Способ профилактики респираторных вирусных инфекций (гриппа) Российский патент 2023 года по МПК A61M15/08 A61K31/79 A61P31/16 

Изобретение относится к области медицины, точнее к профилактике респираторных вирусных инфекций (гриппа), и может найти широкое практическое применение для разработки средств контроля за респираторными вирусными инфекциями человека.

Грипп, несмотря на очевидные успехи в области вакцинологии и химиотерапии, продолжает оставаться трудно контролируемой инфекцией. Это обусловлено особенностями самого возбудителя, в первую очередь, высокой скоростью эволюции, что приводит к ускользанию от иммунного ответа и формированию лекарственно-устойчивых мутантов [Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020. V.39. №7. P.1201-1208]. Поэтому наряду со средствами специфической терапии применяются патогенетические препараты, направленные на подавление реактивных процессов, таких как цитокиновый шторм, воспалительная инфильтрация тканей органов-мишеней и пр. [Crit Care. 2019.V.23. №1. P.214]. В этой связи поиск новых противовирусных лекарственных средств, в особенности неспецифических и эффективных в отношении вирусов разных антигенных групп, является приоритетной задачей медицинской науки.

Полимерные синтетические соединения проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе в отношении самых разных групп вирусов. Так, активность сульфатированных полисахаридов из морских водорослей, таких как галактансульфат, сульфатированный ксиломаннан, каррагенан и пр., была показана в отношении аденовируса, вируса гриппа, респираторно-синцитиального вируса, коронавируса и пр. [Pharmaceutics. 2021. V.13. №5. P.733]. Фосфат-содержащие полимеры синтезируются в клетках и являются одним из факторов противовирусной защиты, в частности, против вируса SARS-CoV-2 [Theranostics. 2021. V.11. №13. P.6193-6213]. Сходную активность проявляют и синтетические полифосфаты против коронавируса [Biochem Pharmacol. 2020. V.182. P.114215; Mar. Drugs. 2020. V.18. №12. P.639.] и в отношении ВИЧ [Chem Biodivers. 2012. V.9. №10. P.2186-2194; Bioorg. Med. Chem. 2010. V.18. №1. P.242-248].

Для неспецифической защиты от гриппозной инфекции используются местно препараты интерферона на полимерных носителях, что позволяет увеличить время присутствия активного вещества в носовой полости. Такая обработка стимулирует местный неспецифический иммунитет слизистых оболочек носовой полости, повышая тем самым порог инфицирования (J Interferon Res. 1984 Fall;4(4):535-41; J Virol. 2009 Apr;83(8):3843-51). Однако такие средства требуют присутствия интерферона - рекомбинантного белкового препарата, требующего сложного биотехнологического производства и соблюдения температурного режима хранения и транспортировки. Кроме того, в клинической практике для профилактики гриппа рекомендуется местное применение оксолиновой мази на основе оксолина (диоксотетрагидрокситетрагидронафталина), обладающей вирулицидной активностью. Строгих доказательств эффективности у оксолиновой мази нет.

В экспериментах описано интраназальное применение полиэтиленимина (Mw 20 kDa) как мукозального адьюванта, снижающего смертность животных от гриппозной пневмонии при интраназальном применении в концентрации 400 мкг/мл на 60% и вирусную активность примерно на порядок (Emerg Microbes Infect., 2016;5(4):e41). Описано также аналогичное использование окисленных полисахаридов - декстранов, приводящее к 5-30%-ному снижению смертности животных при инфицировании вирусом гриппа (Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Vol. 165, No. 2, June, 2018, 248-251), а также карагенана, приводящего к 20%-ной защите животных и проявляющего синергидную активность с противогриппозным препаратом прямого действия - занамивиром (PLoS ONE 10(6): e0128794).

Для профилактики и лечения гриппозной инфекции в настоящее время широко используют противовирусные препараты прямого действия - ингибиторы нейраминидазы, такие как осельтамивира фосфат (Тамифлю) (BMC Infect Dis. 2021;Vol.21, No.1, 887-891). Наряду с профилактическим эффектом, однако, Тамифлю способствует развитию вирусной резистентности к препарату, в особенности при использовании его среди лиц с ослабленной иммунной системой (J Clin Med. 2021, Vol.10, No.16, 3521).

