Питательная среда для культивирования дрожжей SACCHAROMYCES Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при культивировании микроорганизмов для биохимических и микробиологических исследований.

В настоящее время в лабораторной практике для культивирования дрожжей широко применяются твердые питательные среды, содержащие источники углеводного, азотного и минерального питания: YPD, Ридера, Чапека, Сабуро и др.

Известно, что питательная среда YPD содержит дрожжевой экстракт, пептон, глюкозу, агар-агар.

В среду Ридера добавляют различные соли: сульфат аммония, сульфат магния, нитрат кальция, хлорид натрия, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия; витамины: инозит, биотин, пантотеновую кислоту, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту. Для изучения размножения дрожжей предусмотрено добавление 2%, брожения - 5-10% сахара.

Среда Чапека состоит из сахарозы или глюкозы, дигидрофосфата калия, нитрата натрия, сульфата магния, хлорида калия, сульфата железа, агара. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды.

Среда Сабуро отличается сложностью изготовления. Основой ее служит дрожжевая вода, для приготовления которой свежие прессованные дрожжи кипятят в течение 20-30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают на холоде в течение 12 ч. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят до требуемого значения рН. К стерильной дрожжевой воде добавляют пептон, агар, глюкозу или мальтозу; фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют.

Однако накопленные практические данные по использованию известных сред не позволяют определить универсальную, простую в изготовлении, доступную и эффективную питательную среду. Недостатком известных способов являются: трудоемкость технологического процесса, дополнительные затраты на приобретение питательных солей. При этом, как правило, источники питания являются дорогостоящими и дефицитными [1].

Наиболее близкой к заявляемой среде является твердая питательная среда YPD (прототип) [2].

Состав:

дрожжевой экстракт - 0.5%

пептон - 0.5%

D-глюкоза - 2.0%

агар-агар - 2.5±1.0

рН 4.58±0.2

дистиллированная вода - до 1 л.

К недостаткам данной среды относится применение дорогостоящего дрожжевого экстракта и, по нашему мнению, недостаточное обеспечение питанием необходимыми микро- и макроэлементами.

Целью изобретения является разработка универсальной питательной среды для культивирования дрожжей рода Saccharomyces, характеризующейся биохимической ценностью и практической значимостью. Технический результат направлен на повышение выхода биомассы дрожжей и удешевление процесса.

Поставленная цель достигается тем, что модифицированная твердая питательная среда, содержащая пептон, D-глюкозу, агар-агар, готовится на основе геотермальной воды в качестве дополнительного источника минерального и органического питания с общей минерализацией 6.5-7.0 г/л, разбавленную дистиллированной водой до минерализации 3.3-3.5 г/л. Критерием для отбора природной геотермальной воды служило отсутствие фенолов, свинца, ртути, а также степень минерализации и органолептические свойства.

С учетом вышесказанного, при конструировании универсальной модифицированной питательной среды мы исходили из необходимости содержания в среде факторов роста (микро - и макроэлементы, органические соединения), а также источника энергии (D-глюкоза). Дистиллированная вода, как основной растворитель питательных веществ, заменена на геотермальную с разбавлением 1:1, что позволит обогатить питательную среду биологически активными веществами. Применение агар-агара обеспечивает плотную основу для формирования колоний. Ранее данная геотермальная вода была использована нами в составе жидких питательных сред для получения прессованных дрожжей [3, 4].

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известного отсутствием дрожжевого экстракта, частичной заменой дистиллированной воды геотермальной, расширением солевого состава за счет большего содержания микро- и макроэлементов природной воды. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию «новизна».

