobacterium. p.1418 - p.1434. In: Bergey’s manual of systematic Bacteriology. Vol. 2. Sneath, P.H.A., N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.G. Holt (ed.). Baltimore: Williams & Wilkins. 1986. 635 p. Предпочтительно бактерии, продуцирующие молочную кислоту, используемые для ферментации, включают или представляют собой, по меньшей мере, одну Bifidobacterium, выбранную из группы, состоящей из B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. adolescentis, B. thermophilum, B. gallicum, B. animalis или lactis, B. angulatum, B. pseudocatenulatum, B. thermacidophilum и B. longum, более предпочтительно B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. catenulatum, B. longum, более предпочтительно B. longum и B. breve, еще более предпочтительно B. breve, более предпочтительно B. breve, выбранный из группы, состоящей из B. breve Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. breve M-16V (Morinaga), B. breve R0070 (Institute Rosell, Lallemand), B. breve BR03 (Probiotical), B. breve BR92 (Cell Biotech) DSM 20091, LMG 11613 и B. breve I-2219, депонированные в CNCM, Париж, Франция. Наиболее предпочтительно B. breve представляет собой B. breve M-16V (Morinaga) или B. breve I-2219, еще более предпочтительно B. breve I-2219.

Наиболее предпочтительно пищевая композиция изобретения содержит ферментированную композицию, которая ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, содержащими как B. breve, так и S. thermophilus. В одном варианте осуществления ферментация бактериями, продуцирующими молочную кислоту, представляет собой ферментацию Streptococcus thermophilus и Bifidobacterium breve. В одном варианте осуществления конечная пищевая композиция содержит ферментированную композицию, в которой бактерии, продуцирующие молочную кислоту, инактивированы после ферментации.

Предпочтительно ферментированная композиция не ферментируется Lactobacillus bulgaricus. Полагают, что L. bulgaricus ферментированные продукты не являются подходящими для младенцев, поскольку у детей раннего возраста специфическая дегидрогеназа, которая превращает D-лактат в пируват, гораздо менее активна, чем дегидрогеназа, которая превращает L-лактат.

Предпочтительно пищевая композиция изобретения содержит инактивированные бактерии, продуцирующие молочную кислоту, и/или бактериальные фрагменты, полученные из бактерий, продуцирующих молочную кислоту, что эквивалентно более чем 1×10⁴ КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г в пересчете на сухую массу конечной композиции, более предпочтительно 1×10⁵ КОЕ, даже более предпочтительно 1×10⁶ КОЕ. Предпочтительно инактивированные бактерии или бактериальные фрагменты являются эквивалентом менее 1×10¹³ КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на г в пересчете на сухую массу конечной композиции, более предпочтительно 1×10¹¹ КОЕ, даже более предпочтительно 1×10¹⁰ КОЕ. Корреляция инактивированных молочнокислых бактерий и эквивалентность КОЕ может быть определена с помощью молекулярных методов, известных в данной области техники, или путем проверки производственного процесса.

Процесс ферментации

Предпочтительно ферментированная композиция представляет собой продукт, полученный из молока, который представляет собой молочный субстрат, который ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, причем указанный молочный субстрат содержит, по меньшей мере, один, выбранный из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина или их смеси. Продукт, полученный из молока, или молочный субстрат, подлежащий ферментации, соответствующим образом присутствует в водной среде. Ферментированный молочный субстрат включает, по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из молока, сыворотки, сывороточного белка, гидролизата сывороточного белка, казеина, гидролизата казеина или их смесей. Молоко может быть цельным, полуобезжиренным и/или обезжиренным молоком. Предпочтительно ферментированный молочный субстрат содержит обезжиренное молоко. Сыворотка может быть сладкой и/или кислой сывороткой. Предпочтительно сыворотка присутствует в концентрации от 3 до 80 г сухой массы на л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно от 40 до 60 г на л. Предпочтительно гидролизат сывороточного белка присутствует в количестве от 2 до 80 г сухой массы на л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно от 5 до 15 г/л. Предпочтительно лактоза присутствует в количестве от 5 до 50 г сухой массы на л водного субстрата, более предпочтительно от 1 до 30 г/л. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, включает буферные соли для поддержания pH в желаемом диапазоне. Предпочтительно дигидрофосфат натрия или калия используется в качестве буферной соли, предпочтительно от 0,5 до 5 г/л, более предпочтительно от 1,5 до 3 г на л. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, содержит цистеин в количестве от 0,1 до 0,5 г на л водного субстрата, более предпочтительно от 0,2 до 0,4 г/л. Присутствие цистеина приводит к низкому окислительно-восстановительному потенциалу субстрата, что благоприятно для активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности бифидобактерий. Предпочтительно водная среда, содержащая молочный субстрат, включает дрожжевой экстракт в количестве от 0,5 до 5 г/л водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно, от 1,5 до 3 г/л. Дрожжевой экстракт является богатым источником кофакторов ферментов и факторов роста для бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Присутствие дрожжевого экстракта усилит ферментацию бактериями, продуцирующими молочную кислоту.

Соответственно молочный субстрат, в частности водная среда, содержащая молочный субстрат, пастеризуется перед стадией ферментации, чтобы исключить присутствие нежелательных живых бактерий. Соответственно продукт пастеризуется после ферментации, чтобы инактивировать ферменты. Соответственно инактивация ферментов происходит при 75°C в течение 3 мин. Соответственно водная среда, содержащая молочный субстрат, гомогенизируется до и/или продукт, полученный из молока, гомогенизируется после ферментации. Гомогенизация приводит к более стабильному субстрату и/или ферментированному продукту, особенно в присутствии жира.

Плотность инокуляции составляет предпочтительно от 1×10² до 5×10¹⁰, предпочтительно от 1×10⁴ до 5×10⁹ КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту/мл водной среды, содержащей молочный субстрат, более предпочтительно от 1×10⁷ до 1×10⁹ КОЕ бактерий, продуцирующих молочную кислоту/мл водной среды, содержащей молочный субстрат. Конечная плотность бактерий после ферментации составляет предпочтительно от 1×10³ до 1×10¹⁰, более предпочтительно от 1×10⁴ до 1×10⁹ КОЕ/мл водной среды, содержащей молочный субстрат.

Ферментацию предпочтительно проводят при температуре от приблизительно 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, еще более предпочтительно от приблизительно 37°C до 42°C. Оптимальная температура для роста и/или активности бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в частности лактобацилл и/или бифидобактерий составляет от 37°C до 42°C.

Инкубацию предпочтительно проводят при pH от 4 до 8, более предпочтительно от 6 до 7,5. Данный pH не вызывает осаждения белка и/или неприятного вкуса, в то время как бактерии, продуцирующие молочную кислоту, такие как лактобациллы и/или бифидобактерии, способны ферментировать молочный субстрат.

Время инкубации предпочтительно находится в диапазоне от 10 минут до 48 ч, предпочтительно от 2 ч до 24 ч, более предпочтительно от 4 ч до 12 ч. Достаточно долгое время позволяет ферментации и сопутствующей продукции иммуногенных клеточных фрагментов, таких как гликопротеины, гликолипиды, пептидогликан, липотейхоевая кислота (ЛТК), жгутики, липопротеины, ДНК и/или капсульные полисахариды и метаболиты (постбиотики), происходить в достаточной или в большей степени, в то время как время инкубации не должно быть без необходимости долгим по экономическим причинам.

Предпочтительно продукт, полученный из молока, или молочный субстрат, предпочтительно обезжиренное молоко пастеризуют, охлаждают и ферментируют одним или более штаммами, продуцирующими молочную кислоту, предпочтительно штаммом S. thermophilus до определенной степени кислотности, при которой ферментированный продукт охлаждают и хранят. Предпочтительно второй продукт, полученный из молока, получают аналогичным образом с использованием одного или более видов Bifidobacterium для ферментации. В дальнейшем два ферментированных продукта предпочтительно смешивают вместе и смешивают с другими компонентами, составляющими детскую смесь, за исключением жирового компонента. Предпочтительно смесь предварительно нагревают, и в дальнейшем жир добавляют в потоке, гомогенизируют, пастеризуют, и высушивают. Альтернативно, ферментация происходит при наличии как Bifidobacterium, предпочтительно B. breve, так и S. thermophilus в резервуаре для ферментации.