Сходная активность описана для агониста TLR2 пальмитоилцистеина (Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 2710-2718) (90% защиты), полиглутаминовой кислоты (Virology Journal (2015) 12:160-169). В клинической практике ни одно из перечисленных соединений не используется.

С учетом приведенных данных актуальной задачей является необходимость разработки эффективного и безопасного средства неспецифической профилактики гриппозной инфекции.

Задача решается заявляемым изобретением - способ профилактики гриппозной инфекции, состоящий в том, что интразанально вводят водный раствор полимерного вещества, выбранного из ряда, включающего сополимеры винилфосфоновой кислоты (ВФК) с 4-акрилоилморфолином, содержащие 30-70 мол.% винилфосфоновой кислоты с молекулярной массой (20-70)⋅10³.

Заявляемый способ профилактики респираторных вирусных инфекций реализуется совокупностью следующих существенных признаков:

1. Сополимер винилфосфоновой кислоты с 4-акрилоилморфолином (ВФК-4-АМ), имеющий структурную формулу:

где:

n = 30-70 мол. %

m =70-30 мол. %

2. Интраназально вводят раствор сополимера ВФК-4-АМ в физиологическом растворе, концентрация полимера составляет 300 мкг/мл, объем раствора - 30 мкл.

Сополимеры ВФК с 4-АМ получают методом свободно-радикальной сополимеризации. Сополимеризация проводится в запаянных ампулах в инертной атмосфере в водном растворе или в диметилформамиде (ДМФ. В качестве инициатора используется 2,2’-азобис-изобутиронитрил (ДАК) или 2,2'-азобис-(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (АМП)

Синтез сополимера ВФК-4-АМ

2,50 г 4-АМ (0,0177моль), 1,91 г ВФК (0,0177моль) и 0,044 г АМП (1 мас. % от массы мономеров)в 18 мл воды (20 % концентрация) нагревают при 60° C в течение 24 часов. Затем сополимер для удаления низкомолекулярных примесей подвергают диализу против воды. Используют диализные мембраны Spectra/Por 7 фирмы “Spectrum Lab. Inc.” (США), позволяющие удалять соединения с молекулярной массой М≤1000. Сополимер из водных растворов выделяют лиофильной сушкой. Выход: 1,7 г (39 %).

Строение сополимера подтверждают методами ИК и ЯМР спектроскопии. Состав устанавливают с помощью ¹Н и ³¹Р ЯМР-спектроскопии в растворе D₂О на спектрометре Bruker Avance 400 (Германия). В качестве внешнего стандарта при определении состава используют 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин. Полученный сополимер содержит 56 мол. % звеньев ВФК. Молекулярную массу определяют методом седиментации и диффузии, его М_SD=33×10³.

Аналогично получены другие сополимеры, условия их синтеза и характеристикти приведены в таблице 1.

Таблица 1 Условия синтеза и характеристики сополимеров ВФК (М₁) с 4-АМ N Условия сополимеризации Характеристики сополимеров [M₁]:[M₂],
мол.% [M₁+M₂], мас.% Растворитель I [I],
масс. % от
[M₁+M₂] Выход,
% [M₁],
мол. % М_SD•10^-3 1 50:50 20 Н₂О AMP 1 38 56 33 2 75:25 20 Н₂О AMP 0,5 45 70 20 3 35:65 20 ДМФА AIBN 2 71 31 70

где:

I - инициатор

Методика биологических исследований

В работе использовали вирус гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) из коллекции вирусных штаммов НИИЭМ им. Пастера. Для заражения мышей использовали заражающую дозу 2.5×10³ ЭИД₅₀/животное из расчета по 0,025 мл вируссодержащего материала в каждую ноздрю.

Пример 1.

Навески полимеров растворяют в физиологическом растворе и вводят животным (10 животных на группу) однократно интраназально (300 мкг/мл, 30 мкл на животное) за 1 ч. до инфицирования. Животные контрольной группы (плацебо) получают 30 мкл физиологического раствора.

Мышей заражают интраназально под эфирным наркозом вирусом гриппа A\Puerto Rico/8/34 (H1N1) в дозе 5×10³ TCID₅₀ на мышь в объеме 30 мкл. В качестве препарата сравнения используют противогриппозный препарат Тамифлю (осельтамивира фосфат), применяемый в клинике для лечения гриппа. Наблюдение за животными осуществляют в течение 14 дней. Ежедневно фиксируют гибель животных. Достоверность различий в гибели животных оценивают при помощи критерия Мантела-Кокса при анализе кривых выживаемости Каплана-Мейера пакета программ GraphPad Prism v.6.01. Достоверными считали различия между группами, если параметр p не превышал 0,05.