Расширенный лабораторный анализ геотермальной воды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и тд.) показал качественное и количественное отличие ее от дистиллированной. Преимущество использования сульфатно - хлоридно - гидрокарбонатно - натриевой геотермальной воды из скважины №36 (г. Махачкала, Республика Дагестан) складывается из следующих показателей (г/л): аммоний 0.0050, натрий 2.4280, калий 0.0168, магний 0.0100, кальций 0.0182, железо 0.00013 марганец 0.000065, кобальт 0.000003, алюминий 0.0007, цинк 0.000069, медь 0.000008, литий 0.0003, стронций 0.0019, фтор 0.0005, хлор 1.212, бром 0.0028, йод 0.0002, сульфаты 2.7455, гидрокарбонаты 0.7515, карбонаты 0.1002, нитрат 0.0010, фосфаты 0.0000474, борная 0.0148 и кремниевая 0.0192 кислоты; органические компоненты, в том числе (мг/л): битумы нейтральные - 1.0, битумы кислые - 0.7 и гумусовые вещества - 3.0. Геотермальная вода имеет формулу:

Инкубацию дрожжевых культур осуществляли на чашках Петри в микробиологическом термостате Binder-115 (США) при рабочей температуре 30°С, рН 4.5. Контрольные варианты твердых питательных сред, приготовленные с использованием дистиллированной воды, представлены следующим составом: YPD (контроль) [2] -дрожжевой экстракт - 0.5% (BD, США), пептон - 0.5% (BD, США), D-глюкоза - 2.0% (Merk, Германия), агар-агар - 2.5% (Difco, Нидерланды); PD (контроль₁) - все перечисленные выше компоненты, кроме дрожжевого экстракта, растворяли в дистиллированной воде до объема 1 л (таблица).

Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания дрожжей Saccharomyces может быть проиллюстрирована нижеследующими опытными вариантами.

Опытные варианты (Опыт₁, Опыт₂) сред на основе PD готовили следующим образом: пептон - 0.5% (BD, США), D-глюкоза - 2.0% (Merk, Германия), агар-агар - 2.5% (Difco, Нидерланды) растворяли в:

- геотермальной воде 100% (вместо дистиллированной воды) (Опыт₁);

- смеси геотермальная / дистиллированная вода в соотношении 1:1 с общим объемом до 1 л. (Опыт₂) (таблица).

Взвешивание субстратов осуществляли на аналитических весах DV215CD (Ohaus Discovery, Швейцария). Кислотность среды рН 4.5 корректировали IN НСl (Россия) на рН-метре Hanna Instrumental рН 211 (Германия). Стерилизацию среды производили в автоклаве при давлении 0.1 МПа в течение 20 мин. После охлаждения до 50°С среду разливали в чашки Петри. После застывания среду слегка подсушивали в термостате при температуре (30±2)°С в течение суток.

Оценку сред проводили посевом свежевыделенных 3-х суточных коллекционных культур S. cerevisiae Y-503 [5] и S. oviformis М-12Х [6]. Результаты роста гигантских колоний учитывали через 20 суток (фото). Опыты повторяли в 3-х повторностях.

В результате серии экспериментов подобран вариант среды с оптимальной концентрацией геотермальной воды в составе питательной среды. При учете полученных данных проведен сравнительный анализ эффективности опытных сред по интенсивности роста, величине колоний. Многочисленными исследованиями установлено отрицательное воздействие не разбавленной геотермальной воды на размножение клеток и рост колоний дрожжей. Напротив, в опытных вариантах сред, разбавленная геотермальная вода, содержащая оптимальный комплекс органических и минеральных соединений, оказала благоприятное влияние на рост гигантских колоний указанных штаммов (таблица, фото б, г). Безусловно, по ростовым свойствам Опыт₁ (с полной заменой дистиллированной воды геотермальной) и контроль, на основе дистиллированной воды, показали несколько худшие результаты (таблица).

Морфология клеток опытного варианта S. cerevisiae Y-503 отличалась крупными округло-овальными клетками с большим накоплением запасных веществ. Колония представлена в виде цветка; окраска бежевая; поверхность матовая, с радиально исчерченными лепестками; профиль плоский; край светлый, волнистый; структура мажущаяся (таблица, фото б).

Морфология клеток опытного варианта S. oviformis М-12Х отличалась округло-овальными клетками меньшего размера с большим количеством вакуолей; единицы - с запасными веществами. Дрожжи формировали колонию округло-овальной формы; окраска темно-бежевая; поверхность матовая, с многочисленными односторонними бороздами; профиль плоский; край светлый, волнистый; структура мажущаяся (таблица, фото г).