Способы получения ферментированной композиции, подходящей для целей настоящего изобретения, являются хорошо известными. EP 778885, который включен в настоящее описание посредством ссылки, раскрывает в частности в примере 7 подходящий способ получения ферментированной композиции. FR 2723960, который включен в настоящее описание посредством ссылки, раскрывает в частности в примере 6 подходящий способ получения ферментированной композиции. Вкратце, молочный субстрат, предпочтительно пастеризованный, содержащий лактозу и необязательно другие макроэлементы, такие как жиры, предпочтительно растительные жиры, казеин, сывороточный белок, витамины и/или минералы и т. д., концентрируют, например, от 15 до 50% сухого вещества и затем инокулируют S. thermophilus, например, 5% культуры, содержащей от 10⁶ до 10¹⁰ бактерий на мл. Предпочтительно этот молочный субстрат содержит пептиды молочного белка. Температура и продолжительность ферментации представляют собой, как указано выше. Соответственно, после ферментации ферментированная композиция может быть пастеризована или стерилизована и, например, высушена распылением или лиофилизирована, чтобы обеспечить форму, подходящую для приготовления конечного продукта.

Предпочтительный способ получения ферментированной композиции для использования в пищевой композиции изобретения раскрыт в WO 01/01785, более определенно в примерах 1 и 2. Предпочтительный способ получения ферментированной композиции для использования в пищевой композиции изобретения описан в WO 2004/093899, более определенно в примере 1.

Живые клетки бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в ферментированной композиции после ферментации предпочтительно удаляются, например, путем инактивации и/или физического удаления. Клетки предпочтительно инактивируют. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно уничтожаются нагреванием после ферментации молочного субстрата. Предпочтительными способами теплового уничтожения являются (мгновенная) пастеризация, стерилизация, сверхвысокотемпературная обработка, высокотемпературная/кратковременная термическая обработка и/или сушка распылением при температурах, когда бактерии не выживают. Фрагменты клеток предпочтительно получают с помощью термической обработки. При такой термической обработке предпочтительно инактивировано, по меньшей мере, 90% живых микроорганизмов, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 99%. Предпочтительно ферментированная пищевая композиция содержит менее 1×10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) живых молочнокислых бактерий на г сухой массы. Термическую обработку предпочтительно проводят при температуре в диапазоне от 70 до 180°C, предпочтительно от 80 до 150°C, предпочтительно в течение приблизительно от 3 минут до 2 часов, предпочтительно в диапазоне от 80 до 140°C в течение от 5 минут до 40 минут. Инактивация молочнокислых бактерий предпочтительно приводит к меньшему последующему подкислению и более безопасному продукту. Это особенно предпочтительно, когда пищевая композиция должна вводиться младенцам или детям преддошкольного возраста, и все же наблюдаются благоприятные эффекты на ротавирусные инфекции с ферментированной композицией, содержащей инактивированные молочнокислые бактерии. Соответственно после ферментации ферментированная композиция может быть пастеризована или стерилизована и, например, высушена распылением или лиофилизирована, чтобы предоставить форму, подходящую для приготовления конечного продукта.

Неперевариваемые олигосахариды

Настоящая пищевая композиция содержит неперевариваемые олигосахариды и предпочтительно содержит, по меньшей мере, два различных неперевариваемых олигосахарида, в частности два различных источника неперевариваемых олигосахаридов. Наличие неперевариваемых олигосахаридов необходимо для улучшения эффектов в отношении ротавирусной инфекции. Наличие как неперевариваемых олигосахаридов, так и, по меньшей мере, частично ферментированной композиции, в частности продукта молочного происхождения, полученного путем ферментации с бактериями, продуцирующими молочную кислоту, необходимо для улучшения антиротавирусного эффекта, в частности в отношении связывания ротавирусных частиц или блокирования частиц от мест адгезии на эпителиальных клетках кишечника.

Используемый в настоящем описании термин «олигосахариды» относится к сахаридам со степенью полимеризации (СП) от 2 до 250, предпочтительно СП от 2 до 100, более предпочтительно от 2 до 60, еще более предпочтительно от 2 до 10. Если олигосахарид с СП от 2 до 100 включен в настоящую пищевую композицию, это приводит к композициям, которые могут содержать олигосахариды с СП от 2 до 5, СП от 50 до 70 и СП от 7 до 60. Используемый в настоящем изобретении термин «неперевариваемые олигосахариды» относится к олигосахаридам, которые не перевариваются в кишечнике под действием кислот или пищеварительных ферментов, присутствующих в верхних отделах пищеварительного тракта человека, например, тонком кишечнике и желудке, но которые предпочтительно ферментируются кишечной микробиотой человека. Например, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины считаются перевариваемыми.

Предпочтительно настоящие неперевариваемые олигосахариды являются растворимыми. Используемый в настоящем описании термин «растворимый», когда он относится к полисахаридам, волокнам или олигосахаридам, означает, что вещество является, по меньшей мере, растворимым в соответствии со способом, описанным L. Prosky et al., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).

Неперевариваемые олигосахариды, включенные в настоящие пищевые композиции в способах или применениях в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно включают смесь различных неперевариваемых олигосахаридов. Неперевариваемые олигосахариды предпочтительно выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, таких как инулин, неперевариваемых декстринов, галактоолигосахаридов, таких как трансгалактоолигосахариды, ксилоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов глюкоолигосахаридов, гентиоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, нигероолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, хитоолигосахаридов, соевых олигосахаридов, фукоолигосахаридов, сиалилолигосахаридов и их смесей. Такие олигосахариды обладают многими биохимическими свойствами и обладают аналогичными функциональными преимуществами, включая улучшение функции кишечной микробиоты. Однако понятно, что некоторые неперевариваемые олигосахариды и предпочтительно некоторые смеси обладают еще более улучшенным эффектом. Следовательно, более предпочтительно неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, таких как инулин, и галактоолигосахаридов, таких как бетагалактоолигосахариды, и их смесей, еще более предпочтительно бетагалактоолигосахаридов и/или инулина, наиболее предпочтительно бетагалактоолигосахаридов. В одном варианте осуществления в пищевой композиции в соответствии с настоящим изобретением неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из галактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов и их смесей, более предпочтительно бетагалактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов и их смесей.

Неперевариваемый олигосахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из бета-галактоолигосахарида, альфа-галактоолигосахарида и галактана. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления неперевариваемый олигосахарид представляет собой бета-галактоолигосахарид. Предпочтительно неперевариваемый олигосахарид включает галактоолигосахарид с бета(1,4), бета(1,3) и/или бета(1,6)-гликозидными связями и концевой глюкозой. Трансгалактоолигосахарид, например, доступен под торговым наименованием Вивинал®GOS (Domo FrieslandCampina Ingredients), Bi2muno (Clasado), Cup-oligo (Nissin Sugar) и Oligomate55 (Yakult).

Неперевариваемые олигосахариды предпочтительно включают фруктоолигосахариды. Фруктоолигосахариды могут в другом контексте иметь названия, такие как фруктополисахариды, олигофруктоза, полифруктоза, полифруктан, инулин, леван и фруктан и могут относиться к олигосахаридам, содержащим бета-связанные звенья фруктозы, которые предпочтительно связаны бета(2,1) и/или бета(2,6)-гликозидными связями, и предпочтительно СП от 2 до 200. Предпочтительно фруктоолигосахариды содержат концевую бета(2,1)-гликозидную связанную глюкозу. Предпочтительно фруктоолигосахариды содержат, по меньшей мере, 7 бета-связанных звеньев фруктозы. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления используется инулин. Инулин представляет собой тип фруктоолигосахарида, в котором, по меньшей мере, 75% гликозидных связей представляют собой бета(2,1)-связи. Обычно инулин имеет среднюю длину цепи от 8 до 60 моносахаридных звеньев. Подходящий фруктоолигосахарид для применения в композициях настоящего изобретения является коммерчески доступным под торговым наименованием Рафтилин®HP (Orafti). Другими подходящими источниками являются Рафтилоза (Orafti), Фибрулоза и Фибрулин (Cosucra) и Фрутафит и Фруталоза (Sensus).

Предпочтительно настоящая пищевая композиция включает смесь галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов. Предпочтительно смесь галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов присутствует в массовом соотношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, более предпочтительно от 1/1 до 19/1, более предпочтительно от 2/1 до 15/1, более предпочтительно от 5/1 до 12/1, еще более предпочтительно от 8/1 до 10/1, еще более предпочтительно в соотношении приблизительно 9/1. Данное массовое соотношение наиболее предпочтительно, когда галактоолигосахариды имеют низкую среднюю СП и фруктоолигосахариды имеют относительно высокую СП. Наиболее предпочтительной является смесь галактоолигосахаридов со средней СП ниже 10, предпочтительно ниже 6 и фруктоолигосахаридов со средней СП выше 7, предпочтительно выше 11, еще более предпочтительно выше 20.

Предпочтительно настоящая пищевая композиция включает смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и длинноцепочечных фруктоолигосахаридов. Предпочтительно смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и длинноцепочечных фруктоолигосахаридов присутствует в массовом соотношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, еще более предпочтительно от 1/10 до 19/1, более предпочтительно от 1/5 до 15/1, более предпочтительно от 1/1 до 10/1. Предпочтительной является смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов со средней СП ниже 10, предпочтительно ниже 6 и фруктоолигосахаридов со средней СП выше 7, предпочтительно выше 11, еще более предпочтительно выше 20.