Результаты изучения динамики гибели животных суммированы в Таблице 2 и представлены на Фиг. 1.

Таблица 2. Активность фосфорсодержащих полимеров на модели летальной гриппозной пневмонии у мышей. Группа опыта Показатели смертности в группе Погибших животных (пало/заражено) Смертность, % ИЗ p Плацебо 9/10 90 - 1.0000 1 и/н (56 мол.% ВФК, ММ=33000) 0/10 0 100 <0.0001 2 и/н (31 мол.% ВФК, ММ=70000) 4/10 40 56 0.0706 3 и/н (70 мол. % ВФК, ММ=20000) 2/10 20 78 0.0010 Тамифлю 1/10 10 88 0,0005

где:

ИЗ - индекс защиты;

p - критерий Мантела-Кокса для попарных сравнений с группой плацебо;

и/н - интраназальное введение полимеров за 1 ч. до инфицирования вирусом.

Как видно из представленных данных, животные, получившие полимер 1 за 1 час после заражения, выжили все. Полимеры 2 и 3 приводили к снижению доли погибших животных, при этом в случае 3 этот эффект достигал статистических значимых величин, а в случае 2 - нет.

Пример 2.

Для оценки длительности протективного эффекта наиболее эффективного полимера 1 его вводят животным интраназально за 4, 3, 2 или 1 час до инфицирования, либо одновременно с инфицированием. Мыши были интраназально инфицированы вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Животные группы положительного контроля получали Тамифлю перорально при помощи желудочного зонда (20 мг/кг/сут. раз в день в течение 4 суток после заражения). Животные группы отрицательного контроля не получали препаратов.

Гибель животных в группах опыта фиксировали ежедневно в течение 15 дней после инфицирования. Результаты исследования представлены на Фиг. 2.

Графические материалы:

Фиг. 1. Кривые выживаемости Каплана-Мейера в ходе гриппозной пневмонии у мышей, вызванной вирусом гриппа A/Puerto Rico (H1N1) в условиях интраназального применения сополимеров 4-АК с винилфосфоновой кислотой. Плацебо - животные получали интраназально физиологический раствор.

Фиг. 2. Кривые выживаемости Каплана-Мейера в ходе гриппозной пневмонии у мышей, вызванной вирусом гриппа A/Puerto Rico (H1N1) в условиях применения наиболее активного фосфорсодержащего полимера 1 на разных сроках эксперимента.

Как видно из представленных данных, протективный эффект полимера 1 сохраняется в течение 2 часов, после чего уровень гибели животных перестает отличаться от контрольных значений.

В ходе данного исследования охарактеризована протективная активность полимерных соединений на основе фосфоновой кислоты с 4-акрилоилморфолином на модели летальной гриппозной инфекции у животных. Приведенные примеры убедительно свидетельствуют, что полимерные соединения на основе фосфоновой кислоты с 4-акрилоилморфолином являются эффективным средством профилактики гриппозной инфекции при местном применении. При этом эффект наиболее активного из них превосходил протективное действие специфического противовирусного препарата Тамифлю.

Способ профилактики респираторных вирусных инфекций направлен на уменьшение случаев заболеваний и может быть применен в медицинских учреждениях, в учебных учреждениях и в широких контингентах населения.

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактике инфекционных болезней и может быть использовано для профилактики гриппозной инфекции. Способ включает интраназальное введение в физиологическом растворе сополимера винилфосфоновой кислоты с 4-акрилоилморфолином (ВФК-4-АМ), содержащего 35-70 мол.% винилфосфоновой кислоты, с молекулярной массой (20-70)⋅10³, при концентрации сополимера 300 мкг/мл в объеме раствора 30 мкл. Использование изобретения позволяет проводить неспецифическую профилактику гриппозной инфекции при местном применении. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ профилактики гриппозной инфекции, состоящий в том, что интразанально в физиологическом растворе вводят сополимер винилфосфоновой кислоты с 4-акрилоилморфолином (ВФК-4-АМ), содержащий 35-70 мол.% винилфосфоновой кислоты, с молекулярной массой (20-70)⋅10³, при концентрации сополимера 300 мкг/мл в объеме раствора 30 мкл.