В контрольном варианте клетки обоих штаммов имели округлую, овальную и удлиненную форму с содержанием до 90% вакуолей. Размеры клеток, как и колоний, закономерно меньше, чем в опытных вариантах сред (таблица, фото а, в).

Проведенные исследования показали, что предлагаемый состав твердой среды на основе геотермальной воды, является оптимальным и обуславливает относительную сбалансированность среды по питательному составу, что способствует наиболее активному росту дрожжей. Геотермальная вода, используемая для разбавления питательных солей вместо дистиллированной, значительно удешевляет процесс приготовления за счет исключения дрожжевого экстракта. Таким образом, на изготовление среды не требуется ощутимых материальных затрат, так как месторождения геотермальных вод доступны в условиях Дагестана и отдельных территорий России.

Условные обозначения к илюстрациям:

Таблица. Изменение микробиологических параметров клеток и колоний дрожжей S. cerevisiae Y-503 и S. oviformis М-12Х в зависимости от состава питательной среды Фото. Клетки и колонии штаммов S. cerevisiae Y-503 (а, б) и S. oviformis М-12Х (в, г). Модифицированная питательная среда PD-агар: контроль, приготовленный на основе дистиллированной воды (а, в); опыт - на разбавленной геотермальной воде 1:1 (б, г)

Список литературы

1. Пермякова Л.В. Классификация стимуляторов жизненной активности дрожжей // Техника и технология пищевых производств. 2016. Т. 42. N 3. С.46-55.

2. Аливердиева Д.А., Мамаев Д.В., Лагутина Л.С. Транспорт сукцината в клетки Saccharomyces cerevisiae после продолжительной холодовой преинкубации // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. №5. С.485-577.

3. Абрамов Ш.А., Гасанова С.М., Магомаева Д.М., Алиева М.Ю., Кадыров А.Г. Питательная среда для выращивания дрожжей // А.с. СССР №1730140. Б.И. N 16. 1992.

4. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Далгатова Б.И. Аливердиева Д.А., Халилова Э.А. Способ получения питательной среды для выращивания хлебопекарных дрожжей // Патент РФ №2084519. Б.И. №20. 1997.

5. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Далгатова Б.И., Мамаев А.Т., Пейсахова Д.С. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503, используемый в производстве хлебобулочных изделий // А.с. СССР №1284998. Б.И. N 3. 1987.

6. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Макуев А.-С.М., Власова O.K., Нахшунов Р.И. Штамм дрожжей Saccharomyces oviformis Махачкалинская 12Х, используемый для производства шампанских виноматериалов и столовых вин // А.с. №1104149. Б.И. N 27. 1984.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой питательную среду Pd-агар для культивирования дрожжей рода Saccharomyces, содержит пептон, D-глюкозу, агар-агар, геотермальную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования. 1ил., 1 табл.

Питательная среда PD-агар для культивирования дрожжей рода Saccharomyces, содержащая пептон, D-глюкозу, агар-агар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит геотермальную и дистиллированную воду в соотношении 1:1 при следующем содержании исходных компонентов, %: пептон - 0,5; D-глюкоза - 2,0; агар-агар - 2,5; геотермальная / дистиллированная вода 1:1 - до 1 л, при этом геотермальная вода содержит (г/л):

Аммоний - 0,0050

Натрий - 2,4280

Калий - 0,0168

магний - 0,0100

кальций - 0,0182

железо - 0,00013

марганец - 0,000065

кобальт- 0,000003

алюминий - 0,0007

цинк - 0,000069

медь - 0,000008

литий - 0,0003

стронций - 0,0019

фтор - 0,0005

хлор- 1,212

бром - 0,0028

йод - 0,0002

сульфаты - 2,7455

гидрокарбонаты - 0,7515

карбонаты - 0,1002

нитрат - 0,0010

фосфаты- 0,0000474

борную кислоту - 0, 0148

кремниевую кислоту - 0,0192

органические компоненты, в том числе (мг/л):

битумы нейтральные - 1,0,

битумы кислые - 0,7

гумусовые вещества - 3,0.