Предпочтительно настоящая пищевая композиция включает смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и короткоцепочечных галактоолигосахаридов. Предпочтительно смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и короткоцепочечных галактоолигосахаридов присутствует в массовом соотношении от 1/99 до 99/1, более предпочтительно от 1/19 до 19/1, еще более предпочтительно от 1/10 до 19/1, более предпочтительно от 1/5 до 15/1, более предпочтительно от 1/1 до 10/1. Предпочтительной является смесь короткоцепочечных фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов со средней СП ниже 10, предпочтительно ниже 6.

Предпочтительно пищевая композиция не содержит кислых олигосахаридов, полученных из пектина. Такие олигосахариды богаты олигосахаридами галактуроновой кислоты. В контексте настоящего изобретения кислые олигосахариды, полученные из пектина, характеризуются как смесь олигомеров галактуроновой кислоты со степенью полимеризации 2-30. Поэтому предпочтительно настоящая композиция не содержит олигосахаридов галактуроновой кислоты. Эти олигосахариды хорошо известны своей способностью блокировать адгезию патогенов к рецепторам в кишечнике. Тем не менее, как ни удивительно, их присутствие не требовалось для получения максимального блокирующего эффекта ротавирусных частиц, когда неперевариваемые олигосахариды объединяли с ферментированной пищевой композицией.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит от 2,5 до 20 масс.% общих неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно от 2,5 до 15 масс.%, еще более предпочтительно от 3,0 до 10 масс.%, наиболее предпочтительно от 5,0 до 7,5 масс.% в пересчете на сухую массу пищевой композиции. В пересчете на 100 мл настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит от 0,35 до 2,5 масс.% общих неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно от 0,35 до 2,0 масс.%, еще более предпочтительно от 0,4 до 1,5 масс.% в пересчете на 100 мл пищевой композиции. Меньшее количество неперевариваемых олигосахаридов будет менее эффективным в улучшении антиротавирусных эффектов, тогда как слишком большое количество приведет к побочным эффектам в виде вздутия живота и дискомфорта в животе.

Пищевая композиция

Пищевая композиция, используемая в соответствии с настоящим изобретением, также может рассматриваться как фармацевтическая композиция и подходит для введения младенцам. Настоящая пищевая композиция предпочтительно предназначена для энтерального введения, более предпочтительно для перорального введения.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно представляет собой молочную смесь первого уровня, молочную смесь второго уровня, молоко для детей преддошкольного возраста или молочную смесь третьего уровня, или молочную смесь третьего уровня, предназначенную для детей раннего возраста, или молочную смесь для детей раннего возраста. Более предпочтительно пищевая композиция представляет собой молочную смесь первого уровня или молочную смесь второго уровня. Настоящая пищевая композиция может предпочтительно применяться в качестве полноценного питания для младенцев. Предпочтительно настоящая пищевая композиция представляет собой молочную смесь первого уровня. Молочная смесь первого уровня определяется как смесь для использования у младенцев и может, например, быть начальной смесью, предназначенной для младенцев в возрасте от 0 до 6 или от 0 до 4 месяцев. Молочная смесь второго уровня предназначена для младенцев в возрасте от 4 или 6 месяцев до 12 месяцев. В этом возрасте младенцы начинают отлучаться от груди и переходить на другую пищу. Молоко для детей преддошкольного возраста, или молочная смесь третьего уровня, или молочная смесь для детей раннего возраста предназначена для детей в возрасте от 12 до 36 месяцев. Настоящая композиция предпочтительно содержит липидный компонент, белковый компонент и углеводный компонент и предпочтительно вводится в жидкой форме. Настоящая пищевая композиция также может быть в сухой форме, предпочтительно в форме порошка, к которому прилагаются инструкции по смешиванию указанной сухой формы, предпочтительно порошка с подходящей жидкостью, предпочтительно водой. Пищевая композиция, используемая в соответствии с изобретением, предпочтительно содержит другие фракции, такие как витамины, минералы, микроэлементы и другие питательные микроэлементы, чтобы сделать ее полной пищевой композицией. Предпочтительно молочные смеси первого уровня содержат витамины, минералы, микроэлементы и другие питательные микроэлементы в соответствии с международными директивами.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит липид, белок и перевариваемый углевод, в которой липид обеспечивает от 5 до 50% общего количества калорий, белок обеспечивает от 5 до 50% общего количества калорий и перевариваемый углевод обеспечивает от 15 до 90% общего количества калорий. Предпочтительно в настоящей пищевой композиции липид обеспечивает от 35 до 50% общего количества калорий, белок обеспечивает от 7,0 до 12,5% общего количества калорий и перевариваемый углевод обеспечивает от 40 до 55% общего количества калорий. Для расчета % общего количества калорий для белка необходимо учитывать общую энергию, обеспечиваемую белками, пептидами и аминокислотами. Предпочтительно липид обеспечивает от 3 до 7 г липидов на 100 ккал, предпочтительно от 4 до 6 г на 100 ккал, белок обеспечивает от 1,6 до 4 г на 100 ккал, предпочтительно от 1,7 до 2,5 г на 100 ккал и перевариваемый углевод обеспечивает от 5 до 20 г на 100 ккал, предпочтительно от 8 до 15 г на 100 ккал пищевой композиции. Предпочтительно настоящая пищевая композиция содержит липид, обеспечивающий от 4 до 6 г на 100 ккал, белок, обеспечивающий от 1,6 до 2,0 г на 100 ккал, более предпочтительно, от 1,7 до 1,9 г на 100 ккал, и перевариваемый углевод, обеспечивающий от 8 до 15 г на 100 ккал пищевой композиции. В одном варианте осуществления липид обеспечивает от 3 до 7 г липидов на 100 ккал, предпочтительно от 4 до 6 г на 100 ккал, белок обеспечивает от 1,6 до 2,1 г на 100 ккал, предпочтительно от 1,6 до 2,0 г на 100 ккал и перевариваемый углевод обеспечивает 5 до 20 г на 100 ккал, предпочтительно от 8 до 15 г на 100 ккал пищевой композиции, и при этом предпочтительно перевариваемый углеводный компонент содержит, по меньшей мере, 60 масс.% лактозы в пересчете на общее количество перевариваемых углеводов, более предпочтительно, по меньшей мере, 75 масс.%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 90 масс.% лактозы в пересчете на общее количество перевариваемых углеводов. Общее количество калорий определяется суммой калорий, полученных из белков, липидов, перевариваемых углеводов и неперевариваемых олигосахаридов.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит перевариваемый углеводный компонент. Предпочтительными перевариваемыми углеводными компонентами являются лактоза, глюкоза, сахароза, фруктоза, галактоза, мальтоза, крахмал и мальтодекстрин. Лактоза представляет собой основной перевариваемый углевод, присутствующий в грудном молоке. Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит лактозу. Поскольку настоящая пищевая композиция включает ферментированную композицию, которую получают с помощью ферментации бактериями, продуцирующими молочную кислоту, количество лактозы снижается по сравнению с ее источником вследствие ферментации, в результате которой лактоза превращается в лактат и/или молочную кислоту. Следовательно, при получении настоящей пищевой композиции предпочтительно добавляют лактозу. Предпочтительно настоящая пищевая композиция не содержит больших количеств углеводов, кроме лактозы. По сравнению с перевариваемыми углеводами, такими как мальтодекстрин, сахароза, глюкоза, мальтоза и другими перевариваемыми углеводами с высоким гликемическим индексом, лактоза имеет более низкий гликемический индекс и поэтому является предпочтительной. Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит перевариваемый углевод, в которой, по меньшей мере, 35 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75 масс.%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90 масс.%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95 масс.% перевариваемого углевода представляет собой лактозу. В пересчете на сухую массу настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит, по меньшей мере, 25 масс.% лактозы, предпочтительно, по меньшей мере, 40 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50 масс.% лактозы.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит, по меньшей мере, один липид, выбранный из группы, состоящей из липидов животного происхождения (за исключением липидов человека) и липидов растительного происхождения. Предпочтительно настоящая композиция включает комбинацию растительных липидов и, по меньшей мере, одного масла, выбранного из группы, состоящей из рыбьего жира, животного жира, масла водорослей, грибкового масла и бактериального масла. Липид настоящей пищевой композиции предпочтительно обеспечивает от 3 до 7 г на 100 ккал пищевой композиции, предпочтительно липид обеспечивает от 4 до 6 г на 100 ккал. В жидкой форме, например, в качестве жидкости, готовой к применению, пищевая композиция предпочтительно содержит от 2,1 до 6,5 г липидов на 100 мл, более предпочтительно от 3,0 до 4,0 г на 100 мл. В пересчете на сухую массу настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит от 12,5 до 40 масс.% липидов, более предпочтительно от 19 до 30 масс.%. Предпочтительно липид включает незаменимые жирные кислоты альфа-линоленовую кислоту (АЛК), линолевую кислоту (ЛК) и/или длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA). LC-PUFA, ЛК и/или АЛК могут быть предоставлены в виде свободных жирных кислот, в форме триглицеридов, в форме диглицеридов, в форме моноглицеридов, в форме фосфолипидов или в виде смеси одного или более из вышеуказанного. Предпочтительно настоящая пищевая композиция содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно, по меньшей мере, два источника липидов, выбранных из группы, состоящей из рапсового масла (такого как сурепное масло, рапсовое масло с низким содержанием эруковой кислоты и каноловое масло), высокоолеинового подсолнечного масла, высокоолеинового сафлорового масла, оливкового масла, масел из морепродуктов, микробных масел, кокосового масла, пальмоядрового масла. Настоящая пищевая композиция не представляет собой грудное молоко.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит белок. Белок, используемый в пищевой композиции, предпочтительно выбран из группы, состоящей из белков животного происхождения, не относящихся к человеку, предпочтительно молочных белков, растительных белков, таких как предпочтительно соевый белок и/или рисовый белок и их смесей. Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит казеин и/или сывороточный белок, более предпочтительно бычий сывороточный белок и/или бычий казеин. Таким образом, в одном варианте осуществления белок в настоящей пищевой композиции включает белок, выбранный из группы, состоящей из сывороточного белка и казеина, предпочтительно сывороточного белка и казеина, предпочтительно сывороточного белка и/или казеина из коровьего молока. Предпочтительно белок содержит менее 5 масс.% в пересчете на общее количество белка свободных аминокислот, дипептидов, трипептидов или гидролизованного белка. Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит казеин и сывороточные белки при массовом соотношении казеин:сывороточный белок от 10:90 до 90:10, более предпочтительно от 20:80 до 80:20, еще более предпочтительно от 35:65 до 55:45.

Масс.% белка в пересчете на сухую массу настоящей пищевой композиции рассчитывается в соответствии с методом Кьельдаля с помощью измерения общего количества азота и использования коэффициента пересчета 6,38 в случае казеина или коэффициента пересчета 6,25 для других белков, кроме казеина. Используемый в настоящем изобретении термин «белок» или «белковый компонент» относится к сумме белков, пептидов и свободных аминокислот.

Настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит белок, обеспечивающий от 1,6 до 4,0 г белка на 100 ккал пищевой композиции, предпочтительно от 1,6 до 3,5 г, даже более предпочтительно от 1,75 до 2,5 г на 100 ккал пищевой композиции. В одном варианте осуществления настоящая пищевая композиция содержит белок, обеспечивающий от 1,6 до 2,1 г белка на 100 ккал пищевой композиции, предпочтительно от 1,6 до 2,0 г, более предпочтительно от 1,7 до 2,1 г, еще более предпочтительно от 1,75 до 2,0 г на 100 ккал пищевой композиции. В одном варианте осуществления настоящая пищевая композиция содержит белок в количестве менее 2,0 г на 100 ккал, предпочтительно от 1,6 до 1,9 г, даже более предпочтительно от 1,75 до 1,85 г на 100 ккал пищевой композиции. Слишком низкое содержание белка в пересчете на общее количество калорий приведет к снижению адекватного роста и развития младенцев и детей раннего возраста. Слишком большое количество вызовет метаболическую нагрузку, например, на почки младенцев и детей раннего возраста. В жидкой форме, например, в качестве жидкости, готовой к применению, пищевая композиция предпочтительно содержит от 0,5 до 6,0 г, более предпочтительно от 1,0 до 3,0 г, еще более предпочтительно от 1,0 до 1,5 г белка на 100 мл, наиболее предпочтительно от 1,0 до 1,3 г белка на 100 мл. В пересчете на сухую массу настоящая пищевая композиция предпочтительно содержит от 5 до 20 масс.% белка, предпочтительно, по меньшей мере, 8 масс.% белка в пересчете на сухую массу общего количества пищевой композиции, более предпочтительно от 8 до 14 масс.%, еще более предпочтительно от 8 до 9,5 масс.% белка в пересчете на сухую массу общего количества пищевой композиции.

Чтобы удовлетворить потребности в калориях младенца или ребенка преддошкольного возраста, пищевая композиция предпочтительно содержит от 45 до 200 ккал/100 мл жидкости. Для младенцев пищевая композиция более предпочтительно содержит от 60 до 90 ккал/100 мл жидкости, еще более предпочтительно от 65 до 75 ккал/100 мл жидкости. Такая калорийность обеспечивает оптимальное соотношение между потреблением воды и калорий. Для детей преддошкольного возраста, детей в возрасте от 12 до 36 месяцев пищевая композиция более предпочтительно имеет калорийность от 45 до 65, еще более предпочтительно от 50 до 60 ккал/100 мл. Осмолярность настоящей композиции предпочтительно составляет от 150 до 420 мосмоль/л, более предпочтительно от 260 до 320 мосмоль/л. Низкая осмолярность направлена на дальнейшее снижение желудочно-кишечного стресса, который может повлиять на ротавирусную инфекцию.

Когда пищевая композиция находится в готовой к применению жидкой форме, предпочтительный объем, вводимый ежедневно, находится в диапазоне от приблизительно 80 до 2500 мл, более предпочтительно от приблизительно 200 до 1200 мл в день. Предпочтительно количество кормлений в день составляет от 1 до 10, предпочтительно от 3 до 8. В одном варианте осуществления пищевую композицию вводят ежедневно в течение периода, по меньшей мере, 2 дней, предпочтительно в течение периода, по меньшей мере, 4 недель, предпочтительно в течение периода, по меньшей мере, 8 недель, более предпочтительно в течение периода, по меньшей мере, 12 недель в жидкой форме, в котором общий объем, вводимый ежедневно, составляет от 200 мл до 1200 мл и в котором количество кормлений в день составляет от 1 до 10.

Настоящая пищевая композиция, когда она находится в жидкой форме, предпочтительно имеет вязкость от 1 до 60 мПа⋅с, предпочтительно от 1 до 20 мПа⋅с, более предпочтительно от 1 до 10 мПа⋅с, наиболее предпочтительно от 1 до 6 мПа⋅с. Низкая вязкость обеспечивает правильное введение жидкости, например, соответствующий проход через всю соску. Также данная вязкость очень похожа на вязкость грудного молока. Кроме того, низкая вязкость приводит к нормальному опорожнению желудка и лучшему потреблению энергии, что очень важно для младенцев, которым необходима энергия для оптимального роста и развития. В качестве альтернативы настоящая пищевая композиция находится в порошковой форме, подходящей для разведения водой до состояния, готового к применению. Настоящую пищевую композицию предпочтительно готовят путем смешивания порошковой композиции с водой. Обычно таким образом готовят молочную смесь первого уровня. Таким образом, настоящее изобретение также относится к упакованной энергетической композиции, в котором указанная упаковка снабжена инструкциями по смешиванию порошка с подходящим количеством жидкости, что приводит к получению жидкой композиции с вязкостью от 1 до 60 мПа⋅с. Вязкость жидкости определяют с помощью Physica Rheometer MCR 300 (Physica Messtechnik GmbH, Остфильдерн, Германия) при скорости сдвига 95 с^-1 при 20°C.

Применение

Способы или применения в соответствии с настоящим изобретением, включающие введение настоящей пищевой композиции, также относятся к введению эффективного количества пищевой композиции объекту, нуждающемуся в таком лечении, предпочтительно младенцу или ребенку раннего возраста.

Авторы изобретения обнаружили, что комбинация ферментированной формулы (обеспечивающей постбиотические соединения) и смеси неперевариваемых олигосахаридов показала способность ослаблять ротавирусную инфекцию и диарею, вызванную ротавирусом. Ферментированная формула, обогащенная неперевариваемыми олигосахаридами, уменьшала частоту возникновения, продолжительность и степень тяжести диареи. Кроме того, комбинация могла непосредственно взаимодействовать с вирусом и усиливать иммунную систему хозяина. Неожиданно улучшенный эффект ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами наблюдался по сравнению с ферментированной смесью, не содержащей неперевариваемых олигосахаридов, или неперевариваемыми олигосахаридами при анализе прямого блокирования ротавирусных частиц. Это свидетельствует о снижении ротавирусной нагрузки в желудочно-кишечном тракте. Вирусная нагрузка, также известная как концентрация вируса в крови или титр вируса, представляет собой числовое выражение количества инфекционных вирусных частиц на мл. Более высокая вирусная концентрация, титр или нагрузка часто коррелирует со степенью тяжести инфекции.

Кроме того, наибольшие антиротавирусные эффекты по продолжительности, частоте возникновения и степени тяжести наблюдались в группе, которой вводили как неперевариваемые олигосахариды, так и ферментированную смесь. Особенно эффект сокращения продолжительности лечения наблюдался только в этой группе и не может быть объяснен эффектами неперевариваемых олигосахаридов или ферментированной смеси отдельно. Интересно, что комбинация ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами в наибольшей степени увеличивала барьерную функцию кишечника во время ротавирусной инфекции, как было оценено по проницаемости кишечного барьера с использованием анализа альфа-1-антитрипсина. Не желая быть связанными теорией, наблюдаемое улучшение барьерной функции кишечника можно объяснить неожиданным увеличением содержания масляной кислоты в кишечнике. Бутират известен как топливо для эпителиальных клеток кишечника и для улучшения кишечного барьера. Повышенный уровень масляной кислоты больше, чем можно было ожидать, исходя из уровней, обнаруженных для группы получения неперевариваемых олигосахаридов или ферментированной смеси отдельно.

Не желая быть связанными теорией, более низкий уровень вирусовыделения после вмешательства предполагает, что анализируемые компоненты могут влиять на связывание с вирусом. Этот независимый от микробиоты антиинфекционный эффект комбинации неперевариваемых олигосахаридов и ферментированной смеси может включать прямое взаимодействие с патогенами и может быть связан с мимикрией рецепторов. Таким образом, некоторые компоненты вводимой смеси могут действовать как растворимые аналоги рецепторов для определенных молекул хозяина, к которым может прикрепиться вирус. Следовательно, это взаимодействие между патогеном и комбинацией ферментированной смеси и неперевариваемых олигосахаридов может вытеснить прикрепившийся патоген из эпителиальных клеток тонкой кишки, тем самым снижая инфекционную нагрузку или инфекционность ротавируса и таким образом снижая частоту возникновения, продолжительность и/или степень тяжести диареи. Кроме того, наблюдалось пониженное вирусовыделение и другой системный и кишечный иммунный ответ. Также важным является открытие, что ротавирусная инфекция вызвала замедленный прирост массы, в основном наблюдаемый после периода диареи, и что эффекты, вызванные этой ротавирусной инфекцией, на прирост массы улучшились в группе, которая получала комбинацию ферментированной смеси и смеси неперевариваемых олигосахаридов. Наблюдалось не только влияние на рост, в частности на массу тела, но также наблюдалось влияние на относительную массу органов в группе, которая была инфицирована ротавирусом. Селезенка, печень, тонкий и толстый кишечник были уменьшены по массе, даже по относительной массе (масс.% общей массы тела) группы РВ по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует о том, что не только рост, но также развитие страдает после ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом. Однако эти эффекты были улучшены и больше похожи на неинфицированную контрольную группу в группе, которая получала комбинацию ферментированной смеси и смеси неперевариваемых олигосахаридов. Профилактика потери массы, или профилактика замедления роста или слабого роста (в частности, прироста массы), или профилактика замедленного развития органов, таких как печень, селезенка, тонкий кишечник и/или толстый кишечник имеет первостепенное значение для развития и роста младенца или ребенка раннего возраста. Эти наблюдения указывают как на улучшенный рост (в частности, прирост массы), так и на улучшенное развитие младенца или ребенка раннего возраста после ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, при введении пищевой композиции настоящего изобретения.

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу или применению для профилактики вызванного ротавирусной инфекцией замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития, более предпочтительно замедленного прироста массы или слабого прироста массы у младенцев или детей раннего возраста. Предпочтительно способ или применение для профилактики вызванного ротавирусной инфекцией замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития у младенцев или детей раннего возраста представляет собой профилактику замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития в период после ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом. Этот способ или применение может быть достигнуто путем введения пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды.

Следовательно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу или применению для профилактики и/или лечения ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом. Более определенно, в различных вариантах осуществления влияние на ротавирусную инфекцию или диарею, вызванную ротавирусом, представляет собой снижение частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции, или сокращение продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции, или снижение степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции. В дополнительных вариантах осуществления влияние на ротавирусную инфекцию или диарею, вызванную ротавирусом, представляет собой профилактику вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития, или увеличение блокирования ротавирусных частиц, или снижение ротавирусной нагрузки, или увеличение барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции. Изобретение в одном варианте осуществления относится к способу или применению для блокирования ротавирусных частиц, снижения ротавирусной нагрузки и/или снижения выделения ротавируса. Это достигается введением пищевой композиции, как описано выше, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, в частности scGOS и lcFOS, младенцу или ребенку раннего возраста.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции, или сокращения продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции, или уменьшения степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекции, или профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста и/или замедленного развития или слабого развития, или увеличения блокирования ротавирусных частиц, или снижения ротавирусной нагрузки, или увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции, с помощью введения пищевой композиции, как описано выше, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, в частности scGOS и lcFOS, для младенца или ребенка раннего возраста.

Для всех способов и применений заявленные предпочтительные эффекты проявляются по сравнению с младенцами, которым не вводят пищевую композицию настоящего изобретения; другими словами, по сравнению с младенцами, которым вводят пищевую композицию, которая, по меньшей мере, частично не ферментируется и не содержит неперевариваемых олигосахаридов.

Настоящая пищевая композиция вводится младенцу или ребенку раннего возраста от 0 до 36 месяцев. Предпочтительно пищевая композиция вводится младенцу, то есть ребенку в возрасте от 0 до 12 месяцев, более предпочтительно младенцу в возрасте от 0 до 6 месяцев.

В данном документе и в его формуле изобретения глагол «содержать» и его спряжения используются в неограничивающем смысле для обозначения того, что элементы, следующие за словом, включены, но элементы, не упомянутые специально, не исключаются. Кроме того, ссылка на элемент единственного числа не исключает возможности наличия более одного элемента, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Единственное число, таким образом, обычно означает «по меньшей мере, один. Масс.% означает массовой процент. Если не указано иначе, под днем понимается период 24 ч (начинающийся и заканчивающийся в полночь).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Влияние ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами на ротавирусную инфекцию у крыс

Материалы и методы

Штамм ротавируса (РВ), выбранный для инфекции (обезьяний SA-11), получали, как описано в Pérez-Cano F J, et al., 2007, Pediatr. Res. 2007;62: 658-663. Вкратце, репродукцию вирусов проводили в эмбриональных клетках почки африканской зеленой мартышки (МА-104) и титровали как TCID₅₀/мл (TCID, инфекционная доза в тканевой культуре). Вирусы были произведены в соответствии с действующими принципами надлежащей лабораторной практики.

Беременные крысы линии Lewis G14 были получены от Janvier (Ле-Жене-Сент-Иль, Франция) и содержались отдельно в клетках (2184L Eurostandard Type II L, Tecniplast, Уэст-Честер, Пенсильвания, США) с подстилкой из крупных волокнистых частиц и тонкой бумаги в качестве отделки. За ними ежедневно наблюдали и разрешали роды в срок. День рождения регистрировали как день 1 жизни. Потомство объединяли по семь детенышей/самка с одинаковым количеством представителей каждого пола в каждом гнезде. Детеныши имели свободный доступ к соскам и крысиной диете. Самки имели доступ к воде и коммерческой пище (Teklad Global Diet 2014, Envigo, Индианаполис, Индиана, США), соответствующей Американскому институту питания (AIN)-93G диете без ограничения. Каждую самку и ее подстилку содержали индивидуально в условиях контролируемой температуры и влажности в цикле 12 ч:12 ч свет:темнота. Кроме того, животные были помещены в специальное безопасное изолированное помещение, специально предназначенное и допущенное для работы в условиях уровня биобезопасности 2.

Были исследованы экспериментальная пища или пищевые компоненты:

1) Термически ферментированная молочная смесь первого уровня. Ферментированное молоко было получено путем ферментации молочной смеси первого уровня с Bifidobacterium breve C50 и Streptococcus thermophilus 065 в процессе изготовления. В результате этого процесса в композицию смеси добавляли активные бактериальные метаболиты и фрагменты клеток (постбиотические соединения). Она была доступна на рынке во Франции под наименованиями Calisma и Apaisia, как продукт от Bledina. Подходящие способы получения этой молочной смеси первого уровня описаны в примере 1 WO 2004/093899.

2) Смесь неперевариваемых олигосахаридов scGOS (источник Вивинал®GOS, Borculo Domo FrieslandCampina) и lcFOS (источник Рафтилин®HP, Orafti) в соотношении 9:1 масс./масс.

3) Наполнитель: Наполнитель пищевой композиции или ингредиентов в 1 и 2 представлял собой минеральную воду.

Новорожденных в подсосный период крыс G14 Lewis разделяли на несколько различных экспериментальных групп:

1) референтная группа (REF), которая представляла собой контрольную группу, которая не была инфицирована ротавирусом и не получала коррекции режима питания.

2) группа ротавируса (РВ), которая представляла собой контрольную группу, которая была инфицирована ротавирусом и не получала коррекции режима питания

3) исследуемая группа (FM+G/F), которая была инфицирована ротавирусом и получала ферментированное молоко (FM), как описано выше, и смесь неперевариваемых олигосахаридов scGOS/lcFOS (G/F). FM и G/F вводили в количестве 3 г/100 г массы тела/день и 0,8 г/100 г массы тела/день, соответственно.

Каждая группа состояла из трех пометов по семь детенышей в каждом (n=21/группа). Группа REF и РВ получила наполнитель в том же количестве, что и группа FM+G/F. Рацион питания или наполнитель вводили со дня 3 жизни до последнего дня эксперимента. Инокуляцию РВ проводили на день 7 жизни.

SA-11 инокулировали (2×10⁸ TCID₅₀/крыса в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) на день 7 жизни крысам на вскармливании из групп РВ и FM+G/F. Инокуляции РВ проводили через 1 ч после отделения от их самок, чтобы избежать взаимодействия между РВ и компонентами молока. Группа REF получала такой же объем ФСБ при тех же условиях.

Инфекцию SA-11 оценивали на дни 8-21 по скорости роста и клиническим показателям, полученным из образцов кала. Забор кала проводили один раз в день путем легкого надавливания и массажа брюшной части. Образцы немедленно оценивали, взвешивали и замораживали при -20°C для дальнейшего анализа.

Животных умерщвляли в двух различных временных точках: трех животных из каждого помета умерщвляли через 1 неделю после инокуляции РВ на день 14 (n=9/группа), в то время как другие четыре животных из каждого помета продолжали получать рацион питания до конца периода вскармливания на день 21 (n=12/группа). В день умерщвления кровь собирали пункцией сердца для определения гематокрита (HCT) и получения сыворотки, которую хранили при -20°C до дальнейшего анализа. Взвешивали печень, селезенку, толстую и тонкую кишку. Кроме того, тонкую кишку разрезали на части размером 5 мм и инкубировали с ФСБ в течение 10 мин при 37°C в шейкере для получения раствора кишечника (GW). После центрифугирования супернатанты хранили при -20°C до анализа.

Степень тяжести диареи оценивали как по массе кала, так и по шкале стула. Образцы кала оценивали от 1 до 4 (индекс диареи, DI) в зависимости от цвета, текстуры и количества в соответствии со следующей шкалой: нормальный (индекс диареи=1), рыхлый желто-зеленый (индекс диареи=2), полностью рыхлый желто-зеленый (индекс диареи=3), большое количество водянистого (индекс диареи=4) кала. Показатель диареи ≥2 указывает на диарейный кал, тогда как показатели индекса диареи ˂2 указывают на отсутствие диареи. Кроме того, для определения глобального значения степени тяжести диареи проводили анализ площади под кривой (AUC) степени тяжести в течение периода диареи (дни 7-13). Максимальный индекс диареи определяли как наивысший показатель за период диареи.

Частота возникновения диареи выражалась в % животных с диареей (% DA), учитывая количество животных в каждой группе, и в % диарейного кала (% DF), принимая во внимание количество общих образцов, собираемых каждый день в каждой группе. AUC % животных с диареей и % диарейного кала в течение дней 7-13 были рассчитаны как глобальное значение частоты возникновения. Максимальный % животных с диареей и диарейного кала был определен как самые высокие значения в течение периода диареи. Период диареи рассчитывали для каждого животного как интервал между первым и последним днем диареи. Также учитывались фактические дни диареи в период диареи.

Во всех случаях средние значения и AUC для степени тяжести, % DA и % DF рассчитывали с учетом исходных значений вследствие свойственных аспектов каждого лечения; по существу вычитая исходные значения за день до инокуляции ротавирусом вследствие свойственных аспектов каждого лечения (нормализованные результаты). Этот эффект особенно заметен в группах, потребляющих G/F, вследствие свойственного эффекта разжижения стула.

УФ-инактивированные частицы SA-11 при 10⁵/мл использовали для покрытия 96-луночных планшетов (Nunc MaxiSorp, Висбаден, Германия). После блокирования ФСБ-1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, 1 ч, комнатная температура [КТ]) добавляли соответствующие разбавленные образцы сыворотки или образцы промывания кишечника (3 ч, КТ). Кроличий анти-крысиный Ig, конъюгированный с пероксидазой, от Dako (Барселона, Испания), или мышиный биотинилированный анти-крысиный IgA (A93-2), IgG1/2a (R19-15), или IgM (G53-238) моноклональные антитела (МАт) от BD Biosciences (Гейдельберг, Германия) добавляли после промывания. После этого добавляли конъюгированный с пероксидазой экстравидин (Sigma-Aldrich, Мадрид, Испания) и субстрат. Объединенные сыворотки от РВ-инфицированных животных из предыдущих исследований использовали в качестве положительного контроля в каждом планшете. Использовали квадратичную полиномиальную корректировку. Концентрация общих анти-РВ Ab и анти-РВ IgG, IgA и IgM Abs из группы РВ получила значение 100 условных единиц (AU)/мл, и результаты для группы FM+P и со дня 21 были выражены относительно данного значения.

Образцы кала до 10 дней после инокуляции вируса (возраст 7-16 дней) разводили в ФСБ до 20 мг/мл и гомогенизировали с использованием Polytron (Kinematica, Люцерн, Швейцария). Гомогенаты кала центрифугировали (200 g, 5 мин, 4°C) и супернатанты замораживали при -20°C до использования. Вирусные частицы в гомогенатах кала определяли количественно с помощью вышеупомянутого метода ELISA.

Для статистического анализа использовали пакет программ PASW Statistics 20 (SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс, США). Критерии Колмогорова-Смирнова и Левена применяли для оценки нормального распределения и равенства дисперсии соответственно. Стандартный однофакторный дисперсионный анализ ANOVA проводили с учетом экспериментальной группы в качестве независимой переменной. Когда инокуляция SA-11/лечение оказывали значительное влияние на зависимую переменную, применяли ретроспективный анализ Шеффе. U-критерии Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни использовали, когда обнаруживали ненормальное распределение или различную дисперсию. Наконец, критерий хи-квадрат использовали для сравнения частоты возникновения диареи. Различия считались значимыми при значениях P˂0,05. Все результаты выражены как среднее значение и стандартная ошибка среднего числа животных.

Результаты

Влияние на рост:

У всех животных регистрировали массу тела, и ни рацион питания, ни вирусная инфекция не влияли на их рост. Никаких различий не наблюдали до 1 недели после инокуляции (день 14). Это означает, что потерю массы тела вследствие инфекции или влияние рациона питания можно не учитывать. Однако в конечной точке эксперимента на день 21 (n=9/группа) наблюдали некоторые различия. В группе РВ наблюдали значительное снижение массы тела по сравнению с группами REF и FM+G/F. Если принять во внимание общую прибавку массы тела (% со дня 2 до 21), то индукция потери массы тела в группе РВ (p <0,05) и защита с помощью коррекции FM+G/F все еще наблюдается (см. Таблицу 1).

Таблица 1: Масса тела (г) во время исследования, до и после инокуляции вируса на день 7. Результаты выражены как средние значения и стандартная ошибка среднего (n=21 животное/группа).

Возраст МТ (г) REF РВ FM+G/F День Среднее значение SEM Среднее значение SEM Среднее значение SEM 2 6,45 0,10 6,92 0,24 6,22 0,10 7 11,66 0,24 11,83 0,22 11,10 0,20 14 23,32 0,37 23,17 0,41 22,96 0,48 21 34,6 0,66 28,76⃰ 0,42 36,11 0,40

⃰p˂0,05 по сравнению с REF

В группе REF наблюдали относительное увеличение массы тела на 411,11%. В группе РВ это было значительно ниже (p˂0,05) и 310,45%. В группе FM+G/F этого уменьшенного увеличения массы тела не наблюдали, и относительное увеличение составило 439,90%.

Влияние на органы

Ротавирусная инфекция также вызвала некоторые изменения массы органов как на день 14, так и на 21. В частности, через 7 дней после инфекции (день 14 жизни) РВ инфекция вызвала более низкую относительную массу селезенки и более высокую относительную массу печени (p˂0,05 по сравнению с REF). Влияние на массу печени также наблюдали в группе FM+G/F, но влияние на селезенку улучшалось в группе FM+G/F. Результаты на день 21 показали значительное влияние на группу РВ с более низкой относительной массой селезенки, печени и тонкой кишки (SI) по сравнению с группой REF (p˂0,05). Также относительная масса толстой кишки была ниже. Однако добавление смеси FM+G/F предотвратило влияние РВ инфекции на эти переменные (p˂0,05 по сравнению с РВ), и относительная масса была выше и статистически не отличалась от референтной группы.

Частота возникновения диареи

Для оценки частоты возникновения диареи использовали два различных подхода: % животных с диареей (% DA) и % диарейного кала (% DF).

% DA показал, что почти все животные с инокуляцией РВ, 95-100%, в какой-то момент демонстрировали диарею. Как и ожидалось, менее чем у 5% животных из группы REF (без инокуляции РВ) наблюдали диарею. % DA в группе РВ был выше 80% в течение первых 4 дней непосредственно после инокуляции SA-11 (со дня 8 по 11 жизни). После этого этот процент снизился, и на день 13 ни у одного из животных в группе РВ не было кала, подобного диарее. Животные из группы FM+G/F показали некоторое улучшение во время периода диареи. В частности, эта группа показала тенденцию к снижению % DA по сравнению с группой РВ, начиная с двух дней после индукции инфекции (день 8-11). Наблюдали улучшение частоты возникновения диареи, которое было значительно ниже, чем в группе РВ, на день 9 и 10 жизни (p˂0,05).

Расчет частоты возникновения диареи как % DF, который учитывает только количество диарейного кала по отношению к полученным образцам кала, показал ту же модель, что и вышеупомянутые результаты для всех групп, и наблюдали еще более предпочтительный эффект в группе FM+G/F; показывая более низкий % диарейного кала на день 8, 9, 10, 11 и 12.

Процесс диареи в группе РВ начался через 1-2 дня после инокуляции и закончился приблизительно на день 11 жизни. И период диареи, и дни с диареей составляли от 3 до 4 дней. В группе FM+G/F продолжительность этих периодов была немного короче, в частности если смотреть на % диарейного кала (DF). В этом случае продолжительность диареи была сокращена, и уже на день 11 не наблюдали диарейного кала. В любом случае, группа РВ имела максимальную частоту возникновения (% DA и % DF) через 3 дня после индукции РВ (день 10), тогда как группа FM+G/F показала наибольшее значение в первый день после инфицирования (день 8).

Когда были рассчитаны как % DA-AUC (площадь под кривой), так и % DF-AUC, группа РВ имела значения 328,57 и 362,06 условных единиц, соответственно, тогда как у животных REF не развивалась диарея и значения AUC составляли приблизительно 0. В группе FM+G/F наблюдали четкое общее снижение. % DA-AUC был снижен до 207,14 (63% по сравнению с группой РВ), и % DF-AUC был снижен до 107,87 (30% от группы РВ).

Степень тяжести диареи

Индекс диареи (DI) в группе РВ был выше 2,5 со дня 8 по день 10, после чего средний показатель снизился приблизительно до 2 на день 11 и даже ниже после этого, что указывает на отсутствие диареи у большинства животных. В группе FM+G/F наблюдали значительное снижение и DI был ниже 2 во все дни после инфицирования, за исключением первого дня.

AUC модели степени тяжести (sAUC) составляла 5,99 в группе РВ. Значительное снижение sAUC до 3,27 (приблизительно 55%) наблюдали в группе FM+G/F (p˂0,05), демонстрируя общее снижение степени тяжести процесса.

Вирусовыделение

Вирусовыделение оценивали после инокуляции (дни 7-16). У всех инокулированных РВ животных максимальная элиминация вируса (p˂0,054 по сравнению с REF) произошла в первый день после инокуляции (день 8), тогда как после этого не наблюдали различий между группами REF и РВ. В первый день после инокуляции коррекция FM+G/F частично позволила избежать такого увеличения выделения, показывая более низкую вирусную нагрузку, чем в группе РВ (приблизительно 35%; p˂0,05) и больше напоминая животных REF.

Иммунный ответ

Сывороточные специфические анти-РВ антитела (общие, IgG, IgM и IgA) и кишечные IgA и IgM оценивали на день 14 и 21 жизни. Группа РВ имела измеримые уровни специфических общих анти-РВ, IgA, IgG и IgM в сыворотке и кишечнике даже на день 14 жизни по сравнению с группой REF.

Пищевая добавка с FM+G/F была способна модифицировать специфический гуморальный иммунный ответ в отношении РВ. На день 14, в то время как рацион питания, по-видимому, не влиял на общие сывороточные анти-РВ антитела, наблюдали тенденцию к увеличению IgM, значительному увеличению IgG (p˂0,05 по сравнению с РВ) и значительному снижению IgA (p˂0,05 по сравнению с РВ).

В отношении кишечного отдела наблюдали тенденцию к индуцированию более высоких уровней IgA на день 14, но более низких уровней на день 21 вследствие рациона питания FM+G/F. По-видимому, смесь FM+G/F усиливает ранний ответ (день 14) с точки зрения сывороточного анти-РВ IgG и кишечного анти-РВ IgA.

Пример 2: Эксперименты по блокированию ротавируса

Проводили анализ блокирования in vitro для исследования способности FM+G/F, FM или G/F связываться с ротавирусом SA11. 96-луночный планшет совместно инкубировали с 5×10⁴ частиц/мл SA-11 в ФСБ-Твин 1 масс.% с различными разведениями пищи или пищевых компонентов (разведения в минеральной воде) и инкубировали в течение 30 мин. Несвязанные вирусные частицы количественно определяли с помощью ELISA (Pérez-Cano F J, et al., 2007, Pediatr Res 2007;62: 658-663). Частицы вируса SA-11 (от 10⁵ до 10³/мл) использовали в качестве стандарта в каждом планшете. Этот анализ позволяет количественно определить количество частиц SA-11, обнаруженных после инкубации с несколькими разведениями продукта, также как процент ингибирования. FM+G/F в неразведенной форме составлял 267 мг/мл, из которых 211 мг/мл FM и 56 мг G/F. Для FM и G/F исходные растворы составляли 211 мг/мл и 56 мг/мл соответственно. Эти количества были выбраны, поскольку они соответствуют суточному потреблению в примере 1.

Результаты показаны в Таблице 2. Все разведения пищи или пищевых компонентов, использованные в примере 1, обладают ингибирующей активностью. В частности FM+G/F показал высокую связывающую активность, что указывает на высокий блокирующий потенциал этой смеси.

Таблица 2: Процент ингибирования обнаружения частиц РВ после инкубации с G/F, FM и FM+G/F при различных разведениях пищи и/или пищевых компонентов. Результаты выражены с их SEM дубликатов из трех независимых экспериментов.

Продукт G/F FM FM+G/F Кратность разведения продукта) Среднее значение (SEM) Среднее значение (SEM) Среднее значение (SEM) 1/60 10,87⃰ (2,86) 68,56⃰ (8,66) 91,67⃰ (1,94) 1/6 19,98⃰ (2,6) 41,16⃰ (8,7) 98,12⃰ (0,9) 1/3 28,44⃰ (2,35) 29,72⃰ (8,2) 98,9⃰ (0,37) 1/2 39,41⃰ (3,79) 29,68⃰ (10,36) 97,16⃰ (0,59)

⃰p˂0,05 по сравнению с % ингибирования без добавления продукта. Нд: нет данных

#p˂0,05 по сравнению с % ингибирования продуктов с G/F или FM отдельно.

Полагают, что связывание ротавирусных частиц является предпочтительным. Их блокирование путем непосредственного взаимодействия предотвратит или уменьшит проникновение ротавируса в энтероциты и репликацию в тонком кишечнике. Связывание ротавирусных частиц было намного выше с FM+G/F, чем можно было ожидать, основываясь на данных для G/F и FM отдельно. Эти результаты свидетельствуют о неожиданном улучшенном эффекте потребления композиции, содержащей как комбинацию частично ферментированной композиции, так и неперевариваемые олигосахариды, на профилактику и/или лечение ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом. В частности, можно ожидать эффекта профилактики, снижения вирусной нагрузки ротавирусной инфекции, и это может привести к пониженной степени тяжести, пониженной частоте возникновения и пониженной продолжительности ротавирусной диареи и/или пониженному вирусовыделению по сравнению с композициями, не содержащими ферментированную композицию или неперевариваемые олигосахариды.

Пример 3: Влияние ферментированной смеси с неперевариваемыми олигосахаридами на ротавирусную инфекцию у крыс

Проводили эксперимент, аналогичный примеру 1, за исключением того, что инокуляцию РВ проводили на день 5. Измеряли дополнительную кишечную проницаемость и измеряли короткоцепочечные жирные кислоты слепой кишки, как известно в данной области техники.

Были исследованы экспериментальная пища или пищевые компоненты:

1) Термически ферментированная молочная смесь первого уровня. Ферментированное молоко было получено путем ферментации молочной смеси первого уровня с Bifidobacterium breve C50 и Streptococcus thermophilus 065 в процессе изготовления. В результате этого процесса в композицию смеси добавляли активные бактериальные метаболиты и фрагменты клеток (постбиотические соединения). Она была доступна на рынке во Франции под наименованиями Lactofidus или Lactofidia как продукт от Bledina. Применяли дополнительную стадию нагрева для уничтожения бактерий, продуцирующих молочную кислоту, после стадии ферментации (10 мин, 90°C). Разница с формулой в примере 1 состоит в том, что имеет место незначительно повышенная ферментация и выработка молочной кислоты. Количество L-молочной кислоты составляло приблизительно 1,1 г на 100 г.

2) Смесь неперевариваемых олигосахаридов scGOS (источник Вивинал®GOS, Borculo Domo FrieslandCampina) и lcFOS (источник Рафтилин®HP, Orafti) в соотношении 9:1 масс./масс.

3) Наполнитель: Наполнитель пищевой композиции или ингредиентов в 1 и 2 представлял собой минеральную воду.

Новорожденных в подсосный период крыс G14 Lewis разделяли на несколько различных экспериментальных групп:

1) референтная группа (REF), которая представляла собой контрольную группу, которая не была инфицирована ротавирусом и не получала коррекции режима питания.

2) группа ротавируса (РВ), которая представляла собой контрольную группу, которая была инфицирована ротавирусом и не получала коррекции режима питания.

3) исследуемая группа (G/F), которая была инфицирована ротавирусом и получала смесь неперевариваемых олигосахаридов scGOS/lcFOS (G/F). G/F вводили в количестве 0,8 г/100 г массы тела/день, соответственно.

4) исследуемая группа (FM), которая была инфицирована ротавирусом и получала ферментированное молоко (FM). FM вводили в количестве 3 г/100 г массы тела/день.

5) исследуемая группа (FM+G/F), которая была инфицирована ротавирусом и получала ферментированное молоко (FM), как описано выше, и смесь неперевариваемых олигосахаридов scGOS/lcFOS (G/F). FM и G/F вводили в количестве 3 г/100 г массы тела/день и 0,8 г/100 г массы тела/день, соответственно.

В качестве контроля были также включены 3 группы крыс, которые получали те же добавки, что и группы 3, 4 и 5, но без ротавирусной инфекции. Значения диареи, полученные в этих группах, использовали в качестве исходного уровня для нормализации индекса диареи DI и частоты возникновения диареи (% DA).

Результаты:

На основании индекса диареи (DI) эпизод диареи длился со дня 6 (1 день после инокуляции РВ) по день 9 в группе 2 РВ. В день 10 диарея прекратилась во всех группах. Продолжительность диареи, определяемая с помощью DI, была одинаковой в группах 3 и 4. Максимальный DI в дни диареи (день 6-9) наблюдали в группе 2. В группе 5 диарея, основанная на DI, была на день 9 уже значительно ниже, чем в группе 2 РВ. Во все дни диареи DI был самым низким в группе 5. Это свидетельствует о более короткой продолжительности диареи в экспериментальной группе 5.

Частота возникновения диареи (исходя из количества животных, страдающих диареей, исходя из общего количества животных, % DA) была самой низкой в группе 5. На день 9 только в группе 5 частота возникновения диареи уже отсутствовала, тогда как она все еще присутствовала в группах 2, 3 и 4, указывая на укороченную продолжительность или ротавирусную инфекцию при введении комбинации FM и NDO.

Таблица 3: Показатели частоты возникновения диареи с нормализацией

Показатель Группа 2 (РВ) Группа 3 (G/F) Группа 4 (FM) Группа 5 (G/F+FM) MDA 58,33 8,33 34,79 4,17 DA-AUC 166,66 29,52 86,23 8,33

MDA, животные с максимальной диареей (%), DA-AUC: площадь под кривой модели % DA.

Максимальная частота возникновения диареи (MDA), пиковая частота возникновения была значительно ниже (с использованием критерия хи-квадрат) в группе 5 по сравнению с группой 2. MDA также был снижен в группах 3 и 4 по сравнению с группой 2. Площадь под кривой индекса диареи в ходе эксперимента была самой низкой в группе 5 (8,33) и самой высокой - в группе 2 (166,66). Это значение составляло 29,52 в группе 3 и 86,23 в группе 4. Кроме того, низкое значение в группе 5 является ниже, чем ожидалось, исходя из эффектов в группах 3 и 4 отдельно. Это указывает на пониженную степень тяжести в группе, которая потребляет как FM, так и G/F.

Кишечную проницаемость определяли с помощью уровней альфа-1-антитрипсина при промывке кишечника в день 8. Интересно, что комбинация FM с G/F в наибольшей степени увеличивала барьерную функцию кишечника во время ротавирусной инфекции.

Наблюдаемое улучшение барьерной функции кишечника можно объяснить неожиданным увеличением содержания масляной кислоты в кишечнике в группе 5. Бутират известен как топливо для эпителиальных клеток кишечника и для улучшения кишечного барьера. Уровень бутирата слепой кишки в группе 2 составлял 239,21 мкмоль/г материала слепой кишки. Повышенный уровень масляной кислоты в группе 5 (484,39 мкмоль/г материала слепой кишки) является больше, чем можно было ожидать, исходя из уровней, обнаруженных для группы 3 (164,75 мкмоль/г материала слепой кишки, т.е. снижение бутирата) и 4 (309,72 мкмоль/г материала слепой кишки) отдельно.

Изобретение относится к области питания младенцев и детей раннего возраста. Предложено применение ферментированной композиции и неперевариваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды для лечения и/или профилактики ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста. При этом в составе питательной композиции неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, неперевариваемых декстринов, галактоолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, гентиоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, нигероолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, хитоолигосахаридов, соевых олигосахаридов, сиалилолигосахаридов, и фукоолигосахаридов, и их смесей. Пищевую композицию вышеуказанного состава используют для снижения частоты возникновения, степени тяжести и продолжительности диареи, вызванной ротавирусом, или ротавирусной инфекцией, а также для профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста и развития или слабого роста и развития, увеличения блокировки ротавирусных частиц, снижения ротавирусной нагрузки и/или увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции у младенца или ребенка раннего возраста. Питательная композиция проявляет синергетический эффект при использовании ферментированной композиции с неперевариваемыми олигосахаридами для лечения и/или профилактики ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Применение ферментированной композиции и неперевариваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, в которой неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, неперевариваемых декстринов, галактоолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, гентиоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, нигероолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, хитоолигосахаридов, соевых олигосахаридов, сиалилолигосахаридов, и фукоолигосахаридов, и их смесей,

для лечения и/или профилактики ротавирусной инфекции или диареи, вызванной ротавирусом, у младенца или ребенка раннего возраста.

2. Применение ферментированной композиции и неперевариваемых олигосахаридов для изготовления пищевой композиции, которая, по меньшей мере, частично ферментируется бактериями, продуцирующими молочную кислоту, и содержит неперевариваемые олигосахариды, в которой неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов, неперевариваемых декстринов, галактоолигосахаридов, ксилоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, гентиоолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов, маннанолигосахаридов, изомальтоолигосахаридов, нигероолигосахаридов, глюкоманноолигосахаридов, хитоолигосахаридов, соевых олигосахаридов, сиалилолигосахаридов, и фукоолигосахаридов, и их смесей, для

а. снижения частоты возникновения диареи, вызванной ротавирусом или ротавирусной инфекцией,

b. снижения продолжительности диареи, вызванной ротавирусом или ротавирусной инфекцией,

c. снижения степени тяжести диареи, вызванной ротавирусом или ротавирусной инфекцией,

d. профилактики вызванного ротавирусом замедленного роста или слабого роста, и/или замедленного развития, или слабого развития,

е. увеличения блокировки ротавирусных частиц,

f. снижения ротавирусной нагрузки, и/или

g. увеличения барьерной функции кишечника при ротавирусной инфекции

у младенца или ребенка раннего возраста.

3. Применение по п.2, в котором снижение, профилактика или увеличение наблюдается по сравнению с младенцем или ребенком раннего возраста, которому вводят пищевую композицию, которая, по меньшей мере, частично не ферментируется и не содержит неперевариваемых олигосахаридов.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевая композиция содержит от 0,1 до 1,5 мас.% суммы молочной кислоты и лактата в пересчете на сухую массу композиции и, предпочтительно, в которой сумма L-молочной кислоты и L-лактата составляет более 50 мас.% в пересчете на сумму общего количества молочной кислоты и лактата.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевая композиция содержит бактерии, продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium и Streptococcus, предпочтительно обеих.

6. Применение по любому из пп.1-4, в котором пищевая композиция содержит инактивированные бактерии, продуцирующие молочную кислоту.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевая композиция содержит от 2,5 до 15 мас.% неперевариваемых олигосахаридов в пересчете на сухую массу пищевой композиции.

8. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором неперевариваемые олигосахариды выбраны из группы, состоящей из галактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов, предпочтительно обоих.

9. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевая композиция не содержит кислых олигосахаридов, полученных из пектина, в частности олигосахаридов галактуроновой кислоты.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором пищевая композиция представляет собой молочную смесь первого уровня или молочную смесь второго уровня.